KR100954992B1

KR100954992B1 - 경쟁적효소면역측정법을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 검출방법

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Publication number: KR100954992B1
Application number: KR1020070111005A
Authority: KR
Inventors: 이윤정; 김용주; 정옥미; 전우진; 권준헌; 김재홍; 조영식; 하건우; 오진식; 박찬희; 유정은
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원); 주식회사 바이오노트
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2007-11-01
Publication date: 2010-04-29
Also published as: KR20090044763A

Abstract

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(Nucleoprotein)에 대한 단클론 항체가 흡착된 마이크로플레이트에 재조합된 핵단백질 항원이 결합된 인플루엔자 항원 흡착 플레이트 및 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체와 효소가 접합된 효소표지항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 이를 이용하여 검사시료 내 조류 인플루엔자 바이러스 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는 진단방법에 관한 것이다.

조류 인플루엔자, 핵단백질, 단클로 항체, 효소표지항체

Description

경쟁적효소면역측정법을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 검출방법{Diagnostic kit and detecting method for avian influenza virus antibody using competetive ELISA}

본 발명은 경쟁적효소면역측정법을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(Nucleoprotein)에 대한 단클론 항체가 흡착된 마이크로플레이트에 재조합된 핵단백질 항원이 결합된 인플루엔자 항원 흡착 플레이트 및 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체와 효소가 접합된 효소표지항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 이를 이용하여 검사시료 내 조류 인플루엔자 바이러스 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는 진단방법에 관한 것이다.

조류 인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양하며, 닭, 칠면조, 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조에 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다. 특히, 오리는 감염되더라도 임상증상이 잘 나타나지 않는 질병 으로서, 이 중 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI;Highly Pathogenic Avian Influenza)는 국제수역사무국(OIE)에서도 보고 의무가 있는 질병으로 규정하고 있으며, 국내에서는 제 1종 가축 전염병으로 분류하고 있다. 국내에서는 고병원성 조류 인플루엔자(H5N1)가 2차례에 걸쳐 발생한 바 있으며(2003년 12월~2004년 3월, 2006년 11월~2007.3월), 저병원성 조류 인플루엔자(H9N2)는 1996년에 처음 발생한 이후 현재에는 상재화가 되어 있는 상황이다.

조류 인플루엔자의 원인체는 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스 타입 A(Infuenza virus type A)이다. A형 인플루엔자의 혈청형은 두 가지 단백질 즉, 혈구응집(Hemagglutinin) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase)의 종류에 따라 구분되며 H 혈청형과 N 혈청형이 있다. 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 각각의 H 혈청형과 N 혈청형으로 표시(예: H9N2) 하며, 조류 인플루엔자 바이러스는 H혈 청형이 16가지, N 혈청형이 9가지 종류가 있으며 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 144가지이다. 현재까지 발생한 고병원성 조류 인플루엔자는 모두 H5 및 H7 혈청형에 속한다.

현재 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 진단은 바이러스의 분리 및 혈청학적 검사가 있다. 이 중 혈청학적 검사법으로는 혈구응집억제반응(HI), 한천내침강반응 (AGP), 효소면역측정법 (ELISA) 등이 있으며, 계군의 감염여부 혹은 백신여부를 판단하기 위해 대량 모니터링 검사방법으로 사용하고 있다. 혈청학적 검사는 2 단 계로 이루어진다. 첫 번째 단계는 AI 바이러스에 대한 공통 항체를 검출하는 것이며, 두 번째는 첫 번째 단계에서 항체가 양성이면 서브타입(subtype)을 결정짓는 시험을 수행해야 한다. 이와 관련한 OIE 규정은 다음과 같다. 제 1단계로서 그룹(group) 항원에 대한 검사이다. 이 검사는 그룹 A 바이러스에 대한 공통 항체를 검출하는 방법으로, 핵단백질(nucleoprotein, NP)이나 매트릭스(matrix, M) 단백질에 대한 항체검사법이다. 이 항원은 혈청형(H 혹은 N형)에 상관없이 모든 A 타입의 바이러스에서 나타난다. 이 반응에서 양성을 나타내면 인플루엔자 A 바이러스에 감염되었음을 의미하지만 서브타입에 대한 정보를 주지 않는다.

조류 인플루엔자에 대한 공통 항체를 검출하는 검사법으로는 대표적으로 AGP검사법(한천겔침강법)이 있다. 상기 방법은 닭과 칠면조 혈청에서 매우 간단하고 쉽게 검사할 수 있어 기본적인 장비만으로도 할 수 있는 시험법이다. 매우 특이적(specific)이지만 민감도(sensitivity)가 떨어지는 단점을 가지고 있다. 이러한 이유로 개체 검사보다는 계군 검사에 사용하여야 한다. 그러나 수생조류(waterfowl)에서는 침강항체를 생성하지 않기 때문에 사용해서는 안되며 아직까지 여러 종류의 조류들에 대한 충분한 확인(validation)이 되어 있지 않은 시험법이다.

다음은 ELISA(효소면역측정법)법으로서, 이 시험은 분광광도계와 같은 실험실 장비를 갖추어야 하는 단점이 있다. 매우 민감도가 높지만(highly sensitive), 특이도(specificity)가 떨어지는 단점이 있다. 대부분 현재 상용화되어 있는 조류인플루엔자 항체 검출용 ELISA 키트는 간접효소면역측정법(indirect ELISA)으로서, 이 경우 검사하고자 하는 동물 종에 따라 2차항체(second antibody conjugate)를 각기 다르게 사용해야 하므로 기존 상용화된 제품으로 닭과 돼지 이외의 다른 동물의 혈청검사는 할 수 없다.

제 2단계의 혈청검사법으로는 서브타입 특이적(Subtype specific) 항체 검사가 있으며, 혈구응집억제반응법(HI; Haemagglutination inhibition)이 대표적이다. HI법을 수행 할 때에는 H 혈청형에 따라 각기 다른 항원을 사용하여야만 하는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 여러 종류의 동물에 공통적으로 사용할 수 있는 조류 인플루엔자 항체의 진단 방법을 연구하던 중 조류 인플루엔자 바이러스의 공통항원인 핵단백질에 대한 단클론 항체 및 재조합된 핵단백질 항원을 이용하여 경쟁적 효소 면역측정법(Competitive ELISA)에 의해 여러 종의 동물에서 조류 인플루엔자 바이러스 항체를 효과적이고 신속하게 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체가 흡착된 마이크로플레이트에 재조합 핵단백질 항원이 결합된 인플루엔자 항원 흡착 플레이트; 및 조류 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 대한 단클론 항체와 효소가 접합된 효소표지항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 진단키트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체가 흡착된 마이크로플레이트에 재조합 핵단백질 항원이 결합된 인플루엔자 항원 흡착 플레이트; 및 조류 인플루엔자 바이러스 의 핵단백질에 대한 단클론 항체와 효소가 접합된 효소표지항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진단키트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트 및 이를 이용한 진단방법은 조류인플루엔자 바이러스의 핵단백질(Avian Influenza Virus, Nucleoprotein :NP)에 대한 단클론 항체를 먼저 마이크로플레이트에 흡착시켜 핵단백질 항원 만이 상기 마이크로플레이트에 흡착될 수 있도록 전처리 한 후, 재조합 핵단백질 항원을 반응시키고, 실제 검사할 검사시료 및 핵단백질에 대한 단클론 항체에 효소를 접합시킨 효소접합체를 동시 반응시킴으로써 효소접합체가 경쟁적으로 시료 중의 항체와 반응하게 하는 경쟁적 효소면역측정법의 원리를 기초로 한 것이다(도 1 참조). 보다 구체적으로 본 발명에서 제조한 마이크로플레이트에 검사시료와 효소접합체를 동시에 첨가시켜 만약에 검사시료에 핵단백질에 대한 항체가 있을 경우 효소접합체의 항체와 경쟁적으로 반응되며, 검사시료에 항체가 없을 경우에는 효소접합체의 항체만 항원과 반응되도록 하고, 이후 세척과정을 거친 후 발색제를 첨가하면 검사시료에 항체가 있을 경우 발색이 거의 되지 않으며, 항체가 없을 경우 효소접합체와 반응되기 때문에 강한 발색이 되게 하였다. 즉, 발색이 거의 되지 않으면 항체 양성으로 판정하고, 발색이 강하게 되면 항체 음성으로 판정하는 원리를 이용하였다.

진단키트

바람직하게는, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트는 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체가 흡착된 마이크로플레이트에 재조합 핵단백질 항원이 결합된 인플루엔자 항원 흡착 플레이트; 및 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체와 효소가 접합된 효소표지항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

(a) 인플루엔자 항원 흡착 플레이트

본 발명의 인플루엔자 항원 흡착 플레이트는 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체를 고순도로 정제하여 마이크로플레이트 웰에 바람직하게는 0.095~0.105ug/well, 보다 바람직하게는 0.1ug/well 농도로 흡착시키고, 상기 베큘로바이러스에서 발현시킨 조류 인플루엔자 바이러스 핵단백질을 반응시킨 다음 1% 소혈청 알부민 등으로 블로킹시켜 건조시키고 건조된 플레이트를 건조된 실리카겔포와 함께 은박포에 밀봉함으로써 제조될 수 있다.

상기 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체는 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질을 면역원(항원)으로 하여 통상적인 클로닝 및 세포융합기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 단클론 항체의 면역원으로 사용되는 조류 인플루엔자 바이러스는 특별히 한정되지는 않으나 바람직하게는, 국내에서 분리된 고병원성의 조류 인플루엔자(A/CK/Korea/ES/03(H5N1)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 조류 인플루엔자(A/CK/Korea/ES/03(H5N1)를 불활화시킨 후 농축 및 정제하고 원심분리를 통해 혈구 응집능을 보이는 분획을 분리 및 회수함으로써 단클론 항체의 제조를 위한 면역원으로 사용하였다(실시예 <1-1> 참조).

이렇게 제조된 면역원을 이용한 단클론 항체의 제조방법은 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원(항원)을 야생형이나 육종된 마우스(예를 들면 BALB/c)에 투여하여 천연 또는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거나, 애주번트와 혼합하여 투여되거나, 벡터로부터 발현될 수 있으며 DNA 또는 융합 단백질로서 면역 반응을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반응에 의도된 펩타이드와 커플링된 담체 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며, 담체 단백질은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩타이드는 담체 단백질에 대해서 합텐(hapten)으로 작용한다. 단클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 제한 희석으로 클로닝하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 수득된 클론을 배양하는 것이다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 또 다른 장점을 갖는다.

한편, 본 발명에 따른 단클론 항체는 조류 인플루엔자의 공통 항원인 핵단백질을 면역원으로 하여 제조된 것으로서, H1 내지 H15 혈청형을 가진 모든 종류의 조류 인플루엔자 바이러스를 흡착할 수 있다(실시예 <1-2> 및 도 2 참조).

상기 본 발명의 진단키트의 구성성분 중 하나인 재조합 핵단백질 항원은 당업계에 공지된 재조합 단백질의 제조방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 조류 인플루엔자의 핵단백질을 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.

바람직하게는, 상기 재조합 핵단백질은 조류 인플루엔자 바이러스(A/CK/Korea/MS96/96 (H9N2)로부터 클로닝된 핵단백질 유전자를 베큘로바이러스에 도입시킨 후 이를 곤충세포에 접종함으로써 제조될 수 있다.

발명의 일 실시예에서는 조류 인플루엔자 바이러스(A/CK/Korea/MS96/96 (H9N2)의 RNA 추출하고 RT-PCR을 수행함으로써 핵단백질 유전자를 클로닝하고, 이를 베큘로바이러스에 도입시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다. 상기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포인 Sf9 세포에 접종한 후 4-5일경 세포 상층액은 제거하고 세포만 동결융해를 3회 반복한 후 다시 원심분리하여 세포 파편 (debris)을 제 거하고 그 상층액을 핵단백질로 설정하였다(실시예 2 참조). 본 발명에서 클로닝한 핵단백질 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는다.

(b) 효소표지항체

효소표지항체는 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체에 효소를 접합시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 조류 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 대한 단클로 항체는 인플루엔자 항원 흡착 플레이트의 제조에 사용된 단클론 항체와 동일한 방법으로 제조될 수 있다.

상기 효소는 항원항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하도록 하기 위한 표지물질로서, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 퍼옥시다아제를 사용할 수 있다.

상기 단클론 항체에 효소를 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 단클론 항체에 HRPO(horseradish peroxidase)를 공지된 Nakane 법으로 접합시켜 효소표지항체를 제조하였다(실시예 3 참조).

(c) 기타

본 발명의 진단키트는 상기 인플루엔자 항원 접합 플레이트 및 효소표지항체 이외에 경쟁적 효소면역측정법에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.

예를 들면, 이러한 시약으로는 음성대조혈청, 양성대조혈청, 세척액, 효소활성을 측정할 수 있는 기질액 및 반응 정지액을 포함할 수 있다.

상기 음성대조혈청 인플루엔자 항원, 항체가 음성인 정상 닭 혈청을 선별하고 칼슘을 첨가하여 피브린을 형성시켜 제거하여 제조할 수 있다.

상기 양성대조혈청은 인플루엔자 항체가 양성인 닭 혈청을 선별하고 칼슘을 첨가하여 피브린을 형성시켜 제거한다. 포화 암모늄설페이트를 처리하여 농축한 후 칼슘 처리된 정상 닭 혈장으로 적당히 희석하여 제조할 수 있다.

상기 세척액은 폴리소르베이트 20이 0.2% 첨가된 인산염생리식염 완충액 (pH 7.2)으로 제조할 수 있다.

상기 기질액은 사용한 효소의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 HRPO에 대한 기질액으로서 테트라메칠벤지딘 (8mg/ml)과 과산화수소수(20~32%, 0.331ml)를 혼합하여 제조하였다.

상기 반응정지액은 1N 염산일 수 있다.

진단방법

본 발명의 상기 진단키트를 이용한 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단방법은 상기 조류 인플루엔자 항원 흡착 플레이트에 검사시료 및 효소표지항체를 동시에 첨가하여 검사시료 내 항체와 효소표지항체가 경쟁적으로 반응하도록 한 다음 발색제를 첨가하여 검사시료 내 항체의 존재여부를 판별하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 진단방법은 (a) 본 발명의 인플루엔자 항원 흡착 플레이트에 검사시료, 음성대조혈청 및 양성대조혈청을 각각 분주하고, 동시에 효소표지항체를 처리하여 반응시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 반응이 완료된 플레이트를 세척하고 기질용액을 처리하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 플레이트에 반응정지액을 처리하고 흡광도를 측정하는 단계를 포함한다.

상기에서 “검사시료”는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 유무 및 정도를 측정하고자 하는 동물 유래의 혈청일 수 있다. 상기 동물로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 오리, 칠면조, 돼지, 닭, 거위, 기니아폴, 퀘일, 그레이파트리지, 레드파트리지, 꿩, 백조 및 말로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나일 수 있다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 진단방법은 다음과 같이 수행할 수 있다.

검사를 시작하기 약 30분 전에 시약 구성물들을 상온에 방치시켜, 사용 전 가볍게 흔들어 잘 섞어준 후 사용하고, 플레이트는 상온이 된 후에 개봉하여 사용한다.

플레이트는 스트립 형태로 제작하여, 검사에 필요한 웰 수를 결정하고 사용하고 남은 웰은 자체 은박포에 실리카겔과 함께 밀봉하여 2 ~ 8℃에 보관할 수 있도록 한다.

검체의 분주-플레이트의 각 웰에 음성대조액(혈청), 양성대조액(혈청), 검사 하고자 하는 시료 각각 분주하고, 동시에 농축효소표지항체액을 각 웰에 분주한 후 약 10초 이상 시료들이 웰 바깥으로 튀지 않게 조심스럽게 흔들어준 후 플레이트를 첨부된 밀봉테이프로 밀봉한다.

밀봉한 플레이트를 바람직하게는 37℃에서 30분 동안 반응시킨다.

반응 후 각 웰의 내용물을 흡입하고 세척액으로 세척한다.

기질용액을 모든 웰에 분주하고 첨부된 밀봉테이프로 밀봉하고, 실온에서 10분 동안 반응시킨다.

반응정지액을 모든 웰에 넣고 잘 혼합하여 청색이 노란색으로 완전히 변하도록 한다.

공기를 맹검으로 하여(Air blank) 음성대조액, 양성대조액 그리고 각 검체의 흡광도를 측정한다. 이때 흡광도의 측정 파장은 450 nm로 하고, 이중 파장흡광도측정기 (dual wavelength reader)를 사용할 경우 참조파장은 620 nm로 하며 반응 정지액을 넣고 30분 이내에 흡광도 값을 측정한다.

상기와 같은 방법에 따른 진단결과는 다음과 같은 방법으로 판정될 수 있다.

음성대조액(혈청)은 3 웰을 이용하여 시험하며, 평균 흡광도 값은 1.8000 이상이어야 하며, 양성대조액(혈청)은 2 웰을 이용하여 시험하며, 평균 흡광도 값은 0.2000 이하이어야 한다.

측정된 검사시료의 흡광도로부터 하기 식을 이용하여 PI 값을 산출하고, 상기 산출된 검사시료의 PI 값(Percent Inhibition :PI)이 판정기준값 이상인 경우에 양성으로, 미만인 경우에는 음성으로 판정한다.

PI 값 = [1-(샘플 흡광도/음성대조액 평균 흡광도)] X 100

본 발명의 진단방법에 의하면, 닭, 오리, 메추리, 거위, 기니아폴, 그레이파트리지, 레드파트리지, 꿩, 백조, 말 및 돼지의 경우 PI 값이 50 이상이면 양성으로, 미만이면 음성으로 판정할 수 있다. 칠면조의 경우에는 PI 값이 85 이상이면 양성으로, 미만으면 음성으로 판정할 수 있다.

상기 PI 값은 다음과 같은 방법으로 확립할 수 있다. 본 발명에 따른 진단키트를 이용하여 각 동물별로 검사한 항체가와 종래의 HI 법으로 검사한 항체가를 기초로 하여 TG-ROC 방법에 의해 민감도와 특이도를 도표로 그려서 민감도 특이도가 적절한 수준(민감도와 특이도가 어느 한쪽만 높은 것이 아닌)인 때를 PI 값으로 확립한다.

본 발명의 일 실시예에서는 AIV의 다양한 표준 항혈청들을 대상으로 본 발명 의 진단키트의 효능을 시험하였다(실시예 <7-1> 참조). 그 결과, 본 발명의 진단 키트는 특이적으로 모든 타입(H1N1, H2N3, H3N8, H4N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N9, H6N2, H7N1, H7N3, H7N7, H8N4, H9N7, H10N1, H11N6, H11N9, H12N5, H13N6, H14N5, H15N6)의 AIV에 대한 핵단백질 항체를 검출할 수 있음을 확인하였으며(표 5 참조), EDS-76, 마이코플라스마(Mycoplasma), 뉴캐슬병(Newcastle Disease)에 대한 항혈청과는 교차반응성이 없음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서 간접효소면역측정법 원리를 이용한 기존에 상용화된 키트와 본 발명에 따른 진단키트의 AIV 항혈청별 검출능력을 닭 혈청을 대상으로 비교 시험한 결과(실시예 <7-2> 참조), 본 발명의 진단키트가 상용화된 키트에 비해 보다 더 효과적으로 조류인플루엔자에 대한 공통 항체를 검출 할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 6 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서 H9N2 바이러스를 SPF 닭에 접종하고 항체의 존재여부를 본 발명의 진단키트를 이용하여 시험하였다(실시예 <7-3> 참조). 이때, 기존 표준법인 HI 법과 비교하였다. 그 결과, 공격 접종 4일째부터 본 발명의 진단키트로 항체 양전현상을 관찰할 수 있었으며, 본 발명의 진단키트는 기존의 HI 방법과 유사하게 항체를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 3 및 표 7 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 닭, 거위, 오리에 H5N1 백신을 접종하고 항체가 변화를 본 발명의 진단키트 또는 기존의 시판 중인 키트(Synbiotics사 키트, Avivac사 키트, 상기는 모두 간접효소면역측정 ELISA 키트임)를 이용한 진단 시험 및 H5에 대한 HI 검사를 실시하여 조사하였다(실시예 <7-4> 참조). 그 결과, 본 발명의 진단키트를 이용하여 H5N1 백신을 접종한 닭, 거위, 오리 모두 항체를 검출할 수 있었으며(표 9 참조) 그 결과 역시 기존의 HI 법과 유사하게 나타났다. 한편, 기존의 시판중인 ELISA 키트들은 닭 혈청만을 이용할 수 있기 때문에 거위 및 오리의 혈청에 대한 시험을 할수 없었으나, 본 발명의 진단키트는 모든 축종에 사용이 가능하였다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 진단키트가 모든 축종에 적용 가능한지를 확인하기 위해 축종별 민감도 및 특이성을 확인하였다(실시예 <7-5> 참조). 그 결과, 본 발명의 진단키트는 12종의 동물에서 사용가능함을 확인할 수 있었다(표 10 참조).

따라서, 본 발명에 따른 조류 인플루엔자 항체의 진단키트 및 이를 이용한 진단방법은 조류 인플루엔자의 공통항원인 핵단백질을 이용함으로써 여러 종류의 동물에 공통적으로 사용할 수 있으며, 종래의 표준법인 HI 법과 유사한 정도로 진단이 가능함을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법은 모든 축종에 적용 가능하며 특히, 감염되어도 임상증상이 나타나지 않는 오리 및 야생 조류들에서 바이러스 항체를 효과적으로 검출할 수 있고, H 혈청형에 따라 각기 다른 항원을 사용하여야만 하는 종래의 표준법인 HI 법에 비해 간편하고 용이하다. 따라서, 보다 더 신속하게 대량으로 바이러스 항체를 진단할 수 있으므로 동물의 질병 모니터링에 매우 유용하다.

또한, 진단키트 제작에 국내분리 조류인플루엔자 바이러스 유래의 핵단백질을 사용함으로써, 특히, 우리나라에서 유행하고 있는 바이러스 감염 항체를 좀 더 민감도 높게 검출할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

조류 인플루엔자 진단용 단클론 항체 제조

<1-1> 조류 인플루엔자 항원 정제

단클론성 항체 생산에 사용한 조류 인플루엔자 바이러스는 국내에서는 발생한 고병원성 조류 인플루엔자(A/CK/Korea/ES/03(H5N1))로부터 준비하였다. 즉 37.6℃에서 10일령 SPF종란에 바이러스를 접종하여 2~3일간 배양하고 채취한 후, 최종농도 0.2% 포르말린으로 불활화 시키고 농축 및 정제를 실시하였다. 불활화된 조류인플루엔자 바이러스를 1차로 4,000xg에서 30분간 원심분리하고, 상층액을 2차로 70,000xg에서 3시간 초원심분리(L8-70M, Beckman, USA) 하였다. 원심분리 후 생선된 펠렛(pellet)을 다시 재부유(수크로스 양의 1/25배)하여 수크로스 밀도 구배 초고속 원심분리(sucrose density gradient ultracentrifugation, 100,000 xg, 90분)를 수행하고 혈구응집능을 보이는 분획(fraction)을 분리하여 조류 인플루엔자 단클론 항체 생산용 항원으로 사용하였다.

<1-2> 단클론 항체 생산

상기 실시예 <1-1>의 방법으로 정제된 항원을 면역원으로 사용하여 Balb/c 마우스에 면역시켰다. 이후 비장 세포를 분리하여 골수종 세포(myeloma)와 접합시켜 조류 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 단클론 항체를 분비하는 잡종 세포주를 ELISA 방법으로 선별하고 한계희석 방법으로 여러 단세포군을 확립하였다. 이들 세포주를 대량 배양하여 Balb/c 마우스에 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 프로테인 A/G 겔(protein A/G gel)을 이용하여 IgG 항체를 정제하였다.

<1-3> 조류 인플루엔자 항원 진단용 단클론 항체의 특이성 검사

상기 실시예 <1-2>에서 정제된 항체를 이용하여 도트 면역분석법(Dot Immunoassay)을 수행함으로써 일반 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 반응하는 항체를 선별하였다.

그 결과, 클론번호 AIV NP-1 항체 (한국세포주연구재단에 2007년 9월 11일 기탁번호 KCLRF-BP-00166로 기탁)는 마이크로플레이트 흡착용으로 AIV NP-2 항체 (한국세포주연구재단에 2007년 9월 11일 기탁번호 KCLRF-BP-00167로 기탁)는 효소접합체용 항체로 선별하였다. 상기 항체에는 H1 내지 H15 혈청형을 가진 조류인플루엔자 바이러스가 흡착되는 것으로 나타났다(도 2).

< 실시예 2>

베큘로바이러스를 이용한 조류 인플루엔자 항원 재조합 단백질 생산

우리나라에서 1996년 최초 분리된 저병원성의 A/CK/Korea/MS96/96 (H9N2)주를 이용하여 재조합 핵단백질을 생산하였다.

베큘로바이러스에 발현시키기 위한 첫단계로서 조류 인플루엔자 바이러스의 RNA 추출하고 RT-PCR을 수행하였다. 즉, TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하여 주형으로 삼고 하기의 프라이머를 이용하여 원-스텝 RT-PCR 키트(Qiagen, Cat No. 2102212)로 RT-PCR을 수행하였다.

정방향 프라이머: 서열번호 1

5'-AGCAAAAGCAGGGTTAATAATCAC-3'

역방향 프라이머: 서열번호 2

5'-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCCTC-3'

이때, RT-PCR 조건은 다음과 같았다(표 1).

RT-PCR 조건

사이클	반응	온도	시간
1	역전사 반응	45℃	30분
40	RTase 불활성화	94℃	5분
	변성	94℃	30초
	어닐링	50℃	30초
	신장	72℃	40초
1	최종 신장	72℃	5분

PCR 후 수득한 1,565 bp의 핵단백질 유전자를 아가로스 겔에 전기영동하고, 겔 추출 키트(gel extraction kit, Qiagen)를 이용하여 아가로스 겔로부터 추출하였다. TA 클로닝 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 핵단백질 유전자를 클로닝하고, 이를 외부 전문용역회사에 의뢰하여 서열을 확인하였다(서열번호 3).

상기 클로닝한 핵단백질 유전자를 pFastBac (Invitrogen, USA) 도너 벡터(donor vector)에 삽입한 후 bacmid로 전위 (transposition)시켜 재조합 bacmid DNA를 수득하였다. 상기 재조합 bacmid DNA를 셀펙션 시약(Cellfectin reagent, Invitrogen, USA)을 이용하여 Sf9 세포 (Invitrogen)에 형질전환시켜 72시간 추가 배양하여 재조합 베큘로바이러스 (recombinant baculovirus)를 제조하였다. 바이러스 감염역가(Virus infectivity titer)는 플라크 어세이 (plaque assay)를 이용하여 수행하였다.

상기 재조합되어 핵단백질을 발현하는 베큘로바이러스를 배양하기 위한 세포로는 Sf9 세포를 이용하였다. 즉, 상기 재조합 베큘로바이러스를 Sf9 세포에 0.4PFU/cell의 MOI로 접종하여 72시간 추가배양하고 3,000xg, 10 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 이때, 배지의 조성은 90% 곤충세포 배양 배지 (insect cell culture media)와 10% FBS를 이용하였다. 회수한 세포를 대상으로 12% SDS-PAGE을 수행한 다음 쿠마시 블루 염색 (coomasie blue staining)과 토끼항혈청을 이용한 웨스턴 블롯 (western blot)를 수행 하여 대략 57.4KD 크기의 핵단백질을 확인하였다. 상기 토끼 항혈청은 다음과 같은 방법으로 수득하였다. 조류 인플루엔자 바이러스를 부화란에 3-4일간 배양하여 요막강액(allantoic fluid)을 채취하고 0.4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 처리하여 불활화하였다. 상기 불활화된 바이러스를 수크로스 구배(sucrose gradient)를 이용한 초고속 원심분리를 수행하여 바이러스를 분리하고 이를 토끼에 면역하여 토끼 항혈청을 획득하였다.

이에 본 발명자들은 Sf9 세포에 재조합 베큘로바이러스를 접종한 후 4-5일경 세포 상층액은 제거하고 세포만 동결융해를 3회 반복한 후 다시 원심분리하여 세포 파편 (debris)을 제거하고 그 상층액을 핵단백질로 설정하였다

< 실시예 3>

핵단백질에 대한 단클론 항체에 효소를 접합시킨 효소표지항체의 제조

실시예 <1-3>에서 제조한 핵단백질에 대한 단클론 항체 AIV NP-2을 HRPO (horseradish peroxidase)와 공지된 Nakane 법으로 접합시켜 효소접합체를 제조하였다. 즉, HRP 5mg을 1.2ml의 증류수에 용해하고, 0.1M의 소디움-엠-페리오데이트(sodium m-periodate, Sigma, S-1878)가 용해되어 있는 소디움 포스페이트 (sodium phosphate, pH 7.0) 0.3ml를 첨가하였다. 이것을 실온에서 20분간 반응시키고 1mM 소디움 아세테이트 (sodium acetate, pH4.0)로 하룻밤 투석하였다. 단클론 항체 #16을 20mM 카보네이트 (carbonate, pH9.5)에 10mg/ml 농도로 준비하여 상기에서 투석된 HRP 용액에 0.5ml 첨가한후 2시간 실온에서 반응시켰다. 이후 100ul의 소디움 보로하이드라이드 (sodium borohydride, 4mg/ml in water)를 첨가하고 4℃에서 2시간 반응시켰다. 이것을 다시 PBS(pH 7.2)로 투석하였다.

< 실시예 4>

본 발명에 따른 진단키트의 제조

1) 인플루엔자 항원 흡착 플레이트 : 상기 실시예 <1-3>에서 제조한 조류 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 대한 단클론 항체 AIV NP-1를 고순도로 정제하여 마이크로플레이트 웰에 0.1ug/well 농도로 흡착시키고, 상기 실시예 2의 베큘로바이러스에서 발현한 조류 인플루엔자 바이러스 핵단백질을 반응시켰다. 그 후 1% 소혈청 알부민 등으로 블로킹시켜 건조시키고 건조된 플레이트를 건조된 실리카겔포와 함께 은박포에 밀봉하여 사용 전까지 보관하였다.

2) 음성대조혈청 : 인플루엔자 항원, 항체가 음성인 정상 닭 혈청을 선별하고 칼슘을 첨가하여 피브린을 형성시켜 제거하여 제조하였다.

3) 양성대조혈청 : 인플루엔자 항체가 양성인 닭 혈청을 선별하고 칼슘을 첨가하여 피브린을 형성시켜 제거한다. 포화 암모늄설페이트를 처리하여 농축한 후 칼슘 처리된 정상 닭 혈장으로 적당히 희석하여 제조하였다.

4) 세척액 : 폴리소르베이트 20이 0.2% 첨가된 인산염생리식염 완충액 (pH 7.2)으로 제조하였다.

5) 기질액 : 테트라메칠벤지딘 (8mg/ml)과 과산화수소수(20~32%, 0.331ml)를 혼합하여 제조하였다.

6) 반응정지액은 1N 염산으로 하였다.

< 실시예 5>

본 발명에 따른 키트를 이용한 진단방법

본 발명에 따른 키트를 이용하여 조류인플루엔자 항체의 존재유무를 다음의 방법으로 진단하였다.

1) 검사를 시작하기 약 30분 전에 시약 구성물들을 상온에 방치시켜, 사용 전 가볍게 흔들어 잘 섞어준 후 사용하고, 플레이트는 상온이 된 후에 개봉하여 사용한다.

2) 플레이트는 스트립 형태로 제작하여, 검사에 필요한 웰 수를 결정하고 사용하고 남은 웰은 자체 은박포에 실리카겔과 함께 밀봉하여 2 ~ 8℃에 보관할 수 있도록 하였다.

3) 검체의 분주-플레이트의 각 웰에 음성대조액(혈청), 양성대조액(혈청), 검사 하고자 하는 시료 각각 50㎕씩을 분주하고, 동시에 실시예 3에서 조제한 농축효소표지항체액을 각 웰에 50㎕ 씩 분주한 후 약 10초 이상 시료들이 웰 바깥으로 튀지 않게 조심스럽게 흔들어준 후 플레이트를 첨부된 밀봉테이프로 밀봉하였다.

4) 밀봉한 플레이트를 37℃에서 30분 동안 반응시켰다.

5) 반응 후 각 웰의 내용물을 흡입하고 세척액으로 다음과 같은 방법으로 6회 세척하였다. 우선 웰 내의 내용물을 흡입장치로 제거한 후, 세척액을 웰에 완전히 채우고 (웰 당 약 350㎕씩) 용액을 흡입하는 방법으로 6회 반복한 다음, 휴지에 대고 살짝 털어 잔여 용액을 제거하였다.

6) 기질용액을 모든 웰에 100㎕씩 분주하고 첨부된 밀봉테이프로 밀봉하고, 실온에서 10분 동안 반응시켰다.

7) 반응정지액을 모든 웰 에 각 웰 당 100㎕씩 넣고 잘 혼합하여 청색이 노란색으로 완전히 변하도록 하였다.

8) 공기를 맹검으로 하여(Air blank) 음성대조액, 양성대조액 그리고 각 검체의 흡광도를 측정하였다. 이때 흡광도의 측정 파장은 450 nm로 하고, 이중 파장흡광도측정기 (dual wavelength reader)를 사용할 경우 참조파장은 620 nm로 하며 반응 정지액을 넣고 30분 이내에 흡광도 값을 측정하였다.

< 실시예 6>

본 발명의 방법에 따른 진단결과의 판정

본 발명의 키트를 이용한 진단결과의 판정은 다음과 같이 실시하였다.

1) 정도관리

(1) 음성대조액(혈청)은 3 웰을 이용하여 시험하며, 평균 흡광도 값은 1.8000 이상이어야 하며, 약 1개의 값이 범위를 벗어났을 경우 나머지 2개 값의 평균값으로 산출한다. 만약 2개 이상의 값이 위 범위를 벗어났을 경우 재 실험을 하여야 한다.

(2) 양성대조액(혈청)은 2 웰을 이용하여 시험하며, 평균 흡광도 값은 0.2000 이하이어야 한다. 평균 흡광도 값이 위 범위를 벗어난 경우에는 검사과정이나 시약에 문제가 있는 것이므로 그 원인을 확인한 후 재검사 하여야 한다.

2) 판정 기준값 (Percent Inhibition :PI) 계산

(1) 음성대조액(혈청) 평균값 계산

본 발명의 검사방법에 따라 음성대조액(혈청)의 흡광도를 얻은 다음 그 세 값의 평균값을 산출한다.

음성대조액 평균값 계산의 예시

음성 대조액 번호	흡광도 (450 nm, 참조파장 620 nm)
1	2.520
2	2.522
3	2.521
합계	7.563

* 음성대조액(혈청)의 평균 흡광도 : NCx = 7.563/3 = 2.521

(2) 양성대조액(혈청) 평균값 계산

본 발명의 검사방법에 따라 양성대조액(혈청)의 흡광도를 얻은 다음 그 두 값의 평균값을 산출한다.

양성대조액 평균값 계산의 예시

양성 대조액 번호	흡광도 (450 nm, 참조파장 620 nm)
1	0.058
2	0.060
합계	0.118

*양성대조액(혈청)의 평균 흡광도 : PCx = 0.118/2 = 0.059

(3) PI값 평균값 계산

PI value = [1-(샘플 흡광도/음성대조액 평균 흡광도)] X 100

예시) 샘플 흡광도 = 2.420, 음성대조액의 평균 흡광도 = 2.521

PI value = [1-(2.420/2.521)] X 100 = 4

결과 판정 : 음성

3) 결과의 판정

(1) 음성 : 판정 기준값 미만의 PI 값을 나타내는 검체는 음성으로 판정한다.

(2) 양성 : 판정 기준값 이상의 PI 값을 나타내는 검체는 양성으로 판정한다.

(3) 1차 검사에서 양성 판정 검체는 2 웰 이상 재검사하고 재검 결과에서 1 웰 이상 양성으로 판정되면 최종양성으로 판정한다.

(4) 최종 양성 판정된 검체는 다른 임상결과나 실험결과를 함께 이용하여 전문 수의사가 종합적으로 최종 진단을 내려야 한다.

(5) 판정 기준값

다양한 동물에 대한 판정 기준값

동 물

닭

오리

칠면조

메추리

거위

기니아폴

그레이 파트리지

레드 파트리지

꿩

백조

말

돼지

양성 PI값

50 이상

85 이상

50 이상

음성 PI값

50 미만

85 미만

50 미만

< 실시예 7>

본 발명에 따른 진단키트의 효능 시험

<7-1> AIV 항혈청에 대한 시험

이탈리아 IZS 실험실 및 러시아 FGI (모두 OIE reference laboratories)에서 실시한 표준 항혈청들을 대상으로 본 발명의 진단키트의 효능을 상기 실시예 5의 방법으로 시험하고 상기 실시예 6의 방법으로 판정하였다.

그 결과, 본 발명의 진단키트는 H1N1, H2N3, H3N8, H4N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N9, H6N2, H7N1, H7N3, H7N7, H8N4, H9N7, H10N1, H11N6, H11N9, H12N5, H13N6, H14N5, H15N6에 대한 표준 항혈청들과 반응성이 있음을 확인할 수 있었으며, EDS-76, 마이코플라스마(Mycoplasma), 뉴캐슬병(Newcastle Disease)에 대한 항혈청과는 교차반응성이 없음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 진단키트는 특이적으로 모든 타입(type)의 AIV에 대한 핵단백질 항체를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 5).

본 발명의 진단키트를 이용하여 AIV 항혈청형에 대한 진단 결과

혈청번호	AI 형	HI 역가	AGID 결과	진단 결과
혈청번호	AI 형	HI 역가	AGID 결과	흡광도	PI 값	결과	표준양성	표준음성
Batch 2/05	SPF 음성 혈청	neg	neg	1.334	14.0	Neg	0.061	1.552
Batch 1/01	H1N1	1:512	pos	0.069	96.9	Pos	0.075	2.206
Batch 1/05	H2N3	1:2048	pos	0.058	97.4	Pos	0.075	2.206
Batch 1/02	H3N8	1:32	pos	0.075	96.6	Pos	0.075	2.206
Batch 1/04	H4N8	1:512	pos	0.050	97.7	Pos	0.075	2.206
Batch 1/05	H5N1	1:512	pos	0.048	97.8	Pos	0.075	2.206
Batch 1/01	H8N4	1:256	pos	0.062	97.2	Pos	0.075	2.206
Batch 1/05	H9N7	1:4096	pos	0.092	95.8	Pos	0.075	2.206
Batch 1/01	H10N1	1:64	pos	0.110	95.0	Pos	0.075	2.206
Batch 1/01	H11N6	1:128	pos	0.050	97.7	Pos	0.075	2.206
Batch 1/01	H12N5	1:512	pos	0.053	97.6	Pos	0.075	2.206
Batch 1/01	H13N6	1:512	pos	0.049	97.8	Pos	0.075	2.206
Batch 1/01	H14N5	1:256	pos	0.052	97.6	Pos	0.075	2.206
Batch 1/04	H15N6	1:256	pos	0.264	88.0	Pos	0.075	2.206
Batch 2/01	NDV	1:256	neg	1.698	23.0	Neg	0.075	2.206
	H7N1	1:128	pos	0.045	98.6	Pos	0.105	3.179
	H7N3	1:256	pos	0.069	97.8	Pos	0.105	3.179
	H6N2	1:1024	pos	0.060	98.1	Pos	0.105	3.179

* neg : 음성, pos : 양성

<7-2> 본 발명의 진단키트와 기존 상용화된 키트와의 효능비교

간접효소면역측정법 원리를 이용한 기존에 상용화된 키트와 본 발명에 따른 진단키트의 AIV 항혈청별 검출능력을 닭 혈청을 대상으로 비교 시험하였다.

그 결과, 본 발명의 진단키트가 상용화된 키트에 비해 보다 더 효과적으로 조류인플루엔자에 대한 공통 항체를 검출 할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 6).

본 발명에 따른 진단키트와 기존 상용화된 키트의 AIV 항혈청 검출 효능 비교 시험 결과

혈청번호	본 발명의 진단키트 Pos≥51	Synbiotics사, Pos≥338	EU, Avivac사, Pos≥15	H5 HI 역가, Pos≥1:16
H1N1 (Italy)*	94	4151	97	<1:2
H2N3 (Italy)	82	9401	121	1:8
H3N8 (Italy)	93	11263	258	<1:2
H4N8 (Italy)	97	Not tested	Not tested	<1:2
H5N1	95	7775	87	1:512
H5N2 (Italy)	96	11424	264	1:256
H5N3 (Italy)	95	8727	128	1:1024
H5N9 (Italy)	97	9713	92	1:256
H7N1 (Italy)	97	11673	227	<1:2
H7N3 (Italy)	94	Not tested	Not tested	<1:2
H7N7 (Italy)	92	11741	239	<1:2
H8N4 (Italy)	95	12273	259	<1:2
H10N1 (Italy)	94	Not tested	Not tested	1:8
H11N9 (Italy)	97	Not tested	Not tested	<1:2
H12N5 (Italy)	89	11196	293	<1:2
H13N6 (Italy)	92	8937	120	<1:2
H14N5 (Italy)	96	Not tested	Not tested	<1:2
H15N6 (Italy)	91	Not tested	Not tested	<1:2
EDS-76	10	101	9	<1:2
Mycoplasma gallisepticum	42	170	10	<1:2
NDV	24	114	9	<1:2

* 표준혈청(Institute of Zooprophylactic, Viennese, Italy)

<7-3> H9N2 바이러스 공격접종 후 검출 시기 시험

시험은 2회에 걸쳐 실시하였다. 첫 번째 시험은 H9N2 바이러스를 6주령 SPF닭 10수에 10^8.1EID₅₀ _//0.1ml를 0.1ml씩 비강으로 접종하고, 2일 간격으로 각각 개체를 달리하여 20일까지 채혈한 후 본 발명의 진단키트를 이용한 방법으로 항체의 존재여부를 검출하였다. 이때, 기존 표준법인 HI법으로 항체의 존재여부를 검출하여 본 발명의 방법과 비교분석하였다.

두 번째 시험은 바이러스 역가가 첫 번째 시험보다는 낮은 10^4.5EID_50//0.1ml를 이용하여 6주령 SPF닭 6수에 0.1ml씩 비강으로 접종하고, 4, 7, 11, 14일에 채혈한 후 본 발명의 진단키트를 이용하여 항체의 존재여부를 검출하였다. 이때, 기존 표준법인 HI법으로 항체의 존재여부를 검출하여 본 발명의 방법과 비교분석하였다. 비교시험으로서 HI법은 OIE의 술식대로 진행하였다. V 바닥 플레이트 (V buttom plate)에 각 혈청을 25ul씩 2진 희석하고 4HAU의 H9N2 바이러스를 동량 첨가하여 30분간 실온에서 반응시키고, 1% 닭 적혈구를 25ul첨가한 후 실온에서 40분간 방치 후 응집이 되지 않는 최고의 희석배수를 역가로 산정하였다.

실험 결과, 10^8.1EID₅₀ _/0.1ml 및 10^4.5EID₅₀ _//0.1ml를 0.1ml씩 비강으로 공격 접종한 그룹 모두 접종 4일째부터 본 발명의 진단키트로 항체 양전현상을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 진단키트는 기존의 HI 방법과 유사하게 항체를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 3 및 표 7).

H9N2 공격접종 후 항체가 변화

	본 발명에 따른 진단 결과		HI
접종후 경과일	흡광도	PI값
NC	2.511
NC	2.388
PC	0.007
PC	0.010
day 0-1	2.091	15	0
day 0-2	2.140	13	0
day 0-3	1.542	37	0
day 4-1	1.099	55	2
day 4-2	0.865	65	3
day 4-3	1.648	33	2
day 7-1	0.140	94	4
day 7-2	0.019	99	7
day 7-3	0.019	99	5
day 11-1	0.178	93	10
day 11-2	0.040	98	10
day 11-3	0.003	100	10
day 14-1	0.022	99	10
day 14-2	-0.018	101	10
day 14-3	0.515	79	10
blank	2.291	6

- 공격접종량 : 10^4.5EID₅₀/0.1ml, 0.1ml,/I.N

<7-4> H9N2 백신 접종후의 항체가 변화에 대한 시험

H9N2 백신을 SPF 닭 12수에 접종한 후 항체가 변화를 본 발명의 진단키트를 이용하여 측정하였으며, 대조군은 3수를 두었다. 이때, 기존 표준법인 HI 법으로도 항체가 변화를 측정하여 본 발명의 진단키트와 비교하였다.

시험에 공시한 백신은 불활화된 H9N2 바이러스 (2(10) HAU)를 AlOH₃ 겔과 혼합한 백신이었으며, 근육으로 0.5ml씩 접종되었었다. 2주 후에 추가접종을 실시하였다. 항체가 측정을 위한 채혈은 접종전과 1차 접종 14일 후, 2차 접종 2주 후에 실시하였다.

실험 결과, H9N2 백신을 접종한 후 1차 접종 14일부터 항체를 검출할 수 있었다(표 8). 그러나 그 이전에도 충분히 검출할 수 있을 것으로 예상되지만 검체가 접종 후 14일부터 확보되었음으로 본 시험에서 그 이전의 항체 양전은 확인 할 수 없었다.

H9N2 백신 접종 후의 항체가 측정 결과

혈청번호	본 발명의 진단키트		HI (2ⁿ)
혈청번호	흡광도	판정	역가	판정
접종전-1	2.665	음성	1	음성
접종전-2	2.660	음성	2	음성
접종전-3	2.578	음성	1	음성
접종전-4	2.348	음성	2	음성
접종전-5	2.553	음성	2	음성
1차접종 2주후-1	0.053	양성	7	양성
1차접종 2주후-2	0.055	양성	10	양성
1차접종 2주후-3	0.029	양성	9	양성
1차접종 2주후-4	0.025	양성	9	양성
1차접종 2주후-5	0.022	양성	8	양성
1차접종 2주후-6	0.279	양성	9	양성
1차접종 2주후-7	0.039	양성	5	양성
1차접종 2주후-8	0.026	양성	9	양성
1차접종 2주후-9	0.029	양성	8	양성
1차접종 2주후-10	0.022	양성	9	양성
1차접종 2주후-11	0.058	양성	7	양성
1차접종 2주후-12	0.026	양성	8	양성
1차접종 2주후-대조-1	2.615	음성	2	음성
1차접종 2주후-대조-2	2.625	음성	1	음성
1차접종 2주후-대조-3	2.586	음성	2	음성
2차접종 2주후-1	0.035	양성	10	양성
2차접종 2주후-2	0.023	양성	9	양성
2차접종 2주후-3	0.053	양성	7	양성
2차접종 2주후-4	0.040	양성	10	양성
2차접종 2주후-5	0.013	양성	12	양성
2차접종 2주후-6	0.055	양성	9	양성
2차접종 2주후-7	0.020	양성	11	양성
2차접종 2주후-8	0.036	양성	10	양성
2차접종 2주후-9	0.013	양성	10	양성
2차접종 2주후-10	0.021	양성	9	양성
2차접종 2주후-11	0.044	양성	11	양성
2차접종 2주후-대조-1	2.728	음성	0	음성
2차접종 2주후-대조-2	2.845	음성	1	음성
2차접종 2주후-대조-3	2.690	음성	2	음성

<7-4> H5N1 백신 접종 후의 항체가 변화에 대한 시험

닭, 오리 각 5마리씩 및 거위 8마리에 H5N1 백신을 근육으로 0.5ml씩 접종하였다. 그 후 닭은 접종한 지 10일과 28일에, 거위 및 오리는 30일에 채혈하여 본 발명의 진단키트 또는 기존의 시판 중인 키트(Synbiotics사 키트, Avivac사 키트, 상기는 모두 간접효소면역측정 ELISA 키트임)를 이용한 진단 시험 및 H5에 대한 HI 검사를 실시하였다.

그 결과, H5N1 백신을 접종한 닭, 거위, 오리 모두 항체를 검출할 수 있었으며, 닭은 10일 후부터 거위 및 오리는 30일째 검출할 수 있었다(표 9). 물론, 닭의 경우 10일 이전, 거위 및 오리의 경우 30일 이전에도 검출 가능할 것으로 판단되나, 시험에 공시된 검체가 없었으므로 확인할 수 없었다. 한편, 기존의 시판중인 ELISA 키트들은 닭 혈청만을 이용할 수 있기 때문에 시험을 할수 없었으나, 본 발명의 진단키트는 모든 축종에 사용이 가능하였으며 그 결과 역시 기존의 HI 법과 유사하게 나타났다.

H5N1 백신 접종 후의 항체가 측정 결과

No.	혈청내역	본 발명 Pos≥51	Synbiotics사, Pos≥338	EU, Avivac사, Pos≥15	H5 HI 역가, Pos≥1:16
1	닭, 백신 접종 후 10일	63	2242	36	1:8
2	닭, 백신 접종 후 10일	64	810	37	1:8
3	닭, 백신 접종 후 10일	68	3358	10	1:8
4	닭, 백신 접종 후 10일	71	1049	25	1:32
5	닭, 백신 접종 후 10일	64	1659	38	1:8
6	닭, 백신 접종 후 28일	73	8475	72	1:128
7	닭, 백신 접종 후 28일	90	7427	59	1:128
8	닭, 백신 접종 후 28일	91	5622	57	1:256
9	닭, 백신 접종 후 28일	92	4199	28	1:256
10	닭, 백신 접종 후 28일	93	1355	18	1:256
11	거위, 백신 접종 후 30일	80	Not tested	Not tested	1:8
12	거위, 백신 접종 후 30일	84	Not tested	Not tested	1:32
13	거위, 백신 접종 후 30일	82	Not tested	Not tested	1:16
14	거위, 백신 접종 후 30일	85	Not tested	Not tested	<1:2
15	거위, 백신 접종 후 30일	82	Not tested	Not tested	1:8
16	거위, 백신 접종 후 30일	83	Not tested	Not tested	1:8
17	거위, 백신 접종 후 30일	67	Not tested	Not tested	1:16
18	거위, 백신 접종 후 30일	81	Not tested	Not tested	1:64
19	오리, 백신 접종 후 30일	12	Not tested	Not tested	1:8
20	오리, 백신 접종 후 30일	84	Not tested	Not tested	<1:2
21	오리, 백신 접종 후 30일	87	Not tested	Not tested	1:8
22	오리, 백신 접종 후 30일	86	Not tested	Not tested	1:16
23	오리, 백신 접종 후 30일	88	Not tested	Not tested	1:16

<7-5> 축종별 민감도 및 특이도 측정

본 발명에 따른 진단키트가 모든 축종에 적용 가능한지를 확인하기 위해 축종별 민감도 및 특이성을 확인하였다. 이때, 본 발명의 진단키트를 이탈리아 IZS의 ELISA 및 HI 법과 대비하였다. 본 발명에 따른 진단키트를 이용하여 각 동물별로 검사한 항체가와 종래의 HI 법으로 검사한 항체가를 기초로 하여 TG-ROC 방법에 의해 민감도와 특이도를 도표로 그려서 민감도 특이도가 적절한 수준(민감도와 특이도가 어느 한쪽만 높은 것이 아닌)인 때를 PI 값으로 확립하였다.

한편, 일반적으로 민감도 및 특이성은 95% 이상이면 아주 우수하고, 80% 이상이면 활용성이 있는 것으로 판단되는데, 본 발명의 진단키트의 민감도 및 특이성은 각 동물에 대해 대부분 우수한 수준으로 나타났으므로 12종의 동물에서 사용가능함을 확인할 수 있었다(표 10).

본 발명에 따른 진단키트의 축종별 민감도 및 특이도

축종	PI 값*	시험수	HI 대비		IZS사 ELISA 대비
축종	PI 값*	시험수	민감도(%)	특이도(%)	민감도(%)	특이도(%)
오리	50	1,031	95.4	98.5	Not tested	Not tested
칠면조	85	213	97.1	100	97.1	100
돼지	50	266	95.2	97.4	Not tested	Not tested
닭	50	1,613	98.2	97.3	Not tested	Not tested
거위	50	25	100	86.7	100	100
기니아폴	50	19	87.5	100	87.5	100
퀘일	50	46	100	97	100	78
그레이파트리지	50	38	75	94.1	100	100
레드파트리지	50	5	Not tested	100	Not tested	100
꿩	50	18	100	66.7	100	75
백조	50	4	50	Not tested	100	100
말	500	63	Not testd	Not testd	100	Not testd

* PI값 : 50 기준일 때, PI값이 50 이상이면 양성, 50 미만이면 음성

도 1은 경쟁적 효소면역측정법의 원리를 기초로 한 본 발명의 진단 방법을 도식화 한 것이다.

도 2는 도트 면역분석법(Dot immunoassay)을 이용한 본 발명에 따른 조류 인플루엔자 항원 진단용 단클론 항체의 특이성을 검사한 결과이다.

도 3은 H9N2 공격 접종 후 항체가의 변화를 본 발명에 따른 진단키트를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

접종량 : 10^8.1EID₅₀/0.1ml, 0.1ml,/I.N

<110> National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS) <120> Diagnostic kit for avian influenza virus antibody using competetive ELISA and diagnostic method using the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 1 agcaaaagca gggttaataa tcac 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 2 agtagaaaca agggtatttt tcctc 25 <210> 3 <211> 1565 <212> DNA <213> Avian Influenza Virus(A/CK/Korea/MS96/96 (H9N2)) <220> <221> gene <222> (1)..(1565) <223> Nucleoprotein <400> 3 agcaaaagca gggttaataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtcccaaggc 60 accaaacggt cttatgaaca gatggaaact gatggggatc gccagaatgc aactgagatt 120 agggcatccg tcgggaagat gattgatgga attgggagat tctacatcca aatgtgcact 180 gaacttaaac tcagtgatca tgaagggcgg ttgatccaga acagcttgac aatagagaaa 240 atggtgctct ctgcttttga tgaaagaagg aataaatacc tggaagaaca ccccagcgcg 300 gggaaagatc ccaagaaaac tggggggccc atatacagga gagtagatgg aaaatggatg 360 agggaactcg tcctttatga caaagaagaa ataaggcgaa tctggcgcca ggccaacaat 420 ggtgaggatg cgacagctgg tctaactcac ataatgatct ggcattccaa tttgaatgat 480 gcaacatacc agaggacaag agctcttgtt cgaactggaa tggatcccag aatgtgctct 540 ctgatgcagg gctcgactct ccctagaagg tccggagctg caggtgctgc agtcaaagga 600 atcgggacaa tggtgatgga actgatcaga atggtcaaac gggggatcaa cgatcgaaat 660 ttctggagag gtgagaatgg gcggaaaaca agaagtgctt atgagagaat gtgcaacatt 720 cttaaaggaa aatttcaaac agctgcacaa agagctatgg tggatcaagt gagagaaagt 780 cggaacccag gaaatgctga gatcgaagat ctcatatttt tggcaagatc tgcattgata 840 ttgagagggt cagttgctca caaatcttgc ctacctgcct gtgcgtatgg acctgcagta 900 tccagtgggt acgacttcga aaaagaggga tattccttgg tgggaataga ccctttcaaa 960 ctacttcaaa atagccaaat atacagccta atcagaccta acgagaatcc agcacacaag 1020 agtcagctgg tgtggatggc atgccattct gctgcatttg aagatttaag attgttaagc 1080 ttcatcagag ggacaaaagt atctcctcgg gggaaactgt caactagagg agtacaaatt 1140 gcttcaaatg agaacatgga taatatggga tcgagcactc ttgaactgag aagcgggtac 1200 tgggccataa ggaccaggag tggaggaaac actaatcaac agagggcctc cgcaggccaa 1260 accagtgtgc aacctacgtt ttctgtacaa agaaacctcc catttgaaaa gtcaaccatc 1320 atggcagcat tcactggaaa tacggaggga agaacttcag acatgagggc agaaatcata 1380 agaatgatgg aaggtgcaaa accagaagaa gtgtcattcc gggggagggg agttttcgag 1440 ctctcagacg agaaggcaac gaacccgatc gtgccctctt ttgatatgag taatgaaggg 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaagag tacgacaatt aaggaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565

Claims

(a) 기탁번호가 KCLRF-BP-00166인 하이브리도마 세포에 의해 생산된, 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체가 흡착된 마이크로플레이트에 재조합 핵단백질 항원이 결합된 인플루엔자 항원 흡착 플레이트; 및

(b) 기탁번호가 KCLRF-BP-00167인 하이브리도마 세포에 의해 생산된, 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질에 대한 단클론 항체와 효소가 접합된 효소표지항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 진단키트.
제1항에 있어서, 음성대조혈청, 양성대조혈청, 세척액, 효소 활성 측정용 기질액 및 효소 반응 정지액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스가 국내 분리주인 조류 인플루엔자(A/CK/Korea/ES/03(H5N1))임을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 단클론 항체는 H1 내지 H15 형 바이러스에 특이적인 것임을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 재조합 핵단백질은 조류 인플루엔자 바이러스(A/CK/Korea/MS96/96 (H9N2))로부터 클로닝된 핵단백질 유전자를 베큘로바이러스에 도입시킨 후 이를 곤충세포에 접종함으로써 제조된 것임을 특징으로 하는 키트.
제5항에 있어서, 상기 핵단백질 유전자가 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제 및 인버타아제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서, 상기 효소는 퍼옥시다아제임을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 오리, 칠면조, 돼지, 닭, 거위, 기니아폴, 퀘일, 그레이파트리지, 레드파트리지, 꿩, 백조 및 말로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나에서 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항의 조류 인플루엔자 항원 흡착 플레이트에 검사시료 및 제1항의 효소표지항체를 동시에 첨가하여 검사시료 내 항체와 효소표지항체가 경쟁적으로 반응하도록 한 다음 발색제를 첨가하여 검사시료 내 항체의 존재여부를 판별하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 항체의 검출방법.
제10항에 있어서, (a) 제1항의 인플루엔자 항원 흡착 플레이트에 검사시료, 음성대조혈청 및 양성대조혈청을 각각 분주하고, 동시에 제1항의 효소표지항체를 처리하여 반응시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 반응이 완료된 플레이트를 세척하고 기질용액을 처리하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 플레이트에 반응정지액을 처리하고 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 음성대조혈청은 3 웰(well)을 이용하여 시험하며 평균 흡광도 값이 1.8000 이상 이어야 함을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 (a) 단계의 양성대조혈청은 2 웰(well)을 이용하여 시험하며 평균 흡광도 값이 0.2000 이하 이어야 함을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 측정된 검사시료의 흡광도로부터 하기 식을 이용하여 PI 값을 산출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

PI 값 = [1-(샘플 흡광도/음성대조액 평균 흡광도)] X 100
제14항에 있어서, 상기 산출된 검사시료의 PI 값이 판정기준값 이상인 경우에 양성으로, 미만인 경우에는 음성으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 판정기준값이 닭, 오리, 메추리, 거위, 기니아폴, 그 레이 파트리지, 레드 파트리지, 꿩, 백조, 말 및 돼지인 경우에는 50이고 칠면조의 경우 85임을 특징으로 하는 방법.