KR101211593B1 - 신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법 - Google Patents

신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 이용한 신속 면역크로마토그라피법에 의해 닭 총배설강(분변) 스왑시료에서 H9형 조류인플루엔자 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 진단 키트 및 이를 이용하여 H9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

신속 면역크로마토그라피법에 의한 Ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 Ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법{Diagnostic kit for H9 type avian influenza virus using rapid immunochromatography and the method for diagnosing H9 type avian influenza by using the same}
본 발명은 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 이용한 신속 면역크로마토그라피법에 의해 닭 총배설강(분변) 스왑시료에서 H9형 조류인플루엔자 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 진단 키트 및 이를 이용하여 H9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법에 관한 것이다.
조류인플루엔자(Avian Influenza)는 닭, 칠면조 및 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조의 가금류에 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다. 조류인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양한 질병으로 세계동물보건기구(OIE)에서는 병원성에 따라 고병원성과 저병원성 조류인플루엔자로 분류하고 있다.
조류인플루엔자의 원인체는 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 A형 인플루엔자 바이러스(Infuenza virus type A)로서, A형 인플루엔자의 혈청형은 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin)과 뉴라미니다제(Neuraminidase)의 종류에 따라 구분되는 H 혈청형과 N 혈청형이 있다. 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형은 각각의 H 혈청형과 N 혈청형으로 표시하며(예: H9N2형), H 혈청형이 16가지, N 혈청형이 9가지 종류가 있으므로, 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 144가지로 나타낼 수 있다. 1996년 첫 발생 이후 현재까지 국내에서 유행하고 있는 조류인플루엔자의 혈청형은 H9N2형에 속하는 저병원성 조류인플루엔자이다.
조류인플루엔자 바이러스는 비말이나 물 등에 의하여 전파될 수 있으며(잠복기 3-14일) 가장 중요한 전파방법은 분변의 직접적 접촉이다. 분변 속에 있는 바이러스는 최소한 4℃에서 35일 이상 생존이 가능하며, 바이러스에 오염된 분변 1 g은 약 100만수의 닭을 감염시킬 수 있다. 조류인플루엔자 바이러스는 사람의 발, 사료차, 기구, 장비 또는 계란 표면에 분변이 묻어 다른 닭에게 직접적으로 전파가 된다. 계란을 통한 난계대 전염은 일어나지 않으나, 난각에 오염된 분변을 통하여 전파될 수 있으므로, 질병이 발생한 종계에서 생산된 종란과 병아리의 이동은 질병을 전파시킬 수 있다. 현재 국내에서 유행하고 있는 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자의 임상증상은 바이러스의 종류에 따라 다양하며 호흡기증상, 설사, 산란율의 급격한 감소 또는 벼슬 등 머리부위에 청색증을 보이며, 폐사율은 0～60%, 산란율도 10～50%까지 다양하게 관찰된다.
조류인플루엔자 바이러스 감염의 진단은 유전자 검사, 바이러스의 분리 및 혈청학적 검사가 있다. 유전자 검사는 감염된 닭의 분변, 기관, 맹장편도와 기타 실질장기의 시료로부터 유전자를 추출한 후 RT-PCR을 통해 바이러스 감염여부와 감염된 바이러스의 혈청형을 확인할 수 있다. 바이러스 분리는 감염된 시료를 SPF (Specific Pathogen Free) 종란에 접종하여 혈구응집능 바이러스를 확인 및 분리하여 H형 및 N형의 혈청형별 특이 항체를 이용하여 HI(혈구응집억제반응) 및 NI(뉴라미니다제 억제반응)를 통해 분리된 바이러스의 혈청형을 동정할 수 있다. 혈청학적 검사로는 혈액을 이용한 혈구응집억제반응(HI), 한천내침강반응(AGID) 및 효소결합면역흡수법(ELISA)을 통해 계군의 감염여부를 판단할 수 있으며 대량검사가 가능하여 모니터링 검사방법으로 사용하고 있다. 이러한 유전자 검사, 바이러스 분리 및 혈청학적 검사를 하기 위해서는 적절한 시약, 장비 및 전문적인 기술이 있는 실험실에서 이루어져야 하며, 진단시간은 빠르면 3시간에서 5일 정도의 시간이 소요된다.
최근에는 면역크로마토그라피법(Immunochromatography)을 이용한 사람 인플루엔자 바이러스 항원 신속 검사 키트가 개발되어 주로 국내외 병원에서 사람 인플루엔자 바이러스 감염을 진단하는데 널리 이용되고 있으며 이러한 검사 키트는 모두 수입에 의존하고 있는 실정이다. 동물용으로는 일반 조류 인플루엔자 바이러스와 H5형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 신속 면역크로마토그라피법 검사 키트가 개발되어 상업적으로 이용되고 있으나, H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 검출을 위해 상업적으로 이용가능한 신속 진단 키트의 개발은 이루어지지 않았다. 따라서, 상업적으로 이용가능한 H9형 저병원성 조류인플루엔자의 진단 키트의 필요성이 대두되고 있다.
이에 본 발명자들은 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 제조하여 사용할 경우 조류 총배설강(분변) 스왑시료에서 신속 면역크로마토그라피법에 의해 H9형 조류인플루엔자 감염여부를 신속하고 정확하게 감별할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 현장에서 특별한 검사 장비 없이 짧은 시간 안에 손쉽게 조류인플루엔자 감염여부를 진단할 수 있는 진단 키트 및 이를 이용하여 조류인플루엔자를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 기탁번호 KCTC 11753BP, KCTC 11754BP 및 KCTC 11755BP의 하이브리도마 세포로부터 생산되고 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자에 특이적인 단클론 항체를 포함하는 H9형 조류인플루엔자 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 진단 키트를 이용하여 조류인플루엔자를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 키트는 총배설강(분변) 스왑시료를 검체로 사용하여 H9형 조류인플루엔자의 감염여부를 현장에서 특별한 검사 장비 없이 간편하고 신속하게 진단할 수 있었다.
도 1a는 본 발명에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립의 단면도이고[1) 검체 패드, 2) 골드 패드, 3) 멤브레인(T: 검사원 위치, C: 대조선 위치), 4) 흡습패드, 5) 플라스틱 카드], 도 1b는 상기 진단 스트립의 항체-항원 반응 모식도이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명에 의한 진단 스트립의 측정 범위 및 검출한계를 보여준다.
도 3a 및 3b는 본 발명에 의한 진단 스트립의 교차 반응성을 조사한 결과이다.
도 4a 내지 4d는 본 발명에 의한 진단 스트립의 표준주 및 국내 분리 H9형 조류인플루엔자에 대한 반응성 조사 결과이다.
도 5a 및 5b는 본 발명에 의한 진단 스트립을 이용하여 H9형 조류인플루엔자 바이러스 인공 감염 후 인후두 및 총배설강 스왑을 통한 검출시기 및 검출율을 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명에 의한 진단 스트립의 민감도를 실험한 결과이다.
본 발명은 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체들을 사용하여 신속 면역크로마토그라피법에 의해 총배설강(분변) 스왑시료에서 H9형 조류인플루엔자 바이러스를 감별적으로 검출할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 의한 진단 키트는 기탁번호 KCTC 11753BP, KCTC 11754BP 및 KCTC 11755BP의 하이브리도마 세포로부터 생산되고 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자에 특이적인 단클론 항체들을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 진단 키트는 도 1a에 도시된 구성을 갖는 진단 스트립 형태로 제조될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 도 1a에서, 상기 진단 스트립은 1) 검체 패드, 2) 골드 패드, 3) 멤브레인(T: 검사원 위치, C: 대조선 위치), 4) 흡습 패드 및 5) 플라스틱 카드로 구성된다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 진단 스트립을 이용하여 면역크로마토그라피법으로 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자 바이러스를 진단할 수 있다. 보다 상세히 살펴보면, 멤브레인에 H9형 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 특이적인 항체를 흡착 패드에 흡착시키고, 골드 입자에 또 다른 항체를 접합시킨 골드 접합체를 골드 패드에서 건조시킨다. 건조된 골드 접합체를 포함하는 골드 패드와 검체를 적용하는 검체 패드를 중첩하여 멤브레인 위에 얹고 반대편 위치에 흡습 패드를 부착시킨 후 이를 검체 적용 홀과 결과 표시창이 구비된 플라스틱 디바이스에 넣어 H9형 조류인플루엔자 진단 키트를 제조한 다음, 검체 적용 홀에 닭 스왑(분변) 시료로부터 얻은 검액을 약 120～150 ㎕(4～5 drops) 넣으면 검체 중에 존재하는 조류인플루엔자 바이러스가 골드 입자에 부착된 각각의 항체와 반응을 하면서 모세관 현상에 의해서 멤브레인 위에서 전개된다.
도 1b는 상기 진단 스트립의 항체-항원 반응 모식도로서, 분변시료 내 H9형 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 있을 경우 골드입자가 부착된 H9형 특이항체(#17)와 항원-항체 복합체(바이러스-#17 복합체)를 형성하여 전개가 시작된다. 이후 검사선에 H9형 특이항체들(2G9, 5D9)이 부착되어 있어 이전의 항원-항체 복합체(바이러스-#17 복합체)가 전개될 경우 추가로 항원항체 복합체(2G9,5D9-바이러스-#17 복합체)가 형성되어 검사선에 골드입자가 축적되면서 보라색을 띄게 된다.
이때, 상기 단클론항체들(#17, 2G9, 5D9))은 마우스에서 생산된 것이다. 또한 마우스 면역글로불린(IgG)을 정제한 후 산양에 접종하여 면역글로불린에 대한 항체를 생산한 다음 이를 대조선에 부착하였으며, 골드입자가 부착된 마우스 항혈청은 검사선과 반응하고, 남은 항체는 대조선에서 반드시 마우스 면역글로불린 항체와 복합체를 형성하여 보라색을 띄게 된다. H9형 조류인플루엔자 바이러스가 없을 경우 검사선에서는 반응이 관찰되지 않고 대조선은 반드시 보라색 반응이 관찰되어야 한다.
본 발명에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 키트의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 나이트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 또는 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
상기 멤브레인에는 헤마글루티닌 항원이 H9형 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 일정한 위치에 흡착시켜 놓아 해당 바이러스 항원이 검체 중에 존재하는 경우에는 골드 입자에 접합된 항체에 반응한 각각의 바이러스 항원이 멤브레인에 흡착된 항체와 다시 반응하여 해당 위치에 골드 입자 색에 의한 보라색 밴드를 형성한다. 대조선 위치에는 항-마우스 IgG를 흡착시켜 마우스 IgG가 흡착된 골드 입자가 검체 중의 바이러스 항원의 존재 여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 밴드를 나타내게 한다. 반응하지 않은 내용물은 흡습 패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. 즉, 검체 중에 헤마글루티닌 항원을 H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면 그 바이러스에 특이적인 단클론 항체가 흡착된 위치 및 대조선 위치에 보라색 밴드가 동시에 형성된다. 또한 검체 중에 H9형 이외의 조류 인플루엔자 바이러스가 존재하거나 바이러스가 없을 경우 대조선 부위에만 보라색 밴드가 형성된다.
본 발명의 일 실시예에서 기탁번호 KCTC 11755BP의 단클론 항체(#17 항체)는 골드입자와 접합체를 구성하여 멤브레인에 흡착되고, 기탁번호 KCTC 11753BP 및 KCTC 11754BP의 하이브리도마 세포로부터 생산된 단클론 항체(2G9 및 5D9 항체)는 검사선에 흡착시킨다.
또한 본 발명은 상기 H9형 조류인플루엔자 진단 키트를 사용하여 H형 조류인플루엔자를 진단하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 조류인플루엔자 진단용 단클론 항체 제조
1) 조류인플루엔자 항원 정제
국내에서 H9N2형 진단용 항원 및 백신제조용 항원으로 사용하고 있는 H9N2형 조류인플루엔자 바이러스[A/Ck/Kor/301/01 (H9N2)]로부터 준비하였다. 즉 37.0℃에서 9일령 SPF 종란에서 2～3일간 배양한 조류인플루엔자 바이러스를 최종농도 0.2% 포르말린으로 불활화시킨 후 농축 및 정제하였다. 불활화된 조류인플루엔자 바이러스를 1차로 4,000xg에서 30분간 원심분리한 다음 상층액을 2차로 70,000xg에서 3시간 초원심분리(L8-70M, Beckman, USA) 하였다. 원심분리된 펠릿을 다시 재부유(수크로오스 양의 1/25배)하여 수크로오스 밀도구배 초원심분리(sucrose density gradient ultracentrifugation; 100,000 xg, 90분)하고 조류인플루엔자 바이러스 분획(fraction)을 분리하여 조류인플루엔자 단클론 항체 생산용 항원으로 사용하였다.
상기의 방법으로 정제된 항원을 면역원으로 사용하여 Balb/c 마우스에 면역시켰다. 이후 비장 세포를 분리하여 골수종(myeloma)과 접합시켜 조류인플루엔자 바이러스 항원에 대한 단클론 항체를 분비하는 잡종 세포주를 ELISA 방법으로 선별하고 한계희석 방법으로 여러 단세포군을 확립하였다. 이들 세포주를 대량 배양하여 Balb/c 마우스 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 단백질 A/G 겔(gel)을 이용하여 IgG 항체를 정제하였다.
정제된 항체를 이용하여 혈구응집 억제반응(HI)을 통해 H9형 조류인플루엔자 바이러스에 특이적으로 반응하는 항체를 선별하고자 하였다. 획득된 항체 중 72개의 클론에서 HI 양성반응이 관찰되었으며, 그 중 가장 반응성을 보인 3개의 클론(2G9, 5D9 및 #17)을 선별하여 하기 표 1에 나타내었다. 또한 본 발명자들은 상기 3개의 클론을 생산하는 하이브리도마 세포를 한국생명공학연구소 유전자은행에 2010년 8월 25일자로 각각 기탁하여 KCTC 11753BP, KCTC 11754BP 및 KCTC 11755BP를 부여받았다.
HI 반응을 통한 선별된 항체의 효용성 평가
클론 번호 하이브리도마 세포의
기탁번호		 클론생산용 항원 HI 테스트
2G9 KCTC 11753BP A/Ck/Kor/301/01 (H9N2) 24log2
5D9 KCTC 11754BP 26log2
#17 KCTC 11755BP 29log2
[실시예 2] 진단 스트립의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 2G9, 5D9 및 #17 항체를 사용하여 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립을 하기와 같이 제조하였다.
1) 멤브레인 코팅
정제된 H9형 조류인플루엔자 바이러스 항원에 대한 항체 중 상기 실시예 1에서 제조한 2G9, 5D9 두 항체 동일한 농도로 혼합하여 0.58 ㎍/스트립 농도로 PBS에 희석하여 나이트로셀룰로오스 멤브레인 검사선(T: H9형 조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 선) 위치에 흡착시켜 코팅 용액으로 사용하였다. 또한 대조선(C) 위치에는 산양 항 마우스 항체 0.75 ㎍/스트립을 코팅하였다.
2) 골드 패드 제조
상기 실시예 1에서 제조한 #17 항체를 골드 콜로이드(gold colloid)와 결합시켰다. 즉 염화금을 시트로산 나트륨 용액으로 환원시켜 플레인 골드(plain gold)를 제조한 후 각각의 항체를 첨가하면서 40 nm 크기의 항체가 결합된 골드입자를 532 nm에서 흡광도가 10+/-1이 되도록 제조하였다. 여기에 결합된 항체를 안정화시키기 위하여 PEG 용액을 처리하였다. 골드 입자와 항체가 결합된 각각의 골드 접합체들을 혼합하여 8.3 ㎕/스트립이 되도록 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적신 후 건조시켜 골드 패드를 제조하였다.
3) 흡습 패드 및 검체 패드 제조
흡습패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다.
4) 디바이스 조립
도 1에 도시된 바와 같이 상기에서 제조한 1) 검체 패드, 2) 골드 패드, 3) 멤브레인(T: 검사원 위치, C: 대조선 위치), 4) 흡습패드, 및 5) 플라스틱 카드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45 mm/스트립 크기로 절단하였다. 이렇게 절단된 스트립을 최종 디바이스의 하판에 넣고 상판을 덮었다.
5) 최종 제품 구성
상기에서 설명된 디바이스에 검체 채취용 면봉, 희석액(50 mM 트리스(Tris), 0.02% 아지드화 나트륨(Sodium azide), 0.1% 트리톤(triton) X-100, pH 8.0, 1회 시험 시 1 ㎖ 사용)을 구비하여 최종 진단 스트립을 제조하였다.
6) 본 발명에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립의 검사원리
본 발명에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립 사용 시 닭의 총배설강(분변) 스왑시료를 검체 희석액으로 희석하여 검체 적용홀에 적용한다. 이때 검체 중에 H9형 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면 골드 패드의 골드 입자에 접합되어 있는 #17 항체와 1차로 결합하게 되며, 이후 이 결합체는 면역크로마토그라피법 원리에 의해 멤브레인을 따라 이동하게 되면서 멤브레인의 검사선 위치(T)에 있는 2G9 및 5D9 항체와 2차적으로 결합하면서 항체-항원-항체 복합체를 형성하면서 대조선 밴드와 함께 2개 보라색 밴드를 나타낸다(도 1b).
[시험예 1] 검출 한계 조사
상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립의 측정 범위 및 검출한계를 알아보기 위하여, 혈구응집반응 역가 측정 및 EID 역가를 통해 분리주 유래가 서로 다른 H9형 조류인플루엔자 바이러스를 이용하여 실시하였다.
혈구응집반응 역가(Hemagglutination Titer)는 V 바닥 96웰 플레이트의 모든 웰에 PBS(pH 7.2)를 25 ㎕씩 첨가하고 각 1번 웰에 분리주 유래가 서로 다른 H9형 조류 인플루엔자 바이러스를 25 ㎕씩 첨가한 후 2진 희석하였다. 그 후 1% 닭 적혈구 부유액을 25 ㎕ 첨가하고 잘 흔들어 준 다음 실온에서 40분간 정치하였다. 혈구응집반응 역가는 적혈구를 응집시키는 최고 희석배수로 결정하였다.
종란감염 용량(Egg Infectious Dose: EID50)은 9-11일령의 SPF 부화란에 분리주 유래가 서로 다른 H9형 조류인플루엔자바이러스를 10진 희석하여 장요막강내로 0.1 ml씩 접종한 후 37.0℃에서 3일간 배양하고, 다시 장요막강액을 5% 닭 적혈구 부유액과 혼합하여 평판 혈구응집반응을 하여 바이러스 감염 여부를 판정하였다. 역가의 계산은 Reed & Munch법으로 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2 내지 4 및 도 2a 내지 2c에 나타내었다.
닭유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스, 1HAU=105.1EID50/0.1㎖
희석배수 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210
혈구응집 + + + + + + + - - -
HAU 64 32 16 8 4 2 1
키트반응성 + + + + + + + - - -
오리유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스, 1HAU=104.2EID50/0.1㎖
희석배수 21 22 23 24 25 26 27 28
혈구응집 + + + + + - - -
HAU 16 8 4 2 1
키트반응성 + + + + + - - -
야생조류유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스, 2HAU=105.4EID50/0.1㎖
희석배수 21 22 23 24 25 26 27 28 29
혈구응집 + + + + + + + - -
HAU 64 32 16 8 4 2 1
키트반응성 + + + + + + - - -
상기 표 2 내지 4 및 도 2a 내지 2c의 결과에서, 본 발명에 의한 3개의 단클론 항체(2G9, 5D9 및 #17)를 포함하는 실시예 2의 진단 스트립에서 높은 반응성이 관찰되었다. 보다 상세하게는, 검사선(T)의 분리주 유래에 따라서 차이가 있는 것으로 나타났으며, 닭유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스에 대해서는 1 HAU(105.1EID50/0.1㎖)까지, 오리유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스에 대해서는 1 HAU(104.2EID50/0.1㎖), 그리고 야생조류유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스에 대해서는 2 HAU(105.4EID50/0.1㎖)까지 검출할 수 있었다.
[시험예 2] 교차반응성 조사
상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립의 교차반응성을 조사하기 위하여 H1 내지 H15형 조류인플루엔자 바이러스와 조류에 병원성이 있는 여러 종류의 다른 바이러스에 감염된 검체를 상기 진단 스트립에 적용하였으며, 그 결과를 표 5 및 6, 및 도 3a 및 3b에 나타내었다.
조류인플루엔자 HA혈청형에 따른 교차반응성 조사
혈청형 H1N1 H2N2 H3N8 H4N6 H5N3 H6N5 H7N1 H8N4 H9N2 H10N7 H11N6 H12N5 H13N6 H14N5 H15N6
키트반응성 - - - - - - - - + - - - - - -
조류유래 다른 바이러스들과의 교차반응성 조사
바이러스 조류유래 바이러스 H9N2형 조류인플루엔자 바이러스
APV IBV NDV IBDV 310/01 Q30/04 164/04 136/04 116/04 ms96/96
키트반응성 - - - - + + + + + +
※APV: 뉴모 바이러스, TRTV 주, IBV: 전염성 기관지염 바이러스, KS96 주, NDV: 뉴캣슬병 바이러스, 교정원 주, IBDV:감보로 바이러스, Winterfield 2510 주
상기 표 5, 표 6, 도 3a 및 3b의 결과에서, 실시예 2에서 제조한 진단 스트립은 H9형 조류인플루엔자 바이러스에만 특이적으로 양성 반응을 나타내었다. 반면, H9형 이외의 혈정형 즉, H1-8형 및 H10-15형 조류인플루엔자 바이러스 및 조류 유래 다른 바이러스(뉴모바이러스, 전염성기관지염바이러스, 뉴캣슬병바이러스 및 전염성 F 낭병바이러스)에 대해서는 모두 음성을 나타내었다.
[시험예 3] H9형 표준주 및 닭, 오리, 야생조류 유래 조류인플루엔자 바이러스에 대한 반응성 조사
상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립의 H9형 조류인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 조사하기 위하여, H9형 미국 표준주 및 국내 닭, 오리, 야생조류에서 분리된 다양한 여러 H9형 조류인플루엔자 바이러스들에 상기 진단 스트립을 적용하여 반응성을 조사하였으며, 그 결과를 표 7 내지 표 10 및 도 4a 내지 4d에 나타내었다.
바이러스유래 H9형 미국 표준주(Wisconsin1/66)
키트반응성 +
닭유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스
GJ180/08 GJ92/07 GJ91/07 GJ89/07 YS61/07 AS51/06 DY65/04 164/04 136/04 Q30/04 310/01 ms96/96
키트반응성 + + + + + + + + + + + +
오리유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스
GJ77/07 H102-60/07 GJ113/07 GJ84/07 GJ83/07
키트반응성 + + + + +
야생조류유래 H9형 조류인플루엔자 바이러스
PJ24/07 PSC29/05 KH21/05 UP59/04 ES12/04
키트반응성 + + + + +
그 결과, 실시예 2에서 제조한 진단 스트립은 H9형 조류인플루엔자 바이러스의 미국 표준주 뿐만 아니라 다양한 국내 분리 조류인플루엔자 바이러스들 모두에 대해서 양성반응을 보였다.
[시험예 4] 총배설강 스왑을 통한 검출시기 및 검출율 비교
실제 감염동물에서 상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립의 검출능을 조사하기 위하여, 6주령 SPF 닭에 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(A/Ck/Kor/310/01, H9N2) 106.5EID50/0.1ml를 비강으로 감염시킨 후 일자별로 바이러스의 존재여부를 종란접종법으로 조사하고, 이에 대한 상기 진단 스트립의 반응성 유무를 확인하였으며, 그 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다.
도 5a의 결과에서, 닭의 인후두 스왑에서 종란접종법을 통한 바이러스 분리 결과 감염 후 7일까지 조류인플루엔자 바이러스가 배설되는 것이 확인되었다. 반면, 본 발명에 의한 실시예 2의 진단 스트립의 반응성을 조사한 결과, 감염 후 4일째 한 개체에서만 양성반응이 검출되어 바이러스 분리 대비 10%의 키트 양성반응이 확인되었다.
이와 달리 닭의 총배설강 스왑에서 종란접종법을 통해 바이러스를 분리한 경우에는 11일까지 조류인플루엔자 바이러스가 배설되는 것을 확인되었으며, 상기 바이러스 접종 개체수 대비 본 발명에 의한 실시예 2의 진단 스트립을 적용한 경우 접종 후 3～6일 동안 50～57%의 키트 양성반응이 관찰되었다(도 5b). 한편 동 기간동안(감염 후 3～6일) 바이러스가 분리된 개체수에 대비할 경우 실시예 2의 진단 스트립에서 57～83%의 비교적 높은 키트 양성율이 나타남을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로 볼 때 야외 닭 농장에서 본 발명에 의한 실시예 2의 진단 스트립을 사용하여 H9형 조류인플루엔자 바이러스의 감염여부를 확인하기 위하여 임상증상이 관찰되는 개체 5～10수에 적용할 경우 효과적인 감염여부를 확인할 수 있을 것으로 판단되었다. 또한 검출 시료를 인후두 스왑 보다 총배설강 스왑을 사용하여 감염 여부를 검사하는 것이 적절하다고 판단되었다.
[시험예 5] 민감도 조사
야외농장에서 조류인플루엔자 감염사례의 분변을 채취하는데 어려움이 있어, 상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립의 검출 최소 함량의 바이러스를 분변에 스파이킹(spiking)하여 상기 진단 스트립의 민감도를 조사하였다. 먼저 분변 0.1 g, 106.1EID50/100㎕의 바이러스(310/01, H9N2) 100 ㎕, 그리고 상기 진단 스트립의 희석액 800 ㎕를 혼합하여, 그 중 상층액 100 ㎕를 진단 스트립에 반응시켰으며, 그 결과를 하기 표 11 및 도 6에 나타내었다.
Figure 112010057893692-pat00001
상기 표 11 및 도 6의 결과에서, 양성 79%, 의양성 15% 및 음성은 6%로 나타났으며, 분변 내 검출 최소 함량의 바이러스에 대하여 본 발명에 의한 실시예 2의 진단 스트립은 효용성이 있는 것으로 판단되었다.
[시험예 6] 특이도 조사
경기도, 충북 및 충남에 위치한 임상증상이 관찰되지 않은 6개의 농장에서 500개의 총배설강 스왑시료를 채취하여 종란접종법을 통한 바이러스 분리검사 및 상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립을 이용한 특이도 시험을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
농장 주소 품종 동 주령 시료수 시험 결과
바이러스
분리		 키트
반응성
A 농장 경기도 평택시 동삭동 산란계 2동 45주령 20점 음성 음성
3동 45주령 20점 음성 음성
4동 45주령 20점 음성 음성
B 농장 경기도 평택시 동삭동 산란계 2동 17주령 20점 음성 음성
1동 49주령 20점 음성 음성
C 농장 경기도 평택시 고덕면 산란계 육추동 14주령 25점 음성 음성
1동 66주령 25점 음성 음성
2동 32주령 25점 음성 음성
4동 49주령 25점 음성 음성
D 농장 충남 천안시 서북구 입장면 산란계 1동 53주령 20점 음성 음성
2동 47주령 20점 음성 음성
3동 66주령 20점 음성 음성
4동 81주령 20점 음성 음성
5동 30주령 20점 음성 음성
E 농장 충북 충주시 소태면 주치리 산란계 4동 17주령 25점 음성 음성
5동 66주령 25점 음성 음성
3동 31주령 25점 음성 음성
6동 38주령 25점 음성 음성
F 농장 경기도 광주시 실촌면 건업리 산란계 A-1동 54주령 25점 음성 음성
A-2동 36주령 25점 음성 음성
B-1동 13주령 25점 음성 음성
B-2동 38주령 25점 음성 음성
상기 표 12의 결과에서, 조류인플루엔자 음성으로 판정된 모든 총배설강 스왑 시료에서 상기 실시예 2에서 제조한 진단 스트립의 특이도 조사 결과 모두 음성으로 관찰되어 특이도가 100% 임을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11753BP 20100825 한국생명공학연구원 KCTC11754BP 20100825 한국생명공학연구원 KCTC11755BP 20100825

Claims (6)

  1. 기탁번호 KCTC 11753BP, KCTC 11754BP 및 KCTC 11755BP의 하이브리도마 세포로부터 생산되고 헤마글루티닌 항원이 H9형인 조류인플루엔자에 특이적인 단클론 항체를 포함하는 H9형 조류인플루엔자 진단 키트.
  2. 제 1항에 의한 단클론 항체를 포함하고,
    검체패드, 골드패드, 나이트로셀룰오스 멤브레인 및 흡습패드로 구성된 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립.
  3. 제 2항에 있어서,
    기탁번호 KCTC 11753BP 및 KCTC 11754BP의 하이브리도마 세포로부터 생산된 각각의 단클론 항체가 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 흡착된 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립.
  4. 제 2항에 있어서,
    골드패드는 골드 입자와 기탁번호 KCTC 11755BP의 하이브리도마 세포로부터 생산된 단클론 항체를 결합시킨 골드 접합체를 포함하는 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립.
  5. 제 1항에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 키트를 사용하여 조류를 대상으로 H9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법.
  6. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 H9형 조류인플루엔자 진단 스트립을 사용하여 조류를 대상으로 H9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법.
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