CN113683685B - 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用 - Google Patents

抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113683685B
CN113683685B CN202111076987.1A CN202111076987A CN113683685B CN 113683685 B CN113683685 B CN 113683685B CN 202111076987 A CN202111076987 A CN 202111076987A CN 113683685 B CN113683685 B CN 113683685B
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
antibody
avian adenovirus
monoclonal antibody
avian
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111076987.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113683685A (zh
Inventor
李泽君
李雪松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Original Assignee
Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center filed Critical Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority to CN202111076987.1A priority Critical patent/CN113683685B/zh
Publication of CN113683685A publication Critical patent/CN113683685A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113683685B publication Critical patent/CN113683685B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/075—Adenoviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体。本发明还公开了Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒，以及上述单克隆抗体在制备诊断或治疗Ⅰ群4型禽腺病毒病的产品中的应用。本发明利用抗Ⅰ群4型禽腺病毒的单克隆抗体制备的检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，特异性强、敏感性高，可以对Ⅰ群4型禽腺病毒抗体进行快速定性和定量检测，在由Ⅰ群4型禽腺病毒引起的禽心包积水肝炎综合征的诊断及抗体检测方面具有很好的应用前景。

Description

抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂 盒的应用
技术领域
本发明涉及兽用诊断生物制品技术领域，尤其涉及一种抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、以及包含该单克隆抗体的Ⅰ群4型禽腺病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术
I群禽腺病毒(FAdV)分为五亚群(A-E),12种血清型。FAdV-I的五亚群包括A型(FAdV-1)，B型(FAdV-5)，C型(FAdV-4和-10)，D型(FAdV-2,-3,-9和-11)和E(FAdV-6,-7,-8a和-8b)。在2015年之前禽腺病毒已全球传播，FAdV感染主要是亚临床症状或无毒性。然而，从2015年夏天起，中国许多省份出现了高致病性血清型病毒(FAdV-4)的爆发。这些爆发通常多发生在肉雏鸡和蛋鸡中，与包涵体肝炎(IBH)，心包积液综合征(HPS)，腺胃糜烂和溃疡有关。与之前的FAdV疫情引起的轻度疾病相比，过去两年来严重的FAdV感染导致家禽业巨大的经济损失。目前，在我国分离的毒株有FAdV-4、8a、8b、10及11等血清型，FAdV-1、 2、4、8等多种血清型并与自然暴发的肝炎-心包积水综合症有关，据国家肉鸡产业技术体系报道，我国流行毒株中FAdV-4占90％，并且该型病毒已经成为危害养禽业健康发展的最为重要的传染病病原之一，因此，针对FAdV-4开发特异性的诊断试剂盒对于防控该病的流行极为重要。
发明内容
本发明要解决目前市场上缺乏针对Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测产品的技术问题，提供一种抗Ⅰ群4型禽腺病毒的特异性单克隆抗体，该单克隆抗体可用于快速、灵敏地检测Ⅰ群4 型禽腺病毒，对Ⅰ群4型禽腺病毒的临床诊断及其疫苗抗体免疫水平评估、疫病监测与净化提供很好的方法和试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体。
优选的，所述单克隆抗体与Ⅰ群4型禽腺病毒特异性结合,并具有阻断或竞争的活性。
更优选的，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2021114的杂交瘤细胞株产生。
所述单克隆抗体的抗体亚类为为IgG2a，其轻链为к链。
在本发明的另一方面，还提供了一种分泌产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
优选的，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2021114。
在本发明的另一方面，还提供了一种Ⅰ群4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒，包含上述的单克隆抗体。
优选的，本发明试剂盒还包含灭活后纯化的Ⅰ群4型禽腺病毒包被的96孔ELISA酶联反应板(抗原包被板)、Ⅰ群4型禽腺病毒抗原、样品稀释液、单克隆抗体、酶标二抗、TMB 底物溶液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清、10倍浓缩洗涤液、封板膜和试剂盒说明书。其中酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗。
所述试剂盒采用阻断ELISA方法检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体，包括以下步骤：
用纯化的灭活Ⅰ群4型禽腺病毒包被ELISA酶标板；
将待测血清样品与包被抗原作用后，依次加入权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗、显色液和终止液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm,并按公式：阻断率(％)＝(阴性对照孔平均OD450nm值-样品孔平均OD450nm值)/阴性对照孔平均OD450nm值×100％，计算待测血清样品的阻断率，得检测结果。
所述检测结果的判定标准为：阻断率≥21.0％时为Ⅰ群4型禽腺病毒抗体阳性；阻断率≤ 15.0％时为Ⅰ群4型禽腺病毒抗体阴性；15.0％＜阻断率＜21.0％时为可疑，需重复检测，若重复检测结果阻断率仍小于21.0％，则判定为Ⅰ群4型禽腺病毒抗体阴性；所述试剂盒判定检测结果有效的条件为阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率≥50.0％。
在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备诊断或治疗Ⅰ群4型禽腺病毒病的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒在制备诊断由Ⅰ群4型禽腺病毒引发的禽心包积水肝炎综合征(Hydropericardium hepatitissyndrome,HHS)的产品中的应用。
本发明利用抗Ⅰ群4型禽腺病毒的单克隆抗体制备的检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体的阻断 ELISA试剂盒，特异性强、敏感性高，可以对Ⅰ群4型禽腺病毒抗体进行快速定性和定量，在Ⅰ群4型禽腺病毒病的诊断及抗体检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的单克隆抗体1F12与FAdV-4发生特异性反应的间接免疫荧光图；
图2是本发明实施例1的分泌抗FAdV-4单克隆抗体1F12株的抗体亚类鉴定结果图；
图3是本发明实施例4的Ⅰ群4型禽腺病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒外包装示意图。
本发明分泌抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1F12株，已于2021年4月29 日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2021114，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
为了开发特异性针对Ⅰ群4型禽腺病毒的诊断试剂盒，本发明首先采用纯化的Ⅰ群4型禽腺病毒抗原免疫BALB/c小鼠，利用单克隆抗体制备技术，筛选获得了1株稳定分泌抗Ⅰ群 4型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1F12株，分泌的单克隆抗体可以与Ⅰ群4型禽腺病毒病毒特异性的结合，该单克隆抗体亚类为IgG2a亚类、к型。然后用灭活纯化的Ⅰ群4型禽腺病毒包被ELISA板，将待测血清与包被抗原作用后，依次加入1F12单抗、酶标抗鼠二抗、显色液和终止液，利用酶标仪读取吸光度值OD450nm，通过计算待测血清样品的阻断率，建立了检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体的阻断ELISA(Blockinge ELISA,B-ELISA)方法。本发明检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体的B-ELISA方法，以其更高的敏感性和特异性在Ⅰ群4型禽腺病毒病的诊断及其抗体检测方面表现出很好的应用前景。
实施例1 Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及其初步应用
1.单克隆抗体的制备
1.1小鼠免疫用纯化的Ⅰ群4型禽腺病毒抗原加入等量弗氏完全佐剂乳化后，经腹部和背部皮下注射6～8周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，每只100μg；用纯化的Ⅰ群4型禽腺病毒抗原加入等量弗氏不完全佐剂乳化后，每隔两周分别进行第二次和第三次免疫，剂量与首免相同，当小鼠的抗体效价达到1:100000以上时，取抗体效价最高的小鼠脾脏用于细胞融合。三免两周后进行加强免疫，三天后开始细胞融合。
1.2阳性杂交瘤细胞株的建立和筛选按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，在加强免疫后第三天，按常规淋巴细胞杂交瘤技术，脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按1:5～ 10:1的比例在融合剂PEG1450作用下融合，将融合的细胞接种在96孔板中，在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择性培养基下培养。经间接ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，按有限稀释法在96孔细胞培养板中进行3次克隆。
利用淋巴细胞杂交瘤技术，通过间接ELISA检测方法检测杂交瘤细胞上清，通过间接 ELISA方法对融合孔细胞进行筛选，经过鉴定和亚克隆纯化，共获得1株能够稳定分泌抗FAdV-4单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细胞株命名为分泌抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1F12株，且此杂交瘤细胞株已于2021年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2021114。并且该培养物的存活性已由该保藏中心(CCTCC)于2021年5月6日检测完毕，结果为存活。
1.3单克隆抗体腹水的制备和效价测定取8～12周龄雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5ml灭菌液体石蜡，7～10天后腹腔注入2～5×105个杂交瘤细胞，注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，12000rpm离心10min，收集上清液，将阳性杂交瘤细胞培养上清和腹水分别进行10倍倍比稀释，用建立的间接ELISA方法检测，同时设立鼠阳性和阴性血清对照。P/N值≥2.1时抗体的最大稀释度即为其抗体效价。单克隆抗体1F12的抗体效价如下表1所示。
表1杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价
1.4 抗FAdV-4单克隆抗体的鉴定 将LMH细胞培养于6孔培养板，当细胞密度为70～80％时，用FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11分别感染LMH細胞。感染24h后，弃上清，细胞用4％多聚甲醛进行固定，经PBST洗涤三次后，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时， PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，每孔加入2ml PBS，在荧光下显微镜下观察荧光情况，凡有绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。结果显示：1F12单抗只可与FAdV-4结合产生特异性的绿色荧光，而与FAdV-8a、FAdV-8b和 FAdV-11分别感染LMH細胞不发生结合(见图1)。图1中，A：C4型禽腺病毒；B：E8a型禽腺病毒；C：E8b型禽腺病毒；D：D11型禽腺病毒。
1.5单克隆抗体的抗体亚类鉴定按照SBA ClonotypingTM System/HRP(Cat.NO5300-05) 抗体亚类试剂盒说明书进行，对筛选的单克隆抗体1F12株进行抗体亚型鉴定，结果显示杂交瘤细胞1F12分泌的单克隆抗体的抗体亚类为IgG2a，且轻链为к(kappa)链，结果见图2。
1.6单克隆抗体的纯化按照Protein G柱纯化试剂盒说明书进行对FAdV-4单克隆抗体 1F12株腹水进行抗体纯化，用5倍柱体体积(柱子为1ml预装柱)体积ddH2O洗涤Protein G柱，用10倍柱体体积结合Buffer(0.02mol/L PBS缓冲液，pH值7.2)平衡ProteinG柱；向Protein G柱中加入10ml样品，收集滤液再次加入Protein G柱中，保证与Protein G柱结合充分；用10倍柱体体积结合Buffer清洗Protein G柱，去除杂蛋白，反复洗涤3次；用5倍柱体体积洗脱Buffer(100mol/L Gly缓冲液，pH值2.7)洗脱目的蛋白。洗脱后用10倍柱体体积结合Buffer冲洗Protein G柱。再次上样或是使用5ml 20％乙醇冲洗Protein G柱，防止微生物滋生。Protein G柱封口，4℃保存。
1.7辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗按辣根过氧化物酶(HRP)抗体标记试剂盒说明进行，或者按下述方法进行。单抗称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于1ml纯化水中。于上述溶液中加入0.2ml新配的0.1mol/L NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，使用1mmol/L的醋酸钠缓冲液(pH值4.4)透析，2～8℃过夜。加入碳酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH值9.5)20μl，使以上醛化HRP的pH值升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgFAdV-4单克隆抗体1F12株纯化的单抗，在1ml碳酸盐缓冲液中(0.01mol/L)，室温避光轻轻搅拌2小时。加新配的NaBH4溶液(4mg/ml)0.1ml，混匀，置2～8℃孵育2小时。将上述溶液装入透析袋中，PBS缓冲液(0.01mol/L，pH值7.2)透析，2～8℃过夜。称取100g 硫酸铵，加入90ml水加热溶解，然后放在室温冷却，等待硫酸铵结晶析出稳定后，加氨水调 pH值至7.6，然后在透析后的辣根过氧化物和抗体反应液中，边搅拌边逐渐加入等体积饱和硫酸铵，置2～8℃静置3小时。
实施例2 Ⅰ群4型禽腺病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立
1.Ⅰ群4型禽腺病毒病毒阻断ELISA抗体检测操作方法⑴用PH9.6的碳酸盐缓冲液包被稀释离心灭活处理的Ⅰ群4型禽腺病毒抗原，每孔2.5μg/孔，4℃过夜。次日取出后，用0.05％Tween-20 PBS(PBST)洗涤三次，每次3min；⑵用商品化稳定剂封闭抗原包被板，3 室温1h，甩掉封闭液后室温晾干⑶加入抗体稀释液稀释10倍的阴性和阳性血清，每孔100μL37℃孵育1h，洗涤方法同上。⑷每孔100μL 1F12单克隆抗体(2000×)，37℃孵育1小时，洗涤3次；⑸每孔加入抗体稀释液的酶标二抗(4000×)100μL，37℃1h，洗涤3次；第⑷和⑸也可为HRP标记单抗1F12(酶标单抗)，100μL，37℃1h，洗涤3次；⑹每孔加入TMB底物显色液100μL，室温避光显色10min；⑺每孔加入终止液(2M硫酸)50uL终止反应，酶标仪读取吸光度值OD450nm,计算阻断率，阻断率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。
2.抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定将检验合格的Ⅰ群4型禽腺病毒纯化病毒抗原用包被液稀释，然后进行2倍倍比稀释。依次按20、5、2.5、1.25、0.625ug/mL进行稀释，共6个稀释度的抗原，阳性血清与阴性血清分别以1:2、1:5、1:10、1:20稀释进行阻断ELISA试验，包被浓度为最佳稀释倍数，且血清稀释度为1:10时阻断率最高。
3.待检血清作用时间的确定使用最佳条件包被和封闭板ELISA板后，加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h和2h，对阴阳性血清进行阻断ELISA试验，血清作用时间为1h时，阳性对照血清的阻断率最高，所以选择1h为最佳血清作用时间。
4.单克隆抗体工作浓度的确定使用最佳条件包被和封闭抗原包被板后，加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用1h，将单克隆抗体1F12或者酶标单抗进行1:500、1:1000、 1:2000和1:4000倍稀释后进行阻断ELISA试验，单抗1F12或者酶标单抗1:2000进行稀释时，阻断率最高，所以选择1:2000作为单抗或者酶标单抗最佳稀释浓度。
5.底物显色时间的确定按照最适浓度的抗原包被酶标板，用确定的封闭液和条件、血清的稀释度、单抗稀释度和酶标抗体进行，加入底物TMB，室温避光显色，显色时间分别为 5、10和15时，室温显色10分钟时阻断率最高，因而确定最佳显色时间为室温10分钟。
6.阻断ELISA判定标准的确定对200份临床的鸡阴性血清样品进行阻断ELISA检测，经统计学分析，计算出血清样品的平均阻断率(X)为2.9％，标准差(S)为6.0％，X+2S＝15.0％， X+3S＝21.0％；当PI≥21.0％时判该血清为Ⅰ群4型禽腺病毒病毒抗体阳性，PI≤15.0％时判为该血清Ⅰ群4型禽腺病毒病毒抗体阴性，15.0％<PI<21.0％时判为可疑，需重复检测1次，如果结果仍低于21.0％判为抗体阴性。同时确定了该方法成立的条件为：当阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率(PI值)≥50％，判定检测结果有效。
实施例3 Ⅰ群4型禽腺病毒病毒阻断ELISA抗体检测方法的评估和临床应用
1.特异性检验用建立的阻断ELISA检测方法对8型禽腺病毒、11型禽腺病毒、鸡减蛋综合征病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H5亚型禽流感病毒病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒、LMH细胞蛋白免疫鸡等血清样品以及阴性对照和阳性对照血清进行1:10稀释进行检测，根据试验结果，该方法与上述病毒的阳性血清没有交叉反应性，只有Ⅰ群4型禽腺病毒病毒血清抗体呈阳性，具有很好的特异性。
2.敏感性检验将Ⅰ群4型禽腺病毒病毒阳性血清(中和效价1:1000)进行10倍比稀释，用建立的阻断ELISA方法和中和试验平行进行检测。结果显示：阻断ELISA的抗体效价为1:100000，阻断ELISA抗体效价比中和试验至少敏感100倍，具有很好的敏感性。
3.批内批间重复性试验用同批次抗原对3份阳性血清和3份阴性血清进行检测。统计学分析其检测结果，结果显示其批内变异系数在0.8％～7.6％之间，均小于10.0％，说明同一样品在同一批试验中的变异程度很小，具有良好的重复性。用3个不同批次制备ELISA板进行批间重复性试验，其批间变异系数在1.5％～9.2％之间，说明同一样品在不同批次抗原试验中的变异程度很小，具有很好的重复性。综上，本方法具有良好的批内批间重复性。
4.临床样品检测结果用建立的阻断ELISA试验和中和试验进行比较，对江苏、安徽等地区共100份临床样品进行检测，阻断ELISA方法的阳性检出率为36％(36/100)，中和试验阳性检出率为12％(12/100)，建立的阻断ELISA的敏感性显著高于中和试验，具有很好的现地应用性。
实施例4 Ⅰ群4型禽腺病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的组成和应用
1.试剂盒的组成
本发明试剂盒用于检测禽血清中Ⅰ群4型禽腺病毒抗体。按表2所列的试剂盒成分，装配成试剂盒，试剂盒的外包装如图3所示。
试剂盒组装后置于2～8℃保存。如表2所示，(1)抗原包被板；(2)阳性对照血清；(3) 阴性对照血清；(4)样品稀释液；(5)10倍浓缩洗涤液；(6)单克隆抗体；(7)羊抗鼠酶标抗体；(8)TMB底物溶液；(9)终止液；(10)1封板膜；(11)说明书，另外其中(6)单克隆抗体和(7)羊抗鼠酶标抗体也可以为酶标单抗。
表2 Ⅰ群4型禽腺病毒病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的成分和含量
2.本发明试剂盒的使用方法：
2.1试剂准备使用前，将试剂盒中的抗原包被板、样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、单克隆抗体、羊抗鼠酶标抗体、TMB底物溶液和终止液等恢复至室温(20～25℃)并混匀待用。10倍浓缩洗涤液在使用前用去离子水或蒸馏水稀释10倍。阴性和阳性对照血清不稀释。
2.2样品准备将待测血清用样品稀释液按1:10稀释后进行测定；若测定待测血清的抗体滴度，则先用样品稀释液按1:5稀释血清后，再进行2倍倍比稀释，对各稀释度进行测定。
2.3操作步骤
2.3.1加样与孵育取抗原包被板，分别将阴性对照血清、阳性对照血清和稀释好的待检血清、加入到抗原包被板孔中，阴性和阳性对照血清各2孔，0.1ml/孔。轻轻振匀孔中样品，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1小时。
2.3.2洗涤去除封板膜，弃去孔中液体，每孔加入0.3ml洗涤液，作用3分钟，弃去洗涤液，重复洗涤3次。
2.3.3与单克隆抗体作用每孔加入单克隆抗体0.1ml，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1小时。
2.3.4洗涤按2.3.2方法洗涤。
2.3.5与酶标抗体作用每孔加入羊抗鼠酶标抗体0.1ml，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1小时。
2.3.6洗涤按2.3.2方法洗涤。
2.3.7显色每孔中加入TMB底物溶液0.1ml，轻摇2秒，室温(20～25℃)下避光显色10 分钟。
2.3.8终止每孔加入终止液0.05ml，置酶标仪上测定各孔OD450nm值。
3.判定
3.1结果有效性当阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率(PI值)≥ 50％，判定检测结果有效。
3.2阻断率的计算阻断率(PI)用以下公式计算：
PI＝(阴性对照孔平均OD450nm值-样品孔平均OD450nm值)/阴性对照孔平均OD450nm值)×100％
3.3结果判定
当样品的阻断率(PI)≥21.0％，判为Ⅰ群4型禽腺病毒病毒抗体阳性；
当样品的阻断率(PI)≤15.0％，判为Ⅰ群4型禽腺病毒病毒抗体阴性；
当样品的阻断率15.0％＜PI＜21.0％，判为可疑；应再重复检测1次，若PI值仍＜21.0％，则判为Ⅰ群4型禽腺病毒病毒抗体阴性。
ELISA判定为阳性样品的最高稀释倍数，即为该血清样品的ELISA抗体滴度。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体，所述单克隆抗体是由Ⅰ群4型禽腺病毒作为抗原免疫动物制得，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2021114的杂交瘤细胞株产生。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗体亚类为IgG2a，其轻链为к链。
3.一种分泌产生权利要求1所述抗Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2021114。
4.一种Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，还包含Ⅰ群4型禽腺病毒抗原包被的ELISA酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、Ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、酶标二抗、显色液、终止液、10倍浓缩洗涤液、封板膜和试剂盒说明书。
6.根据权利要求5所述的Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用阻断ELISA方法检测Ⅰ群4型禽腺病毒抗体，包括以下步骤：
用纯化的灭活Ⅰ群4型禽腺病毒包被ELISA酶标板；
将待测血清样品与包被抗原作用后，依次加入权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗、显色液和终止液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm , 并按公式：阻断率（%）=（阴性对照孔平均OD450nm值-样品孔平均OD450nm值）/阴性对照孔平均OD450nm值×100%，计算待测血清样品的阻断率，得检测结果。
7.根据权利要求6所述的Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测结果的判定标准为：阻断率≥21.0%时为Ⅰ群4型禽腺病毒抗体阳性；阻断率≤15.0%时为Ⅰ群4型禽腺病毒抗体阴性；15.0%＜阻断率＜21.0%时为可疑，需重复检测，若重复检测结果阻断率仍小于21.0%，则判定为Ⅰ群4型禽腺病毒抗体阴性；所述试剂盒判定检测结果有效的条件为阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率≥50.0%。
8.权利要求1或2所述单克隆抗体在制备诊断或治疗Ⅰ群4型禽腺病毒病的产品中的应用。
9.权利要求4-7任一项所述Ⅰ群4型禽腺病毒抗体检测试剂盒在制备诊断由Ⅰ群4型禽腺病毒引发的禽心包积水肝炎综合征的产品中的应用。
CN202111076987.1A 2021-09-15 2021-09-15 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用 Active CN113683685B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111076987.1A CN113683685B (zh) 2021-09-15 2021-09-15 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111076987.1A CN113683685B (zh) 2021-09-15 2021-09-15 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113683685A CN113683685A (zh) 2021-11-23
CN113683685B true CN113683685B (zh) 2024-03-26

Family

ID=78586322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111076987.1A Active CN113683685B (zh) 2021-09-15 2021-09-15 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113683685B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118027181A (zh) * 2023-06-14 2024-05-14 珠海重链生物科技有限公司 六邻体蛋白抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105412921A (zh) * 2015-12-14 2016-03-23 青岛易邦生物工程有限公司 一种ⅰ群4型禽腺病毒疫苗
CN109142724A (zh) * 2018-08-24 2019-01-04 北京市动物疫病预防控制中心 一种用于检测i群禽腺病毒4型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用
CN109824766A (zh) * 2019-02-28 2019-05-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105412921A (zh) * 2015-12-14 2016-03-23 青岛易邦生物工程有限公司 一种ⅰ群4型禽腺病毒疫苗
CN109142724A (zh) * 2018-08-24 2019-01-04 北京市动物疫病预防控制中心 一种用于检测i群禽腺病毒4型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用
CN109824766A (zh) * 2019-02-28 2019-05-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立;万文妍等;《中国兽医学报》(第05期);第45-50页 *
抗血清4型禽腺病毒Fiber2蛋白单克隆抗体研制及其应用;王萍;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》(第12期);参见第1-57页，特别是"研究内容一" *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113683685A (zh) 2021-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112899239B (zh) 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用
US20230194526A1 (en) Blocking elisa kit for detecting antibody to swine acute diarrhea syndrome coronavirus n protein
CN109142724B (zh) 一种用于检测i群禽腺病毒4型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用
CN113683685B (zh) 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用
CN101672849A (zh) 鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒及其制备方法和用途
CN112760294A (zh) 犬i型腺病毒单克隆抗体/多克隆抗体、双抗夹心elisa试剂盒和应用
CN108918869B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用
CN109321532B (zh) 一种用于检测山羊副流感病毒3型的双抗体夹心elisa检测试剂盒及其应用
KR100954992B1 (ko) 경쟁적효소면역측정법을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 검출방법
WO2023109535A1 (zh) 抗马立克氏病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒应用
CN116836938A (zh) 一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN102559603B (zh) 分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN109851671B (zh) 检测口蹄疫o型广西株抗原的单克隆抗体及其应用
CN102533664A (zh) 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN114316037B (zh) 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用
CN115902236A (zh) 一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒及检测方法
CN116338193A (zh) 一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN110894216B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用
CN110607282B (zh) 牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用
CN114113634A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用
CN107991481A (zh) 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN108251379B (zh) 一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒
CN111650375A (zh) 用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用
CN114921418B (zh) 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法
CN118047860B (zh) 一种具有竞争活性的iltv单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant