CN112611864A - 筛分病菌模型的系统及筛分方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于病菌筛分领域，具体涉及一种筛分感染化脓隐秘杆菌或感染伪结核棒状杆菌模型的系统及方法。所述系统包括酶标板、加热器、试剂、数据库、酶标仪、数据对比输出模块；所述酶标板包括聚苯乙烯/聚氯乙烯材料标板，包括96孔或48孔；试剂包括抗原包被液、酶标抗体、显色液、病菌感染模型或免疫模型血清；数据库为健康或感染或免疫的动物模型产生不同的抗体量的吸光度，可导入和可删除；所述酶标仪设置波长为450nm。本发明提供的筛分系统的数据库完善，筛分的结果精确，可以快速筛分出感染病菌模型的病菌类型，简单方便。

Description

筛分病菌模型的系统及筛分方法
技术领域
本发明属于病菌筛分领域，具体涉及一种筛分感染化脓隐秘杆菌或感染伪结核棒状杆菌模型的系统及方法。
背景技术
化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)感染在全世界家养和野生动物中都有发生，感染通常导致多种动物的化脓性肺炎、乳腺炎、子宫内膜炎、流产、死胎等症状。化脓隐秘杆菌感染山羊主要有日渐消瘦、体表淋巴结炎、化脓性肺炎等临床症状，剖解可见到肺脏等脏器有化脓灶，表现出肺泡隔增宽、肺泡壁增厚、肺纤维化以及多器官炎症细胞的持续性浸润、化脓性炎症等病理变化。化脓隐秘杆菌是动物皮肤、上呼吸道和泌尿生殖道黏膜微生物群落的一部分，同时也是一种重要的机会致病菌，常与多种病原菌混合感染引发组织化脓性或坏死性病变。临床上，从有体表淋巴结炎和呼吸道疾病症状的病患山羊肺脏中常分离到混合感染的化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)等致病菌，在肺炎病例化脓隐秘杆菌的分离率中较高。
混合感染是现代规模化养殖中的常见现象，混合感染的化脓菌常为多重耐药菌，这给药物治疗带来了困难，需要确诊才能采取更好有针对性的治疗方案。混合感染同样给临床鉴别诊断带来了极大困难，一般需要实验室诊断才能确诊。化脓菌混合感染的实验室经典诊断方法是病原菌的分离鉴定，但化脓隐秘杆菌相对于伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌等致病菌的生长周期更长、营养要求更高，通过分离培养往往会造成漏检。重要的是，病原菌分离培养只适合于体表感染病例或剖检病例的诊断。ELISA诊断是一种适合于活体检测的常用方法，可以作为化脓菌感染这种慢性感染的感染状态的依据。此外，研究化脓隐秘杆菌等化脓菌感染、免疫机理的动物常用小鼠，目前也缺乏确认小鼠感染、免疫状态的筛分系统及方法。
传统疫苗一般只对特定血清型病原体有良好免疫保护效果，不会对混合感染的病原体产生广泛应答和较好交叉保护作用，这样就需要针对每种病原体进行多次免疫接种才能取得较好的免疫预防效果。另外，混合感染中的一些病原体可能会影响另一些病原体感染或免疫的免疫应答水平，表现为免疫拮抗或协同。目前没有相关文献对混合感染的化脓隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌等致病菌的有效疫苗的说明。化脓隐秘杆菌已报道的抗原有溶血素(Pyolysin，PLO)和铁ATP结合盒(ATP bindingcassette，ABC)转运体的底物结合蛋白——铁结合蛋白(Iron-binding protein，IBP)等，这些抗原为研究混合感染中化脓隐秘杆菌的抗体应答提供了明确靶标。
发明内容
本申请中小鼠感染或免疫化脓隐秘杆菌(生物保藏号为CCTCC NO：M2014037，GenBank NO：CP012649)会对伪结核棒状杆菌感染产生交叉保护免疫。这为山羊化脓性感染的疫苗研发提供了新思路。
而且在研究化脓菌混合感染的抗体应答时，发现化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌抗体存在交叉反应，IBP是化脓隐秘杆菌参与抗体应答、与伪结核棒状杆菌发生血清学交叉反应的主要抗原之一。此外，在化脓隐秘杆菌免疫动物中，IBP的IgG抗体检出率高于PLO抗体检出率，提示IBP是评估化脓隐秘杆菌免疫水平的可选靶标。
有鉴于此，本发明在于提供一种筛分感染化脓隐秘杆菌或感染伪结核棒状杆菌模型的系统。本发明中所述模型包括人工感染的动物模型和自然感染的动物模型。
所述系统包括酶标板、加热器、试剂、数据库、酶标仪、数据对比输出模块；
所述酶标板包括聚苯乙烯/聚氯乙烯材料标板，包括96孔或48孔；
所述试剂包括PLO包被液或IBP包被液、酶标抗体、显色液、病菌感染模型血清或免疫模型血清；
数据库为健康或感染或免疫的动物模型产生不同的抗体量的吸光度，可导入和可删除；
所述酶标仪设置波长为450nm。
进一步，所述加热器间接或直接给酶标板提供热量。
进一步，所述感染病菌模型包括指感染病菌的动物、或动物的某些携带病菌的部分。
进一步，所述显色液为TMB单组分显色液。
进一步，所述PLO包被液或IBP包被液的浓度为0.16±0.05μg/mL；
优选地，所述PLO包被液或IBP包被液为rrIBP包被液或rPLO包被液。
具体地，本发明中所有rIBP或rPLO均为重组质粒经过细菌培养得到的重组蛋白。
进一步，所述病菌感染模型血清或免疫模型血清为1:100血清稀释液。
进一步，所述酶标抗体为pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体稀释液。稀释比例优选为1:20000。
酶标仪设置波长450nm时的吸光度值OD450nm，
健康或感染小鼠模型产生PLO的吸光度值：
OD450nm(PLO-健康)＝0.195-0.301；
OD450nm(PLO-感染葡萄球菌)＝0.238-0.346；
OD450nm(PLO-感染伪结核棒状杆菌)＝0.249-0.597；
OD450nm(PLO-感染奇异变形杆菌)＝0.252-0.522，
OD450nm(PLO-感染化脓隐秘杆菌)＝2.204-3.162；
OD450nm(PLO-先感染伪结核棒状杆菌再感染化脓隐秘杆菌)＝0.226-0.358；
或健康或感染小鼠模型产生IBP的吸光度值：
OD450nm(IBP-健康)＝0.234-0.314；
OD450nm(IBP-感染葡萄球菌)＝0.239-0.360；
OD450nm(IBP-感染伪结核棒状杆菌)＝0.539-1.159；
OD450nm(IBP-感染奇异变形杆菌)＝0.197-0.482；
OD450nm(IBP-感染化脓隐秘杆菌)＝2.349-3.373；
OD450nm(IBP-先感染伪结核棒状杆菌再感染化脓隐秘杆菌)＝1.256-2.898；
或化脓隐秘杆菌免疫小鼠模型产生PLO的吸光度值：
OD450nm(PLO-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.212-2.789；
或化脓隐秘杆菌免疫小鼠模型产生IBP的吸光度值：
OD450nm(IBP-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.201-3.243；
或化脓隐秘杆菌免疫山羊模型产生PLO的吸光度值：
OD450nm(PLO-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.234-2.237；
或化脓隐秘杆菌免疫山羊模型产生IBP的吸光度值：
OD450nm(IBP-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.302-2.727。
具体地，在本发明中使用的未免疫小鼠也属于健康小鼠。
本发明中，PLO是化脓隐秘杆菌的主要毒力因子和宿主保护性抗原，编码基因plo在所有化脓隐秘杆菌分离株中都被检测到。PLO基因在感染动物体内也会表达，表达水平高的菌株毒力更强。尽管PLO是胆固醇依赖性细胞溶血素(Cholesterol-dependentcytolysins，CDC)的成员之一，多种革兰氏阳性细菌产生CDC，如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、猪链球菌(S.suis猪链球菌素)、化脓性链球菌(S.pyogenes)，肺泡拟杆菌(P.alvei)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，但PLO是CDC家族中差异最大的蛋白质，与CDC家族的其他毒素的同源性低于67％，是检测化脓隐秘杆菌感染常用的靶标。然而，我们采用ELISA方法，在伪结核棒状杆菌感染后1周再感染化脓隐秘杆菌的小鼠血清中没有检测到明显的PLO抗体水平，提示混合感染可能干扰PLO在宿主体内的表达或免疫应答。另外，在灭活化脓隐秘杆菌免疫的小鼠和山羊中也出现较大比例检测不出PLO抗体的现象。这些现象表明需要重新评估PLO作为诊断或检测靶标的科学性。
本发明中，铁是一种必需微量元素，参与细菌各种关键代谢途径，包括生物合成、DNA复制、转录、呼吸和氧化应激反应。病原菌拥有高效的铁摄取系统，以维持体内外生存和毒力，抵御宿主杀菌作用。革兰氏阳性细菌铁摄取系统主要有二价金属离子ABC转运体、铁ABC转运体、血红素ABC转运体等。在化脓隐秘杆菌感染小鼠、化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌混合感染小鼠血清中能检测到IBP抗体，表明铁ABC转运体在上述感染模型中能表达，并且产生特异抗体。
另外在某些具体实施例中，rIBP-ELISA与凝集实验在检测化脓隐秘杆菌感染小鼠、免疫小鼠和免疫山羊血清抗体的结果上一致，表明IBP可以作为检测化脓隐秘杆菌感染和免疫水平的检测靶标。
本发明目的在于还提供一种利用前述的系统筛分感染化脓杆菌模型或感染伪结核棒状杆菌模型的方法。
所述方法具体为：
(1)采用缓冲液稀释所述抗原包被液；
(2)稀释的抗原包被液加入所述酶标板孔中过夜；
(3)弃去包被液，加PBST洗涤；
(4)加明胶溶液封闭后，弃去封闭液，加PBST洗涤；
(5)所述感染病菌模型血清稀释，加入所述酶标板，所述加热器提供热量孵育；
(6)弃血清稀释液，加PBST洗涤；
(7)酶标抗体稀释，稀释后加TMB单组分显色液反应；
(8)反应后加终止液终止；
(9)使用所述酶标仪测吸光度后与所述数据库在所述对比输出模块对比后输出结果。
进一步，所述病菌感染模型血清或免疫模型血清进行1:100稀释。
进一步，所述酶标抗体为pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体稀释液。稀释比例优选为1:20000。
进一步，所述TMB单组分显色液反应8-12min。优选为10min。
进一步，所述PLO包被液或IBP包被液使用碳酸盐缓冲液稀释，使浓度为0.16±0.05μg/mL。
进一步，选择PLO包被液，酶标仪设置为450nm波长时的吸光度值OD450nm，所述数据对比输出模块具体执行为：
若OD450nm＞0.550时，则判定为化脓隐秘杆菌单独感染阳性模型；
若OD450nm≤0.470时，则判定为化脓隐秘杆菌单独感染阴性模型；
若0.470＜OD450nm≤0.550时，则判定为可疑。
具体地，选择PLO包被液适合于检测化脓隐秘杆菌单独感染。
选择IBP包被液，酶标仪设置为450nm波长时的吸光度值OD450nm，所述数据对比输出模块具体执行为：
若OD450nm＞1.230时，则判定为化脓隐秘杆菌感染阳性模型；
若OD450nm≤1.070时，则判定为化脓隐秘杆菌感染阴性模型；
若1.070＜OD450nm≤1.230时，则判定为可疑。
选择IBP包被液适合于检测混合感染。
具体地，采用单因素方差方法分析数据。计算细菌攻毒组中健康模型和未接种化脓隐秘杆菌模型血清rPLO-ELISA的平均值
Figure BDA0002815022060000061
和标准差(SD)，以样本的
Figure BDA0002815022060000071
时判为化脓隐秘杆菌感染阳性，以样本的
Figure BDA0002815022060000072
时判为化脓隐秘杆菌阴性，两者之间判为可疑。计算细菌攻毒组中单独接种伪结核棒状杆菌小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm的平均值
Figure BDA0002815022060000073
和标准差(SD)，以样本的
Figure BDA0002815022060000074
时判为混合感染中化脓隐秘杆菌感染阳性，以样本的
Figure BDA0002815022060000075
时判为化脓隐秘杆菌感染阴性，两者之间判为可疑。
在某些实施例中，经计算，细菌攻毒组中健康小鼠和未接种化脓隐秘杆菌小鼠血清rPLO-ELISA OD450nm的
Figure BDA00028150220600000710
和SD分别是0.309184211和0.080355495，
Figure BDA0002815022060000076
即当样本的rPLO-ELISA OD450nm>0.550时判定为化脓隐秘杆菌感染阳性，当样本的rPLO-ELISA OD450nm≤0.470时判定为化脓隐秘杆菌感染阴性，介于两者之间判为可疑。细菌攻毒组中单独接种伪结核棒状杆菌小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm的
Figure BDA0002815022060000077
和SD分别为0.7524375和0.158804689，
Figure BDA0002815022060000078
Figure BDA0002815022060000079
即当样本的rIBP-ELISA OD450nm>1.230时判定为化脓隐秘杆菌感染阳性，当样本的rIBP-ELISA OD450nm≤1.070时判定为化脓隐秘杆菌感染阴性，介于两者之间判为可疑。
优选地，所述PLO包被液或IBP包被液为rIBP包被液或rPLO包被液。
某些实施例中优化方案为：采用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释菌体抗原、rPLO和rIBP，将其分别加入96孔酶标板孔中，每孔100μL，菌体抗原包被浓度为5μg/mL，rPLO和rIBP包被浓度为0.16μg/mL；4℃包被过夜；弃去包被液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入200μL 2％明胶溶液，37℃封闭2h；弃去封闭液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，备用。
病菌模型血清分别进行1:100稀释，包被酶标板每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃去血清稀释液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入100μL酶标抗体稀释液，37℃孵育1h。弃去酶标抗体稀释液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入100μL TMB单组分显色液，室温反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液以终止反应，使用酶标仪测定波长450nm孔中吸光度(OD450nm)。
本发明目的在于还提供一种灭活化脓隐秘杆菌在制备免疫伪结核棒状杆菌感染药物中的应用。
本申请某些实施例表明灭活化脓隐秘杆菌免疫对伪结核棒状杆菌有交叉免疫保护作用。则在制备免疫伪结核棒状杆菌感染药物中会起到非常重要的作用。
本发明目的在于还提供一种IBP抗原在检测化脓隐秘杆菌免疫动物的IgG抗体中作为检测试剂的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的筛分系统及方法可以快速的筛分出感染病菌模型的病菌类型，操作简单方便。
本发明提供的筛分系统的数据库完善，而且数据库根据需要可导入或者删除，且筛分的结果比较准确。
附图说明
图1为筛分感染病菌模型的系统示意图。
图2为rPLO抗血清识别化脓隐秘杆菌PLO的免疫印迹图。
图3为接种部位化脓、皮肤坏死图。
图4A为重组蛋白纯化后的rPLO SDS-PAGE图。
图4B为重组蛋白纯化后的rIBP SDS-PAGE图。
图5A为rIBP抗血清检测的交叉反应分析免疫印迹图。
图5B为化脓隐秘杆菌抗血清检测的交叉反应分析免疫印迹图。
图5C为伪结核棒状杆菌抗血清检测的学交叉反应分析免疫印迹图。
图6A为ELISA检测化脓隐秘杆菌感染和免疫小鼠PLO抗体情况图。
图6B为ELISA检测化脓隐秘杆菌感染和免疫小鼠IBP抗体情况图。
其中，图2中，M为蛋白质相对分子质量标准；1为PLO；
图4A中，M为蛋白质相对分子质量标准；1为重组蛋白rPLO；
图4B中，M为蛋白质相对分子质量标准；1为重组蛋白rIBP；
图5A、图5B和图5C中，M为蛋白质相对分子质量标准；1为伪结核棒状杆菌；2为化脓隐秘杆菌；3为rIBP。
图6A中，PLO为包被rPLO抗原的ELISA(rPLO-ELISA)；
图6B中，IBP为包被rIBP抗原的ELISA(rIBP-ELISA)；
图6A和图6B中，1为健康小鼠血清；2为金黄色葡萄球菌接种小鼠血清；3为伪结核棒状杆菌接种小鼠血清；4为奇异变形钢筋接种小鼠血清；5为大肠杆菌接种小鼠血清；6为化脓隐秘杆菌接种小鼠血清；7为伪结核棒状杆菌接种1周后接种化脓隐秘杆菌小鼠血清；8为灭活化脓隐秘杆菌免疫小鼠血清。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，化脓隐秘杆菌(生物保藏号为CCTCC NO：M2014037，GenBank NO：CP012649)、金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌山羊分离株由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所分离、鉴定及提供；山羊临床血清及重组蛋白rPLO和rIBP均由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所提供。
本发明实施例中，TSB培养基购自BD公司；蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；酶标板购自Corning公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体购自Earthox公司；TMB单组分显色液购自索莱宝公司；明胶购自BioFroxx公司；Quick Start Bradford购自BioRad公司。
本发明实施例中，昆明小鼠为雌性SPF昆明小鼠，身体质量约为25g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司。
实施例1筛分系统
参照图1，筛分感染病菌模型的系统，包括酶标板、加热器、试剂、数据库、酶标仪、数据对比输出模块；
其中，酶标板包括聚苯乙烯/聚氯乙烯材料标板，包括96孔或48孔；
其中，试剂包括抗原包被液、酶标抗体、显色液、病菌感染模型血清或免疫模型血清；
其中，数据库为健康或感染或免疫的动物模型产生不同的抗体量的吸光度，可导入和可删除；
其中，所述酶标仪设置波长为450nm或410nm。
其中，显色液为TMB单组分显色液。
其中，抗原包被液包括PLO包被液，浓度为0.16±0.05μg/mL；IBP包被液，浓度为0.16±0.05μg/mL。
实施例2细菌培养及重组蛋白制备
(1)细菌培养
将化脓隐秘杆菌(生物保藏号为CCTCC NO：M2014037，GenBank NO：CP012649)会单菌落接种于含8％小牛血清的TSB培养基，37℃振摇培养48h；
将伪结核棒状杆菌单菌落接种于TSB培养基，37℃振摇培养24h；
将金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌单菌落分别接种于LB培养基，37℃振摇培养过夜。
(2)化脓隐秘杆菌PLO的鉴定
将实施例1中新鲜培养的化脓隐秘杆菌6 000r/min离心10min，保留上清。上清经0.22μm滤膜过滤后用分子截留为10,000ku膜块进行超滤浓缩。采用免疫印迹鉴定浓缩液中的PLO，具体操作为：浓缩液样品经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，采用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次后与rPLO小鼠抗血清(1:100)孵育，TBST洗3次后与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(1:2 000)孵育，最后置BCTP/NBT中显色。
免疫印迹显示，如图2所示，超滤浓缩的化脓隐秘杆菌培养物上清与rPLO小鼠抗血清反应显现1条带，条带大小约为54ku，与PLO的预期大小相符，表明培养的化脓隐秘杆菌分泌了PLO。
(3)细菌攻毒
将步骤(1)中新鲜培养的细菌培养物分别采用腹腔注射方式以亚致死剂量接种健康昆明小鼠，化脓隐秘杆菌、葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌接种小鼠数量均为15只，以制备小鼠感染血清。
在亚致死剂量化脓隐秘杆菌接种1周后再腹腔接种致死剂量的葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌，每种致死剂量细菌接种小鼠15只。对于再攻毒小鼠存活率大于50％的细菌，先进行该细菌的亚致死性小鼠腹腔接种，一周后再腹腔接种致死剂量或亚致死剂量的化脓隐秘杆菌。统计小鼠死亡率。于最后一次接种后的2周采集存活小鼠血液，分离血清。
存活结果：
腹腔接种亚致死剂量化脓隐秘杆菌、葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌的小鼠从接种后第5天开始陆续会在注射部位出现体表化脓病灶，如图3所示，小鼠不出现死亡。
在化脓隐秘杆菌接种1周后再接种致死剂量的葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌。65％小鼠能抵抗伪结核棒状杆菌而存活下来；
而接种金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌的小鼠存活率不高于10％。
腹腔接种亚致死剂量伪结核棒状杆菌后再接种致死剂量化脓隐秘杆菌，小鼠存活率不高于20％。
腹腔接种亚致死剂量伪结核棒状杆菌后再接种亚致死剂量化脓隐秘杆菌，小鼠存活率不低于90％。
(4)重组蛋白的制备
表达PLO(37-281位氨基酸残基)(pET-28a-PLO)和IBP(pGEX-4T-1-IBP)[PLO和IBP编码基因来源于生物保藏号为CCTCC NO：M2014037，GenBank NO：CP012649)]的重组菌株BL21(DE3)分别接种至LB培养基中，37℃下180r/min振摇培养至菌体浓度达OD600nm约为0.6时，加入终浓度0.1mmol/L IPTG，37℃下诱导表达3h，收集菌体。冰水浴中超声裂解菌体(超声功率为300W，工作4s间歇5s，超声裂解15min)。采用Ni-NTA或Gluthathione-Sepharose4B亲和层析从裂解菌体中纯化rPLO或rIBP，经0.22μm滤器过滤后采用Quick StartBradford测定蛋白质浓度。
含重组质粒的重组菌经IPTG诱导后，利用Ni-NTA从含pET-28a-PLO的重组菌中纯化得到rPLO(如图4A所示)，利用Gluthathione-Sepharose 4B从含pGEX-4T-1-IBP的重组菌中纯化得到rIBP(如图4B所示)。
(5)动物免疫
向实施例2步骤(1)中新鲜培养的化脓隐秘杆菌培养液中加入0.2％甲醛溶液，37℃灭活24h，每6h振摇1次。无菌检验合格的灭活细菌培养液加入弗氏佐剂或铝胶佐剂制备成化脓隐秘杆菌灭活疫苗。将rBIP与弗氏佐剂乳化制备成rBIP抗原。将化脓隐秘杆菌灭活疫苗采用肌肉注射方式免疫动物，每只小鼠0.2mL，每只山羊1mL。小鼠免疫15只，山羊免疫10只。将rBIP抗原采用肌肉注射方式免疫小鼠5只。以上小鼠和山羊各进行3次免疫，每间隔2周免疫1次。第3次免疫后2周采集血液，分离血清。血清于-20℃保存。
实施例3测试分析
(1)交叉免疫保护测试
用铝胶佐剂制成的化脓隐秘杆菌灭活疫苗按实施例2中步骤(4)的方法免疫小鼠，共免疫45只。第3次免疫2周后，对免疫小鼠进行腹腔接种致死剂量伪结核棒状杆菌，同时对15只未免疫的健康小鼠进行腹腔接种致死剂量伪结核棒状杆菌。统计小鼠死亡率。
第3次免疫化脓隐秘杆菌灭活疫苗2周后，腹腔接种致死剂量伪结核棒状杆菌，免疫小鼠的存活率为53.3％(24/45)，未免疫小鼠存活1只。这表明灭活化脓隐秘杆菌免疫对伪结核棒状杆菌有交叉免疫保护作用。
(2)凝集实验
为了验证化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌的血清学交叉反应，利用凝集实验测试了化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌抗血清及伪结核棒状杆菌与化脓隐秘杆菌抗血清、rIBP抗血清的交叉反应性。用含0.2％Procline300的PBS对新鲜培养的化脓隐秘杆菌和伪结核棒状杆菌进行1:4稀释，对血清进行倍比稀释。微量板每孔加入稀释的菌悬液50μL，同时加入倍比稀释的血清50μL，每种抗血清每个浓度梯度做3个重复，设一个血清空白对照，以PBS补足体积。微量板置37℃孵育12h。观察凝集结果。以抗血清和细菌完全不出现凝集状态的上一个血清稀释度作为两者的凝集效价。
菌体与抗血清37℃孵育12h后，可见化脓隐秘杆菌或伪结核棒状杆菌除了能与自身1:256稀释的抗血清呈现完全凝集外，还能与伪结核棒状杆菌抗血清(凝集效价1:64)或化脓隐秘杆菌抗血清(凝集效价1:128)发生凝集，表明化脓隐秘杆菌和伪结核棒状杆菌的抗血清与这两种细菌具有交叉反应性(如表1所示)。rIBP抗血清除了与化脓隐秘杆菌(凝集效价1:64)发生凝集，还与伪结核棒状杆菌(凝集效价1:16)发生凝集，表明rIBP抗血清与伪结核棒状杆菌具有交叉反应性。
表1细菌与抗血清的凝集实验
Figure BDA0002815022060000131
Figure BDA0002815022060000141
(3)免疫印迹
采用免疫印迹验证蛋白质抗原是否参与交叉反应。取实施例2步骤(1)中新鲜培养的化脓隐秘杆菌和伪结核棒状杆菌各1mL，12 000r/min离心1min，保留菌体。菌体、rIBP加入SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，样本经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，采用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次后与化脓隐秘杆菌小鼠抗血清、rIBP小鼠抗血清或伪结核棒状杆菌小鼠抗血清(1:100)孵育，TBST洗3次后与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(1:2 000)孵育，最后置BCTP/NBT中显色。
化脓隐秘杆菌抗血清和rIBP抗血清除了与自身抗原反应显现条带外，还与伪结核棒状杆菌有一定的交叉反应(如图5A和5B所示)。伪结核棒状杆菌抗血清除了与自身抗原反应外，还与化脓隐秘杆菌和rIBP反应(如图5C所示)，表明化脓隐秘杆菌和伪结核棒状杆菌蛋白质抗原有血清学交叉反应，IBP是其中1种交叉反应抗原。
实施例4分析数据库建立
(1)抗原包被酶标板的制备
将实施例2步骤(4)中制备的rPLO和rIBP分别包被酶标板，包被rPLO的酶标板称为rPLO-ELISA，包被rIBP的酶标板称为rIBP-ELISA。具体方法为：采用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原rPLO和rIBP至0.16μg/mL，将抗原稀释液加入96孔酶标板孔中，每孔100μL；4℃包被过夜；弃去包被液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入200μL2％明胶溶液，37℃封闭2h；弃去封闭液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，备用。
(2)检测
将实施例2步骤(3)和实施例2步骤(5)中的血清分别进行1:100稀释，包被酶标板每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃去血清稀释液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入100μL1:20 000pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体或辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体稀释液，37℃孵育1h。弃去酶标抗体稀释液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入100μL TMB单组分显色液，室温反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液以终止反应，使用酶标仪测定波长450nm孔中吸光度(OD450nm)。
采用单因素方差方法分析数据。计算细菌攻毒组中健康小鼠和未接种化脓隐秘杆菌小鼠血清rPLO-ELISA的平均值
Figure BDA0002815022060000151
和标准差(SD)，以样本的
Figure BDA0002815022060000152
时判为化脓隐秘杆菌感染阳性，以样本的
Figure BDA0002815022060000153
时判为化脓隐秘杆菌阴性，两者之间判为可疑。因为IBP与伪结核棒状杆菌有血清学交叉反应，为了去除交叉反应影响，计算细菌攻毒组中单独接种伪结核棒状杆菌小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm的平均值
Figure BDA0002815022060000154
和标准差(SD)，以样本的
Figure BDA0002815022060000155
时判为混合感染中化脓隐秘杆菌感染阳性，以样本的
Figure BDA0002815022060000156
时判为化脓隐秘杆菌感染阴性，两者之间判为可疑。为了去除IBP与伪结核棒状杆菌的血清学交叉反应，在待检血清中加入伪结核棒状杆菌吸附交叉反应抗体，再使用rIBP-ELISA测试化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌混合感染小鼠血清抗体，以验证血清中确实存在针对化脓隐秘杆菌IBP的IgG抗体。
(a)化脓隐秘杆菌接种小鼠血清抗体检测
结合图6A和图6B，亚致死剂量细菌腹腔接种后2周，与健康小鼠血清相比，化脓隐秘杆菌接种小鼠血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISA OD450nm均差异极显著，表明化脓隐秘杆菌接种小鼠产生了针对PLO和IBP的高水平抗体，具体数据如下表2。
表2用分别包被rPLO、rIBP抗原的ELISA检测化脓隐秘杆菌接种小鼠和健康小鼠血清的吸光度情况
Figure BDA0002815022060000161
(b)交叉反应
在葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌接种小鼠血清中，只有伪结核棒状杆菌接种小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm高于健康小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm，但低于化脓隐秘杆菌接种小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm，
经单因素方差分析得出，伪结核棒状杆菌接种小鼠与健康小鼠和化脓隐秘杆菌接种小鼠接种血清rIBP-ELISA OD450nm差异显著，表明rIBP与伪结核棒状杆菌小鼠血清有一定程度的交叉反应，具体数据如下表3。
经计算，细菌攻毒组中健康小鼠和未接种化脓隐秘杆菌小鼠血清rPLO-ELISAOD450nm的
Figure BDA0002815022060000162
和SD分别是0.309184211和0.080355495，
Figure BDA0002815022060000163
即当样本的rPLO-ELISA OD450nm>0.550时判定为化脓隐秘杆菌感染阳性，当样本的rPLO-ELISA OD450nm≤0.470时判定为化脓隐秘杆菌感染阴性，介于两者之间判为可疑。细菌攻毒组中单独接种伪结核棒状杆菌小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm的
Figure BDA0002815022060000171
和SD分别为0.7524375和0.158804689，
Figure BDA0002815022060000172
Figure BDA0002815022060000173
即当样本的rIBP-ELISA OD450nm>1.230时判定为化脓隐秘杆菌感染阳性，当样本的rIBP-ELISA OD450nm≤1.070时判定为化脓隐秘杆菌感染阴性，介于两者之间判为可疑。
表3用包被rIBP抗原的ELISA检测葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌、化脓隐秘杆菌、大肠杆菌接种小鼠血清吸光度情况
Figure BDA0002815022060000174
攻毒小鼠和健康小鼠血清rPLO-ELISAOD450nm差异菌不显著，表明rPLO与葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌小鼠血清没有交叉反应，具体数据如表4。
表4用包被rPLO抗原的ELISA检测葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌、化脓隐秘杆菌接种小鼠血清吸光度情况
Figure BDA0002815022060000181
(c)混合感染
为了去除IBP与伪结核棒状杆菌的血清学交叉反应，在待检血清中加入伪结核棒状杆菌吸附交叉反应抗体，再使用rIBP-ELISA测试化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌混合感染小鼠血清抗体。亚致死剂量化脓隐秘杆菌接种1周后再接种致死剂量的葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌，存活小鼠血清rPLO-ELISAOD450nm和rIBP-ELISA OD450nm与健康小鼠血清rPLO-ELISAOD450nm和rIBP-ELISA OD450nm差异极显著，与单独接种化脓隐秘杆菌小鼠血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISA OD450nm差异不显著，表明先感染化脓隐秘杆菌1周后再感染葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、奇异变形杆菌不影响PLO和IBP抗体水平。
接种亚致死剂量伪结核棒状杆菌1周后再接种致死剂量或亚致死剂量化脓隐秘杆菌，接种小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm与健康小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm、伪结核棒状杆菌接种小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm差异极显著，与单独接种化脓隐秘杆菌小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm差异不显著，具体数据如下表5。
表5用包被rIBP抗原的ELISA检测伪结核棒状杆菌1周后再接种致死剂量或亚致死剂量化脓隐秘杆菌接种和其他单独接种小鼠血清吸光度情况
Figure BDA0002815022060000191
而接种小鼠血清rPLO-ELISA OD450nm与健康小鼠血清rPLO-ELISA OD450nm差异不显著，表明小鼠先感染伪结核棒状杆菌1周后再化脓隐秘杆菌不产生针对PLO的抗体，具体数据如下表6。
表6用包被rPLO的ELISA检测伪结核棒状杆菌1周后再接种致死剂量或亚致死剂量化脓隐秘杆菌接种和其他单独接种小鼠血清吸光度情况
Figure BDA0002815022060000192
Figure BDA0002815022060000201
为了去除IBP与伪结核棒状杆菌的血清学交叉反应，在待检血清中加入伪结核棒状杆菌吸附交叉反应抗体，再使用rIBP-ELISA测试化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌混合感染小鼠血清抗体，结果显示接种亚致死剂量伪结核棒状杆菌1周后再接种化脓隐秘杆菌小鼠血清rIBP-ELISA OD450nm与健康血清rIBP-ELISA OD450nm差异极显著。同时使用凝集实验验证了伪结核棒状杆菌吸附后血清的凝集效价，接种亚致死剂量伪结核棒状杆菌1周后再接种化脓隐秘杆菌小鼠血清有与化脓隐秘杆菌的凝集效价为1:128，大于化脓隐秘杆菌与伪结核棒状杆菌抗血清凝集效价(1:64)。
这表明接种亚致死剂量伪结核棒状杆菌1周后再接种化脓隐秘杆菌，在小鼠血清中检测到的IBP抗体不是因rIBP与伪结核棒状杆菌小鼠血清有交叉反应造成的，而是真实存在的。结果同时表明在混合感染中IBP更适合作为判定化脓隐秘杆菌感染是否成功的检测靶标，以样本的rIBP-ELISA OD450nm>1.230作为判定化脓隐秘杆菌感染阳性是可行的。
(d)化脓隐秘杆菌免疫动物血清检测
采用肌肉注射方式，用弗氏佐剂或铝胶佐剂制成的灭活化脓隐秘杆菌抗原对健康小鼠和山羊进行3次免疫，最后1次免疫后2周采集血液，分离血清。
经检测和统计分析，结合图6A和图6B，29％小鼠血清rPLO-ELISA OD450nm与未免疫小鼠血清读值无显著差异，6％rIBP-ELISA OD450nm与未免疫小鼠血清读值无显著差异。如下表7所示。
表7 ELISA检测化脓隐秘杆菌免疫小鼠和未免疫小鼠的血清吸光度情况
Figure BDA0002815022060000211
Figure BDA0002815022060000221
30％山羊血清rPLO-ELISA OD450nm与未免疫山羊血清读值无显著差异，10％山羊血清rIBP-ELISA OD450nm与未免疫山羊血清读值无显著差异。如下表8所示。这些不存在明显IBP IgG抗体的血清在凝集实验中也仅有低水平的凝集效价，凝集效价低于1:32。
表8 ELISA检测化脓隐秘杆菌免疫山羊和未免疫山羊的血清吸光度情况
Figure BDA0002815022060000222
表7表8数据表明弗氏佐剂或铝胶佐剂灭活化脓隐秘杆菌抗原不能使所有免疫动物产生化脓隐秘杆菌菌体蛋白的IgG抗体，但免疫动物针对IBP的IgG抗体检出率高于PLO的IgG抗体检出率。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.筛分感染化脓隐秘杆菌或感染伪结核棒状杆菌模型的系统，其特征在于，所述系统包括酶标板、加热器、试剂、数据库、酶标仪、数据对比输出模块；
所述酶标板包括聚苯乙烯/聚氯乙烯材料标板，包括96孔或48孔；
所述试剂包括PLO包被液或IBP包被液、酶标抗体、显色液、病菌感染模型或免疫模型血清；
数据库为健康或感染或免疫的动物模型产生不同的抗体量的吸光度，可导入或可删除；
所述酶标仪设置波长为450nm。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述PLO包被液或IBP包被液浓度为0.16±0.05μg/mL。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述病菌感染模型血清或免疫模型血清为1:100血清稀释液。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述数据库包括：
酶标仪设置波长450nm时的吸光度值OD450nm，
健康或感染小鼠模型产生PLO的吸光度值：
OD450nm(PLO-健康)＝0.195-0.301；
OD450nm(PLO-感染葡萄球菌)＝0.238-0.346；
OD450nm(PLO-感染伪结核棒状杆菌)＝0.249-0.597；
OD450nm(PLO-感染奇异变形杆菌)＝0.252-0.522，
OD450nm(PLO-感染化脓隐秘杆菌)＝2.204-3.162；
OD450nm(PLO-先感染伪结核棒状杆菌再感染化脓隐秘杆菌)＝0.226-0.358；
或健康或感染小鼠模型产生IBP的吸光度值：
OD450nm(IBP-健康)＝0.234-0.324；
OD450nm(IBP-感染葡萄球菌)＝0.239-0.360；
OD450nm(IBP-感染伪结核棒状杆菌)＝0.539-1.159；
OD450nm(IBP-感染奇异变形杆菌)＝0.197-0.482；
OD450nm(IBP-感染化脓隐秘杆菌)＝2.349-3.373；
OD450nm(IBP-先感染伪结核棒状杆菌再感染化脓隐秘杆菌)＝1.256-2.898；
或化脓隐秘杆菌免疫小鼠模型产生PLO的吸光度值：
OD450nm(PLO-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.212-2.789；
或化脓隐秘杆菌免疫小鼠模型产生IBP的吸光度值：
OD450nm(IBP-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.201-3.243；
或化脓隐秘杆菌免疫山羊模型产生PLO的吸光度值：
OD450nm(PLO-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.234-2.237；
或化脓隐秘杆菌免疫山羊模型产生IBP的吸光度值：
OD450nm(IBP-化脓隐秘杆菌免疫)＝0.302-2.727。
5.利用权利要求4所述的系统筛分感染化脓隐秘杆菌或感染伪结核棒状杆菌模型的方法，其特征在于，将所述病菌感染模型血清或免疫模型血清进行1:100稀释。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PLO包被液或IBP包被液使用碳酸盐缓冲液稀释，使浓度为0.16±0.05μg/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，选择PLO包被液，酶标仪设置为450nm波长时的吸光度值OD450nm，所述数据对比输出模块具体执行为：
若OD450nm＞0.550时，则判定为化脓隐秘杆菌单独感染阳性模型；
若OD450nm≤0.470时，则判定为化脓隐秘杆菌单独感染阴性模型；
若0.470＜OD450nm≤0.550时，则判定为可疑。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，选择IBP包被液，酶标仪设置为450nm波长时的吸光度值OD450nm，所述数据对比输出模块具体执行为：
若OD450nm＞1.230时，则判定为化脓隐秘杆菌感染阳性模型；
若OD450nm≤1.070时，则判定为化脓隐秘杆菌感染阴性模型；
若1.070＜OD450nm≤1.230时，则判定为可疑。
9.灭活化脓隐秘杆菌在制备免疫预防伪结核棒状杆菌感染药物中的应用。
10.IBP抗原在检测化脓隐秘杆菌免疫动物的IgG抗体中作为检测试剂的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113354719A (zh) * 2021-05-11 2021-09-07 重庆市畜牧科学院 奇异变形杆菌抗原鉴定及其在检测变形杆菌感染中应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070282071A1 (en) * 2002-10-01 2007-12-06 Donna Jean Crowther Enhanced ESCR of HDPE resins
CN101581726A (zh) * 2009-03-26 2009-11-18 张晓艳 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒
CN101799470A (zh) * 2009-03-26 2010-08-11 张晓艳 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒
CN101970005A (zh) * 2008-02-08 2011-02-09 斯克利普斯研究院 用遗传编码的非天然氨基酸打破免疫耐受
CN104073450A (zh) * 2014-02-28 2014-10-01 重庆市畜牧科学院 山羊源化脓隐秘杆菌及其应用
CN105198987A (zh) * 2015-09-24 2015-12-30 东北农业大学 一种抗化脓隐秘杆菌plo蛋白单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用
US20190038737A1 (en) * 2013-09-19 2019-02-07 Zoetis Services Llc Oil-based adjuvants
CN109414463A (zh) * 2016-02-25 2019-03-01 托马斯·朱利叶斯·波洛迪 治疗慢性传染性疾病的组合物和方法
CN109781995A (zh) * 2019-01-09 2019-05-21 吉林特研生物技术有限责任公司 一种绿脓杆菌抗体elisa快速检测试剂盒及检测方法
CN110642927A (zh) * 2019-10-16 2020-01-03 重庆市畜牧科学院 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用
CN110967482A (zh) * 2018-09-30 2020-04-07 重庆市畜牧科学院 一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070282071A1 (en) * 2002-10-01 2007-12-06 Donna Jean Crowther Enhanced ESCR of HDPE resins
CN101970005A (zh) * 2008-02-08 2011-02-09 斯克利普斯研究院 用遗传编码的非天然氨基酸打破免疫耐受
CN101581726A (zh) * 2009-03-26 2009-11-18 张晓艳 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒
CN101799470A (zh) * 2009-03-26 2010-08-11 张晓艳 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒
US20190038737A1 (en) * 2013-09-19 2019-02-07 Zoetis Services Llc Oil-based adjuvants
CN104073450A (zh) * 2014-02-28 2014-10-01 重庆市畜牧科学院 山羊源化脓隐秘杆菌及其应用
CN105198987A (zh) * 2015-09-24 2015-12-30 东北农业大学 一种抗化脓隐秘杆菌plo蛋白单克隆抗体及其识别的抗原表位和应用
CN109414463A (zh) * 2016-02-25 2019-03-01 托马斯·朱利叶斯·波洛迪 治疗慢性传染性疾病的组合物和方法
CN110967482A (zh) * 2018-09-30 2020-04-07 重庆市畜牧科学院 一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测试剂盒及其检测方法
CN109781995A (zh) * 2019-01-09 2019-05-21 吉林特研生物技术有限责任公司 一种绿脓杆菌抗体elisa快速检测试剂盒及检测方法
CN110642927A (zh) * 2019-10-16 2020-01-03 重庆市畜牧科学院 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIAN L.M HODGSON 等: "Efficacy of an ovine caseous lymphadenitis vaccine formulated using a genetically inactive form of the Corynebacterium pseudotuberculosis phospholipase D", VACCINE, vol. 17, no. 7, pages 802 - 808, XP004154818, DOI: 10.1016/S0264-410X(98)00264-3 *
XU GUOYANG 等: "Isolation and identification of pathogenic bacteria of lymphadenitis in goat and establishment of multiplex PCR detection method", ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, vol. 48, no. 2, pages 324 - 330 *
刘威;何深宏;任绍科;李小燕;杨雪芬;程方俊;周作勇;曹立亭;: "化脓隐秘杆菌间接免疫荧光方法的建立及应用", 湖南农业大学学报(自然科学版), no. 02, pages 230 - 235 *
张斯旂 等: "山羊皮下脓肿的病原分离与鉴定", 中国畜牧兽医, vol. 46, no. 03, pages 949 - 956 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113354719A (zh) * 2021-05-11 2021-09-07 重庆市畜牧科学院 奇异变形杆菌抗原鉴定及其在检测变形杆菌感染中应用

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