KR101740026B1 - 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트 - Google Patents
4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체, 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체는 친수성이 증가하여 비특이적 결합이 감소하고, 형광의 밝기와 신호의 강도, 신호의 안정성이 매우 우수하여, 시료 내에 미량의 표적물질이 존재하더라도 용이하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 신규한 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체는 친수성이 증가하여 비특이적 결합이 감소하고, 형광의 밝기와 신호의 강도, 신호의 안정성이 매우 우수하여, 시료 내에 미량의 표적물질이 존재하더라도 용이하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트에 관한 것이다.
일반적으로 면역학적 검정(immunoassay)이란 항원 및 항체의 어느 한쪽 또는 양쪽을 방사성 동위 원소 또는 화학형광 물질(chemiluminescent material) 등으로 표시하고, 항원-항체반응에 의하여 항원 또는 항체의 존재를 확인하는 일을 말한다. 또한 항원-항체반응 뿐만 아니라 표적물질과 이를 인식하는 타겟 모이어티(moiety) 사이에 반응 역시 광의의 면역학적 검정이라 할 것이다.
표적물질과 이를 인식하는 타겟 모이어티의 어느 한쪽 또는 양쪽을, 방사성 동위 원소를 이용하여 표시하는 방법을 방사 면역 측정법이라고 하고, 화학형광 물질을 이용하여 표시하는 방법을 면역형광법이라고 한다. 이러한 면역학적 검정에 사용되는 대표적인 방법으로서, 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay 또는 enzyme-linked immunospecific assay, ELISA)이 사용되고 있는데, 이는 효소를 표식자로 하여 표적물질 또는 이를 인식하는 타겟 모이어티의 양을 측정하는 방법이다.
최초 개발된 시점에서 ELISA의 표지자로서 효소를 사용하였으나, 이후의 기술개발에 따라 현재에는 형광물질이 보편적으로 사용되고 있다. 특히 유기형광물질은 반도체 등을 이용하는 발광성 재료에 비해 희소 금속 등 자원적인 제약도 덜하고, 저렴하기 때문에 산업적 이용은 물론 의료 분야에까지 폭넓게 이용되고 있다. 그러나, 기존의 유기 형광 색소는 용매에 대한 용해성이 낮기 때문에 취급이 어려운 문제가 있고, 고농도에서는 색소 분자가 반 데르 발스 상호작용으로 응집되어 형광 강도가 약해지는 농도소광이라는 현상을 나타내거나, 비특이적 결합을 나타내는 문제점이 있다.
따라서, 유기형광물질의 친수성을 증진시켜, 고농도에서도 형광 강도를 유지하거나, 비특이적 결합을 감소시키는 유기형광물질의 개발이 요구된다 할 것이다.
한편, 한국등록특허공보 제1394420호는 신규한 코마린 유도체를 포함하는 다중형광체 및 이를 이용한 LED 광원 기반 진단용 미세 형광정량 바이오센서에 관한 것으로, 한 분자가 다수의 형광체를 가지게 됨으로써 형광밝기와 신호강도 및 신호 안정성이 개선된 형광단을 개시하였고, 한국공개특허공보 제2015-0139177호는 라텍스를 포함하는 형광면역분석용 키트에 관한 것으로, 라텍스를 매개체로 형광신호를 증폭시켜 검출감도를 증진시킨 형광면역진단키트를 개시하였으나, 본 발명의 신규한 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트를 기재한 바는 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체를 라텍스 비드에 결합시킨 후에, 친핵성 치환반응을 통해 고분자화함으로써, 다중의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 결합되도록 제조한 라텍스 비드에 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 결합시킨 표적물질 검출용 조성물 및 이를 포함하는 표적물질 검출용 키트를 제공하고, 본 발명에 따른 표적물질 검출용 조성물이 표적물질로 선정한 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다는 것과 최소검출한계를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물을 제공한다.
상기 화학식 1에서,
A는 C3~C8의 알킬렌, C3~C8의 알케닐렌 또는 C3~C8의 알키닐렌을 나타내며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌은 독립적으로 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기 및 니트로기로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 더 치환될 수 있으며;
R1 내지 R8은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 시아노기, 니트로기 또는 하이드록시를 나타내고;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
X는 할로겐을 나타내고;
R은 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
n은 1~3의 정수를 나타내고;
m은 1~10의 정수를 나타낸다.
또한, 본 발명은 (a) 
과 
를 반응시켜 
을 제조하고, 
과 
을 반응시켜 
을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 
과 
을 반응시켜 
을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 하기 
과 
을 반응시켜 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 상기 화학식 1의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 라텍스 비드 표면에 결합시키는 단계;
(b) 상기 라텍스 비드 표면에 결합된 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물에 리신 링커를 결합시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 라텍스 비드- [화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커] 복합체에 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물, 리신 링커, 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 순차적으로 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 라텍스 비드-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커]-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커]-화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 복합체에 표적 물질을 인식하는 타겟 모이어티를 결합시키는 단계;를 포함하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 포함하는 표적물질 검출용 키트을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 표적물질 검출용 키트에 표적물질을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛 띠가 나타나면, 표적물질을 함유하고 있음으로 판정하고, 대조선에만 형광빛 띠가 나타나면, 표적물질을 함유하고 있지 않음으로 판정하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체는 상기 제조된 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 라텍스 비드에 결합시킨 후에, 친핵성 치환반응을 통해 고분자화함으로써, 다중의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 결합되도록 제조한 라텍스 비드에, 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 결합시킴으로써 제조되는 것이고, 본 발명의 표적물질 검출용 키트는 상기 제조된 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체는 친수성이 증가하여 시료 내에 표적물질 이외의 물질과의 비특이적 결합이 감소하고, 형광의 밝기와 신호의 강도, 신호의 안정성이 매우 우수하여, 시료 내에 미량의 표적물질이 존재하더라도 용이하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물의 발색단을 PST로 표시하고, 이를 간략하게 표시한 것이다.
도 2는 본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물의 최적 파장을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 다중의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체화합물이 결합된 라텍스 비드의 제작과정을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드이 다중으로 결합된 라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체 복합체를 이용하여 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 양에 따른 형광 세기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물의 최적 파장을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 다중의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체화합물이 결합된 라텍스 비드의 제작과정을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드이 다중으로 결합된 라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체 복합체를 이용하여 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 양에 따른 형광 세기의 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 C3~C8의 알킬렌, C3~C8의 알케닐렌 또는 C3~C8의 알키닐렌을 나타내며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌은 독립적으로 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기 및 니트로기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 더 치환될 수 있으며;
R1 내지 R8은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 시아노기, 니트로기 또는 하이드록시기를 나타내고;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1~C8의 알킬기을 나타내며;
X는 할로겐을 나타내고;
R은 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
n은 1~3의 정수를 나타내고;
m은 1~10의 정수를 나타낸다.
이하에 각 용어의 의미를 설명하고자 한다. 각 용어는 본 발명에서 통일된 의미로 사용되고, 단독으로 사용되는 경우 또는 다른 용어와 조합으로 사용되는 경우에도 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 할로겐은 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자이며, 바람직하게는 불소 원자, 염소 원자 및 브롬 원자이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 C1~C8의 알킬기는 탄소수 1 내지 8의 직쇄 또는 분지쇄의 1가 탄화수소기를 포함하며, 바림직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, n-헵틸 및 n-옥틸 중에서 선택된 어느 하나 이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 특히 탄소수를 지정했을 경우에는, 그 수의 범위의 탄소수를 갖는 알킬기를 의미한다.
본 발명의 C1~C8의 알콕시기는 바람직하게는 메틸옥시, 에틸옥시, n-프로필옥시, 이소프로필옥시, n-부틸옥시, 이소부틸옥시, sec-부틸옥시, tert-부틸옥시, n-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 3-펜틸옥시, n-헥실옥시, 이소헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시, n-헵틸옥시 및 n-옥틸옥시기 중에서 선택된 어느 하나 이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 특히 탄소수를 지정했을 경우에는, 그 수의 범위의 탄소수를 갖는 알콕시기를 의미한다.
상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물은 380~440㎚에서 흡광 파장범위를 가지고, 550~630㎚에서 여기 파장범위를 가지는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 이의 염 및 용해성 화합물로 제조될 수 있다.
본 발명은 (a) 
과 
를 반응시켜 
을 제조하고, 
과 
을 반응시켜 
을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 
과 
을 반응시켜 
을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 
과 
을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 및 이의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 C3~C8의 알킬렌, C3~C8의 알케닐렌 또는 C3~C8의 알키닐렌을 나타내며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌은 독립적으로 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 할로C1~C8의 알킬기 및 니트로기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 더 치환될 수 있으며;
R1 내지 R8은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 할로C1~C8의 알킬기, 시아노기, 니트로기 또는 하이드록시기를 나타내고;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1~C8의 알킬기을 나타내며;
X는 할로겐을 나타내고;
R은 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
n은 1~3의 정수를 나타내고;
m은 1~10의 정수를 나타낸다.
상기 (a) 단계에서 
과 상기 
의 반응용매는 증류수이고, 상기 
과 
의 반응용매는 아세토니트릴인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서 
과 
의 반응용매는 아세토니트릴과 에탄올의 혼합용매인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 (c) 단계에서 
과 
의 반응용매는 디클로로메탄인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 라텍스 비드 표면에 결합시키는 단계;
(b) 상기 라텍스 비드 표면에 결합된 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물에 리신 링커를 결합시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 라텍스 비드-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커] 복합체에 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물, 리신 링커, 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 순차적으로 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 라텍스 비드-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커]-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커]-화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 복합체에 표적 물질을 인식하는 타겟 모이어티를 결합시키는 단계;를 포함하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
상기 라텍스 비드는 바람직하게는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 결합할 수 있도록 다수의 반응성 아미노기가 존재하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지는 않는다.
상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000nm인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50~1,000nm인 것이며, 더욱더 바람직하게는 100nm인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 타겟 모이어티(moiety)는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 앱타머 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 용어 항체란 당해 기술 분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로블린이다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체 모두를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 표적물질은 검출하고자 하는 바이러스, 원핵세포(세균 등), 진핵세포(진균 등)이거나 또는 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포 내에 존재하는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 표적물질이 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포 내에 존재하는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 또는 항체인 경우에는 분리하고자 하는 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포에 외부에너지를 가하여 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포의 세포막 및 막을 제거하여 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 또는 항체를 노출시킨 후에, 타겟 모이어티와 반응시켜 표적물질-타겟 모이어티 결합체의 생성을 유도할 수 있다. 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포의 세포막 및 막을 제거하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 효소처리(예컨데, lysosyme 등), 열처리, 화학약품(예컨대, SDS, NaOH 등) 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 라텍스에 결합된 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물과 직접적으로 또는 링커를 이용하여 간접적으로 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 모든 종류의 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체는 항체의 아민기와 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물의 브로모기를 친핵성 치환 반응시켜 공유결합을 형성함으로써 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물과 직접적으로 결합될 수 있는데, 항체의 구조에 따라 이러한 결합이 원활히 수행하지 못하게 될 수도 있다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 펩타이드 등의 링커를 사용하여 간접적으로 항체와 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 결합시킬 수 있으며, 이때 사용되는 링커는 항체와 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 간의 결합을 매개할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 표적물질 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 표적물질과 결합하는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 포함하는 표적물질의 결합부; 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 상기 표적물질의 특이적 타겟 모이어티가 고정된 검사선(test line); 및 항-타겟 모이어티가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 표적물질 검출용 키트의 유효성분인 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체는 건조 또는 용액상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조상태인 것이지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 건조는 실온에서 1시간 동안 자연 건조하는 것이지만, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 표적물질 검출용 키트에 표적물질을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛 띠가 나타나면, 표적물질을 함유하고 있음으로 판정하고, 대조선에만 형광빛 띠가 나타나면, 표적물질을 함유하고 있지 않음으로 판정하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예
1: 4
-(4-
메틸피페라지닐
)
스티릴피리딘
유도체 화합물 중 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-
이움
)트리브로마이드 클로라이드 화합물(화학식 2의 화합물)의 합성
1-1. 4-(4-
메틸피페라진
-1-일)
벤즈알데하이드의
합성
4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈알데하이드의 합성 과정은 다음과 같다.
N-메틸피페라진(N-methylpiperazine, 4.2g, 42.0mmol)과 4-플루오로벤즈알데하이드 (4-fluorobenzaldehyde, 3g, 24.2mmol)를 20㎖의 증류수에 녹이고, 탄산나트륨 (4.2g, 40mmol)을 넣어준 후에, 혼합용액을 24시간 가열 환류하였다. 반응이 완결된 후 얻어진 반응용액을 실온으로 냉각한 후 증류수를 100㎖로 희석하고, 분별깔대기에 넣고, 20㎖의 디클로로메탄(dichlromethane)으로 3회 추출하였다. 유기층 추출액을 10㎖의 증류수로 씻고 무수 황산나트륨으로 건조 후 여과하고 감압증류하여 얻어진 고체를 헥산(hexane)에 넣고 여과하여 원하는 생성물 4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈알데하이드 (4-(4-methylpiperazin-1-yl)benzaldehyde)(4.2 g, 85%)를 흰색 고체로 얻었다.
1H NMR (500 Mz, CDCl3) δ 9.76 (s, 1H), 7.73 (d, 2H, J = 11.3 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 11.3 Hz), 3.39 (t, 4H, J = 6.4 Hz), 2.54 (t, 4H, J = 6.4 Hz), 2.33 (s, 3H).
1-2. 1,1'-
(프로판-1,3-디일)비스
(4-
메틸피리딘
-1-
이움
)브로마이드 클로라이드의 합성
1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(4-메틸피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드의 합성과정은 다음과 같다.
4-피콜린 (4-Picoline, 3.78g, 40.6mmol)과 1-브로모-3-클로로프로판 (1-bromo-3-chloropropane, 1.6g, 10.2mmol)을 20㎖의 아세토니트릴에 용해하고, 40℃에서 밤새 교반하였다. 반응이 완결된 후 감압증류하여 용매를 제거하고 과량의 1-브로모-3-클로로프로판 (1-bromo-3-chloropropane)은 헥산(hexane)으로 씻어서 제거하여 원하는 생성물인 1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(4-메틸피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드(1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(4-methylpyridin-1-ium) bromide chloride) (3.16 g, 90%)를 얻었다.
1H NMR (500 Mz, DMSO-d 6) δ 9.04 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.01 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 4.68 (t, 4H, J = 9.2 Hz), 2.62 (m, 8H).
1-3. (E)-1,1'-
(프로판-1,3-디일)비스(4-((E)
-4-(4-
메틸피페라진
-1-일)
스티
릴)피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드의 합성
화합물 (E)-1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(4-((E)-4-(4-메틸피페라진-1-일)스티릴)피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드의 합성과정은 다음과 같다.
상기 4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈알데하이드 (4-(4-methylpiperazin-1-yl)benzaldehyde, 46mg, 0.23mmol)과 상기 1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(4-메틸피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드(1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(4-methylpyridin-1-ium) bromide chloride, 37mg, 0.11mmol)를 아세토니트릴과 에탄올의 혼합용매에 녹인 후 피페리딘 한 방울을 가해주고 40℃에서 4시간동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 감압증류하여 용매를 제거하고 남은 생성물을 1㎖의 에틸에테르로 2회 씻고 정제된 (E)-1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(4-((E)-4-(4-메틸피페라진-1-일)스티릴)피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드 ((E)-1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(4-((E)-4-(4-methylpiperazin-1-yl)styryl)pyridin-1-ium) bromide chloride)(68 mg, 88%)를 얻었다.
1H NMR (500 Mz, CD3OD) δ 8.71 (d, 4H, J = 8.6 Hz), 8.06 (d, 4H, J = 8.6 Hz), 7.87 (d, 2H, J = 20.2 Hz), 7.62 (d, 4H, J = 11.0 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 20.2 Hz), 7.00 (d, 4H, J = 11.0 Hz), 4.68 (t, 4H, J = 9.5 Hz), 3.39 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 3.13 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 2.65 (t, 8H, J = 6.1 Hz), 2.39 (s, 6H).
1-4. (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-
메틸피페라진
-1-
이움
)트리브로마이드 클로라이드(화학식 2의 화합물)의 합성
(E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드의 합성반응은 다음과 같다.
(E)-1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(4-((E)-4-(4-메틸피페라진-1-일)스티릴)피리딘-1-이움)브로마이드 클로라이드 ((E)-1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(4-((E)-4-(4-methylpiperazin-1-yl)styryl)pyridin-1-ium) bromide chloride, 19mg, 0.026mmol)과 1,4-디브로모-트랜스-부텐 (1,4-dibromo-trans-butene, 30mg, 0.14mmol)을 2㎖의 디클로로메탄 (dichloromethane)에 넣고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하여 제거하고 생성된 고체를 2㎖의 헥산(hexane)으로 3회 씻은 후에 주황색 고체인 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드((E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(pyridine-1-ium-4,1-diyl))bis(ethene-2,1-diyl))bis(4,1-phenylene))bis(1-((E)-4-bromobut-2-en-1-yl)-1-methylpiperazin-1-ium) tribromide chloride) (28 mg, 93%)을 얻었다(도 1).
1H NMR (500 Mz, DMSO-d 6) δ 8.93 (d, 4H, J = 7.1 Hz), 8.20 (d, 4H, J = 7.1 Hz), 8.02 (d, 2H, J = 20.5 Hz), 7.70 (d, 4H, J = 10.7 Hz), 7.38 (d, 2H, J = 20.5 Hz), 7.13 (d, 4H, J = 10.7 Hz), 6.35 (m, 2H), 6.13 (m, 2H), 4.61 (t, 4H, J = 8.6 Hz), 4.23 (m, 8H), 3.65 (m, 4H), 3.54 (m, 8H), 3.18 (m, 4H), 3.14 (s, 6H), 3.01 (m, 2H).
실시예 2: 화학식 1의 신규한 4-(4- 메틸피페라지닐 ) 스티릴피리딘 유도체 화 합물 중 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1- 메틸피페라진 -1- 이움 )트리브로마이드 클로라이드 화합물(화학식 2의 화합물)의 최적 파장 분석
화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 실시예 1에 의해 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물의 최적 여기 및 흡광 파장을 분석하였다.
상기 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물을 증류수 용액에 1㎎/㎖ 농도가 되도록 녹인 후 흡광 및 여기 스펙트럼을 분석하였다. 분석결과 412㎚의 흡광파장(Excitation wavelength)과 580㎚의 여기파장(Emission wavelength)을 가지는 것으로 나타났다(도 2).
실시예
3: 화학식 1의
신규한
4-(4-
메틸피페라지닐
)
스티릴피리딘
유도체 화합물 중 화학식 2의 화합물이 다중으로
결합된
라텍스
비드의
제조
3-1. 화학식 2의 화합물이
결합된
라텍스
비드
제조
10μmol의 라텍스 비드에 화학식 1의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 중 1.7㎎의 합성된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드(화학식 2의 화합물)를 혼합하여, 상온에서 2일 동안 교반하면서 간간이 초음파를 처리하였다.
반응물을 18℃에서 15,000rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 0.5㎖의 증류수를 넣고, 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하여, (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드가 결합된 라텍스 비드를 수득하였다.
3-2. 라텍스
비드에
결합한 화학식 2의 화합물에 리신 링커 결합
상기 수득한 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물이 결합된 라텍스 비드에 3㎎의 L-리신과 6㎎의 탄산수소나트륨을 600㎕의 증류수와 200㎕의 메탄올 혼합용액에 분산시킨 후에, 상온에서 2일 동안 교반하면서, 간간이 초음파로 처리하였다.
반응물을 18℃, 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상등액을 제거하였다. 0.5㎖의 증류수를 넣고, 다시 원심분리한 후에 상등액을 제거하여, (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드-리신이 결합된 라텍스 비드를 수득하였다.
3-3. 화학식 2의 화합물이 다중
결합된
라텍스
비드의
제조
상기 수득한 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드-리신이 결합된 라텍스 비드에 1.7㎎의 화학식 2의 화합물 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드를 혼합하여, 상온에서 2일 동안 교반하면서 간간이 초음파를 처리하였다.
반응물을 18℃에서 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 0.5㎖의 증류수를 넣고, 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하여 리신 링커를 통해 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드가 이중으로 결합된 라텍스 비드를 수득하였다.
상기 수득된 리신 링커를 매개로 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드가 이중으로 결합된 화합물이 결합된 라텍스 비드에 3㎎의 L-리신과 6㎎의 탄산수소나트륨을 600㎕의 증류수와 200㎕의 메탄올 혼합용액에 분산시킨 후에, 상온에서 2일 동안 교반하면서, 간간이 초음파로 처리하였다.
반응물을 18℃, 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상등액을 제거하였다. 0.5㎖의 증류수를 넣고, 다시 원심분리한 후에 상등액을 제거한 후에, (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드를 혼합하여, 상온에서 2일 동안 교반하면서 간간이 초음파를 처리하였다.
반응물을 18℃에서 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 0.5㎖의 증류수를 넣고, 다시 원심분리한 후 상등액을 제거하여 리신 링커를 이용하여 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드가 삼중으로 결합된 라텍스 비드를 수득하였다(도 3).
실시예
4: 라텍스
비드에
결합된
다중의 화학식 2로 표시되는 화합물에 표적물질을 인식하는
타겟모이어티가
결합된
라텍스
비드
복합체 제조
표적물질을 검출하기 위하여 상기 실시예 3에서 제조한 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드가 삼중으로 결합된 라텍스 비드와 타겟 모이어티로서 항체를 결합시켜야 한다. 표적물질은 인플루엔자 바이러스로 하였으며, 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 라텍스 비드에 결합된 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물에 결합시키기 위해 아래와 같이 시행하였다. 특히 인플루엔자 바이러스에 대한 항체는 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP)를 사용하였다.
상기 실시예 3에서 제조한 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드가 삼중으로 결합된 라텍스 비드에 400㎕의 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)을 가하여 분산시킨 후에, 30㎕의 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체(1㎎/㎖)를 혼합하고, 실온에서 24시간 동안 반응시켰다.
항체가 결합하지 않은 라텍스 비드에 결합된 다중의 (E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드 화합물의 반응기를 제거하기 위하여 상기 반응액에 0.01M의 글리신 용액 188㎕를 혼합하고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응액을 18℃에서 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고, 100㎕의 0.1% BSA를 포함하는 완충용액(pH9.0)에 분산하여 4℃의 암실에서 보관하였다.
실시예
5: 표적물질 검출용
키트의
제작
인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체가 결합된 다중-[(E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드]-라텍스 비드 복합체가 표적물질 검출용 키트에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체가 결합된 다중-[(E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드]-라텍스 비드 복합체를 포함하는 표적물질 검출용 조성물을 포함하는 표적물질 검출용 키트를 제작하였다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정간격을 두고, 상기 실시예 4에 따른 44nM 표적물질 검출용 조성물 2㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(Test line; T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 2.5㎍을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선에 고정한 인플루엔자 바이러스에 대한 항체는 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체이다.
상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(Control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 2㎍을 가하여 고정시켰다.
그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다.
실시예
6: 표적물질 검출용
키트의
검출한계 측정
H5N3형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하고, 시료희석액(25mM HEPES, 100mM NaCl, 2.5mM MgCl2, 0.1% NP40, pH7.5)을 별도로 준비하였다.
상기 실시예 5에서 제작한 표적물질 검출용 키트의 시료 주입부에 H5N3형 인플루엔자 바이러스 시료 75㎕를 가하고, 이어 상기 시료 희석액 75㎕를 가한 다음, 암실에서 5분간 반응시키고, 방출된 형광세기를 측정하였다.
이때, 상기 시료에 포함된 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 양은 1.0×102 PFU/㎖, 2.5×102 PFU/㎖, 5.0×102 PFU/㎖, 1.0×103 PFU/㎖, 2.5×103 PFU/㎖, 5.0×103 PFU/㎖, 1.0×104 PFU/㎖ 또는 5.0×104 PFU/㎖이 되도록 설정하였고, 대조군은 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.
형광측정결과, 상기 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체가 결합된 다중-[(E)-4,4'-(((1E,1'E)-(1,1'-(프로판-1,3-디일)비스(피리딘-1-이움-4,1-디일))비스(에텐-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌))-비스(1-((E)-4-브로모부트-2-엔-1-일)-1-메틸피페라진-1-이움)트리브로마이드 클로라이드]-라텍스 비드 복합체를 포함하는 표적물질 검출용 조성물을 포함하는 표적물질 검출용 키트의 검출한계는 2.5×102 PFU/㎖임을 확인하였다(도 4).
Claims (15)
- 하기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 C3~C8의 알킬렌, C3~C8의 알케닐렌 또는 C3~C8의 알키닐렌을 나타내며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌은 독립적으로 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기 및 니트로기로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 더 치환될 수 있으며;
R1 내지 R8은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 시아노기, 니트로기 또는 하이드록시기를 나타내고;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
X는 할로겐을 나타내고;
R은 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
n은 1~3의 정수를 나타내고;
m은 1~10의 정수를 나타낸다. - 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물.
[화학식 2]
- 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물의 여기파장은 550~630㎚인 것을 특징으로 하는 화합물.
- (a)과
를 반응시켜
을 제조하고,
과
을 반응시켜
을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된과
을 반응시켜
을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된과
을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1의 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 방법.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 C3~C8의 알킬렌, C3~C8의 알케닐렌 또는 C3~C8의 알키닐렌을 나타내며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌은 독립적으로 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기 및 니트로기로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 더 치환될 수 있으며;
R1 내지 R8은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 시아노기, 니트로기 또는 하이드록시기를 나타내고;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
X는 할로겐을 나타내고;
R은 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
n은 1~3의 정수를 나타내고;
m은 1~10의 정수를 나타낸다. - 제4항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기과 상기
의 반응 용매는 증류수이고, 상기
과 상기
의 반응 용매는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기과 상기
의 반응 용매는 아세토니트릴과 에탄올의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기과
의 반응 용매는 디클로로메탄인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 제조하는 방법.
- (a) 하기 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 라텍스 비드 표면에 결합시키는 단계;
(b) 상기 라텍스 비드 표면에 결합된 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물에 리신 링커를 결합시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 라텍스 비드-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커] 복합체에 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물, 리신 링커, 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물을 순차적으로 결합시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 라텍스 비드-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커]-[화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물-리신 링커]-화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물 복합체에 표적 물질을 인식하는 타겟 모이어티를 결합시키는 단계;를 포함하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체의 제조방법.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 C3~C8의 알킬렌, C3~C8의 알케닐렌 또는 C3~C8의 알키닐렌을 나타내며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌은 독립적으로 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기 및 니트로기로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 더 치환될 수 있으며;
R1 내지 R8은 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C1~C8의 알킬기, C1~C8의 알콕시기, 시아노기, 니트로기 또는 하이드록시기를 나타내고;
R9 및 R10은 서로 독립적으로 수소 또는 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
X는 할로겐을 나타내고;
R은 C1~C8의 알킬기를 나타내며;
n은 1~3의 정수를 나타내고;
m은 1~10의 정수를 나타낸다. - 제8항에 있어서, 상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000㎚인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 타겟 모이어티(moiety)는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 앱타머 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체의 제조방법.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체.
- 제11항에 따른 화학식 1로 표시되는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체 화합물이 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 표적물질은 바이러스, 원핵세포, 진핵세포, DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 표적물질 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 표적물질과 결합하는 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체를 포함하는 표적물질의 결합부; 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 상기 표적물질의 특이적 타겟 모이어티가 고정된 검사선(test line); 및 항-타겟 모이어티가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 테스트 스트립 형태의 표적물질 검출용 키트.
- 제13항의 표적물질 검출용 키트에 표적물질을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛 띠가 나타나면, 표적물질을 함유하고 있음으로 판정하고, 대조선에만 형광빛 띠가 나타나면, 표적물질을 함유하고 있지 않음으로 판정하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출 방법.
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| KR1020160085877A KR101740026B1 (ko) | 2016-07-07 | 2016-07-07 | 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트 |
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2017
- 2017-06-30 WO PCT/KR2017/006929 patent/WO2018008897A1/ko active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005539243A (ja) | 2002-05-03 | 2005-12-22 | モレキュラー プローブス， インコーポレイテッド | リン酸化分子の検出および分離のための組成物および方法 |
| JP2009523452A (ja) | 2006-01-18 | 2009-06-25 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | キナーゼ活性を測定するための方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Chem. Eur. J. 2016, 22, pp.6037~6047 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018008897A1 (ko) * | 2016-07-07 | 2018-01-11 | 원광대학교산학협력단 | 4-(4-메틸피페라지닐)스티릴피리딘 유도체가 다중 결합된 라텍스 비드 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 표적물질 검출용 키트 |
| KR20220007021A (ko) * | 2020-07-09 | 2022-01-18 | 인텔로스 주식회사 | 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트 |
| KR102594836B1 (ko) | 2020-07-09 | 2023-10-27 | 인텔로스 주식회사 | 라텍스 비드, 링커 및 항체를 포함하는 면역 크로마토그래피용 시약 및 이를 포함하는 래피드 키트 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018008897A1 (ko) | 2018-01-11 |
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