CN101062410A - 一种肠出血性大肠杆菌o157:h7基因工程疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗，其采用肠出血性大肠杆菌O157:H7毒力抗原志贺毒素II结合亚单位、紧密粘附素及III型分泌蛋白A通过基因重组方法构建融合工程菌，经高密度发酵及一系列的纯化程序从而获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体产生高效的免疫应答和免疫预防保护及治疗作用。

Description

一种肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，转别涉及一种多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗及其制备方法。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是出血性肠炎的主要病原体，其主要血清型是O157:H7。该菌被确认为致病菌的20多年来世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)，还可在5％～10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。EHEC O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。目前，对O157:H7感染尚缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。由于O157:H7的暴发流行和治疗上的困难，疫苗研究就显得极为紧迫。有效的疫苗研制是预防和治疗O157:H7感染最简单、经济、快捷的手段。

O157菌的致病性主要体现于细菌的粘附定植力和细菌毒素两个方面。紧密粘附素(Intimin)是该菌重要而且特异的粘附分子，intimin及其受体(转位紧密粘附素受体Tir)介导细菌粘附于肠上皮细胞，引起肠上皮细胞粘附和擦拭性(attaching and effacing，A/E)损伤。Intimin的胞外区(C-端片段)是与Tir受体结合的功能区，现有实验结果已经证明intimin尤其是C-端片段(Intimin-C)的特异性抗体可以阻断细菌的粘附进而使其丧失致病力，因而具有较强的免疫保护性(1.Dean NEA和Gansheroff L J，Mills M.Infect Immun2002，70(5)：2414；2.Li Y和Frey E，Mackenzie AM.Infect Immun 2000，68(9)：5090)。EHEC O157:H7的III型分泌系统(type III secretion system，TTSS)相关蛋白EspA(Esp为E.coli secreted protein缩写)与粘附和擦拭性损伤形成的信号传递有关，EspA形成的纤维样管状结构是其他效应蛋白进入宿主细胞的通道，EspB，EspD经过此通道分泌到宿主细胞，并在细胞膜表面形成小孔，Tir蛋白经过此通道及小孔插入宿主细胞，Intimin与Tir结合造成A/E损伤。研究证明EspA具有良好的免疫原性和免疫保护性，EspA是表面表达和多聚体形式存在，抗EspA抗体常比其他表面蛋白的抗体存在的数量多、持续时间长；又因EspA的高度保守性，抗EspA抗体可以提供多种血清型广泛交叉的保护作用(1.Crepin VF和Shaw R，Abe CM.Journal of Bacteriology 2005，187(8)：2881；2.Gruenheid S和Sekirov I，Thomas NA.Mol.Microbiol，2004，51(5)：1233；3.Mundy R和Petrovska L，Smollett K.Infect Immun.2004，72(4)：2288；4.Potter AA和Klashinsky S，Li Y.Vaccine 2004，22(3-4)：362)。

EHEC O157:H7可以产生两种毒素，分别称为志贺毒素I(Stx1)和志贺毒素II(Stx2)。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，前者具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用从而抑制蛋白质合成，是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础；后者具有细胞结合特性，能与具有特定糖鞘脂受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用，是志贺样毒素致病的关键。多数O157:H7细菌产生Stx2，而且Stx2毒性强于Stx1，与HUS及TTP等严重并发症的相关性更为密切。在表达方式上，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。分泌的Stx2通过肠上皮细胞吸收入血，肠粘膜免疫对其具有-定的阻断作用。但是由于Stx2类毒素具有潜在的毒性，对人来说，采用其作为疫苗抗原具有较大的风险，已有实验表明以基因工程克隆的Stx2B亚单位作为疫苗仍然具有较强的免疫原性和更高的安全性，刺激机体可以产生较高效价的保护性抗体，具有中和毒素的作用(1.Potter AA和Klashinsky S，Li Y.Vaccine，2004，22(3-4)：362；2.PaolaM和George M，Randy J.Infect Dis，2001，183(9)：435)。此外又证实StxB亚单位因能与具有Gb3受体的抗原递呈细胞——树突状细胞(DC)结合，有助于疫苗抗原的递呈和诱导细胞及体液免疫应答，显示了良好的免疫佐剂活性(1.Nacilla H和Fabrice B，Mohamed A.International Immunology，2003，15(10)：1161；2.Nacilla H和Emmanuelle B，Sophie B.The Journal ofImmunology，2000，165(7)：3301)。

用病原菌全菌或裂解产物接种机体是较为传统的疫苗学方法，然而由于EHEC O157:H7菌体抗原成份复杂，含有多种致病因子，且与普通大肠杆菌有大量的共同抗原，易引发不良反应，使EHEC O157:H7菌全菌疫苗研究和应用受到限制。目前国外EHEC O157:H7疫苗研究进展最快的是Konadu E Y等研制的O157脂多糖与绿脓杆菌A蛋白的结合疫苗于98年进入I期临床试验，但进展缓慢，而有文章指出O157脂多糖所诱生的抗体具有类似抗生素一样促使O157菌释放致死性志贺毒素的作用，因而该路线成功的可能性较小(1.Konadu EY和TranHT.Infect Dis，1998，177(2)：383；2.Konadu E和Donohue-RolfeA，Calderwood SB.Infect Immun，1999，67(11)：6191；3.Ahmed A和Li J，Shiloach Y.Infect Dis，2006，193(4)：515)。

随着基因工程技术的成熟，亚单位基因工程疫苗将成为EHEC O157:H7疫苗研究的主攻方向。在细菌的感染过程中，由于宿主和致病菌之间有着复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生有效的保护作用，混合多抗原成分的疫苗可以激发机体更强的免疫应答，而以融合基因方式获得多组分疫苗与其他方式相比具有更多优势，既降低纯化成本，又可以保证融合蛋白质量稳定、批间差异小。

发明内容

本发明在疫苗抗原的选择上直接针对EHEC O157:H7的重要致病因子，针对现有技术存在的不足，强调多个致病因子相关保护性抗原的组合应用以产生强大的免疫保护作用，提供一种多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗及其制备方法。

本发明所提供的多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗至少包括肠出血性大肠杆菌O157III型分泌蛋白EspA、紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C以及志贺毒素II结合亚单位Stx2B三种免疫保护性抗原亚单位。

本发明将肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157III型分泌蛋白A(EspA)、紧密粘附素(Intimin)C端免疫保护性片段、志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)在基因水平按进行连接构建融合蛋白，进而获得不同保护性抗原亚单位融合方式的疫苗抗原。优选地，其构建顺序为EspA-IntiminC300-Stx2B。

本发明优选采用以下连接方式及连接子：

1.紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)和III型分泌蛋白A(EspA)连接的方式是：Intimin-C的编码基因通过编码连接子的一段核苷酸序列与EspA基因连接，从而获得融合蛋白EspA-Intimin-C。编码所述融合蛋白的基因序列可以是图1所示的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。所述的免疫保护性片段Intimin-C的基因序列为图2所示的核苷酸序列。所述将肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C300)的编码基因和III型分泌蛋白A(EspA)基因相连接的方式是：III型分泌蛋白A(EspA)位于5’端，O157菌紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C300)的编码基因通过编码连接子(酪氨酸-丙氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸，YAPQDP)的一段核苷酸序列连接于EspA基因的3’端。

2.紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)、III型分泌蛋白A(EspA)和志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)优选的连接方式是：上述融合蛋白EspA-Intimin-C通过编码连接子的一段核苷酸序列与Stx2B基因连接，从而获得融合蛋白EspA-Intimin-C-Stx2B。编码所述融合蛋白的基因序列是SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。所述的融合蛋白的结构是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。所述将EspA-Intimin-C融合基因和Stx2B基因相连接的优选方式是：EspA-Intimin-C融合基因5’端，Stx2B基因通过编码连接子(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸，GSGGSG)的一段核苷酸序列连接于融合基因的3’端，在EspA-IntiminC300-Stx2B志贺毒素II结合亚单位Stx2B基因3’端连接6聚组氨酸编码序列。获得的融合蛋白具有较高的表达量，建立了融合蛋白EspA-IntiminC300-Stx2B的纯化工艺，研究了其抗原活性与免疫保护性，并经动物实验证实其免疫预防和感染治疗效果。

本发明所提供的优选多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明所提供的多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗适合于制备注射剂和口服剂。

本发明还提供一种制备多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗的方法，其包括以下步骤：

(1)培养肠出血性大肠杆菌O157:H7，获取其基因组DNA；

(2)克隆肠出血性大肠杆菌O157:H7的EspA及IntiminC300的编码基因；

(3)以获得的EspA及IntiminC300的编码基因为基础，构建融合基因EspA-IntiminC300表达质粒；

(4)以融合基因EspA-IntiminC300为基础，构建融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B表达质粒；

(5)以融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B表达质粒转化宿主，获得目的蛋白；以及

(6)分离并纯化目的蛋白Es-IntiminC300-Stx2B，制成基因工程疫苗。

其中，所述构建融合基因EspA-IntiminC300表达质粒包括可以下步骤：

(1)用限制性内切酶切EspA和Intimin-C300的克隆质粒；

(2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；

(3)切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；

(4)将EspA和Intimin-C300目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有EspA-IntiminC300基因的重组质粒；以及

(5)将含有EspA-IntiminC300基因的重组质粒转化大肠杆菌。

所述构建融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B表达质粒可以包括以下步骤：

(1)用PCR方法扩增EHEC O157:H7的Stx2B和上述EspA-IntiminC300的编码基因；

(2)用重叠延伸PCR方法扩增EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因；

(3)EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因的克隆；

(4)用限制性内切酶切EspA-IntiminC300-Stx2B的克隆质粒；

(5)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；

(6)切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；

(7)将EspA-IntiminC300-Stx2B目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有EspA-IntiminC300-Stx2B基因的重组质粒；以及

(8)将含有EspA-IntiminC300-Stx2B基因的重组质粒转化大肠杆菌。

本发明的基因工程重组菌及重组融合蛋白具有如下基本特性：a.在摇瓶条件下，目的蛋白表达量达60％，高密度发酵条件下，目的蛋白表达量约40％。b.重组蛋白以包涵体形式表达，分子量为63kDa。c.纯化的重组蛋白能够诱导动物产生较高滴度的抗体，并有良好的免疫保护作用。

本发明采用基因工程手段构建表达多种保护性抗原亚单位融合蛋白疫苗，所得多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗高效、安全、便于分离纯化。

以下结合附图及具体实施例对本发明进行进一步说明。

附图说明

图1为EspA-IntiminC300融合基因质粒构建结构示意图。

图2为融合蛋白EspA-IntiminC300-Stx2B质粒构建结构示意图。

图3为本发明目的基因EspA和Intimin-C的PCR克隆扩增。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因EspA的PCR扩增产物(600bp)；泳道3为目的基因Intimin-C300的PCR扩增产物(900bp)。结果表明，目的基因EspA和Intimin-C300的PCR克隆扩增效果良好。

图4是融合基因EspA-Intimin-C300重组表达质粒的酶切鉴定。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2重组质粒NcoI/BamHI双酶切产物(600bp)；泳道3为重组质粒NcoI/XhoI双酶切产物(1500bp)；泳道4为重组质粒BamHI/XhoI双酶切产物(900bp)。结果表明酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功，目的基因连接正确。

图5为本发明目的基因Stx2B和融合基因EspA-Intimin-C300的PCR克隆扩增。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因EspA-IntiminC300的PCR扩增产物(1500bp)；泳道3为目的基因Stx2B的PCR扩增产物(300bp)。结果表明目的基因EspA-IntiminC300和Stx2B的PCR克隆扩增效果良好。

图6为本发明融合目的基因EspA-IntiminC300-Stx2B重叠延伸PCR扩增。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因EspA-IntiminC300-Stx2B重叠延伸PCR扩增产物(1700bp)。结果表明目的基因EspA-IntiminC300-Stx2B重叠延伸的扩增效果良好。

图7是融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B重组表达质粒的酶切鉴定。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为重组质粒NcoI/XhoI双酶切产物(1700bp)；结果表明酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功，目的基因连接正确。

图8是基因重组菌EspA-Intimin-C300-Stx2B/BL21诱导表达PAGE电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2为pET-28a(+)/BL21(DE3)空质粒；泳道3为重组蛋白诱导前；泳道4～7为重组蛋白加入IPTG诱导1，2，4，6h；泳道8为包涵体溶解液(箭头所示为重组融合蛋白EspA-Intimin-C300-Stx2B)。基因重组菌经过诱导后在分子量63KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。经过UVP图像扫描分析，诱导4小时目的蛋白表达量约40％。

图9为目的蛋白EspA-Intimin-C300-Stx2B纯化效果PAGE电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2～8为目的蛋白洗脱峰样品。结果显示，经过纯化步骤，目的蛋白的纯度得到明显改善，收获的目的蛋白峰经UVP扫描分析纯度达到94.5％。

图10和11分别为融合基因EspA-Intimin-C300以及EspA-Intimin-C300-Stx2B测序的结果图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例用于对本发明中的一种疫苗的制备方法进行描述，其余组合方式与此类似，应理解的是，这些实施例是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。

本发明采用以下技术路线及步骤：

1.EspA-IntiminC300融合基因的构建

1)克隆肠出血性大肠杆菌O157:H7的EspA和Intimin-C300的编码基因。

①培养肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)

②用PCR方法扩增EHEC O157:H7的EspA和Intimin-C300的编码基因。

③PCR产物的克隆。

2)构建EspA和Intimin-C300的融合基因。

①用限制性内切酶切EspA和Intimin-C300的克隆质粒。

②酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离。

③切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带。

④将EspA和Intimin-C300目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有EspA-IntiminC300基因的重组质粒。

⑤将含有EspA-IntiminC300基因的重组质粒转化大肠杆菌。

3)测定EspA-IntiminC300融合基因的序列。

2.原核表达质粒pET28a(+)EspA-IntiminC300-Stx2B的构建。

1)构建EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因。

①用PCR方法扩增EHEC O157:H7的Stx2B和上述EspA-IntiminC300的编码基因。

②用重叠延伸PCR方法扩增EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因。

③EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因的克隆。

④用限制性内切酶切EspA-IntiminC300-Stx2B的克隆质粒。

⑤酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离。

⑥切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带。

⑦将EspA-IntiminC300-Stx2B目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有EspA-IntiminC300-Stx2B基因的重组质粒。

⑧将含有EspA-IntiminC300-Stx2B基因的重组质粒转化大肠杆菌。

3)测定EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因的序列。

4)诱导表达EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因，获得目的蛋白EspA-IntiminC300。

5)纯化分离目的蛋白EspA-IntiminC300-Stx2B。

6)鉴定目的蛋白EspA-IntiminC300-Stx2B的纯度。

此目的蛋白EspA-IntiminC300-Stx2B即为融合型肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 III型分泌蛋白A(EspA)、紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)及志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)多价基因工程疫苗。

实施例1

肠出血性大肠杆菌O157:H7融合基因EspA-Intimin-C300的构建

1.引物设计及PCR扩增

1)引物设计如下：根据从GenBank查到的O157:H7(SaKai标准株)编码EspA及Intimin-C300的基因，利用软件Primer Premier5.0进行引物的设计和分析。将linker(方框中部分)序列设计在上游基因(EspA)的3′端并引入BamHI位点，以BamHI酶切的粘性末端即可将两基因进行正确连接。引物由上海英俊公司合成。

EspA：

上游引物P1：

5′- CCATGGATACATCAAATGCAAC-3′(NcoI)

下游引物P2：

5′-

TTACCAAGGGATATT-3′(BamHI)Intimin-C300：

上游引物P3：

5′-

ACTTCAGCACTTA-3′(BamHI)

下游引物P4：

5′- CTCGAGTTCTACACAAACCGCATA-3′(XhoI)

2)目的基因的PCR扩增

以肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7基因组DNA(煮沸破菌上清液)为模板。94℃预变性5min，按照94℃30s→55℃30s→72℃1min进行30个循环，最后72℃延伸10min，分别扩增EspA和Intimin-C300基因片段。(扩增结果如图3所示)

2.EspA-Intimin-C300融合基因表达载体及重组表达型工程菌的构建(质粒构建结构示意图如图1所示)

1)PCR产物的克隆

将获得的EspA和Intimin-C300基因片段分别克隆入pMD18-T，转化E.coliDH5α，氨苄抗性筛选阳性重组子，抽提质粒，分别用NcoI和EamHI、BamHI和XhoI做双酶切鉴定，鉴定正确后回收基因片段。

2)EspA-Intimin-C300融合基因的构建

先将EspA片段构建于表达载体pET-28a(+)，之后将Intimin-C300片段构建于融和基因表达载体pET-28a(+)-espA。分别进行3个双酶切鉴定：NcoI和BamHI；BamHI和XhoI；NcoI和XhoI。(酶切结果如图4所示)

3)将酶切鉴定无误的基因重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得重组工程菌。

4)重组工程菌EspA-Intimin-C300/BL21送上海英俊公司测序。测序结果见图10。

实施例2

肠出血性大肠杆菌O157:H7融合蛋白EspA-Intimin-C300-Stx2B的构建与表达

1.引物设计及PCR扩增

1)引物设计如下：根据从GenBank查到的O157:H7(SaKai标准株)编码Stx2B的基因以及实施例1中构建的融合基因EspA-Intimin-C300序列，利用软件Primer Premier5.0进行引物的设计和分析。将linker(方框中部分)序列设计在上游融合基因(EspA-Intimin-C300)的3′端，利用重叠延伸PCR方法将融合基因EspA-Intimin-C300和编码Stx2B的基因连接起来。引物由上海英俊公司合成。

EspA-Intimin-C300：

上游引物P1：

5′- CCATGGATACATCAAATGCAAC-3′(NcoI)

下游引物P2：

5′-

TTCTACACAAACCG-3′

Stx2B：

上游引物P3：

5′-

AAGAAGATGTTTAT-3′

下游引物P4：

5′- CTCGAGGTCATTATTAAACTGCAC-3′(XhoI)

2)目的基因的PCR扩增

分别以EspA-Intimin-C300/BL21质粒和肠出血性大肠杆菌EHEC Q157:H7基因组DNA(煮沸破菌上清液)为模板。94℃预变性5min，按照94℃30s→55℃30s→72℃1min进行30个循环，最后72℃延伸10min，分别扩增EspA-Intimin-C300和Stx2B基因片段。(扩增结果如图5所示)

3)重叠延伸PCR扩增EspA-Intimin-C300-Stx2B融合基因。

以上述步骤2)中扩增的PCR回收产物为模板，以P1，P4为引物，94℃预变性5min，按照94℃30s→55℃30s→72℃1min进行35个循环，最后72℃延伸10min，扩增出EspA-Intimin-C300-Stx2B融合基因。(扩增结果如图6所示)

2.EspA-Intimin-C300-Stx2B融合基因表达载体及重组表达型工程菌的构建

1)PCR产物的克隆

将获得的EspA-Intimin-C300-Stx2B融合基因片段克隆入pMD18-T，转化E.coli DH5α，氨苄抗性筛选阳性重组子，抽提质粒，用NcoI和XhoI做双酶切鉴定，鉴定正确后回收基因片段。

2)EspA-Intimin-C300-Stx2B融合基因表达载体的构建

将1)中回收的EspA-Intimin-C300-Stx2B融合基因片段构建于表达载体pET-28a(+)，用NcoI和XhoI做双酶切鉴定。(酶切结果如图7所示)

3)将酶切鉴定元误的基因重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得重组工程菌。

4)重组工程菌EspA-Intimin-C300-Stx2B/BL21送上海英俊公司测序。测序结果见图11。

3.重组工程菌的诱导表达及形式鉴定

重组工程菌在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中培养，至菌液OD₆₀₀≈0.6时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导不同时间收集菌液，超声波破菌，差速离心分别留取上清和沉淀，处理后进行凝胶电泳鉴定表达形式及表达量。(诱导表达及形式鉴定如图8所示)

4.融合蛋白EspA-Intimin-C300-Stx2B的纯化

重组菌的发酵，采用德国B.Braun 10L发酵罐，按照工程菌发酵常规工艺进行。发酵结束后离心收集细菌，称重后冻存备用。用pH值8.0的TE缓冲液重悬细菌，经高压匀浆仪进行破菌，差速离心收集包涵体，分别用含1％TritonX100的TE缓冲液和含1M、2M尿素TE缓冲液洗涤包涵体，用8M尿素溶解包涵体，透析后利用蛋白所带的6个His标签，采用亲和层析的方法进行蛋白纯化。(纯化结果如图9所示)

5.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度，蛋白浓度为93.5％。

实施例3

动物免疫及抗体检测

目的蛋白EspA-Intimin-C300-Stx2B经过纯化后免疫4～5周龄的Balb/c小鼠，100ug/只/次，100μL抗原与等量福氏完全佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。每周一次，分别于免疫3、4次后的4天采血，ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。

结果：EspA-Intimin-C300-Stx2B免疫3次后的抗体阳性率在90％，免疫4次后的抗体阳性率达到98％。

实施例4

免疫动物的攻毒保护

同实施例3的免疫方案，免疫4次后的第10天采用致死剂量的O157菌超声上清液(主要成分为Stx2毒素，蛋白浓度1mg/mL)0.05mL腹腔注射对免疫小鼠及对照小鼠进行攻毒实验，观察各组小鼠的死亡情况，在30天的观察期后计算免疫小鼠的死亡/生存率如下表1所示。

表1 Stx2B-Intimin-C皮下免疫小鼠，O157菌超声上清攻毒-免疫保护效果

组别	动物数量(只)	攻毒后死亡情况					30天后存活数量	存活率(保护率)
									3天	4天	5天	6天	7-30天
		EspA-Intimin-C300-Stx2B	50	0	1	1								1	0	47	94％
PBS对照组	50						0	36	12	2	0	0	0

结果显示，EspA-Intimin-C300-Stx2B组免疫小鼠的保护率达到90％以上。

结论：疫苗抗原EspA-Intimin-C300-Stx2B免疫小鼠，可针对O157菌毒性物质攻击产生有效保护作用，保护率高。

实施例5

感染动物的疫苗治疗观察

以高浓度EHEC O157:H7细菌培养物(1×10⁹Cfu)经胃灌饲Balb/c小鼠，48hr后以疫苗抗原EspA-Intimin-C300-Stx2B 100ug(100uL)/只或等体积PBS连续两天每天一次对饲菌小鼠进行灌胃治疗。观察治疗后小鼠排菌时间。观察结果如下表2所示。

表2疫苗抗原治疗饲菌小鼠后排菌时间观察结果

组别	动物数量(只)	治疗后小鼠终止排菌天数					10天后持续排菌小鼠数量	平均排菌时间(天)
									3天	4天	5天	6天	7-10天
		EspA-Intimin-C300-Stx2B	50	12	19	10								4	5	0	＞10
PBS对照组	50						0	2	3	3	5	37	＞10

两组结果经统计学分析，p＜0.001。说明疫苗抗原EspA-Intimin-C300-Stx2B对饲菌小鼠进行灌胃治疗可有效缩短染菌小鼠排菌时间。

结论：疫苗抗原EspA-Intimin-C300-Stx2B对O157菌感染有治疗作用。

                                        序列表

SEQ ID NO：1

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗

<160>1

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>1782

<212>DNA

<213>肠出血性大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic E.coli O157:H7，EHEC O157:H7)天然序列人工融合改建

<400>1

1    ATGGATACAT CAAATGCAAC ATCCGTTGTT AATGTGAGTG CGAGTTCTTC GACATCGACG 60

61   ATCTATGACT TAGGTAATAT GTCGAAGGAT GAGGTGGTTA AGCTATTTGA GGAACTCGGT 120

121  GTTTTTCAGG CTGCGATTCT CATGTTTTCT TATATGTATC AGGCACAAAG TAATCTGTCG 180

181  ATTGCAAAGT TTGCTGATAT GAATGAGGCA TCTAAAGCGT CAACCACGGC ACAAAAGATG 240

241  GCTAATCTTG TGGATGCCAA AATTGCTGAT GTTCAGAGTA GCACTGATAA GAATGCGAAA 300

301  GCCAAACTTC CTCAAGACGT GATTGACTAT ATAAACGATC CACGTAATGA CATAAGTGTA 360

361  ACTGGTATTC GTGATCTTAG TGGTGATTTA AGCGCTGGTG ATCTGCAAAC AGTGAAGGCG 420

421  GCTATTTCAG CTAAAGCGAA TAACCTGACA ACGGTAGTGA ATAATAGCCA GCTCGAAATT 480

481  CAGCAAATGT CGAATACATT AAATCTCTTA ACGAGTGCAC GTTCTGATGT GCAATCTCTA 540

541  CAATATAGAA CTATTTCAGC AATATCCCTT GGTAAATACG CGCCGCAGGA TCCTACTTCA 600

601  GCACTTAATG CCAGTGCGGT TATATTTTTT GATCAAACCA AGGCCAGCAT TACTGAGATT 660

661  AAGGCTGATA AGACAACTGC AGTAGCAAAT GGTAAGGATG CTATTAAATA TACTGTAAAA 720

721  GTTATGAAAA ACGGTCAGCC AGTTAATAAT CAATCCGTTA CATTCTCAAC AAACTTTGGG 780

781  ATGTTCAACG GTAAGTCTCA AACGCAAGCA ACCACGGGAA ATGATGGTCG TGCGACGATA 840

841  ACACTAACTT CCAGTTCCGC CGGTAAAGCG ACTGTTAGTG CGACAGTCAG TGATGGGGCT 900

901  GAGGTTAAAG CGACTGAGGT CACTTTTTTT GATGAACTGA AAATTGACAA CAAGGTTGAT 960

961  ATTATTGGTA ACAATGTCAG AGGCGAGTTG CCTAATATTT GGCTGCAATA TGGTCAGTTT 1020

1021 AAACTGAAAG CAAGCGGTGG TGATGGTACA TATTCATGGT ATTCAGAAAA TACCAGTATC 1080

1081 GCGACTGTCG ATGCATCAGG GAAAGTCACT TTGAATGGTA AAGGCAGTGT CGTAATTAAA 1140

1141 GCCACATCTG GTGATAAGCA AACAGTAAGT TACACTATAA AAGCACCGTC GTATATGATA 1200

1201 AAAGTGGATA AGCAAGCCTA TTATGCTGAT GCTATGTCCA TTTGCAAAAA TTTATTACCA 1260

1261 TCCACACAGA CGGTATTGTC AGATATTTAT GACTCATGGG GGGCTGCAAA TAAATATAGC 1320

1321 CATTATAGTT CTATGAACTC AATAACTGCT TGGATTAAAC AGACATCTAG TGAGCAGCGT 1380

1381 TCTGGAGTAT CAAGCACTTA TAACCTAATA ACACAAAACC CTCTTCCTGG GGTTAATGTT 1440

1441 AATACTCCAA ATGTCTATGC GGTTTGTGTA GAAGGAAGTG GTGGCAGTGG CAAGAAGATG 1500

1501 TTTATGGCGG TTTTATTTGC ATTAGCTTCT GTTAATGCAA TGGCGGCGGA TTGTGCTAAA 1560

1561 GGTAAAATTG AGTTTTCCAA GTATAATGAG GATGACACAT TTACAGTGAA GGTTGACGGG 1620

1621 AAAGAATACT GGACCAGTCG CTGGAATCTG CAACCGTTAC TGCAAAGTGC TCAGTTGACA 1680

1681 GGAATGACTG TCACAATCAA ATCCAGTACC TGTGAATCAG GCTCCGGATT TGCTGAAGTG 1740

1741 CAGTTTAATA ATGACCTCGA GCACCACCAC CACCACCACT GA                    1782

SEQ ID NO：2

<210>2

<211>593

<212>蛋白质

<213>EspA-IntiminC300-Stx2B融合蛋白的氨基酸序列

1   MDTSNATSVV NVSASSSTST IYDLGNMSKD EVVKLFEELG VFQAAILMFS YMYQAQSNLS 60

61  IAKFADMNEA SKASTTAQKM ANLVDAKIAD VQSSTDKNAK AKLPQDVIDY INDPRNDISV 120

121 TGIRDLSGDL SAGDLQTVKA AISAKANNLT TVVNNSQLEI QQMSNTLNLL TSARSDVQSL 180

181 QYRTISAISL GKYAPQDPTS ALNASAVIFF DQTKASITEI KADKTTAVAN GKDAIKYTVK 240

241 VMKNGQPVNN QSVTFSTNFG MFNGKSQTQA TTGNDGRATI TLTSSSAGKA TVSATVSDGA 300

301 EVKATEVTFF DELKIDNKVD IIGNNVRGEL PNIWLQYGQF KLKASGGDGT YSWYSENTSI 360

361 ATVDASGKVT LNGKGSVVIK ATSGDKQTVS YTIKAPSYMI KVDKQAYYAD AMSICKNLLP 420

421 STQTVLSDIY DSWGAANKYS HYSSMNSITA WIKQTSSEQR SGVSSTYNLI TQNPLPGVNV 480

481 NTPNVYAVCV EGSGGSGKKM FMAVLFALAS VNAMAADCAK GKIEFSKYNE DDTFTVKVDG 540

541 KEYWTSRWNL QPLLQSAQLT GMTVTIKSST CESGSGFAEV QFNNDLEHHH HHH        593

Claims (8)

1.一种多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗，其特征在于，至少包括肠出血性大肠杆菌O157III型分泌蛋白EspA、紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C以及志贺毒素II结合亚单位Stx2B三种免疫保护性抗原亚单位。

2.根据权利要求1所述的基因工程疫苗，其特征在于，其为所述肠出血性大肠杆菌O157III型分泌蛋白EspA、紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C以及志贺毒素II结合亚单位Stx2B在基因水平进行连接构建而成的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的基因工程疫苗，其特征在于，所述融合蛋白的构建顺序为EspA-IntiminC300-Stx2B。

4.根据权利要求3所述的基因工程疫苗，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列为图5所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗适合于制备注射剂和口服剂。

6.一种制备多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)培养肠出血性大肠杆菌O157:H7，获取其基因组DNA；

(2)克隆肠出血性大肠杆菌O157:H7的EspA及IntiminC300的编码基因；

(3)以获得的EspA及IntiminC300的编码基因为基础，构建融合基因EspA-IntiminC300表达质粒；(4)以融合基因EspA-IntiminC300为基础，构建融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B表达质粒；

(5)融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B表达质粒转化宿主菌，获得目的蛋白；以及

(6)分离并纯化目的蛋白EspA-IntiminC300-Stx2B，制成基因工程疫苗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述构建融合基因EspA-IntiminC300表达质粒包括以下步骤：

(1)用限制性内切酶切EspA和Intimin-C300的克隆质粒；

(2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；

(3)切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；

(4)将EspA和Intimin-C300目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有EspA-IntiminC300基因的重组质粒；以及

(5)将含有EspA-IntiminC300基因的重组质粒转化大肠杆菌。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述构建融合基因EspA-IntiminC300-Stx2B表达质粒包括以下步骤：

(1)用PCR方法扩增EHEC O157:H7的Stx2B和上述EspA-IntiminC300的编码基因；

(2)用重叠延伸PCR方法扩增EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因；

(3)EspA-IntiminC300-Stx2B的融合基因的克隆；

(4)用限制性内切酶切EspA-IntiminC300-Stx2B的克隆质粒；

(5)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；

(6)切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；

(7)将EspA-IntiminC300-Stx2B目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有EspA-IntiminC300-Stx2B基因的重组质粒；以及

(8)将含有EspA-IntiminC300-Stx2B基因的重组质粒转化大肠杆菌。

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