KR101799142B1 - 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트 - Google Patents
조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 라텍스를 매개체로 하여 조류 인플루엔자 바이러스의 항원인 핵단백질에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트 및 상기 키트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 형광면역진단키트를 이용하면, 미량의 시료를 사용하더라도 상기 시료에 포함된 조류 인플루엔자 바이러스와 같은 다양한 유전형의 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질을 종래의 키트에 비하여 약 2.5배 향상된 검출감도로 검출 또는 정량분석할 수 있을 뿐만 아니라, 인플루엔자 A 바이러스 이외의 다른 호흡기 감염성 바이러스는 검출하지 않는 특이성을 나타내므로, 조류 인플루엔자 바이러스의 감염 진단과 이를 이용한 인플루엔자 모니터링에 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 라텍스를 매개체로 하여 조류 인플루엔자 바이러스의 항원인 핵단백질(nucleoprotein, NP)에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트 및 상기 키트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 혈구응집소(Hemagglutinin; HA)와 뉴라미니다제(Neuraminidase:NA)의 종류에 따라 구분되는데, 지금까지 144종류(HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)가 알려져 있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다. 이러한 인플루엔자 바이러스는 매년 겨울이면 새로운 항원성을 지닌 인플루엔자 바이러스가 유행하며 사람을 포함한 가축, 조류에 거쳐 바이러스가 유행하며 이러한 바이러스의 모니터링은 매우 중요하다. 따라서 이에 따른 특이성과 민감성이 높은 프라이머와 프로브의 개발이 요구되고 있다.
최근 관심이 집중되고 있는 조류 인플루엔자 바이러스(avian influenza virus, AIV)는 모두 A형에 속하는 바이러스로, 바이러스의 외막에 있는 HA와 NA의 유전자에 따라 HA는 16종류, NA는 9종류로 나누어지는 등 그 혈청형이 다양하며, 다른 혈청형 간에 교차방어가 되지 않는다고 알려져 있는데, AIV의 다양한 혈청형 중 현재까지 발생한 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI)는 모두 H5 또는 H7 혈청형에 의한 것으로 알려져 있다. 조류인플루엔자 바이러스 중 H5형과 H7형에서 나타나는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(HPAI)는 가금류에 감염시 높은 폐사율을 보이며 국가적으로 많은 경제적 피해를 주는 것으로 알려져 있으며, HPAI와 더불어 H9형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(LPAI)는 산란계 농가 등에서 많은 피해를 일으킬 뿐 아니라 HPAI와 함께 사람으로의 감염에 대한 보고가 이루어지고 있다. 특히, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1형은 아시아지역을 중심으로 인체감염이 이루어지고 있으며, 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 H9N2형도 인수공통감염의 보고가 있어 공중보건학적인 위해가 큰 것으로 알려져 있다.
이러한 조류 인플루엔자 바이러스의 감염으로 인한 피해를 감소시키기 위하여, 조류 인플루엔자 바이러스의 감염을 조기에 진단할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되어왔다. 예를 들어, 한국특허공개 제2007-21690호에는 조류 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자를 증폭하여 바이러스를 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트, 4종의 인플루엔자 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출 방법 및 검출 키트가 개시되어 있고, 국제특허공개 WO 2010/128396호에는 인플루엔자 A 또는 B 주 내의 보존 영역을 증폭하는 역전사(RT-PCR) 실시간(q-PCR) 분석법을 사용하여, 인플루엔자 바이러스를 검출 및 정량분석하는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2013-0116609호에는 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형을 결정하는 HA 유전자의 아형 (H5형, H7형, H9형) 및 NA 유전자의 아형(N1형, N2형, N3형) 판별과 병원성의 검사가 동시에 가능한 조류인플루엔자 바이러스 검사용 프로브 조성물, 유전자 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 개발된 방법은 조류 인플루엔자 바이러스의 감염이 어느정도 진행된 후에는 사용할 수 있었으나, 조류 인플루엔자 바이러스의 감염초기에는 시료에 포함된 바이러스가 미량으로 존재하기 때문에, 감염여부를 확인하기 어렵다는 단점이 있었다. 따라서, 미량의 바이러스가 포함된 시료에서도 조류 인플루엔자 바이러스를 보다 효과적으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 조류 인플루엔자 바이러스를 보다 효과적으로 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 라텍스를 매개체로 하여 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트를 개발하였으며, 상기 형광면역진단키트를 사용할 경우, 시료에 포함된 미량의 NP 항원까지도 검출하여 조류 인플루엔자 바이러스를 보다 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 조류 인플루엔자 바이러스를 보다 효과적으로 검출하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 라텍스에 주목하게 되었다. 통상적으로, 샌드위치 ELISA 키트는 항체에 형광물질과 같은 표지물질을 결합시키는데, 상기 항체에 결합된 형광물질에서 방출되는 형광세기가 한계가 있어, 항원의 농도가 낮은 경우에는 기저값과 비교하여 형광세기의 변화를 측정하기가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하고자, 형광물질과 항체를 결합시킬 수 있는 매개체를 사용하여 형광물질과 항체를 결합시키는 방법이 사용되고 있는데, 상기 매개체에는 다수의 형광물질을 결합시킬 수 있어, 항원의 농도가 낮은 경우에도 기저값과 구별되는 형광세기를 측정할 수 있다. 그러나, 이러한 방법을 사용할 경우에, 상기 매개체의 종류에 따라 형광신호가 간섭받을 수 있다는 문제점이 있다. 즉, 매개체가 형광신호의 일부를 흡수하거나 또는 형광신호와 유사한 파장의 빛을 방출할 경우, 측정된 값의 신뢰도가 의심될 수 있기 때문에, 상기 형광신호와 전혀 무관한 매개체를 사용하여야만 한다. 본 발명자들은 이러한 특징을 나타내는 매개체로서 라텍스를 사용할 수 있음을 규명하였다. 즉, 라텍스에 다수의 형광물질과 항체를 결합시킬 경우, 미세한 양의 항원이 결합되더라도 형광신호가 증폭될 수 있고, 이러한 형광신호에 대한 어떠한 간섭도 나타내지 않으므로, 항체와 형광물질의 결합 매개체로서 라텍스를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다. 실제로, 본 발명자들은 라텍스를 매개체로 사용하여 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체를 제작하고, 상기 제작된 결합체를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 형광면역진단키트를 제작하였으며, 상기 제작된 형광면역진단키트를 사용하여 면역진단 효과를 비교한 결과, 미량의 NP 항원을 포함하는 시료에서도 상기 NP 항원을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 라텍스를 매개체로 하여 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 라텍스는 다수의 형광물질 및 항체와 결합할 수 있는 매개체로서 사용할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 형광물질 및 항체와 결합할 수 있도록 표면에 다수의 반응성 아민기가 존재하는 라텍스를 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "조류 인플루엔자 바이러스(avian influenza virus)"란, 닭, 오리, 야생 조류 등에서 조류 인플루엔자를 유발시킬 수 있는 원인 바이러스를 의미한다. 상기 바이러스는 외막에 있는 HA와 NA의 유전자에 따라 HA는 16종류, NA는 9종류로 나누어지는 등 그 혈청형이 다양하며, 다른 혈청형 간에 교차방어가 되지 않는다고 알려져 있는데, AIV의 다양한 혈청형 중 현재까지 발생한 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI)는 모두 H5 또는 H7 혈청형에 의한 것으로 알려져 있다. 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 감염된 조류와의 접촉을 통해 사람에게도 감염될 수 있는 것으로 알려져 있는데, 주요한 감염 매개체는 감염된 조류의 배설물인 것으로 알려져 있다. 조류 인플루엔자 바이러스가 사람에게 감염될 경우, 기침과 호흡 곤란 등의 호흡기 증상이며 발열, 오한, 근육통 등의 신체 전반에 걸친 증상이 동반될 수 있고, 설사 등의 위장관계 증상이나 두통 및 의식 저하와 같은 중추신경계 관련 증상이 동반될 수 있으며, 호흡기 증상 없이 위장관계 증상이나 중추신경계 관련 증상만 나타난 사례도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 H1N1, H5N3, H7N1, H7N7, H9N2 등의 NP 항원을 포함하는 유전형을 갖는 다양한 조류 인플루엔자 바이러스가 될 수 있다. 이는 현재 일반연구가 허용되지 않아 실험 접근이 어려운 고병원성의 조류인플루엔자를 대신하여 이들 고병원성과 유사한 항원성을 갖는 저병원성 바이러스를 대상으로 함으로써, 고병원성의 조류 인플루엔자를 연구할 수 있는 단초를 제공한다는 의의가 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원과 결합할 수 있으면서도 라텍스와 직접적으로 또는 링커를 이용하여 간접적으로 결합할 수 있는 모든 종류의 항체가 될 수 있다. 상기 항체는 항체의 카르복실기와 라텍스의 반응성 아민을 반응시켜서 이미노 결합을 형성함으로써 상기 라텍스와 직접적으로 결합될 수 있는데, 항체의 구조에 따라 이러한 결합이 원활히 수행하지 못하게 될 수도 있다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 펩타이드, 글루타르알데히드 등의 링커를 사용하여 간접적으로 항체와 라텍스를 결합시킬 수 있으며, 이때 사용되는 링커는 항체와 라텍스간의 결합을 매개할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 항체에 결합되는 형광물질은 항체에 결합되어 항원-항체 결합여부를 검출할 수 있게 하는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 핵사크로로-6-카르복시플루오레세인, 테트라크로로-6-카르복시플루오레세인, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우, 칼 플루오르레드 610, 쿠마린 또는 이들의 유도체 등이 사용될 수 있고, 보다 바람직하게는 다수의 형광물질이 밀집되어 증폭된 형광신호를 나타낼 수 있는 덴드리머 형태의 형광물질이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 쿠마린 유래 덴드리머를 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트는 라텍스를 매개체로 하여 상기 항체와 상기 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 결합체를 포함하는 ELISA 키트가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 샌드위치 ELISA 키트가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit) 키트가 될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 혈액시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 상기 라텍스를 매개체로 하여 상기 항체와 상기 형광물질이 결합된 결합체, 상기 항체와 동일한 항원을 검출할 수 있는 다른 항체가 고정된 검사선 및 상기 결합체에 포함된 항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 구비된 면역스트립 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit)가 될 수 있다.
본 발명의 키트는 조류 인플루엔자 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료로부터 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는데, 상기 라텍스를 매개체로 하여 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체 외에도, 검출 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 예를 들어, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 등을 포함할 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트에, 목적하는 항원의 존재여부가 확인되지 않은 분리된 시료를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 (a) 조류 인플루엔자 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 키트를 이용하여 상기 수득한 시료로부터 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원을 검출 또는 정량분석하는 단계를 포함한다. 이때, 사용되는 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 땀, 타액, 콧물, 객담, 혈액, 뇨, 분변 등의 가검물을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 라텍스를 매개체로 하여 상기 항체와 상기 형광물질이 결합된 결합체, 검사선에 고정되고 항원을 검출할 수 있는 제2항체, 대조선에 고정되고 상기 결합체에 포함된 항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 기판에 고정된 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트를 제작하고, 상기 키트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원을 검출하는 방법을 도 1a 및 1b를 참조하여 설명한다.
도 1a는 정량적 형광면역진단키트 시스템을 나타내는 개략도로서, 스트립에 시료를 가하면, 컴퓨터를 통해 결과를 표시함을 나타내고, 도 1b는 본 발명에서 제공하는 조류 인플루엔자 감염진단용 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법을 예시적으로 나타낸 개략도이다. 환자로부터 수득한 가검물과 시료희석액을 상기 키트에 가하면, 이에 포함된 항원이 측면유동방식으로 항체와 형광물질이 결합된 결합체에 도달한 항원-항체 결합체를 형성하고, 상기 결합체는 검사선에 고정된 제2항체와 결합하여 검사선에 고정된다. 또한, 상기 결합체 중에서 항원과 결합하지 못한 결합체는 대조선에 고정된 이차 항체와 결합하여 대조선에 고정된다. 이러한 항원-항체 반응이 종료된 후, LED 광원으로부터 상기 형광물질에서 흡수할 수 있는 파장의 빛을 상기 검사선과 대조선에 가하면, 상기 검사선과 대조선에 결합된 각 결합체의 형광물질로부터 특정 파장의 형광이 방출되고, 이를 검출기를 통해 측정한다.
따라서, 라텍스를 매개체로 하여 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트는 조류 인플루엔자 바이러스의 감염이 의심되는 환자의 보다 효과적인 면역진단에 사용될 수 있음을 확인하였는데, 이는 라텍스에 다수의 형광물질이 결합되어, 형광신호를 증폭시킬 수 있기 때문인 것으로 분석되었다.
본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 형광면역진단키트를 이용하면, 미량의 시료를 사용하더라도 상기 시료에 포함된 조류 인플루엔자 바이러스와 같은 다양한 유전형의 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질을 종래의 키트에 비하여 약 2.5배 향상된 검출감도로 검출 또는 정량분석할 수 있을 뿐만 아니라, 인플루엔자 A 바이러스 이외의 다른 호흡기 감염성 바이러스는 검출하지 않는 특이성을 나타내므로, 조류 인플루엔자 바이러스의 감염 진단과 이를 이용한 인플루엔자 모니터링에 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 정량적 형광면역진단키트 시스템을 나타내는 개략도로서, 스트립에 시료를 가하면, 컴퓨터를 통해 결과를 표시한다.
도 1b는 본 발명에서 제공하는 조류 인플루엔자 감염진단용 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법을 예시적으로 나타낸 개략도이다.
도 2는 항체-라텍스-쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도이다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 라텍스에 항체와 쿠마린 유래 덴드리머가 결합한 결합체의 검출특성을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 결합체와 항체를 대상으로 NP 항원을 사용한 도트 블럿 면역분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3c는 4℃에서 10일 동안 보관된 결합체와 쿠마린 유래 덴드리머의 형광강도를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4는 서로 다른 형태의 결합체를 대상으로 그의 흡광 및 발광특성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체를 나타내고, (B)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 결합체를 나타내며, (C)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머, 항체 및 항원이 결합된 결합체를 나타낸다.
도 5a는 본 발명에서 제공하는 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 처리되는 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 항원의 처리양에 따라 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값(T/C ratio)의 변화를 비교한 결과를 나타낸다.
도 5c는 동일한 처리양의 항원을 사용하여 도트 블럿 면역분석을 수행한 결과 및 RDT 키트를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6a는 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 다양한 바이러스 시료를 적용하여 대조선(C)과 검사선(T)에서 측정된 형광값을 나타내는 그래프이다.
도 6b는 상기 측정된 대조선(C)과 검사선(T)의 형광값으로부터 산출된 T/C ratio의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 동일한 바이러스 시료를 사용하여 도트 블럿 면역분석을 수행한결과를 나타내는 사진이다.
도 7a는 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 2명 정상인 시료(Normal-1 및 Normal-2), H1N1의 감염이 확인된 5명 환자의 시료(H1N1-1, H1N1-2, H1N1-3, H1N1-4 및 H1N1-5) 및 인플루엔자 A가 아닌 다른 호흡기 바이러스(Metapneumovirus, Adenovirus, Parainfluenza 및 RSV) 감염이 확인된 4명 환자의 시료를 적용하여 대조선(C)과 검사선(T)에서 측정된 형광값을 나타내는 그래프이다.
도 7b는 상기 측정된 대조선(C)과 검사선(T)의 형광값으로부터 산출된 T/C ratio의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 다양한 농도의 NP 정제항원을 형광면역진단키트에 적용하여, 대조선(C)과 검사선(T)에서의 형광강도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 상기 측정된 형광강도로부터 산출된 T/C ratio를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 상기 T/C ratio를 통계처리하여 제작된 검량선을 나타낸다.
도 1b는 본 발명에서 제공하는 조류 인플루엔자 감염진단용 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법을 예시적으로 나타낸 개략도이다.
도 2는 항체-라텍스-쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도이다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 라텍스에 항체와 쿠마린 유래 덴드리머가 결합한 결합체의 검출특성을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 결합체와 항체를 대상으로 NP 항원을 사용한 도트 블럿 면역분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3c는 4℃에서 10일 동안 보관된 결합체와 쿠마린 유래 덴드리머의 형광강도를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4는 서로 다른 형태의 결합체를 대상으로 그의 흡광 및 발광특성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체를 나타내고, (B)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 결합체를 나타내며, (C)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머, 항체 및 항원이 결합된 결합체를 나타낸다.
도 5a는 본 발명에서 제공하는 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 처리되는 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 항원의 처리양에 따라 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값(T/C ratio)의 변화를 비교한 결과를 나타낸다.
도 5c는 동일한 처리양의 항원을 사용하여 도트 블럿 면역분석을 수행한 결과 및 RDT 키트를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6a는 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 다양한 바이러스 시료를 적용하여 대조선(C)과 검사선(T)에서 측정된 형광값을 나타내는 그래프이다.
도 6b는 상기 측정된 대조선(C)과 검사선(T)의 형광값으로부터 산출된 T/C ratio의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 동일한 바이러스 시료를 사용하여 도트 블럿 면역분석을 수행한결과를 나타내는 사진이다.
도 7a는 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 2명 정상인 시료(Normal-1 및 Normal-2), H1N1의 감염이 확인된 5명 환자의 시료(H1N1-1, H1N1-2, H1N1-3, H1N1-4 및 H1N1-5) 및 인플루엔자 A가 아닌 다른 호흡기 바이러스(Metapneumovirus, Adenovirus, Parainfluenza 및 RSV) 감염이 확인된 4명 환자의 시료를 적용하여 대조선(C)과 검사선(T)에서 측정된 형광값을 나타내는 그래프이다.
도 7b는 상기 측정된 대조선(C)과 검사선(T)의 형광값으로부터 산출된 T/C ratio의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 다양한 농도의 NP 정제항원을 형광면역진단키트에 적용하여, 대조선(C)과 검사선(T)에서의 형광강도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 상기 측정된 형광강도로부터 산출된 T/C ratio를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 상기 T/C ratio를 통계처리하여 제작된 검량선을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이
결합된
결합체의 제작
항체와 형광물질이 라텍스 비드에 결합된 항체-형광물질 결합체를 제작하였다. 이때, 항체로는 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체(anti-influenza A-7307 및 anti-influenza A-7304, Medix Biochemica)를 사용하고, 형광물질로는 쿠마린 유래 덴드리머(coumarin-derived dendrimer)를 사용하였으며, 라텍스 비드로는 Aliphatic Amine Latex Beads (2% w/v, 20 nm, Life technology)를 사용하였다.
구체적으로, PBS(pH 7.4)로 세척된 상기 라텍스 비드, 128㎕ 쿠마린 유래 덴드리머(1 mg/㎖ in DMSO) 및 0.8 ㎖ 결합완충액(0.1 M sodium biocarbonate, pH 8.5)을 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 진탕시키며 반응시켜서, 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 라텍스를 수득하였으며, 이를 PBS로 2회 세척한 다음, 0.8 ㎖ 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 항체를 가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 상기 반응물에 0.5 ㎖ 글루타르알데히드를 천천히 가하고 1분 동안 격렬히 교반하였다. 교반이 종료된 후, 반응물을 4℃에서 2시간 동안 진탕반응시키고, 상기 반응물을 원심분리하여 침전물을 수득한 다음, 이를 PBS로 2회 세척하여 라텍스 비드에 쿠마린 유래 덴드리머 및 항체가 결합된 결합체를 수득하였다. 상기 결합체를 1 ㎖ BSA를 포함하는 용액으로 재현탁시키고, 4℃에서 보존하였다(도 2).
도 2는 항체-라텍스-쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도로서, 라텍스에 존재하는 반응성 아민기가 쿠마린 유래 덴드리머에 존재하는 NHS 에스터기와 반응하여 NHS가 제거되면서 아미드결합이 형성되고, 라텍스의 다른 반응성 아민기가 글루타르알데하이드에 존재하는 알데하이드기와 결합하여 이미노 결합을 형성한다. 이후 상기 항체는 글루타르알데히드의 알데하이드기와 항체의 반응성 아민기가 결합하여 이미노 결합을 형성하여 최종적으로, 라텍스에 항체와 쿠마린 유래 덴드리머가 결합한 결합체가 생성된다.
실시예
2: 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이
결합된
결합체의 특성 분석
실시예
2-1: 2차 항체에 대한 반응성 분석
상기 제조된 결합체의 특징을 알아보기 위하여, 상기 항체 또는 결합체를 PVDF 멤브레인에 점적(spot)하고 이들 각각을 육안, UV 조사 및 2차 항체(HRP-anti-mouse IgG)로 검출하였다(도 3a).
도 3a는 본 발명에서 제공하는 라텍스에 항체와 쿠마린 유래 덴드리머가 결합한 결합체의 검출특성을 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3a에서 보듯이, 육안 및 UV 조사를 통하여 상기 결합체를 검출할 수 있었으나, 2차 항체를 이용할 경우에는 잘 검출되지 않았다. 이는 라텍스에 결합된 항체가 2차 항체에 대한 반응성이 낮아졌기 때문인 것으로 분석되었다.
한편, 상기 항체와 결합체를 대상으로 NP 항원을 사용한 도트 블럿 면역분석을 수행하였다. 구체적으로, PVDF 멤브레인에 희석된 바이러스로 감염된 시료 10㎕를 점적하고, 37℃에서 90분간 건조시켰다. 건조된 멤브레인에 5% 탈지분유를 포함하는 PBS를 가하고 1시간 동안 블로킹시켰다. 상기 멤브레인에 1차 항체(1㎍/㎖)를 가하고 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 멤브레인을 PBST로 3회 세척하고, HRP가 결합된 항-마우스 IgG 항체를 가하였으며, 실온에서 1시간 동안 진탕반응시켰다. 상기 멤브레인을 PBST로 3회 세척하고, 상기 멤브레인에 ECL 기질을 가한 다음 1분동안 반응시켜서 발색수준을 검출하였다(도 3b).
도 3b는 본 발명에서 제공하는 결합체와 항체를 대상으로 NP 항원을 사용한 도트 블럿 면역분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3b에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 결합체는 항원에 대한 반응성이 낮은 것처럼 보이지만, 이는 항원에 대한 반응성이 낮은 것이 아니라, 2차 항체인 HRP가 결합된 항-마우스 IgG 항체에 대한 반응성이 낮아서 나타난 결과로 분석되었다.
실시예
2-2: 안정성 분석
본 발명에서 제공하는 결합체의 안정성을 확인하기 위하여, 상기 제작된 결합체를 4℃에서 10일 동안 보관한 다음, 그의 형광강도를 동일한 양의 신선한 쿠마린 유래 덴드리머의 것과 비교하였다(도 3c).
도 3c는 4℃에서 10일 동안 보관된 결합체와 쿠마린 유래 덴드리머의 형광강도를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 3c에서 보듯이, 본 발명의 결합체는 4℃에서 10일 동안 보관한 후에도, 신선한 쿠마린 유래 덴드리머가 나타내는 형광강도의 약 92.19±5.34%의 형광강도를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 결합체는 매우 안정된 물질임을 알 수 있었다.
실시예
2-3:
흡광
및 발광특성 분석
라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체, 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 결합체 및 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머, 항체 및 항원이 결합된 결합체를 각각 제작하고, 이들의 흡광 및 발광특성을 분석하였다(도 4).
도 4는 서로 다른 형태의 결합체를 대상으로 그의 흡광 및 발광특성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체를 나타내고, (B)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 결합체를 나타내며, (C)는 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머, 항체 및 항원이 결합된 결합체를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 라텍스에 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 결합체는 450nm의 최고 피크를 갖는 넓은 흡수파장대와 590nm의 발광 스펙트럼을 나타내는데, 상기 결합체에 항체 또는 항원이 결합되어도, 결합체의 흡수파장대와 발광 스펙트럼은 유의하게 변화되지 않음을 확인하였다.
실시예
3:
형광면역진단키트의
제작
상기 실시예 1에서 제작한 결합체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트를 제작하였다.
구체적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료주입부를 구비시켰다. 상기 시료주입부와 일정간격을 두고, 상기 실시예 1에서 제작한 결합체를 가하고, 상기 결합체와 일정 간격을 두고 검사선을 설정한 다음, 상기 검사선에 H1N1 바이러스의 NP에 대한 또 다른 항체를 1.1㎍을 가하여 고정시켰다.
상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선을 설정한 다음, 상기 대조선에 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.2㎍을 가하여 고정시켰다.
그 결과로서, 시료에 포함된 H1N1 바이러스의 NP 항원을 검출할 수 있도록, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 결합체, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광면역진단키트(fluorescent immunochromatographic test, FICT)를 제작하였다.
실시예
4:
형광면역진단키트의
검출한계 측정
상기 실시예 3에서 제작한 형광면역진단키트를 사용한 면역진단을 수행하고, 이들 형광면역진단키트가 검출할 수 있는 항원의 검출한계를 도트 블럿 면역분석법 및 종래의 rapid diagnostic test(RDT) 키트(Humasis)와 비교하였다.
상기 실시예 3에서 제작한 형광면역진단키트에 각각 0, 10, 100, 250 및 500 ng/10㎕/strip의 NP 정제 항원을 처리하고, 이들의 검출수준을 비교하였다(도 5a 내지 5c).
도 5a는 본 발명에서 제공하는 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 처리되는 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 항원의 처리양에 따라 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값(T/C ratio)의 변화를 비교한 결과를 나타내며, 도 5c는 동일한 처리양의 항원을 사용하여 도트 블럿 면역분석을 수행한 결과 및 RDT 키트를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
상기 도 5a 내지 5c에서 보듯이, T/C ratio의 값이 NP 항원의 처리양 증가에 따라 증가하고, NP 항원의 최소 검출한계는 100 ng/10㎕임을 확인하였다. 이에 반하여, 도트 블럿 면역분석 및 RDT 키트를 사용하여 분석한 경우에는 검출한계가 250 ng/10㎕를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명이 결합체를 포함하는 형광면역진단키트는 종래에 비하여 2.5 배 우수한 검출한계를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예
5:
형광면역진단키트를
사용한 다양한 인플루엔자 바이러스의 검출
본 발명에서 제공하는 결합체는 NP 항원에 대한 항체를 포함하므로, H1N1 뿐만 아니라 다양한 유전형의 인플루엔자 바이러스 검출에 사용할 수 있을 것으로 예상하였다.
이를 확인하고자, 다양한 유전형의 조류 인플루엔자 바이러스(H5N3, H7N1, H7N7 및 H9N2)를 9 내지 11일 동안 부화시킨 계란의 요막강에 접종하고, 2일 동안 배양한 다음, 요막액을 수득하고, 상기 수득한 요막액을 원심분리하여 상층액을 수득하였다(2600×g, 4℃ 및 5분). 상기 수득한 상층액을 NTE 완충액(100 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 10 mM Tris-Cl, pH 7.4)에 포함된 20% 수크로스 쿠션에 위치시키고, 초스피드 원심분리를 수행하여(112,6006×g 및 2 시간), 각각의 바이러스를 정제하였다.
상기 정제된 4종의 조류 인플루엔자 바이러스와 신종플루 환자로부터 얻어진 H1N1 바이러스를 포함하는 시료 및 정상인의 시료를 상기 실시예 3에서 제작한 형광면역진단키트에 적용하여 분석하였다(도 6a 내지 6c).
도 6a는 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 다양한 바이러스 시료를 적용하여 대조선(C)과 검사선(T)에서 측정된 형광값을 나타내는 그래프이고, 도 6b는 상기 측정된 대조선(C)과 검사선(T)의 형광값으로부터 산출된 T/C ratio의 변화를 나타내는 그래프이며, 도 6c는 동일한 바이러스 시료를 사용하여 도트 블럿 면역분석을 수행한결과를 나타내는 사진이다.
도 6a 내지 6c에서 보듯이, H1N1의 형광강도에 비하여, 4가지 조류 인플루엔자 바이러스(H5N3, H7N1, H7N7 및 H9N2)의 형광강도는 낮은 수준을 나타내었으나, 정상인에 비하여는 높은 수준을 나타내었고, 상기 4가지 조류 인플루엔자 바이러스 중에서도 H7N1 및 H7N7은 비교적 높은 형광강도를 나타내었으며, 이러한 결과는 도트 블럿 면역분석시에도 동일하게 나타났다.
따라서, 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트는 신종플루 뿐만 아니라 다양한 유전형의 인플루엔자 A 형 바이러스에 의해 유발되는 조류 인플루엔자의 발병여부를 진단하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
6:
형광면역진단키트를
사용한, 호흡기 바이러스 감염 환자의 진단
공지된 배양방법, PCR 방법, 종래의 H1N1의 감염을 진단할 수 있는 키트(RDT)(Chi Hyun Cho, et al., Journal of Virological Methods, 187:51-56, 2013) 및 상기 실시예 3에서 제작한 형광면역진단키트를 사용하여, 2명 정상인 시료(Normal-1 및 Normal-2), H1N1의 감염이 확인된 5명 환자의 시료(H1N1-1, H1N1-2, H1N1-3, H1N1-4 및 H1N1-5) 및 인플루엔자 A가 아닌 다른 호흡기 바이러스(Metapneumovirus, Adenovirus, Parainfluenza 및 RSV) 감염이 확인된 4명 환자의 시료를 분석하였다(표 1, 도 7a 및 도 7b).
도 7a는 본 발명의 결합체를 포함하는 형광면역진단키트에 2명 정상인 시료(Normal-1 및 Normal-2), H1N1의 감염이 확인된 5명 환자의 시료(H1N1-1, H1N1-2, H1N1-3, H1N1-4 및 H1N1-5) 및 인플루엔자 A가 아닌 다른 호흡기 바이러스(Metapneumovirus, Adenovirus, Parainfluenza 및 RSV) 감염이 확인된 4명 환자의 시료를 적용하여 대조선(C)과 검사선(T)에서 측정된 형광값을 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 측정된 대조선(C)과 검사선(T)의 형광값으로부터 산출된 T/C ratio의 변화를 나타내는 그래프이다.
상기 표 1, 도 7a 및 도 7b에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 결합체를 포함하는 형광면역진단키트는 인플루엔자 A 계열의 바이러스는 검출할 수 있으나, 그 외의 다른 호흡기 감염성 바이러스는 검출할 수 없음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 결합체를 포함하는 형광면역진단키트는 인플루엔자 A 계열의 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있어, 조류 인플루엔자의 감염여부를 확인하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
7: 조류 인플루엔자 바이러스 정량분석용 검량선
본 발명에서 제공하는 결합체를 포함하는 형광면역진단키트는 인플루엔자 A 계열의 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있어, 조류 인플루엔자의 감염여부를 확인하는데 사용될 수 있으므로, 검출된 바이러스를 정량분석하는데 사용될 수 있는 검량선을 제작하고자 하였다.
즉, NP 정제항원을 0, 0.65, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40HAU/10㎕의 농도로 실시예 3에서 제작한 형광면역진단키트에 적용하여, 대조선(C)과 검사선(T)에서의 형광강도를 측정하고, 이로부터 T/C ratio를 산출하였으며, 상기 산출된 T/C ratio를 통계적으로 분석하여 검량선을 제작하였다(도 8a 내지 8c).
도 8a는 다양한 농도의 NP 정제항원을 형광면역진단키트에 적용하여, 대조선(C)과 검사선(T)에서의 형광강도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 상기 측정된 형광강도로부터 산출된 T/C ratio를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 상기 T/C ratio를 통계처리하여 제작된 검량선을 나타낸다.
상기 제작된 검량선은 NP 정제항원의 농도에 따라 측정된 대조선(C)과 검사선(T)에서의 형광강도를 통계처리하여 얻어진 것이기 때문에, 본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트와 상기 검량선을 이용할 경우, 시료에 감염된 조류 인플루엔자 바이러스를 정량분석할 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (11)
- 형광물질이 라텍스에 결합되고, 상기 라텍스에 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, NP) 항원에 대한 항체가 결합된, 형광물질-라텍스-항체 복합체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트로서,
상기 형광물질은 쿠마린 유래 덴드리머이고,
라텍스에 존재하는 하나의 반응성 아민기가 쿠마린 유래 덴드리머에 존재하는 NHS 에스터기와 아미드 결합을 형성한 것이고,
라텍스에 존재하는 다른 반응성 아민기가 글루타르알데히드에 존재하는 하나의 카르복시기와 이미노 결합을 형성하고, 상기 글루타르알데히드에 존재하는 다른 카르복시기가 항체의 아민기와 이미노 결합을 형성한 것인, 형광면역진단키트.
- 제1항에 있어서,
상기 라텍스는 다수의 형광물질 및 항체와 결합할 수 있는 매개체인 것인 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 조류 인플루엔자 바이러스는 고병원성 바이러스와 유사한 항원성을 갖는 H1N1, H5N3, H7N1, H7N7, H9N2 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전형을 포함하는 바이러스인 것인 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 조류 인플루엔자 바이러스의 NP 항원에 대한 단클론 항체인 것인 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 결합체는 하나의 항체에 복수의 형광물질이 결합된 형태인 것인 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 키트는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit) 키트인 것인 키트.
- (a) 조류 인플루엔자 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 시료를 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 키트에 가하여 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(necleoprotein, NP) 항원을 검출 또는 정량분석하는 단계를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 시료는 땀, 타액, 콧물, 객담, 혈액, 뇨, 분변 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 가검물인 것인 방법.
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| Date | Code | Title | Description |
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| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |