CN111650375A - 用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型包被的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，可快速、简便、高效的检测牛副流感病毒3型抗体，且成本低，适合样品的高通量检测。

Description

用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，涉及一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)属于副黏病毒科 呼吸道病毒属，是有囊膜的单股负链RNA病毒。该属病毒成员除了BPIV3，还包括人 副流感病毒1型和3型(HPIV1，HPIV3)、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、绵羊副流 感病毒3型(OPIV3)等，是导致人和动物呼吸道疾病的重要病原。BPIV3是牛呼吸 道综合征的主要病原，感染后多造成急性的临床症状，出现体温升高、食欲不振、精 神萎靡、流涕、咳嗽、呼吸困难等，对育肥牛的危害极大。目前，BPIV3流行于世界 各国，在美洲、欧洲、亚洲各国均不断发生或流行。近年来，我国山东、黑龙江、辽 宁和内蒙古等多个省份均有发生，导致养牛业蒙受重大的经济损失。
BPIV3作为重要的呼吸道疾病病原，在病原学检测方面，主要依赖于荧光定量 RT-PCR技术，用于快速定量检测BPIV3。此外，也建立了检测牛病毒性腹泻病毒、BPIV3 和牛呼吸道合胞体病毒3种病毒的多重RT-PCR诊断方法，该方法特异、快速、准确 的特点，可用于3种病毒的同时鉴定。在血清学诊断技术中，中和实验是该病常用的 血清学诊断方法，同时也是该病血清学诊断的金标准，具有极高的可信度。血凝抑制 试验由于成本低、操作简便也是BPIV3抗体检测的常用方法。此外，国内也建立了检 测BPIV3抗体的间接ELISA方法，可用于临床样品的高通量检测。如李德栋等建立了 间接ELISA用于检测牛副流感病毒3型血清抗体，其敏感性为1:1280，同时牛传染性 鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性血清无交叉反应，检测符合率98.9％；杨建乐 等同样建立了牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法(4.杨建乐,赵贵民,侯佩莉, 王洪梅,李杰,何洪彬.牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 动物医学进展,2016,37(11):19-24.)，结果表明牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、 牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8％； 建立间接ELISA诊断方法与血清中和试验比较,总体总符合率为96.67％；与美国爱德 士BPIV3间接ELISA试剂盒比较,总体符合率为95.56％；吕闯等提出了牛副流感病毒 3型NP单抗制备及固相阻断ELISA的建立和应用(吕闯，牛副流感病毒3型NP单抗 制备及固相阻断ELISA的建立和应用[D].中国农业科学院，2012)，对同为牛呼吸道病 毒的IBRV和BVDV阳性牛血清进行SPB-ELISA，结果IBRV和BVDV阳性牛血清都 没有阻断效果，表明该方法具有良好的特异性。敏感性试验结果表明该方法对病毒中 和抗体效价大于1:32的血清阳性检出率为100％。用3份阳性血清与3份阴性血清进 行批内重复试验和批间重复试验，根据试验结果计算变异系数，变异系数均小于10％， 表明该方法具有良好的重复性。利用SPB-ELISA对经病毒中和试验检测的已知阳性的 100份血清样品进行检测，结果阳性检出率为93％，表明该方法与病毒中和试验具有 较高的符合率。专利CN201611078635.9提出了一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接 竞争酶联适配体方法，结果表明牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛传染性支气管 炎病毒感染牛的阳性血清进行Ic-ELAA试验，无交叉。Ic-ELAA方法与商品化试剂盒 的符合率88％。CN201410225816.4提出了一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白 及ELISA试剂盒，48份疑似有交叉反应的参考血清，检测结果全部为阴性。对阳性参 考血清检出阳性的最大稀释倍数均为200～300倍。应用该ELISA试剂盒对临床采集 的100份血清样品进行检测，同时利用间接免疫荧光试验方法进行同步检测，进而比 较牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒与免疫荧光方法的符合率。可见两种方法 检测样品的阳性符合率为87％，阴性符合率为91.7％。总符合率为89.35％。上述检测 方法虽然大大提高了检测效率，但敏感性和符合率有待于进一步提高。
自1975年Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术以来，单克隆抗体作为检测技术开发的一种重要工具，在人和动物病原的抗体和抗原检测中发挥了重要作用。与 多克隆抗体相比，单克隆抗体具有以下优势：(1)针对单一抗原表位；(2)无限复制 及生产。利用单克隆抗体建立的阻断ELISA检测方法，在动物传染病的监测和预防方 面发挥着重要作用。目前国内外尚无针对牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体的阻断ELISA 检测方法，本发明旨在建立检测BPIV3抗体的阻断ELISA检测试剂盒，为临床检测和 相关研究奠定基础。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，可快速、 简便、高效的检测牛副流感病毒3型抗体，且成本低，适合样品的高通量检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型(CPIV3) 包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克 隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO： C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。
其中，杂交瘤细胞株2E6的抗原为CPIV3病毒JS2013株。
进一步地，所述所述试剂盒还包括样品稀释液、显色液、终止液和洗涤液。
优选地，所述样品稀释液为含有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％硫柳汞钠的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。
优选地，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温 -20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1％。
优选地，所述终止液为2M的硫酸水溶液。
优选地，所述显色液为TMB one solution试剂。
在一些实施例中，所述酶标记抗体制备方法如下：
(1)取5mg辣根过氧化物酶溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温 反应30分钟；
(2)将5mg纯化后的单克隆抗体2E6用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓 冲液)透析过夜；
(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小 时；
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。
在一些实施方式中，纯化的山羊副流感病毒CPIV3 JS2013株的包被量为 1:200～1:600(HA血凝价为213)，酶标单克隆抗体2E6的浓度为5.25～42μg/mL。
本发明同时提出了上述阻断ELISA试剂盒在检测牛副流感病毒3型抗体上的应用。
本发明还提供一种牛副流感病毒3型阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其包括：
(1)实验准备：试剂盒各个组分在使用前均需恢复至室温(20-25℃)，加液前充 分摇匀；
(2)加入血清：在抗原包被板上每孔加入血清稀释液40μL，阳性对照孔和阴性 对照孔各加入阳性血清、阴性血清10μL；样品孔加入待检血清样品10μL；总体积共 50μL/孔；每次实验设空白对照孔2个，各加入50μL血清稀释液作为空白对照；37℃ 孵育60min；
(3)洗板：将20×洗涤液用纯水或去离子水进行20倍稀释，即为工作浓度的1× 洗涤液；甩干抗原包被板中的液体，每孔加入1×洗涤液200μL，洗涤3次，在洗涤和 加入下一试剂前，避免孔壁变干；
(4)加入单抗反应液：用样品稀释液对800×酶标抗体进行1：800倍稀释，即为 工作浓度的1×酶标抗体，每孔加入工作浓度的1×酶标抗体50μL，置37℃孵育60min；
(5)洗板：甩干抗原包被板中的液体，每孔加入1×洗涤液200μL，洗涤3次，在 洗涤和加入下一试剂前，避免孔壁变干；
(6)底物显色：每孔加入TMB底物液50μL显色，置37℃避光作用8-10min；
(7)终止反应：每孔加入终止液25μL/孔，终止显色，用酶标仪测定OD450nm值。
本发明的有益效果：
(1)特异性强：本发明试剂盒与临床血清样品中的BPIV3有较强的反应性，与牛 其他病原抗体无交叉反应；
(2)灵敏度高：本发明试剂盒最低可检测1：5120稀释的BPIV3阳性血清；
(3)重复性：本发明试剂盒的批内和批间重复性较好；
(4)简便快速：本发明试剂盒需求技术难度低，不需要贵重仪器，操作简便、快 速；
(5)高通量：本发明试剂盒可以用于大量样品检测。
因此，本发明试剂盒为BPIV3抗体的高通量检测、灭活疫苗的效力检验以及相关基础研究提供技术手段，对BPIV3的防控具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明名做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实 施例。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明作进一步的说明，而非对本发明进行限制。
实施例1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.抗原的制备：将山羊副流感病毒3型(CPIV3)JS2013株(本毒株保藏编号为：CCTCC NO：V201832。保藏日期为：2018年6月26日，保藏地址：中国，武汉，武 汉大学，中国典型培养物保藏中心，其公开于专利CN2018109262262中)感染MDBK 细胞，接毒4d待细胞出现病变后收获病毒，10,000rpm离心30min，去细胞碎片； 上清经40,000×g超速离心2h，弃上清，沉淀用适量PBS过夜溶解。
2.免疫Balb/c小鼠：将超离病毒皮下多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，一共免疫3次，每次免疫间隔2周，首免使用100ul超离 病毒与等量完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)免疫，后两次均使用100ul超离病毒与 等量的不完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合免疫；第三次免疫2周后采血，检测 小鼠的免疫血清效价，选取ELISA抗体效价>106的小鼠，细胞融合前4d加强免疫一 次，100ul超离病毒腹腔注射。
3.细胞融合：细胞融合采取PEG细胞融合方法。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免 疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1:3～1:5的比例充分混匀，2 000rpm 25℃离心5min，弃 上清，再加入适量的无血清RPMI-1640培养基重悬，2 000rpm 25℃离心5min以清洗 细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀，置37℃水浴预热，1min中加入0.8ml 提前在37℃水浴中预热的PEG2000，边加边振荡。加完后继续振荡1min，然后在5min 内按照1、2、3、3、3ml/min分别加入12ml预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基， 37℃静置10min，2 000rpm 25℃离心5min，弃上清，加入含15％FBS和HAT的 RPMI-1640培养基重悬，分装到已铺有饲养细胞的96孔板中，于5％CO2培养箱培养。 期间观察孔中细胞情况，待融合7d后，细胞生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，取 上清进行抗体检测。
4.杂交瘤细胞的筛选：以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液为包被液，以400倍稀释的超离病毒为包被抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。PBST洗涤3次，拍干；将 融合细胞上清，1:1 000稀释的Balb/c免疫小鼠阳性血清以及1:1 000稀释的小鼠阴性 血清加入相应的孔内，100ul/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1:4 000 稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自北京全式金生物技术有限公司)， 100ul/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB，100ul/孔，室温避 光显色10min；每孔加入50ul 2mol/L硫酸终止反应。酶标仪测定酶标板OD450nm值， P为各检测孔的OD450nm值，N为阴性血清的OD450nm值，当阴性血清OD450nm值≤0.1 且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2.1，即阴、阳性对照均成立的前 提下，以P/N≥2.1判定为阳性孔的判定标准判定检测孔的阴阳性。隔2d后再检测一次， 选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株进行亚克隆。
5.杂交瘤细胞的克隆化：将筛选出的阳性孔细胞株用台盼蓝染色，计数，用含15％FBS的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释后的细胞悬液加入 提前铺有饲养细胞的96孔板，每孔100uL，置37℃，5％CO2培养箱中培养，期间观 察细胞株，待生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，按照之前建立的间接ELISA方法 及时进行ELISA检测。记录单克隆细胞的阳性孔，并进行同样的亚克隆3次以上，直 至克隆后所有的克隆细胞株上清检测均为阳性且各孔检测的OD450nm值较接近。将克 隆化的CPIV3特异单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，冻存。
6.腹水的制备：将灭菌的液体石蜡腹腔注射10～12周龄的Balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.3mL/只，7d后，将杂交瘤细胞株2E6注射入小鼠腹腔， 每只0.2mL(2×106～3×106个杂交瘤细胞)。7～10d后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水， 3000rpm离心20min，收集上清，分装，标记并保存至-20℃备用。
7抗体特性分析：测定获得的2个单克隆抗体2E6的效价为1:204 800。
实施例2单克隆抗体的纯化和过氧化物酶标记
1.单克隆抗体纯化：将腹水在4 000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达50％ 以沉淀免疫球蛋白，继续搅拌30min，然后在13 000rpm、4℃条件下离心30min，弃上 清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫 酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，采用不同浓度硫酸铵分级沉淀免疫球蛋白， 继续搅拌30min，在13 000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲 液(0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白，测定抗体含量，-20℃冻存 备用。将单克隆抗体粗蛋白采用Protein G预装柱(GE公司)进行纯化，新柱子先用5ml超 纯水过柱，再用5ml、浓度为0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过 程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续采用10ml、0.4M的 PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；采用5ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合 位点上的抗体，在洗脱液中加入pH 8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合 抗体保存的中性。测定单克隆抗体腹水纯化后浓度与效价，结果见表1。
表1单克隆抗体腹水纯化后浓度与效价测定
Figure BDA0002583326160000071
2.酶标记多克隆抗体的制备
取纯化后的单克隆抗体2E6，与辣根过氧化物酶(HRP)耦连，得到酶标记抗体。具体方法如下：
(1)取5mg HRP溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温反应30分钟；
(2)5mg纯化后的单克隆抗体2E6用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓冲液) 透析过夜；
(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。
将杂交瘤细胞株2E6送中国典型培养物保藏中心保藏。保藏信息如下：
分类命名为：杂交瘤细胞株2E6，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC， 保藏单位地址：武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C201627，保藏日期2016年2月1日。
以纯化CPIV3作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的2E6抗体作为检测抗体制备试剂盒，检测不同的ELISA条件：包被抗体浓度、检测抗体使用浓度、反应时间等， 最终确定试剂盒中成分及检测方法。
1.试剂盒组成
试剂盒：包括预包被酶标板、酶标记抗体工作液、样品稀释液、显色液、终止液、 洗涤液。
(1)试剂的配制
包被缓冲液(0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液)：3.2克碳酸钠，5.86克碳酸氢钠，用纯水定容至1L。
样品稀释液：8g氯化钠，3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，10g牛血清白蛋白，0.02％(w/v)硫柳汞钠，用纯水定容至1L。
洗涤液：溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗 涤液中的体积百分浓度为0.1％。
封闭液：溶剂是0.1M、pH值为9.6的PBS缓冲液，溶质为BSA(牛血清白蛋白)，BSA 在封闭液中的质量百分浓度为1％。
终止液：2M的硫酸水溶液。
显色液：商品化TMB one solution溶液(Promega公司，货号G7431)。
(2)牛副流感病毒3型阻断ELISA抗体检测试剂盒条件优化
a.抗原包被浓度和单克隆抗体2E6工作浓度的优化
按照矩阵法进行，以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液为包被液，分别以200、400、600、800倍稀释的超离全病毒(HA血凝价为213)作为包被抗原，4℃过夜包被酶标板(Costar)。PBST洗涤3次后加入0.5％BSA置37℃培养箱封闭2h，PBST洗涤3次，拍干， 依次加入400、800、800、1600、2400倍稀释的HRP标记单克隆抗体2E6，每个稀释度 重复一次，取其平均值。选择OD450nm值接近1的反应条件作为最佳反应条件。结果如下： 最佳抗原包被浓度为1:400稀释(HA血凝价为213),可工作浓度范围在1:200～1:600；单 克隆抗体2E6的最佳工作浓度为1:800稀释(21μg/ml)，可工作范围在1:400～1:2400 (5.25～42μg/ml)(表2)。
表2抗原包被浓度和单克隆抗体2E6工作浓度的选择
Figure BDA0002583326160000081
Figure BDA0002583326160000091
b.血清作用时间的优化：按照上述的最佳包被浓度包被酶标板，PBST洗涤3次后加入0.5％BSA置37℃培养箱封闭2h，PBST洗涤3次，拍干，分别加入1:5倍稀释的BPIV3 阳性和阴性血清，50uL/孔，每个稀释度重复一次，置37℃培养箱，分别在孵育30min、 45min、60min时取出相应的酶标条，PBST洗涤3次，拍干，同时加入单克隆抗体后继 续作用。计算各条件下的PI值，取重复孔平均值。血清作用时间为30～60min均可，其 中45min检测结果较好(表3)。
表3血清作用时间的优化
Figure BDA0002583326160000092
c.酶标2E6单抗的作用时间优化：按照前述最佳反应条件依次进行，加入酶标2E6单抗后，置37℃培养箱，分别在孵育30min，45min，60min时取出相应的酶标条， PBST洗涤3次，拍干，3个时间点的酶标条同时加入底物TMB后显色。每个时间点 重复一次，计算各条件下的PI值，取重复孔平均值，选择阴性血清OD450nm值接近1、PI值最大时作用时间最短的反应条件作为最佳反应条件。酶标2E6单抗的作用时间 30-60min无显著差异(p>0.05)(表4)。
表4酶标2E6单抗作用时间优化
Figure BDA0002583326160000101
d.底物作用时间优化：按照前述最佳反应条件依次进行，加入底物TMB，50uL/ 孔，室温避光作用。分别在作用5min，10min，15min时取下相应的酶标条，加入2M H2SO4，25uL/孔终止反应。每个时间点重复一次，计算各条件下的PI值，取重复孔平 均值，选择阴性血清OD450nm值接近1、PI值最大时作用时间最短的反应条件作为最佳 反应条件。结果如下：底物最佳作用时间为10min(表5)。
表5底物作用时间优化
Figure BDA0002583326160000102
e.阻断ELISA临界值的确定：用阻断ELISA检测确定的BPIV3抗体阴性牛血清， 计算其阻断率，经统计学分析，通过与中和实验结果进行比较，进行特异性和敏感性 分析，以PI≥35％时判定血清样品为抗体阳性，PI≤35％时判定血清样品为抗体阴性。
(3)实施例：
收集45份牛临床血清样品，分别用上述建立的阻断ELISA方法和中和实验检测 血清中BPIV3抗体。阻断ELISA结果与中和实验相比，符合率为100％。
(4)预包被酶标板的制备
预包被酶标板的制备方法，包括如下步骤：
1)包被：采用包被缓冲液将纯化后的CPIV3病毒1:400倍稀释(HA血凝价为213)， 得到包被工作液。将包被工作液按每孔100μL加入酶标板中，4℃静置12-18h。
2)封闭：将酶标板以洗板机吸干-洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干；然后将封闭液按每孔150μL加入酶标板中，37℃孵育3小时。洗涤过程中采用洗涤液。
3)抽干密封：弃去孵育后的酶标板中的封闭液，拍干，放入真空冷冻干燥机中抽干3小时，真空热封。
(5)酶标记抗体工作液的配制
采用实施例2中方法制备酶标记单克隆抗体2E6，采用样品稀释液稀释至21μg/mL，得到酶标记抗体工作液，2～8℃避光保存。
2.试剂盒的具体使用方法
试剂盒的具体使用方法包括如下步骤：
(1)实验准备：试剂盒各个组分在使用前均需恢复至室温(20-25℃)，加液前 充分摇匀。
(2)加入血清：在抗原包被板上每孔加入血清稀释液40μL，阳性对照孔和阴性对照孔各加入阳性血清、阴性血清10μL；样品孔加入待检血清样品10μL；总体积共50μL/ 孔。每次实验设空白对照孔2个，各加入50μL血清稀释液作为空白对照。37℃孵育60min。
(3)洗板：将20×洗涤液用纯水或去离子水进行20倍稀释，即为工作浓度的1×洗涤液。甩干抗原包被板中的液体，每孔加入1×洗涤液200μL，洗涤3次，在洗涤和加入 下一试剂前，避免孔壁变干；
(4)加入单抗反应液：用样品稀释液对800×酶标抗体进行1：800倍稀释，即为工作浓度的1×酶标抗体，每孔加入工作浓度的1×酶标抗体50μL，置37℃孵育60min；
(5)洗板：甩干抗原包被板中的液体，每孔加入1×洗涤液200μL，洗涤3次，在洗 涤和加入下一试剂前，避免孔壁变干；
(6)底物显色：每孔加入TMB底物液50μL显色，置37℃避光作用8-10min。
(7)终止反应：每孔加入终止液25μL/孔，终止显色，用酶标仪测定OD450nm值。
进一步地，纯化病毒抗原包被量为1:400(HA血凝价为213)。
进一步地，酶标2E6单克隆抗体的浓度为21μg/mL。
3.试剂盒特性检验
(1)重复性实验
a.批内重复实验
使用同批制备的试剂盒在不同时间分别检测6份临床血清样品，计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表6，可见6份病料检测结果的变异系数在0.4％～4.2％之 间，说明同批试剂盒在不同时间操作检测结果重复性良好。
表6批内重复实验结果
Figure BDA0002583326160000121
b.批间重复实验
使用三个不同批次制备的试剂盒在同时分别检测8份随机选择的临床样品，计算平 均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表7，可见8份病料检测结果的变异系数在0.9％～15.9％之间，说明不同批试剂盒在同一时间操作检测结果重复性良好。
表7批间重复实验结果
Figure BDA0002583326160000122
(2)特异性实验
用本发明建立的方法对牛病毒性腹泻病毒阳性血清(BVDV，本实验室保存)、蓝舌病病毒阳性血清(BTV，本实验室保存)、O型口蹄疫病毒阳性血清(O-FMDV，兰州兽 医研究所提供)、A型口蹄疫病毒阳性血清(A-FMDV，兰州兽医研究所提供)进行特 异性试验，该方法只与BPIV3阳性血清反应呈阳性，说明该方法具有很好的特异性。详 细结果见表8。
表8特异性实验检测结果
Figure BDA0002583326160000131
(3)敏感性实验
对BPIV3阳性血清进行2倍比稀释，采用实施例3中试剂盒进行检测，结果如表9所示。从表9可见，该试剂盒最低可检测的血清稀释度为1:5 120。
表9敏感性实验检测结果
Figure BDA0002583326160000132
本发明建立的牛副流感病毒3型阻断ELISA抗体检测试剂盒具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高等特点，可快速检测血清样品中是否含有BPIV3抗体；本发明适合应用 于养殖场牛群是否感染BPIV3的大批量检测，也可用于BPIV3灭活疫苗等免疫后的血清 抗体效价检测。
以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些 简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型包被的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO：C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。
2.根据权利要求1所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒还包括样品稀释液、显色液、终止液和洗涤液。
3.根据权利要求2所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有1%牛血清白蛋白（m/v）和0.02%硫柳汞钠（m/v）的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。
4.根据权利要求2所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1%。
5.根据权利要求2所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的硫酸水溶液。
6.根据权利要求1所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗体制备方法如下：
（1）取5 mg辣根过氧化物酶溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温反应30分钟；
（2）将5 mg纯化后的单克隆抗体2E6用偶联缓冲液透析过夜；
（3）将步骤（1）所得溶液加入步骤（2）透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；
（4）加入硼氢化钠封闭反应位点；
（5）磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。
7.根据权利要求1所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，纯化的山羊副流感病毒3型的包被量为1:200～1:600，酶标记抗体的浓度为5.25～42μg/mL。
8.根据权利要求1所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包被缓冲液为0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液，CB缓冲液由3.2克/L的碳酸钠和5.86克/L的碳酸氢钠组成。
9.权利要求1-8任一项所述的阻断ELISA试剂盒在检测牛副流感病毒3型抗体上的应用。
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