KR101668915B1

KR101668915B1 - 라텍스를 포함하는 형광면역분석용 키트

Info

Publication number: KR101668915B1
Application number: KR1020140067016A
Authority: KR
Inventors: 박현; 여선주; 정점규; 띠헝 딘
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-02
Filing date: 2014-06-02
Publication date: 2016-10-25
Also published as: KR20150139117A

Abstract

본 발명은 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하여, 형광신호를 증폭시켜서 검출감도를 증진시킨 형광면역진단키트 및 상기 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형광면역진단키트는 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하여, 미량의 시료를 사용하더라도 목적하는 항원을 효과적으로 검출할 수 있으므로, 다양한 항원의 검출 및 이를 이용한 질환의 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

라텍스를 포함하는 형광면역분석용 키트{Kit for fluorescence-linked immuno assay comprising latex}

본 발명은 라텍스를 포함하는 형광면역분석용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하여, 형광신호를 증폭시켜서 검출감도를 증진시킨 형광면역진단키트 및 상기 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 면역학적 검정(immunoassay)이란 항원 및 항체의 어느 한쪽 또는 양쪽을 방사성 동위 원소 또는 화학형광 물질(chemiluminescent materical) 등으로 표시하고, 항원 항체 반응에 의하여 항원 또는 항체의 존재를 확인하는 일을 말한다. 이때, 방사성 동위 원소를 이용한 방법을 방사 면역 측정법이라고도 하고, 화학형광 물질을 이용한 방법을 면역형광법이라고 한다. 이러한 면역학적 검정에 사용되는 대표적인 방법으로서, 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay 또는 enzyme-linked immunospecific assay, ELISA)이 사용되고 있는데, 이는 효소를 표식자로 하여 항원항체반응을 이용한 항원 또는 항체량을 측정하는 방법이다. 상기 ELISA는 면역학적 검정에 대한 효율성이 검정된 방법으로서, 경제적이고 용이하게 면역학적 검정을 수행할 수 있어 현재까지 인간 및 동물의 질병 진단에 기본적으로 사용되고 있다.

최초 개발된 시점에서는 ELISA의 표지자로서 효소를 사용하였으나, 이후의 기술개발에 따라 현재에는 형광물질이 보편적으로 사용되고 있다. 이러한 형광물질로서 사용되는 대표적인 물질은 프탈로사이아닌(Phthalocyanine) 유도체 화합물로서, 국내외에서 LD(laser diode)용으로 사용되고 있으나, 너무 비싸고, 형광의 세기가 너무 강하여, 형광특성의 수명이 짧고(photobleaching), 살아있는 세포에는 사용하기 어렵다는 단점이 있었다. 이러한 단점을 극복하기 위한 방안으로서, LED(light-emitting diode) 광원을 이용한 기술이 대두되고 있다. 상기 LED 광원은 저렴하고 열이 나지 않으며, 수명이 길고 작아서 작동이 용이하다는 장점이 있어, 상기 LED 광원으로부터 발색되는 빛을 이용할 수 있는, 460nm 내지 645nm의 파장영역을 갖는 형광물질이 개발되고 상용화되고 있다.

이같은 460nm 내지 645nm의 파장영역을 갖는 형광물질의 대표적인 예로서 쿠마린(coumarin) 유도체가 개발되었는데, 이는 덴드리머 형태로 구성되어 LED 광원에 적용할 수 있고 낮은 세기의 빛으로도 형광신호를 유발시킬 수 있어, 상기 쿠마린 유래 덴드리머를 이용하여 다중형광제, 바이오센서, 형광면역진단용 키트 등이 개발되고 있다(한국특허공개 제2010-0116287호, 한국특허공개 제2011-0097092호, 한국특허공개 제2013-0037142호). 그러나, 상기 쿠마린과 같은 LED 광원 형광체는 빛의 세기가 약해 오히려 진단에 사용하기에 단점이 되므로 이러한 단점을 극복할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 형광면역진단키트의 형광신호를 증폭시켜서 보다 적은량의 시료를 사용하더라도 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구, 노력한 결과 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 사용할 경우, 하나의 항체에 다수의 형광물질이 표지되어 형광신호를 증폭시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 효과적으로 면역진단을 수행할 수 있는 형광면역진단키트를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 라텍스에 주목하게 되었다. 통상적으로, 샌드위치 ELISA 키트는 항체에 형광물질과 같은 표지물질을 결합시키는데, 상기 항체에 결합된 형광물질에서 방출되는 형광세기가 한계가 있어, 항원의 농도가 낮은 경우에는 기저값과 비교하여 형광세기의 변화를 측정하기가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하고자, 형광물질과 항체를 결합시킬 수 있는 매개체를 사용하여 형광물질과 항체를 결합시키는 방법이 사용되고 있는데, 상기 매개체에는 다수의 형광물질을 결합시킬 수 있어, 항원의 농도가 낮은 경우에도 기저값과 구별되는 형광세기를 측정할 수 있다. 그러나, 이러한 방법을 사용할 경우에, 상기 매개체의 종류에 따라 형광신호가 간섭받을 수 있다는 문제점이 있다. 즉, 매개체가 형광신호의 일부를 흡수하거나 또는 형광신호와 유사한 파장의 빛을 방출할 경우, 측정된 값의 신뢰도가 의심될 수 있기 때문에, 상기 형광신호와 전혀 무관한 매개체를 사용하여야만 한다. 본 발명자들은 이러한 특징을 나타내는 매개체로서 라텍스를 사용할 수 있음을 규명하였다. 즉, 라텍스에 다수의 형광물질과 항체를 결합시킬 경우, 미세한 양의 항원이 결합되더라도 형광신호가 증폭될 수 있고, 이러한 형광신호에 대한 어떠한 간섭도 나타내지 않으므로, 항체와 형광물질의 결합 매개체로서 라텍스를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다. 실제로, 본 발명자들은 라텍스를 사용하거나 또는 사용하지 않고 형광물질과 항체의 복합체를 각각 제작한 다음, 이들 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 제작하였으며, 상기 제작된 형광면역진단키트를 사용하여 면역진단 효과를 비교한 결과, 라텍스를 사용하여 제작한 복합체가 포함된 형광면역진단키트는 더욱 낮은 농도의 항원을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 목적하는 항원의 존재여부를 보다 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 라텍스는 항체와 형광물질이 결합된 복합체에서 항체와 형광물질을 결합시키는 매개체로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 라텍스는 다수의 형광물질 및 항체와 결합할 수 있는 매개체로서 사용할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 형광물질 및 항체와 결합할 수 있도록 표면에 다수의 반응성 아민기가 존재하는 라텍스를 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 라텍스와 직접적으로 또는 링커를 이용하여 간접적으로 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 모든 종류의 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체는 항체의 카르복실기와 라텍스의 반응성 아민을 반응시켜서 이미노 결합을 형성함으로써 상기 라텍스와 직접적으로 결합될 수 있는데, 항체의 구조에 따라 이러한 결합이 원활히 수행하지 못하게 될 수도 있다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 펩타이드, 글루타르알데히드 등의 링커를 사용하여 간접적으로 항체와 라텍스를 결합시킬 수 있으며, 이때 사용되는 링커는 항체와 라텍스간의 결합을 매개할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 항체에 결합되는 형광물질은 항체에 결합되어 항원-항체 결합여부를 검출할 수 있게 하는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 핵사크로로-6-카르복시플루오레세인, 테트라크로로-6-카르복시플루오레세인, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우, 칼 플루오르레드 610, 쿠마린 또는 이들의 유도체 등이 사용될 수 있고, 보다 바람직하게는 다수의 형광물질이 밀집되어 증폭된 형광신호를 나타낼 수 있는 덴드리머 형태의 형광물질이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 쿠마린 유래 덴드리머를 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트는 본 발명의 라텍스를 매개체로 하여 상기 항체와 상기 형광물질이 결합된 복합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 복합체를 포함하는 ELISA 키트가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 샌드위치 ELISA 키트가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit) 키트가 될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 혈액시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 상기 라텍스를 매개체로 하여 상기 항체와 상기 형광물질이 결합된 복합체, 상기 항체와 동일한 항원을 검출할 수 있는 다른 항체가 고정된 검사선 및 상기 복합체에 포함된 항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 구비된 면역스트립 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit)가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 말라리아 항원에 대한 항체와 형광물질인 쿠마린 유래 덴트리머가 직접 결합된 복합체(제1 복합체, 도 2의 (a))와 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체, 도 2의 (b))를 각각 제작하고, 이들을 포함하는 형광면역진단키트의 제작하였다(실시예 2).

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형광면역진단키트에, 목적하는 항원의 존재여부가 확인되지 않은 분리된 시료를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 분리된 시료로부터 목적하는 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 본 발명의 라텍스를 매개체로 하여 상기 항체와 상기 형광물질이 결합된 복합체(3), 검사선(T)에 고정되고 항원을 검출할 수 있는 제2항체(4), 대조선(C)에 고정되고 상기 복합체에 포함된 항체를 검출할 수 있는 이차 항체(5)가 기판(6)에 고정된 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원(1)을 검출하는 방법을 도 1을 참조하여 설명한다. 도 1은 본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법을 예시적으로 나타낸 개략도 이다. 혈액시료(7)와 시료희석액(8)을 상기 키트에 가하면, 이에 포함된 항원(1)이 측면유동방식(9)으로 항체와 형광물질이 결합된 복합체(2)에 도달하여 항원-항체 결합체를 형성하고, 상기 결합체는 검사선에 고정된 제2항체(4)와 결합하여 검사선에 고정된다. 또한, 상기 복합체(3) 중에서 항원(1)과 결합하지 못한 복합체(3)는 대조선에 고정된 이차 항체(5)와 결합하여 대조선에 고정된다. 이러한 항원-항체 반응이 종료된 후, LED 광원(10)으로부터 상기 형광물질에서 흡수할 수 있는 파장의 빛(11)을 상기 검사선과 대조선에 가하면, 상기 검사선과 대조선에 결합된 각 복합체(3)의 형광물질로부터 특정 파장의 형광이 방출되고, 이를 검출기(12)를 통해 측정한다.

상기 도 1에서 (a)는 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 나타내고, (b)는 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 나타낸다는 점에서 차이가 있을 뿐, 이들을 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법은 동일하다. 다만, 하나의 항체에 하나의 형광물질이 결합된 복합체를 사용할 경우(a) 보다는, 라텍스를 매개체로 하여 하나의 항체에 다수의 형광물질이 결합된 복합체를 사용하는 경우(b) 형광신호가 증폭되므로, 보다 효과적으로 검출여부를 판정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 실시예 2에서 제작된 형광면역진단키트의 면역진단 효과를 비교한 결과, 상기 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 100ng의 검출한계(도 3)를 나타낸 반면, 상기 제2 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 1pg의 검출한계(도 4)를 나타내었고; 상기 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 정상인의 혈액시료와 말라리아 환자의 혈액시료를 구별하지 못함(도 5)에 비하여, 상기 제2 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 정상인의 혈액시료와 말라리아 환자의 혈액시료를 명확히 구별할 수 있음(도 6)을 확인하였다.

따라서, 라텍스를 이용하여 항체와 형광물질을 결합시킨 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 보다 효과적인 면역진단에 사용될 수 있음을 확인하였는데, 이는 라텍스에 다수의 형광물질이 결합되어, 형광신호를 증폭시킬 수 있기 때문인 것으로 분석되었다.

본 발명의 형광면역진단키트는 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하여, 미량의 시료를 사용하더라도 목적하는 항원을 효과적으로 검출할 수 있으므로, 다양한 항원의 검출 및 이를 이용한 질환의 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 형광면역진단키트를 이용하여 목적하는 항원을 검출하는 방법을 예시적으로 나타낸 개략도 이다.
도 2의 (a)는 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 제1 복합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도이고, 도 2의 (b)는 항체-라텍스-쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 제2 복합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도이다.
도 3은 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 항원의 처리양에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 항원의 처리양에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액을 가하여 검출한 결과를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 시료의 종류에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액을 가하여 검출한 결과를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 시료의 종류에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항체-형광물질 복합체의 제작

항체와 형광물질이 결합된 항체-형광물질 복합체를 제작함에 있어서, 라텍스의 사용여부에 따라 서로 다른 형태의 항체-형광물질 복합체를 제작하였다. 이때, 항체로는 말라리아 항원에 대한 항체를 사용하고, 형광물질로는 쿠마린 유래 덴트리머(coumarin-derived dendrimer)를 사용하였다.

실시예 1-1: 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)의 제작

먼저, 0.1M NaHCO₃ 완충액(pH8.5)과 1mg/㎖의 항체용액을 1:1(v/v)로 혼합하고, 실온에서 30분간 방치하였다.

다음으로, 쿠마린 유래 덴트리머를 1mg/㎖의 농도로 DMSO에 용해시킨 용액을 수득하였다.

상기 항체혼합액에 쿠마린 유래 덴드리머 용액을 12당량의 비율로 가하여 혼합하고, 4℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후, 반응물을 gel chromatograpy(Zeba™ Spin Desalting columns)에 가하고 1,000g로 2분 동안 원심분리하여 항체에 결합되지 않은 쿠마린 유래 덴드리머를 제거하였다. 이어, 상기 gel chromatograpy에 1.5%(w/v) BSA가 포함된 용출액을 가하여, 쿠마린 유래 덴드리머와 항체의 결합체를 용출함으로써, 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 제1 복합체를 제작하였다. 상기 제1 복합체는 차광조건에서 냉장보관하였다(도 2의 (a)). 상기 제작된 제1 복합체는 하나의 항체에 하나의 쿠마린 유래 덴트리머가 결합된 형태이다.

도 2의 (a)는 쿠마린 유래 덴드리머와 항체가 결합된 제1 복합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도로서, 항체에 존재하는 반응성 아민기(18)가 쿠마린 유래 덴드리머에 존재하는 NHS 에스터기(19)와 반응하여 NHS(20)가 제거되면서, 아미드결합(21)이 형성되는 과정을 나타낸다.

실시예 1-2: 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)의 제작

쿠마린 유래 덴드리머에 라텍스를 가하여, 쿠마린 유래 덴드리머와 라텍스가 결합된 제2 결합체를 제작하였다.

구체적으로, 20nm 크기의 amine latex(Invitrogen사, A37858) 500㎕에 세척완충액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 0.1M Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)을 가하여 3회 세척하고, 이에 500㎕의 0.1M NaHCO₃ 완충액(pH8.5)을 가하여 실온에서 30분간 방치하였다. 이어, 상기 쿠마린 유래 덴드리머 용액을 12당량의 비율로 가하여 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 다시 4℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후, 반응물에 상기 세척완충액을 가하여 3회 세척함으로써, 상기 라텍스에 결합되지 않은 쿠마린 유래 덴드리머를 제거하였다. 그런 다음, 500㎕의 글루타르알데히드를 가하고 4℃에서 12시간 동안 추가로 반응시킨 다음, 상기 세척완충액을 가하여 3회 세척함으로써, 반응하지 않은 글루타르알데히드를 제거함으로써, 쿠마린 유래 덴드리머와 라텍스가 결합된 결합체를 수득하였다. 상기 수득한 결합체에 250㎕의 0.1M NaHCO₃ 완충액(pH8.5)을 가하여 실온에서 30분 동안 방치한 다음, 250㎕의 0.1M NaHCO₃ 완충액(pH8.5)에 항체가 포함된 항체용액(0.5mg/㎖)을 가하고, 4℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후, 세척완충액으로 3회 세척하여, 상기 결합체에 결합되지 않은 항체를 제거함으로써, 항체-라텍스-쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 제2 복합체를 제작하였다. 상기 제2 복합체에 500㎕의 0.1% BSA를 포함하는 세척완충액을 가하고, 차광조건에서 냉장보관하였다(도 2의 (b)). 상기 제작된 제2 복합체는 다수의 아민기를 포함하는 라텍스로 인하여, 하나의 라텍스에 둘 이상의 항체 및/또는 둘 이상의 쿠마린 유래 덴트리머가 결합된 형태이다.

도 2의 (b)는 항체-라텍스-쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 제2 복합체를 제작하는 원리를 나타낸 개략도로서, 라텍스에 존재하는 하나의 반응성 아민기(22)가 쿠마린 유래 덴드리머에 존재하는 NHS 에스터기(19)와 반응하여 NHS(20)가 제거되면서 아미드결합(23)이 형성되고, 라텍스에 존재하는 다른 반응성 아민기(24)가 글루타르알데히드에 존재하는 카르복시기(25)와 결합하여 이미노 결합(26)을 형성한다. 또한, 상기 글루타르알데히드의 카르복시기(27)와 항체의 반응성 아민기(18)가 결합하여 이미노 결합(28)을 형성한다.

실시예 2: 형광면역진단키트의 제작

상기 실시예 1에서 제작한 각각의 복합체가 말라리아 항원 검출용 면역형광분석키트에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 각 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 제작하였다.

구체적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 혈액시료를 투입할 수 있는 시료주입부를 구비시켰다. 상기 검체패드와 일정간격을 두고, 상기 실시예 1-1 또는 1-2에서 제작한 복합체를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선을 설정한 다음, 상기 검사선에 삼일열 말라리아 항원에 대한 또 다른 항체(말라리아 젖산 탈수소효소에 대한 단클론 항체, C&K Bio Resource Inc. 5G6)를 1.1㎍을 가하여 고정시켰다.

상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선을 설정한 다음, 상기 대조선에 삼일열 말라리아 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.2㎍을 가하여 고정시켰다.

그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 복합체(제1 복합체 또는 제2 복합체), 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광면역진단키트(fluorescent immunochromatographic test, FICT)를 각각 제작하였다.

실시예 3: 형광면역진단키트의 검출한계 비교

상기 실시예 2에서 제작한 각각의 형광면역진단키트를 사용한 면역진단을 수행하고, 이들 형광면역진단키트가 검출할 수 있는 항원의 검출한계를 측정하고 비교하였다.

실시예 3-1: 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트의 검출한계 측정

먼저, 1mg/㎖의 삼일열 말라리아 젖산 탈수소효소 항원(C&K Bio Resource Inc)에 정상 혈액을 가하여 10배 희석한 것을 시료로서 준비하고, 시료희석액(0.1M Tris-HCl, 1% Triton X-100, 0.1% NaN₃, pH 8.5)을 별도로 준비하였다.

다음으로, 상기 실시예 2에서 제작한 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트의 시료주입부에 상기 시료 10㎕를 가하고, 이어 상기 시료희석액 100㎕를 가한 다음, 암실에서 5분 동안 반응시키고, 방출된 형광세기(Excitation:460nm, Emission:590nm)를 측정하였다(도 3). 이때, 상기 시료에 포함된 항원의 양은 1, 10, 100 또는 1000ng이 되도록 설정하였고, 대조군으로는 항원을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

도 3은 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 항원의 처리양에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 3에서 보듯이, 항원의 처리양이 100ng 이상인 경우에는 검사선의 형광세기의 값이 기저값과 구별되어 유의하게 측정되었으나, 이 보다 적은양의 항원을 처리할 경우에는 형광세기의 값이 기저값과 거의 구별되지 않아 측정되지 않음을 확인하였다. 따라서, 상기 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 100ng의 검출한계를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 제2 복합체를 포함하는 형광면역진단키트의 검출한계 측정

상기 실시예 2에서 제작한 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트를 사용하고, 항원의 처리양을 0.1, 1, 10, 100, 1,000 또는 10,000pg이 되도록 설정하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여 형광면역진단키트의 검출한계를 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 항원을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

도 4는 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 항원의 처리양에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 4에서 보듯이, 항원의 처리양이 1pg 이상인 경우에는 검사선의 형광세기의 값이 기저값과 구별되어 유의하게 측정되었으나, 이 보다 적은양의 항원을 처리할 경우에는 형광세기의 값이 기저값과 유의하게 구별되지 않음을 확인하였다. 따라서, 상기 제2 복합체를 포함하는 형광면역진단키트는 1pg의 검출한계를 나타냄을 알 수 있었다.

상기 결과로부터, 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체보다는, 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체를 포함하는 형광면역진단키트가 현저하게 우수한 검출한계를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4: 형광면역진단키트의 민감성 비교

열대열 말라리아가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아가 발병된 환자의 혈액을, 상기 실시예 2에서 제작한 각각의 형광면역진단키트에 적용하여 면역진단을 수행하고, 검출 민감성을 비교하였다.

실시예 4-1: 제1 복합체를 포함하는 형광면역진단키트의 민감도

삼일열 말라리아 젖산 탈수소효소 항원 대신, 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1의 방법을 이용하여 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)를 포함하는 형광면역진단키트의 대조선과 검사선에서 방출된 형광세기를 측정하였다(도 5). 이때, 대조군으로는 정상인의 혈액을 처리한 것을 사용하였다.

도 5는 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액을 가하여 검출한 결과를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 시료의 종류에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 대조군, 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액 처리군 및 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액 처리군의 검사선에서의 형광세기의 차이가 유의하지 않음을 확인하였다. 따라서, 항체와 형광물질이 직접 결합된 복합체(제1 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트로는 말라리아 항원을 검출하는 것이 어려움을 알 수 있었다.

실시예 4-2: 제2 복합체를 포함하는 형광면역진단키트의 민감도

삼일열 말라리아 젖산 탈수소효소 항원 대신, 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-2의 방법을 이용하여 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)를 포함하는 형광면역진단키트의 대조선과 검사선에서 방출된 형광세기를 측정하였다(도 6). 이때, 대조군으로는 정상인의 혈액을 처리한 것을 사용하였다.

도 6은 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트를 사용하여 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액과 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액을 가하여 검출한 결과를 나타내는 그래프로서, (a)는 대조선(C)과 검사선(T)에서 항원의 처리양에 따른 형광세기의 변화를 나타내고 (b)는 시료의 종류에 따라 측정된 검사선에서 측정된 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 대조군에 비하여 열대열 말라리아(P.f)가 발병된 환자의 혈액 처리군 및 삼일열 말라리아(P.v)가 발병된 환자의 혈액 처리군의 검사선에서 측정된 형광세기가 유의하게 증가함을 확인하였다. 따라서, 라텍스를 매개체로 하여 항체와 형광물질이 결합된 복합체(제2 복합체)를 포함하는 면역형광진단키트는 말라리아 항원을 용이하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

형광물질이 라텍스에 결합되고, 상기 라텍스에 항체가 결합된, 형광물질-라텍스-항체 복합체를 포함하는, 상기 항체에 특이적인 항원을 검출하기 위한 형광면역진단키트로서,
상기 형광물질은 쿠마린 유래 덴드리머이고,
상기 복합체는 항체에 대한 쿠마린 유래 덴드리머의 비율이 12당량이며,
라텍스에 존재하는 하나의 반응성 아민기가 쿠마린 유래 덴드리머에 존재하는 NHS 에스터기와 아미드 결합을 형성한 것이고,
라텍스에 존재하는 다른 반응성 아민기가 글루타르알데히드에 존재하는 하나의 카르복시기와 이미노 결합을 형성하고, 상기 글루타르알데히드에 존재하는 다른 카르복시기가 항체의 아민기와 이미노 결합을 형성한 것인, 형광면역진단키트.
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제1항에 있어서,
상기 복합체는 하나의 항체에 복수의 쿠마린 유래 덴드리머가 결합된 형태인 것인 형광면역진단키트.
제1항에 있어서,
상기 키트는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit) 키트인 것인 형광면역진단키트.
제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 형광면역진단키트에, 목적하는 항원의 존재여부가 확인되지 않은 분리된 시료를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 분리된 시료로부터 목적하는 항원을 검출하는 방법.