CN103558377B - 一种肠出血性大肠杆菌o157:h7elisa抗体检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种肠出血性大肠杆菌o157:h7elisa抗体检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒及其使用方法，包括：a）包被板、b）10×浓缩洗涤液、c）稀释液、d）酶标二抗、e）底物A液、底物B液、底物缓冲液、f）阴、阳性对照血清、g）终止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液。本发明与现有技术相比具有以下优点：1、能够简便快速的检测血清中大肠杆菌O157：H7特异性抗体；2、特异性好，包被板包被抗原为大肠杆菌O157：H7特异性蛋白intimin，和大肠杆菌其它血清型以及鸡白痢等血清不发生交叉反应；3、灵敏度高。

Description

一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒及其使用方法，属于抗体检测领域。
背景技术
肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)等食源性病原微生物是当今世界上不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。在食源性病原微生物中,EHEC占有重要地位，主要包括O157:H7、O26:H11和O111,O157:H7是出血性肠炎的主要致病菌。O157:H7感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点。1982年，O157:H7首先在美国发现，此后在世界各地散发或地方流行,已成为全球性的公共卫生和食品安全问题。
目前,国内外已报道的检测方法大多对抗原进行检测，而缺乏对抗体检测方法的研究，因而有必要建立快速、简便、特异的抗体检测方法。
O157:H7LEE毒力岛上的eae基因编码的94kDa的外膜蛋白即紧密素（intimin）是EHEC重要的外膜蛋白，其介导细菌与上皮细胞的紧密黏附，是最重要的黏附因子，可产生A/E病变。O157:H7主要依靠紧密素及其受体黏附于肠上皮细胞，紧密素的特异性抗体可阻断细菌的黏附而使其丧失致病力，具有较强的免疫原性和免疫保护性，是理想的疫苗备选抗原。Intimin蛋白为包被抗原的ELISA抗体检测试剂盒对大肠杆菌O157:H7的流行病学调查以及疫苗效果评估有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒选择肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因的表达产物intimin包被酶标板及其应用方法，其可快速检测血清中大肠杆菌O157:H7特异性抗体，了解鸡体抗体水平或感染状况，对于该病的流行病学调查有着重要作用。
本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为：一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a）包被板、b）10×浓缩洗涤液、c）稀释液、d）酶标二抗、e）底物A液、底物B液、底物缓冲液、f）阴、阳性对照血清、g）终止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物为5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’。
按上述方案，所述的包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，按如下配方进行配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加ddH2O定容至1000ml。
按上述方案，所述的10×浓缩洗涤液为含5%Tween-20的10×PBST，pH值为7.4，按如下配方进行配制：10×PBS1000ml，Tween-205ml。
按上述方案，所述的10×PBS浓度为0.1mol/L，pH值为7.4，按如下配方进行配制：Na2HPO4.12H2O58g，KH2PO44g，NaCl160g，KCl4g，溶于980mlddH20中，调pH至7.4，定容至1000ml。
按上述方案，所述的稀释液为含1%MILK的PBST，按如下配方进行配制：取用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液100ml，MILK1.0g，混合。
按上述方案，所述的酶标二抗为兔抗鸡lgY-HRP。
按上述方案，所述的底物缓冲液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混匀，其中所述的底物A液配制方法为H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4℃避光保存；所述的底物B液配制方法为TMB0.1g、无水乙醇50ml，混合，4℃避光保存；所述的底物缓冲液：柠檬酸.H2O4.91g，Na2HPO4.12H2O19.38g，加ddH2O定容至1000ml。
按上述方案，所述的阴性对照血清为采集健康的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的阳性对照血清为采集抗O157:H7的SPF鸡血，离心取上清，保存备用。
按上述方案，所述的终止液为2mol/LH2SO4，按如下配方进行配制：取浓H2SO455.5ml，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至500ml。
肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括有以下步骤：
1）取包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物为5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’，用稀释液将待检样品1:200倍稀释后加入板孔中，100uL/孔，用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照血清各设2孔，100uL/孔，另设一空白对照孔，空白对照孔加100ul待检样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37℃温育1h；
2）甩净孔中用稀释液稀释的待检样品和阴、阳性对照血清以及待检样品稀释液，用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净10倍稀释的浓缩洗涤液，拍干；
3）将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入用稀释液1:5000倍稀释的酶标二抗100ul，37℃温育1h；
4）洗涤，方法同步骤2）；
5）将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入底物A液、底物B液、底物缓冲液配成的显色液100ul，混匀，室温避光显色10分钟。
6）将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入终止液50ul，在酶标仪上测定OD450。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、能够简便快速的检测血清中大肠杆菌O157：H7特异性抗体，了解鸡体抗体水平或感染状况，对于该病的流行病学调查有着重要作用；
2、特异性好，包被板包被抗原为大肠杆菌O157：H7特异性蛋白intimin，和大肠杆菌其它血清型以及鸡白痢等血清不发生交叉反应；
3、灵敏度高，血清稀释1:1600倍时仍能检测到O157:H7intimin特异性抗体。
具体实施方式
一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a）包被板、b）10×浓缩洗涤液、c）稀释液、d）酶标二抗、e）底物A液、底物B液、底物缓冲液、f）阴、阳性对照血清、g）终止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物为5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’。
所述的包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，按如下配方进行配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加ddH2O定容至1000ml。
所述的10×浓缩洗涤液为含5%Tween-20的10×PBST，pH值为7.4，按如下配方进行配制：10×PBS1000ml，Tween-205ml。
所述的10×PBS浓度为0.1mol/L，pH值为7.4，按如下配方进行配制：Na2HPO4.12H2O58g，KH2PO44g，NaCl160g，KCl4g，溶于980mlddH20中，调pH至7.4，定容至1000ml。
所述的稀释液为含1%MILK的PBST，按如下配方进行配制：取用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液100ml，MILK1.0g，混合。
所述的酶标二抗为兔抗鸡lgY-HRP。
所述的底物缓冲液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混匀，其中所述的底物A液配制方法为H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4℃避光保存；所述的底物B液配制方法为TMB0.1g、无水乙醇50ml，混合，4℃避光保存；所述的底物缓冲液：柠檬酸.H2O4.91g，Na2HPO4.12H2O19.38g，加ddH2O定容至1000ml。
所述的阴性对照血清为采集健康的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的阳性对照血清为采集抗O157:H7的SPF鸡血，离心取上清，保存备用。
所述的终止液为2mol/LH2SO4，按如下配方进行配制：取浓H2SO455.5ml，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至500ml。
肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括有以下步骤：
1）取包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物为5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’，用稀释液将待检样品1:200倍稀释后加入板孔中，100uL/孔，用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照血清各设2孔，100uL/孔，另设一空白对照孔，空白对照孔加100ul待检样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37℃温育1h；
2）甩净孔中用稀释液稀释的待检样品和阴、阳性对照血清以及待检样品稀释液，用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净10倍稀释的浓缩洗涤液，拍干；
3）将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入用稀释液1:5000倍稀释的酶标二抗100ul，37℃温育1h；
4）洗涤，方法同步骤2）；
5）将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入底物A液、底物B液、底物缓冲液配成的显色液100ul，混匀，室温避光显色10分钟。
6）将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入终止液50ul，在酶标仪上测定OD450。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒组成与配制
1、试剂组成
引物由上海生物工程公司合成，兔抗鸡lgY-HRP购自于Thermo公司，MILK购自BD公司，酶标板购自深圳金灿华公司，Tween-20购自AMRESCO公司，大肠杆菌其它血清型O1、O2、O11、O18、O35、O45、O78、O86、O88、O147、鸡白痢以及新城疫等标准血清购自中国兽药监察所。
2、试剂配制
A）10×浓缩洗涤液（PBSTPH7.4）：10×PBS1000ml，Tween-205ml
B）包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液PH9.6)：Na2CO31.59g,NaHCO32.93g，加ddH2O定容至1000ml
C）封闭液（含5.0%MILK）：1×PBST100ml，BSA5.0g
D）显色液（底物液）：
底物A液：H2O20.75ml，三蒸水100ml，4℃避光保存。
底物B液：TMB0.1g，无水乙醇50ml，4℃避光保存。
底物缓冲液：柠檬酸.H2O4.91g，Na2HPO4.12H2O19.38g，加ddH2O定容至1000ml。
使用方法：底物缓冲液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混匀，现配现用。
E）10×PBS（0.1mol/LPH7.4）：Na2HPO4.12H2O58g，KH2PO44g，NaCl160g，KCl4g，溶于980mlddH20中，调PH至7.4，定容至1000ml。
F）终止液（2mol/LH2SO4）：取浓H2SO455.5ml，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至500ml。
G）稀释液（含1%MILK的PBST）：1×PBST100ml，MILK1.0g
H）制备试剂：双蒸水
肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法
1、样品的处理：被检样品为血清，用稀释液稀释200倍后编号备检。
2、被检样品的检测：①将备检样品加入包被抗原的96孔板，100uL/孔。用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设2孔，100uL/孔。另设一空白对照孔，空白对照孔加100ul样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37℃温育1h。②甩净孔中溶液，用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净洗涤液，拍干。③每孔加入用稀释液1:5000倍稀释的酶标二抗（抗鸡lgY-HRP）100ul，37℃温育1h。④洗涤，方法同2。⑤每孔加入显色液100ul，混匀，室温避光显色10分钟。⑥每孔加入终止液50ul，10分钟内在酶标仪上测定OD450。
3、结果判定
以空白孔调零，在酶标仪上测定各孔OD450，试验成立条件是阳性对照孔平均OD450值应大于或等于0.600，阴性对照孔平均OD450值低于0.200。
样品孔OD450值大于0.300判为阳性，小于0.300判为阴性。
肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒的初步应用
1、灵敏性试验：将阳性血清系列稀释（1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200），用肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒进行检测，检测结果表明血清稀释1:1600倍时仍能检测到O157:H7intimin特异性抗体（试验结果如表1）。
表1灵敏性试验结果
2、特异性试验：在相同条件下，用肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒检测致病性大肠杆菌其他血清型O1、O2、O11、O18、O35、O45、O78、O86、O88、O147、鸡白痢以及新城疫等血清以及O157:H7阳性血清，检测结果表明鸡大肠杆菌其它血清型O1、O2、O11、O18、O35、O45、O78、O86、O88、O147、鸡白痢以及新城疫等血清均呈阴性反应，但与O157:H7阳性血清呈阳性反应（试验结果如表2）。
表2特异性试验结果
3、重复性试验：批内重复性试验：取同一批次的包被抗原的酶标板，对8份血清进行检测，每份样品检测8孔，计算各样品OD450值的变异系数（试验结果如表3）。批间重复性试验：取不同批次的包被抗原的酶标板，对8份血清进行检测（同上），计算各样品OD450值的变异系数（试验结果如表4）。从表3可以看出，批内重复性试验变异系数均小于10%，表明在同一批次中的检测结果变异程度小，具有较好的批内重复性；从表4可以看出，批间重复性试验变异系数均小于10%，表明不同批次检测结果的变异程度较小，具有较好的批间重复性。
表3批内重复性试验结果
表4批间重复性试验结果
序列表
<110>湖北省农科院畜牧兽医研究所
<120>一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒及其使用方法
<160>2
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>eae基因的上游引物
<400>1
GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT32
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>eae基因的下游引物
<400>2
CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG29

Claims (7)

1.一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)包被板、b)10×浓缩洗涤液、c)稀释液、d)酶标二抗、e)底物A液、底物B液、底物缓冲液、f)阴、阳性对照血清、g)终止液，所述的阴性对照血清为采集健康的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的阳性对照血清为采集抗O157:H7的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物为5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’；所述的底物缓冲液9.5mL，底物A液32μL，底物B液0.5mL，混匀，其中所述的底物A液配制方法为H2O20.75mL、三蒸水100mL，混合，4℃避光保存；所述的底物B液配制方法为TMB0.1g、无水乙醇50mL，混合，4℃避光保存；所述的底物缓冲液：柠檬酸.H2O4.91g，Na2HPO4.12H2O19.38g，加ddH2O定容至1000mL；所述的终止液为2mol/LH2SO4，按如下配方进行配制：取浓H2SO455.5mL，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至500mL。
2.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，按如下配方进行配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加ddH2O定容至1000mL。
3.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的10×浓缩洗涤液为含5％Tween-20的10×PBST，pH值为7.4，按如下配方进行配制：10×PBS1000mL，Tween-205mL。
4.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的10×PBS浓度为0.1mol/L，pH值为7.4，按如下配方进行配制：Na2HPO4.12H2O58g，KH2PO44g，NaCl160g，KCl4g，溶于980mLddH20中，调pH至7.4，定容至1000mL。
5.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的稀释液为含1％MILK的PBST，按如下配方进行配制：取用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液100mL，MILK1.0g，混合。
6.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为兔抗鸡lgY-HRP。
7.肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括有以下步骤：
1)取包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物为5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’，用稀释液将待检样品1:200倍稀释后加入板孔中，100μL/孔，用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照血清各设2孔，100μL/孔，另设一空白对照孔，空白对照孔加100μL待检样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37℃温育1h；
2)甩净孔中用稀释液稀释的待检样品和阴、阳性对照血清以及待检样品稀释液，用ddH2O10倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200μL/孔，每次5min，然后甩净10倍稀释的浓缩洗涤液，拍干；
3)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入用稀释液1:5000倍稀释的酶标二抗100μL，37℃温育1h；
4)洗涤，方法同步骤2)；
5)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入底物A液、底物B液、底物缓冲液配成的显色液100μL，混匀，室温避光显色10分钟；
6)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入终止液50μL，在酶标仪上测定OD450。
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