CN108251379B - 一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和灵敏度高、特异性好的创伤弧菌检测试剂盒，属于创伤弧菌免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。所述创伤弧菌检测试剂盒包括以下组分：酶标板、创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。本发明提供的创伤弧菌检测试剂盒能够特异性检测创伤弧菌，灵敏度高，对创伤弧菌膜蛋白样品的最低检测限为78ng。

Description

一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌 检测试剂盒
技术领域
本发明属于创伤弧菌疾病特异性检测技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒。
背景技术
创伤弧菌是公认的人鱼共患病的条件致病菌，对近海和河口环境的鳗鱼、黄姑鱼、牡蛎、大菱鲆、石斑鱼等水产名贵经济动物以及养殖从业人员危害大，该菌分为生物I型、生物II型、生物III型3个生物型，一般感染创伤弧菌生物I型的病人致死率高达60％以上；创伤弧菌生物II型主要感染鳗鲡等咸淡水养殖品种，导致感染鱼大量死亡，造成严重经济损失。因此，创伤弧菌疾病的诊断与预防尤为重要和关键，目前创伤弧菌病还缺乏快速、准确的诊断方法和免疫监测手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和灵敏度高、特异性好的创伤弧菌检测试剂盒，所述试剂盒可应用于创伤弧菌病疫苗免疫效果评价、免疫应答水平监测，以及水产动物创伤弧菌病的快速诊断。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。
本发明还提供了一种创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明还提供了一种创伤弧菌检测试剂盒，包括以下组分：酶标板、创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。
优选的，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体腹水效价大于1：128000。
优选的，所述抗体稀释液为质量浓度0.8～1.2％的BSA-PBST溶液。
优选的，所述抗体稀释液的pH值为7.1～7.3。
优选的，所述封闭液为质量浓度1.6～2.4％的BSA-PBST溶液。
优选的，所述的洗涤液为PBST溶液；所述洗涤液的pH值为7.0～7.4。
优选的，所述显色液包括底物显色A液和底物显色B液；所述底物显色 A液包括26～28g/L的醋酸钠，3.0～3.5g/L的柠檬酸，0.5～0.7ml/L30wt％的双氧水；所述底物显色B液包括0.35～0.45g/L的乙二胺四乙酸二钠，1.8～2.0g/L的柠檬酸，90～110ml/L的甘油，0.28～0.32g/L的四甲基联苯胺；在使用所述显色液前将等体积的底物显色A液和底物显色B液混匀。
优选的，所述终止液为质量浓度0.10～0.11％的硫酸溶液。
本发明的有益效果：本发明提供的杂交瘤细胞株能够分泌产生创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的效价高，腹水效价大于1：128000；采用该单克隆抗体，酶标板、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品组成一种创伤弧菌检测试剂盒，该试剂盒能够特异性检测创伤弧菌，灵敏度高，对创伤弧菌膜蛋白样品的最低检测限为78ng。
附图说明
图1为实施例1中创伤弧菌膜蛋白的分离纯化SDS-PAGE电泳图；
图2为实施例3中不同稀释度的创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体的特异性检测检测结果图；
图3为实施例4中创伤弧菌检测试剂盒对常见的不同水产细菌菌株的检测结果图。
生物保藏说明
本发明所述的杂交瘤细胞株VvmAb1m1n7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心；保藏编号为CCTCC NO:C2016146，保藏时间为2016年12月22 日。
具体实施方式
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016146。所述杂交瘤细胞的保藏时间为2016年12月22日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。
本发明中所述杂交瘤细胞株能够分泌生产针对创伤弧菌膜蛋白IgG的单克隆抗体；所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的腹水效价大于1：128000。
本发明中所述杂交瘤细胞株的制备方法具体的包括以下步骤：1)制备获得创伤弧菌膜蛋白；2)用所述的创伤弧菌膜蛋白免疫小鼠，获得免疫后小鼠； 3)当所述免疫后小鼠的血清效价大于1.0×10-4后，取免疫后小鼠的脾细胞进行细胞融合，筛选获得阳性细胞；4)将所述阳性细胞进行单细胞克隆化获得杂交瘤细胞株。
在本发明中，所述的创伤弧菌膜蛋白来源于创伤弧菌，在本发明中优选的将创伤弧菌进行扩增获得大量创伤弧菌，然后从获得的大量创伤弧菌中分离膜蛋白。在本发明具体实施过程中，所述创伤弧菌可以为市售的创伤弧菌，也可以是从携带创伤弧菌的水产动物的组织中分离获得的，所述分离方法采用本领域常规的细菌分离方法即可，无其他特殊要求；所述创伤弧菌优选的在扩增前进行复苏，本发明对所述复苏的方法没有特殊限定，采用本领域常规的菌种复苏方法即可；所述复苏优选的采用灭菌TSA平板培养复苏创伤弧菌。
本发明中所述的创伤弧菌的扩增优选的采用液体培养基培养扩增所述创伤弧菌，所述液体培养基优选的为TSB培养液；所述扩增的温度优选的为 26～30℃，更优选的为28℃。
本发明在扩增获得大量创伤弧菌后，收集创伤弧菌菌体；本发明中所述收集创伤弧菌菌体的方法优选为离心；所述离心的转速优选为5500～6500rpm，更优选为6000rpm，所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min，本发明在离心后收集固相组分即为创伤弧菌菌体。
本发明在获得创伤弧菌菌体后，用Tris-HCl溶液将获得的创伤弧菌菌体重悬置于4℃备用；所述Tris-HCl溶液的浓度优选的为10mM；所述Tris-HCl 溶液的pH值优选的为7.4。
本发明中所述膜蛋白分离的方法优选的为Triton X-114法，具体方法步骤参考《大肠杆菌外膜蛋白的分离及其双向电泳图谱的建立》，现代生物医学进展2009，9(2)201-205。本发明获得创伤弧菌膜蛋白后，优选的对其进行 SDS-PAGE电泳分析，在36KD附近出现条带，说明所述创伤弧菌膜蛋白的分子量在36KD左右。
本发明在获得创伤弧菌膜蛋白后，用所述的创伤弧菌膜蛋白免疫小鼠获得免疫后小鼠。在本发明中所述小鼠优选的为雌性小鼠；更优选的为8～12周龄的Balb/c雌性小鼠；本发明中，所述小鼠优选的购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。在本发明中所述免疫小鼠的创伤弧菌膜蛋白的用量为优选的为65～75μg/只，更优选的为70μg/只；本发明中所述免疫的方法优选的为内静脉注射免疫小鼠，每间隔10天免疫一次。本发明优选的在4次免疫后对小鼠摘眼球取血，用ELISA法检测抗血清效价。
本发明在所述免疫后小鼠的血清效价大于1.0×10-4后，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选获得阳性细胞。在本发明中所述细胞融合采用本领域常规的方法，无其他特殊要求。
本发明在所述细胞融合后，用优选的方法对融合后的细胞进行筛选；在本发明中所述筛选方法优选的为ELISA方法和亲和力排序。能够在HAT培养液正常生长繁殖且ELSIA检测为阳性(P/N≥2.1)的细胞即为阳性融合细胞。
本发明在获得阳性细胞后，将所述阳性细胞进行单细胞克隆化获得单克隆阳性杂交瘤细胞株。在本发明中所述单细胞克隆化即为从筛选到的阳性细胞分离单细胞，然后对分离获得的单细胞进行培养，从中再次分离能够分泌创伤弧菌单克隆抗体的单细胞。在本发明中，所述培养的条件优选的为 36～38℃，在体积分数为5％CO2的环境中湿润培养10～14d。本发明中所述分离方法优选的为有限稀释法。本发明在所述单细胞克隆化后，获得能够稳定分泌创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供了一种创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明中所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的腹水效价大于1：128000。
本发明还提供了一种创伤弧菌检测试剂盒，包括以下组分：酶标板、创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。
在本发明中，所述试剂盒包括创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体即为上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体；所述所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的腹水效价大于1：128000。
在本发明中，所述试剂盒包括HRP酶标记鼠抗，所述HRP酶标记鼠抗优选的采用市售的HRP酶标记的羊抗鼠多克隆抗体；所述HRP酶标记的羊抗鼠多克隆抗体在使用前用抗体稀释液稀释；所述稀释的倍数优选的为5000。
在本发明中，所述试剂盒包括抗体稀释液，所述抗体稀释液优选的为质量浓度0.8～1.2％的BSA-PBST溶液，更优选的为1％的BSA-PBST溶液。在本发明具体实施过程中，所述抗体稀释液的制备方法优选的为：将磷酸缓冲液PBS与吐温-20混合后获得PBST溶液，然后将牛血清白蛋白溶解于所述 PBST溶液获得抗体稀释液。本发明中所述抗体稀释液的pH值优选的为 7.1～7.3，更优选的为7.2。本发明中所述抗体稀释液的作用为稀释创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体和HRP酶标记鼠抗至最佳反应浓度。
在本发明中，所述试剂盒包括封闭液，本发明中所述封闭液的作用为封闭反应未结合位点。所述优选的封闭液为质量浓度1.6～2.4％的BSA-PBST溶液，更优选的为质量浓度2.0％的BSA-PBST溶液。在本发明中所述封闭液的制备方法与抗体稀释液的制备方法一致，在此不再赘述。
本发明中所述试剂盒还包括洗涤液，所述的洗涤液为PBST溶液；所述洗涤液的pH值优选的为7.0～7.4，更优选的为7.2。
在本发明中，所述试剂盒包括显色液，所述显色液包括底物显色A液和底物显色B液；所述底物显色A液优选的包括26～28g/L的醋酸钠，3.0～3.5g/L 的柠檬酸，0.5～0.7ml/L浓度为30wt％的双氧水；更优选的包括27.2g/L的醋酸钠，3.2g/L的柠檬酸，0.6ml/L浓度为30wt％的双氧水；
所述底物显色B液优选的包括0.35～0.45g/L的乙二胺四乙酸二钠， 1.8～2.0g/L的柠檬酸，90～110ml/L的甘油，0.28～0.32g/L的四甲基联苯胺；更优选的包括0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠，1.9g/L的柠檬酸，100l/L的甘油， 0.3g/L的四甲基联苯胺；在本发明中，所述四甲基联苯胺优选的先溶解于 DMSO中，所述四甲基联苯胺与DMSO的质量体积比为1:2(g/ml)。本发明在使用所述显色液前将等体积的底物显色A液和底物显色B液混匀。
在本发明中，所述试剂盒包括终止液，所述终止液为质量浓度0.10～0.11％的硫酸溶液。本发明中所述终止液的作用为终止反应。
本发明所述试剂盒还包括阳性对照品，所述阳性对照品为创伤弧菌膜蛋白，所述阳性对照品种创伤弧菌膜蛋白的浓度优选的为80～120μg/mL，更优选的为100μg/mL。
在本发明中所述试剂盒还包括空白对照品，所述空白对照品为生理盐水，所述生理盐水的质量浓度优选的0.8～0.9％，更优选的为0.85％。
本发明中，所述创伤弧菌检测试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：
(1)加样：将待测样本用磷酸缓冲液PBS(pH7.2)稀释至细菌OD595 值为0.5-1.0后，加入96孔酶标板反应孔中，每孔50uL；将阳性对照样品和空白对照各加入1孔，每孔50uL；37℃孵育1h；
(2)封闭：用BSA-PBS封闭液，每孔加入100uL，37℃孵育1h；
(3)洗涤：洗涤液洗涤，每孔加入150uL，每次2min，洗3次；
(4)加一抗：用BSA-PBS抗体稀释液把创伤弧菌膜蛋白IgG单抗稀释 4000倍，每个反应孔加入50uL，37℃孵育1h；
(5)洗涤：洗涤液洗涤，每孔加入150uL，每次2min，洗3次；
(6)加HRP酶标抗体：用抗体稀释液把羊抗鼠-HRP抗体稀释5000倍，每个反应孔加入50uL，37℃孵育1h；
(7)洗涤：洗涤液洗涤，每孔加入150uL，每次2min，洗2次；第3次用纯水洗涤2min；
(8)加显色液：每个反应孔加入显色液50uL，室温下反应5～10min；
(9)加终止液：每反应孔加入终止液30uL，室温下反应1min；
(10)测OD450值：于酶标仪中测定吸光度OD450值；
(11)结果判断：阳性对照结果/阴性对照结果≥2.1时，计算待检样品与阴性对照光吸收值之比(P/N)，当P/N≥2.1时判为阳性结果，当P/N<2.1时判为阴性结果。
本发明中所述待检样品为菌液或疑似携带有创伤弧菌的水产动物组织。
下面结合实施例对本发明提供的一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
保藏号为CCTCCNO:C2016146的创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体细胞株VvmAb1m1n7的制备
1.创伤弧菌膜蛋白的制备与纯化
通过灭菌TSA平板复苏、克隆创伤弧菌，挑取单菌落至灭菌TSB培养液 28℃扩增创伤弧菌，6000rpm离心15min弃上清留沉淀，用Tris-HCl(10mM，pH7.4)重悬置4℃备用；
用改良Triton X-114法提取纯化膜蛋白，分离获得较纯的创伤弧菌膜蛋白；具体步骤如下：(1)创伤弧菌菌株培养14～18个小时后，6000rpm离心 15min，用Tris-HCl(10mM，pH7.4)洗涤2遍。(2)用按菌体质量1:5～1： 10(w/v)加入膜蛋白提取缓冲液A(10mMpH7.4Tris-HCl，150mM NaCl， 2％[v/v]Triton X-114，0.3mg/mL EDTA，35μg/mL PMSF[现用现加])，超声破碎完全。(3)冰浴30min-60min后，于4℃14000rmp离心20min。(4)取上清，置于37℃水浴5min，待溶液分为两层。(5)37℃水平转头4800rpm 离心8min，弃上清。(6)加入3倍体积的冰无菌水，加入EDTA和PMSF至分别终浓度0.3mg/mL，35μg/mL，冰浴10min，溶液变清亮。(7)37℃水浴至溶液分层，37℃水平转头4800rpm离心8min，弃上清。(8)重复6、7 操作2次。(9)将下层用冰丙酮按1：9(即待处理液1：冰丙酮9)沉淀40min。 (10)冰上吹干，7M尿素溶解待测。(11)测定蛋白含量和纯度。
SDS-PAGE电泳分析创伤弧菌膜蛋白，可见36kD条带，如附图1，其中1为 Mark加样5ul/孔；2为标准蛋白2mg/ml；3为标准蛋白1mg/ml；4为标准蛋白0.5mg/ml；5为样品(原液10倍稀释)；6为空白；7为样品(原液5倍稀释)。电泳法测得蛋白含量约3mg/ml。纯度90％以上，分子量约36KD。
2.Balb/c小鼠的免疫
8-12周龄的Balb/c雌性小鼠3只(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，纯化的创伤弧菌膜蛋白以70ug/只体内静脉注射免疫小鼠，每间隔10 天免疫一次，4次免疫后对小鼠摘眼球取血，ELISA法检测抗血清效价。
3.杂交瘤细胞株的建立和McAb制备
当免疫小鼠血清效价达到1.0×10-4后，取脾细胞进行细胞融合，通过 ELISA方法和亲和力排序等筛选阳性细胞孔，进行单细胞克隆化，建立、保存单克隆抗体杂交瘤细胞株，并制备单克隆抗体细胞株小鼠腹水；检测到阳性杂交瘤细胞孔后，对细胞孔中的细胞进行3次以上的单克隆化，获得能稳定分泌McAb的阳性细胞株，命名为：VvmAb1m1n7。
4.创伤弧菌膜蛋白IgG McAb效价及细胞株亚类测定
McAb的效价测定按间接ELISA法进行，酶标板包被创伤弧菌膜蛋白 (100μg/mL)；BSA蛋白封闭，检测小鼠腹水或细胞培养上清液，分别设阳性对照(免疫小鼠多抗血清)和阴性对照(Sp2/0细胞培养上清)液，37℃、孵育1h，PBST洗涤液洗涤三次；加HRP标记抗鼠二抗，37℃、孵育1h，PBST 洗涤液洗涤三次；加底物液(TMB)，室温避光显色10～20min；加终止液(浓硫酸)，静置10min；用酶标仪检测450nm的OD值；空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍为阳性。
创伤弧菌膜蛋白McAb细胞株Ig亚类鉴定参照Ig亚类鉴定试剂盒步骤进行。
创伤弧菌膜蛋白McAb细胞株VvmAb1m1n7效价与亚型测定结果分别如表1、表2。所述创伤弧菌膜蛋白McAb细胞株VvmAb1m1n7效价大于 1:128000；所述杂交瘤细胞株亚型测定为IgG2b。
表1杂交瘤细胞VvmAb1m1n7腹水ELISA效价
Figure RE-GDA0001595472150000081
表2杂交瘤细胞VvmAb1m1n7亚级份测定
Figure RE-GDA0001595472150000082
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性
实施例2
创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒
1.创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒的组成
将包括创伤弧菌等被测细菌包被酶标板、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体VvmAb1m1n7、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和空白对照组装成ELISA试剂盒。
(1)酶标板包被创伤弧菌等被测细菌
将创伤弧菌等被测细菌(设阳性对照和空白对照)用磷酸缓冲液PBS (pH7.2)稀释至细菌OD595值为0.5-1.0，加入96孔酶标板反应孔中，每孔 50μL，4℃包被过夜或37℃包被1h；甩板弃液；每个反应孔加入100μL用PBS 配制的2％牛血清白蛋白，37℃封闭1h；PBST洗涤，每次2min，洗三次，于 -20℃保存备用。
(2)创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体
创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体VvmAb1m1n7用1％-PBST的抗体稀释液按照1:4000稀释后加入反应孔，每孔50μL，37℃孵育1h；PBST洗涤，每次2min，洗三次。
(3)HRP酶标记鼠抗
HRP酶标记的羊抗鼠多克隆抗体用1％-PBST的抗体稀释液稀释加入反应孔，每孔50μL，37℃孵育1h；PBST洗涤，每次2min，洗二次，第3次用纯水洗涤2min。
(4)封闭液
按72mL的0.2M Na2HPO4与28mL的0.2M NaH2PO4比例混和配制成 pH7.2磷酸缓冲液(pH7.2)，加入0.1mL吐温-20，再加牛血清白蛋白2g溶解混匀后使用。
(5)抗体稀释液
100mL pH 7.2磷酸缓冲液PBS加入0.1mL吐温-20混合后，加牛血清白蛋白1g溶解混匀后使用。
(6)洗涤液
1000mL磷酸缓冲液PBS(pH7.2)加入1mL吐温-20，混匀后使用(PBST)。
(7)显色液
底物显色A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30wt％双氧水0.3mL，蒸馏水加至500mL；
底物显色B液:乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，取0.15g 四甲基联苯胺(TMB)溶于3mLDMSO中，蒸馏水加至500mL；
取等量A液和B液混匀后使用，注意避光保存。
(8)终止液
浓硫酸(96％)22.2mL，蒸馏水177.8mL，混匀后使用。
(9)阳性对照
用磷酸缓冲液PBS(pH7.2)稀释创伤弧菌膜蛋白至浓度100μg/mL，包被至96孔酶标板反应孔中，每孔50μL，4℃包被过夜或37℃包被1h。
(10)空白对照
0.85％的生理盐水包被至96孔酶标板反应孔中，每孔50μL，4℃包被过夜或37℃包被1h。
2.创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒的使用方法
(1)加样：将待测样本用磷酸缓冲液PBS(pH7.2)稀释至细菌OD595值为0.5-1.0后，加入96孔酶标板反应孔中，每孔50uL；同时设阳性对照样品(100μg/mL)和空白对照各加入1孔，每孔50uL；37℃孵育1h；
(2)封闭：用2％BSA-PBS封闭液，每孔加入100uL，37℃孵育1h；
(3)洗涤：洗涤液洗涤，每孔加入150uL，每次2min，洗3次；
(4)加一抗：用1％BSA-PBS抗体稀释液把创伤弧菌膜蛋白IgG单抗稀释4000倍，每个反应孔加入50uL，37℃孵育1h；
(5)洗涤：洗涤液洗涤，每孔加入150uL，每次2min，洗3次；
(6)加HRP酶标抗体：用抗体稀释液把羊抗鼠-HRP抗体稀释5000倍，每个反应孔加入50uL，37℃孵育1h；
(7)洗涤：洗涤液洗涤，每孔加入150uL，每次2min，洗2次；第3次用纯水洗涤2min；
(8)加显色液：每个反应孔加入显色液50uL，室温下反应5～10min；
(9)加终止液：每反应孔加入终止液30uL,室温下反应1min；
(10)测OD450值：于酶标仪中测定吸光度OD450值。
(11)结果判断：阳性结果/阴性结果≥2.1时，计算待检样品与阴性对照光吸收值之比(P/N)，当P/N≥2.1时判为阳性结果，当P/N<2.1时判为阴性结果。
实施例3
创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒灵敏度和特异性测定
1.灵敏度测定
将5000ng创伤弧菌膜蛋白样品，倍比稀释成系列梯度，应用创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒测定，分析其对创伤弧菌膜蛋白的检测灵敏度。
创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒对创伤弧菌膜蛋白的灵敏度检测结果：灵敏度约为78ng。
2.特异性测定
创伤弧菌FJ03-X2、创伤弧菌1.1758(标准株)、爱德华氏菌ETY、嗜水气单胞菌ZN1、大肠杆菌K88、恶臭假单胞菌Pseu03、溶藻弧菌Val-BG等培养至对数生长期，收集菌体，调整菌液浓度OD595值0.5-1.0，0.3％甲醛溶液灭活24h，5000r/min,离心10min，重复3次，超声波破碎菌体后，应用创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒，创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体设1:500、1：1000、1:2000、1：4000、1:8000、1：16000、1:32000、1：64000 等不同稀释度，测定其特异性。
七株水产病原菌检测结果如图2，仅有创伤弧菌FJ03-X2和创伤弧菌 1.1758(标准株)的ELISA-OD492值几乎大于0.3，其它5株非创伤弧菌病原菌的ELISA-OD492值几乎小于0.15、接近空白对照，尤其创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体VvmAb1m1n7稀释度为1：4000、差异显著，说明该试剂盒能特异性检测创伤弧菌。
实施例4
创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒的应用
应用创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒检测临床水产细菌病原，包被菌液浓度OD595值0.5-1.0的创伤弧菌FJ03-X2、创伤弧菌FJ04-L1、创伤弧菌070504、创伤弧菌071010、创伤弧菌1.1758、创伤弧菌070516、爱德华氏菌ETY、嗜水气单胞菌ZN1、大肠杆菌K88、恶臭假单胞菌Pseu03、溶藻弧菌Val-BG等11株细菌，一抗--创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体稀释度设为 1：4000，二抗--羊抗鼠-HRP抗体稀释度为1：5000，测定各组待测样本的特异性情况。
如附图3所示：所有被检水产创伤弧菌(FJ03-X2、FJ04-L1、070504、 071010、1.1758、070516等)的ELISA-OD492值均大于0.5；而非创伤弧菌的水产常见病原如爱德华氏菌ETY、嗜水气单胞菌ZN1、大肠杆菌K88、恶臭假单胞菌Pseu03、溶藻弧菌Val-BG等的ELISA-OD492值均小于0.2，进一步验证了创伤弧菌膜蛋白IgG抗体间接ELISA检测试剂盒可以特异性检测水产创伤弧菌病原。
由上述实施例可知，本发明提供的杂交瘤细胞株能够分泌产生创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，所述创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体的效价高，腹水效价大于1：128000；本发明提供的创伤弧菌检测试剂盒灵敏度高，对创伤弧菌膜蛋白样品的最低检测限为78ng，能够特异性检测创伤弧菌，所有被检水产创伤弧菌(FJ03-X2、FJ04-L1、070504、071010、1.1758、070516等)的 ELISA-OD492值均大于0.5，而非创伤弧菌的水产常见病原如爱德华氏菌ETY、嗜水气单胞菌ZN1、大肠杆菌K88、恶臭假单胞菌Pseu03、溶藻弧菌Val-BG 等的ELISA-OD492值均小于0.2，可以特异性检测水产创伤弧菌病原。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016146。
2.一种创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：酶标板、权利要求2所述的创伤弧菌膜蛋白IgG单克隆抗体、HRP酶标记鼠抗、封闭液、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照品和空白对照品。
4.根据权利要求3所述的创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液的pH值为7.1~7.3。
5.根据权利要求3所述的创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为PBST溶液；所述洗涤液的pH值为7.0~7.4。
6.根据权利要求3所述的创伤弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述显色液包括等体积的底物显色A液和底物显色B液；
所述底物显色A液包括26~28g/L的醋酸钠，3.0~3.5g/L的柠檬酸，0.5~0.7ml/L的双氧水，所述双氧水的浓度为30wt％；
所述底物显色B液包括0.35~0.45g/L的乙二胺四乙酸二钠，1.8~2.0g/L的柠檬酸，90~110ml/L的甘油，0.28~0.32g/L的四甲基联苯胺；
所述显色液现用现配。
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Assignee: NINGBO FUFA AQUATIC PRODUCTS CO.,LTD.

Assignor: BIOLOGICAL TECHNOLOGY INSTITUTE OF FUJIAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: A hybridoma cell line, monoclonal antibody against Vibrio vulnificus membrane protein, and Vibrio vulnificus detection kit

Granted publication date: 20200731

License type: Common License

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