CN117769588A - 增强化学发光信号的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在化学发光反应中增强化学发光反应混合物中的致化学发光化合物的化学发光信号的方法，所述方法包括在有效量的增强剂存在的情况下氧化致化学发光化合物以获得增强的化学发光信号，选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物用于在化学发光反应中，优选在化学发光免疫测定中增强吖啶鎓化合物，优选吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺的化学发光信号的用途，相关化学发光组合物和试剂盒。
Description
本发明涉及在化学发光反应中增强化学发光反应混合物中致化学发光化合物的化学发光信号的方法，该方法包括在有效量的增强剂存在下氧化致化学发光化合物以获得增强的化学发光信号，使用选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物在化学发光反应中，优选在化学发光免疫测定中增强吖啶鎓化合物，优选吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺的化学发光信号，以及相关化学发光组合物和相关试剂盒。
化学发光免疫测定作为非放射性免疫测定技术，继酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定和荧光免疫分析技术之后，在世界范围内发展迅速。化学发光免疫测定是具有高灵敏度、宽检测范围、简单快速的操作、稳定的标记和低污染，使其成为理想的定量免疫测定方法的技术(Cinquanta等人，“Chemiluminescent immunoassay technology:what does itchange in autoantibody detection？,”Auto Immun Highlights,8:9,2017年6月24日)。
如今，化学发光免疫测定法通常优于用于定量各种生物物质诸如小分子、核酸、激素、抗体等的常规检测方法诸如放射免疫测定法。其特征在于致化学发光底物由于化学或酶促触发物质的外部刺激而产生光。致化学发光底物的突出实例是鲁米诺、1,2-二氧杂环丁烷芳基磷酸酯、三-(联吡啶基)钌(II)络合物或基于吖啶鎓的探针。通常，根据致化学发光底物的性质、应用的触发物质和光输出的最终类型，化学发光反应可以分为闪光型和辉光型化学发光。如Tannouset等人所述(Tannouset等人，“Combined flash and glow-typechemiluminescent reactions for high-throughput genotyping of biallelicpolymorphisms,”Analytical Biochemistry，第320卷，第2期，第266-272页，2003年9月15日)，闪光型反应在数秒至数分钟的范围内产生明亮的化学发光信号，而辉光型反应中的光输出不那么亮，但其可以持续数个小时。根据选择的方法，可以相应地设计闪光型和辉光型免疫测定。
如果需要高通量的样品，基于吖啶鎓盐的闪光型探针通常用于化学发光免疫测定，用于快速和超灵敏的信号产生。突出的实例是10-甲基-2,6-二甲基-吖啶鎓-NHS酯(Me-DMAE-NHS)、N-磺基丙基-二甲基-吖啶鎓-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NSP-DMAE-NHS)、N-磺基丙基-吖啶鎓-磺酰胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NSP-SA-NHS)和10-甲基-2,6-二甲基-吖啶鎓-(聚环氧乙烷)4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MeAE-PEO4-NHS)，这些分子及其变体例如描述于EP1273917 B1、EP 1539702 B1和其它文献中。所有这些分子在碱性过氧化氢的外部刺激下都会产生光。通常，将后面的试剂逐步加入触发溶液A和B中。过氧化氢通常是触发剂A与酸如硝酸的组合的一部分。此后在触发剂B中注入氢氧化钠。
为了产生最佳的信号，触发剂B另外被认为需要去垢剂分子，所述去污剂分子可能在水溶液中形成胶束结构。Chang和Miller在US 4,927,769中描述了基于季胺的阳离子去垢剂是特别有利的。尽管非离子或阴离子去污剂也是可能的，但是阳离子去垢剂的头部基团中的正电荷被认为将大部分疏水的基于吖啶鎓的探针和带负电荷的过氧化氢阴离子带到胶束界面的空间附近，从而促进化学发光信号输出，如也在Natrajanet等人(Natrajan等人，“Effect of surfactants on the chemiluminescence of acridiniumdimethylphenylester labels and their conjugates,”Org.Biomol.Chem.,9，第5092-5103页，2011年4月13日)中所描述的。US 4,927,769中包括的这种阳离子去垢剂的突出实例是十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)。
尽管如此，化学发光免疫测定技术还需要进一步的改进，以允许对超低浓度的分析物进行定量，并且通常促进信号与噪声的区分。这些改进很可能需要通过优化的增强剂物质来增强化学发光。
本发明的根本问题是提供用于化学发光免疫测定技术的方法和相关试剂，其可用于分析物特别是具有超低浓度的分析物的改进的定量，并且其通常可用于更好地促进信号与噪声的区分。
本发明的另一个根本问题是提供能够在化学发光免疫测定中增强致化学发光化合物(优选为吖啶鎓化合物，例如吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺)的化学发光信号的物质。
在第一方面，本发明的根本问题通过用于在化学发光反应中增强化学发光反应混合物中致化学发光化合物的化学发光信号的方法来解决，所述方法包括在有效量的增强剂存在的情况下氧化致化学发光化合物以获得增强的化学发光信号，其中致化学发光化合物是吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，其中所述增强剂是一种化合物或两种、三种或更多种化合物的混合物，并且其中所述增强剂化合物或这些增强剂化合物中的每一种选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组：
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；以及X1-为卤化物或氢氧根离子，优选为氯化物或溴化物。
根据本发明的有效量的增强剂由一种、两种或更多种增强剂化合物提供，其中它们中的每一种选自由本文公开的式(I)的季胺阳离子物质组成的组。
根据本发明的每种增强剂化合物都具有芳族头部基团。根据本发明的增强剂化合物的阳离子部分的可能的阴离子抗衡离子包括但不限于氯化物、溴化物和氢氧化物。
在优选实施方案中，根据本发明的方法包括向含有致化学发光化合物(即吖啶鎓化合物，例如吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺)的化学发光反应混合物中加入增强剂的步骤。
在优选实施方案中，根据本发明的增强剂化合物或每种增强剂化合物选自由本文公开的式(I)的季胺阳离子物质组成的组，其中R1为C3-C18烷基或烯基，优选为C5-C18烷基或烯基；更优选为C8-C16烷基或烯基；最优选为C12-C14烷基或烯基；R2和R3彼此独立地为甲基、乙基、丙基或丁基，优选为甲基；R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基，优选为氢、甲基或乙基；和/或X1-为氯化物或溴化物，优选为氯化物。
在优选实施方案中，根据本发明的增强剂化合物、增强剂中的至少一种化合物或增强剂中的每种化合物选自由以下组成的组：
-苄基二甲基二十烷基氯化铵、
-苄基二甲基十九烷基氯化铵、
-苄基二甲基十八烷基氯化铵、
-苄基二甲基十七烷基氯化铵、
-苄基二甲基十六烷基氯化铵、
-苄基二甲基十五烷基氯化铵、
-苄基二甲基十四烷基氯化铵、
-苄基二甲基十三烷基氯化铵、
-苄基二甲基十二烷基氯化铵、
-苄基二甲基十一烷基氯化铵、
-苄基二甲基癸基氯化铵、
-苄基二甲基壬基氯化铵、
-苄基二甲基辛基氯化铵、
-苯扎氯铵、
-苄基二甲基庚基氯化铵、
-苄基二甲基己基氯化铵、
-苄基二甲基戊基氯化铵、
-苄基二甲基丁基氯化铵、
-苄基二甲基丙基氯化铵、
-苄基三丙基氯化铵、
-苄基二丙基乙基氯化铵、
-苄基二乙基丙基氯化铵、
-苄基二丙基甲基氯化铵、
-苄基丙基乙基甲基氯化铵、
-苄基三丁基氯化铵、
-苄基二丁基丙基氯化铵、
-苄基二丙基丁基氯化铵、
-苄基丁基丙基乙基氯化铵、
-苄基丁基丙基甲基氯化铵、
-苄基丁基乙基甲基氯化铵、
-苄基二乙基丁基氯化铵、
-C12-14-烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵、
-十二烷基(乙基苄基)二甲基氯化铵、
-十四烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵、
-十八烷基二甲基(ar-乙基苄基)氯化铵和含有溴化物而不是氯化物的相应的上述化合物。
表1显示了包括根据本发明的分子结构的示例性增强剂化合物(适合作为化学发光增强剂的具有芳族头部基团的阳离子物质)的列表。为了澄清所列物质的身份，尽管化学命名中可能存在歧义，但如果化学文摘服务(CAS)注册号和/或化合物记录(CID)可被找到并且公开可用，则将该信息列于表1中。根据美国化学学会的分类的化学文摘社注册号可通过https://www.cas.org或https://commonchemistry.cas.org获得。CID记录可通过https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov在国立卫生研究院的PubChem数据库中找到。如果未将CAS和/或CID赋予化合物，或者没有公开可用的信息，则相应的化合物被定义为“n.d.”。
根据本发明的增强剂可由表1中的两种、三种或更多种表1中的上述化合物的混合物组成，并且该混合物也可作为单独的制品商购获得。表1中上述化合物中的两种、三种或更多种的混合物的一个实例(其可作为单独的制品商购获得)是例如苯扎氯铵或苯扎溴铵。苯扎氯铵是烷基苄基二甲基氯化铵(ABDAC)的混合物，其烷基部分由C8至C188链组成。根据混合物的组成，可以分别找到苯扎氯铵的多种商业制品和CAS编号。
如果根据本发明的增强剂化合物包括手性C原子，则增强剂化合物公开并包括所述化合物的所有异构体形式。
在优选实施方案中，化学发光反应混合物中所述增强剂的有效量为0.001％重量/体积(w/v)或更高，优选为0.01％w/v，更优选为0.1％w/v或更高，最优选为0.2％w/v或更高，在每种情况下均基于化学发光反应混合物的总体积。通常，在化学发光反应中，增强化学发光反应混合物中致化学发光化合物的化学发光信号所需的增强剂的有效量将根据所选择的增强剂而变化，并且可以凭经验确定。通常，化学发光反应混合物中增强剂的有效量大于0.005重量％/体积，优选大于0.01％w/v，在每种情况下均基于化学发光反应混合物的总体积。在优选实施方案中，化学发光反应混合物中包含的实现增强的化学发光信号的增强剂的量在0.005％w/v至3％w/v的范围内，优选在0.01％w/v至2％w/v的范围内，也优选在0.05％w/v至1％w/v的范围内，更优选在0.08％w/v至0.8％w/v的范围内，甚至更优选在0.1％w/v至0.6％w/v的范围内，最优选在0.2％w/v至0.5％w/v的范围内，在每种情况下均基于化学发光反应混合物的总体积。在特别优选的实施方案中，包含在化学发光反应混合物中的实现增强的化学发光信号的增强剂的量在0.08％w/v至0.4％w/v的范围内，在每种情况下均基于化学发光反应混合物的总体积。
优选地，根据本发明的方法或用途的化学发光反应应该在20℃至37℃的温度和10至13.5的范围内的pH下进行。优选在用于本发明的方法之前稀释根据本发明的增强剂。合适的稀释剂包括水、酸性水溶液或碱性水溶液。
在优选实施方案中，根据本发明的增强剂可溶于化学发光反应混合物中。
在优选实施方案中，根据本发明的方法通过免疫测定进行或者是免疫测定的一部分，其中免疫测定优选包括检测抗原、抗体或自身抗体的存在或不存在的步骤。免疫测定可以优选选自包括竞争性测定、捕获桥测定、免疫量度测定(immunometric assay)、直接或间接类别捕获测定的组。这些形式中的每一种的原理详述于The Immunoassay Handbook，第3版，由David Wild编辑，Elsevier,2005中。
在优选实施方案中，根据本发明的化学发光反应是闪光型化学发光反应。闪光型化学发光反应在数秒至数分钟的范围内产生明亮的化学发光信号。
在进一步优选的实施方案中，根据本发明的在化学发光反应中增强化学发光反应混合物中致化学发光化合物的化学发光信号的方法包括作为化学发光反应的闪光型化学发光反应。
在优选实施方案中，将根据本发明的增强剂在化学发光反应开始之前、同时或之后不久与致化学发光化合物在化学发光反应混合物中组合，优选将增强剂在化学发光反应开始的同时与致化学发光化合物在化学发光反应混合物中组合。
在优选实施方案中，检测由根据本发明的化学发光反应产生的化学发光信号，持续固定的持续时间，优选地，形成化学发光反应混合物，开始化学发光反应并同时检测信号，更优选地，检测的持续时间为0.01至360秒，甚至更优选为0.1至30秒，甚至更优选为0.3至15秒，最优选为0.5至10秒，其中在每种情况下，检测的持续时间从化学发光反应开始时开始。
在优选实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：在化学发光反应开始的同时，将根据本发明的增强剂与化学发光反应混合物中的致化学发光化合物组合，和/或从化学发光反应开始时开始检测由根据本发明的化学发光反应产生的化学发光信号，持续0.1至10秒的固定的持续时间。
根据本发明，化学发光反应优选通过引发致化学发光化合物的氧化来开始。优选地，氧化致化学发光化合物的引发步骤通过添加氧化化合物(优选为过氧化氢)来进行。
在优选实施方案中，优选根据前述实施方案中的至少一个实施方案，化学发光反应混合物还包含过氧化氢、酸(优选为硝酸)和/或碱性氢氧化物(优选为氢氧化钠)。
在优选实施方案中，优选根据前述实施方案中的至少一个实施方案，化学发光反应混合物包括触发溶液A和触发溶液B。优选地，触发溶液A包括酸(优选为硝酸)和过氧化氢，触发溶液B包括碱性氢氧化物(优选为氢氧化氢钠)和根据本发明的增强剂。
在优选实施方案中，优选根据前述实施方案中的至少一个实施方案，通过将触发溶液A(优选包括硝酸和过氧化氢)和触发溶液B(优选包括氢氧化钠和根据本发明的增强剂)与致化学发光化合物混合来提供化学发光反应混合物，所述致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺。
根据本发明的致化学发光化合物是吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺。
在本领域中众所周知的是：吖啶鎓化合物在水性介质中以吖啶鎓形式与假碱形式之间的平衡存在，其中实际上所有的免疫测定都在水性介质中进行。吖啶鎓化合物的假碱形式不能与过氧化氢反应，因此不能产生化学发光。化学发光吖啶鎓形式与非化学发光假碱形式之间的平衡受到介质pH的强烈影响。酸性pH促进吖啶鎓形式形成，碱性pH促进假碱形式形成。
在非均相测定形式中，来自吖啶鎓化合物或吖啶鎓化合物标记的生物活性分子(称为示踪剂或缀合物)的化学发光通常由两种试剂的依次添加触发。需要用含过氧化物的强酸对吖啶鎓化合物进行初步处理来将吖啶鎓化合物的假碱形式转化为吖啶鎓形式。然后用碱溶液处理，中和酸并提高反应介质的pH值，使过氧化氢电离，从而使光发射发生。
优选地，用于本发明的致化学发光化合物是根据式(II)的吖啶鎓酯：
其中R1为烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、磺基烷基、羧基烷基和氧代烷基；并且其中R3至R15各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、氨基、酰氨基、酰基、烷氧基、羟基、羧基、卤素、卤化物、硝基、氰基、磺基、磺基烷基、氨磺酰基、羧基烷基、琥珀酰亚胺酯和氧代烷基或任何其它离去基团；并且任选地，如果存在，X1-为阴离子；
或根据式(III)的吖啶鎓磺酰胺
其中R1选自由以下组成的组：烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、磺基烷基、羧基烷基和氧代烷基，并且其中R2至R15各自独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、氨基、酰氨基、酰基、烷氧基、羟基、羧基、卤素、卤化物、硝基、氰基、磺基、磺基烷基、氨磺酰基、羧基烷基、琥珀酰亚胺酯和氧代烷基或任何其它离去基团；并且任选地，如果存在，X1-为阴离子。
在优选实施方案中，优选根据前述实施方案中的至少一个实施方案，化学发光化合物是如本文公开的根据式(II)的吖啶鎓酯，其中另外R12和R14各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、氨基、羧基、羟基、烷氧基、硝基或卤化物；R11和R15各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、酰氨基、磺酰胺或硫化物；并且R13代表以下取代基
R13＝L-R16-R17
其中L为氨磺酰氯或被省略，R16被省略或为烷基、芳基、芳烷基、(酰氨基)z，其中z＝1-10，优选z＝1或2，或为(聚环氧乙烷)x，其中x＝1-10，优选x＝4；并且R17选自由以下组成的组：
或任何其它离去基团，
其中R为烷基、芳基或芳烷基；X为CH3SO4、OSO2F、卤化物、OSO2CF3、OSO2C4F9，或
并且其中R12、R13和R14取代基位置是可互换的。
在优选实施方案中，优选根据前述实施方案中的至少一个，致化学发光化合物是如本文公开的根据式(III)的吖啶鎓磺酰胺，其中另外R12、R13和R14各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、氨基、羧基、羟基、烷氧基、硝基或卤化物；R11和R15各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、酰氨基、磺酰胺或硫化物；并且R2代表以下取代基
R2＝L-R16-R17
其中L是氨磺酰基或被省略，R16被省略或为烷基、芳基、芳烷基、(酰氨基)z，其中z＝1-10，优选z＝1或2，或(聚环氧乙烷)x，其中x＝1-10，优选x＝4；并且R17选自由以下组成的组：
或任何其它离去基团，
其中R为烷基、芳基或芳烷基；X为CH3SO4、OSO2F、卤化物OSO2CF3、OSO2C4F9或
并且其中R11至R15取代基位置是可互换的。
适用于本发明的吖啶鎓化合物进一步描述于1986年10月6日提交的美国专利申请序列号915,527中和Natrajanet等人，“A comparison of chemiluminescent acridiniumdimethylphenyl ester labels with different conjugation sites”,Org BiomolChem,13(9):2622-337，2015年3月中。
在优选实施方案中，优选根据前述实施方案中的至少一个，致化学发光化合物选自由以下组成的组：
-N-磺基丙基-二甲基吖啶鎓-(聚环氧乙烷)x-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NSP-DMAE-PEOx-NHS)，其中x＝1-10，优选N-磺基丙基-二甲基吖啶鎓-(聚环氧乙烷)4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NSP-DMAE-PEO4-NHS)；
-2,6-(二甲基)-3-氯磺酰基苯基-N-(3-磺基丙基)-吖啶鎓-9-羧酸酯(SPAE)；
-2,6-(二甲基)-3-氨磺酰基苯基-N-(3-磺基丙基)-吖啶鎓-9-羧酸-(聚环氧乙烷)4-五氟苯基酯(SPAE-PEO4-PFP)；
-2,6-(二甲基)-3-氯磺酰基苯基-N-甲基-吖啶鎓-9-羧酸三氟甲磺酸酯(MeAE)；
-2,6-(二甲基)-3-氨磺酰基苯基-N-甲基-吖啶鎓-9-羧酸三氟甲磺酸酯-(聚环氧乙烷)4-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MeAE-PEO4-NHS)，
-2,3,4,5,6-五氟苯基氧基-1-羰基-4,7,10,13-四氧杂pentade-环-(15-氨基)-3’-磺酰基-2',6'-二甲基苯基-N-(3-磺基丙基)-吖啶鎓-9-羧酸酯，
-10-甲基-2,6-二甲基-吖啶鎓-NHS酯甲基硫酸盐(Me-DMAE-NHS)
-N-磺基丙基-二甲基吖啶鎓-N-羟基琥珀酰亚胺(NSP-DMAE-NHS)；和
-N-磺基丙基-吖啶鎓-磺酰胺-N-羟基琥珀酰亚胺(NSP-SA-NHS)。
表2中显示了根据本文定义的式(II)或(III)的示例性吖啶鎓化合物(适合作为根据本发明的致化学发光化合物)的列表。为了澄清所列物质的身份，尽管化学命名中可能存在歧义，但如果化学文摘服务(CAS)注册号和/或化合物记录(CID)可被找到并且公开可用，则将该信息列于表2中。根据美国化学学会的分类的化学文摘社注册号可通过https://www.cas.org or https://commonchemistry.cas.org获得。CID记录可通过https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov在国立卫生研究院的PubChem数据库中找到。如果化合物未被赋予CAS和/或CID，或者没有公开可用的信息，则相应的化合物被定义为“n.d.”。
表2:根据本发明的式(II)或(III)的吖啶鎓化合物的示例性列表。
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根据本发明的吖啶鎓化合物可以被任何氧化剂氧化，所述氧化剂与该化合物反应引起该化合物的激发，使得该化合物在化学发光反应中发光。优选氧化剂是稀碱中的过氧化氢。
在优选实施方案中，根据本发明的化学发光反应混合物以基于化学发光反应混合物总体积的0.01体积％至1体积％，优选基于化学发光反应混合物总体积的0.05体积％至0.5体积％，最优选基于化学发光反应混合物总体积的0.1体积％至0.3体积％的量包含氧化剂。
发射的光可使用诸如以下装置的标准测量装置进行定量：LB 960 Centro微板光度计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG,德国)、810型光度计(Ciba-CorningDiagnostics Corp.,Medfield,MA)或RA分析仪10(Euroimmun,a PerkinElmer company,德国)。
在优选实施方案中，能够化学发光发射的致化学发光化合物发射波长为400nm或更长，优选为400nm至690nm，更优选为400nm至550nm，更优选为405nm至500nm，最优选为410nm至490nm的光。
在第二方面，通过使用选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物解决本发明的根本问题
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；并且X1-为卤化物或羟基离子，优选为氯化物或溴化物，用于在化学发光反应中，优选在化学发光免疫测定中增强吖啶鎓化合物，优选吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选根据本发明的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺的化学发光信号。
在优选实施方案中，所述化合物选自由本文定义的式(I)的季胺阳离子物质组成的组，其中R1为C3-C18烷基或烯基，优选为C5-C18烷基或烯基；更优选为C8-C16烷基或烯基；最优选为C12-C14烷基或烯基；R2和R3彼此独立地为甲基、乙基、丙基或丁基，优选为甲基，R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基，优选为氢、甲基或乙基；和/或X1-为氯化物或溴化物，优选为氯化物。
优选地，将选自由如上所述的式(I)的季胺阳离子物质组成的组的一种、两种或更多种化合物用于在化学发光反应中，优选在化学发光免疫测定中增强优选根据本发明的致化学发光化合物，优选吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺的化学发光信号。
根据本发明，所述化合物是具有芳族头部基团的根据本发明的增强剂化合物。
在第三方面，本发明的根本问题通过化学发光组合物来解决，所述组合物含有至少一种选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；并且X1-为卤化物或羟基离子，优选为氯化物或溴化物，和至少一种致化学发光化合物，其中致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选为本文公开的式(II)或式(III)的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺。
根据本发明，根据本发明的化学发光组合物中的至少一种化合物是具有芳族头部基团的根据本发明的增强剂化合物。
在优选实施方案中，根据本发明的化学发光组合物还包含荧光剂。
根据本发明的化学发光组合物还可包含一种或多种荧光剂，例如荧光素钠、罗丹明B和/或罗丹明6G。一种或多种荧光剂在接收来自致化学发光化合物的化学发光信号的光能后会发出一种荧光。可能荧光素的量子产率可以远远大于致化学发光化合物的量子产率，因此可以间接提高致化学发光化合物的量子产率。例如，荧光素钠(9-(邻羧基苯基)-6-羟基-3H-呫吨-3-酮二钠)是水溶性荧光剂，并且具有分别为494nm和518nm的激发和发射波长。荧光素钠的量子产率高达0.97。类似地，罗丹明系列荧光剂也具有非常高的荧光量子产率。在根据本发明的化学发光组合物中，荧光剂优选以约0.1mg/L至约1g/L的浓度使用。
在优选实施方案中，根据本发明的化学发光组合物是根据本发明的方法的化学发光反应混合物。优选地，根据本发明的化学发光组合物还包含硝酸、过氧化氢和/或氢氧化钠。
本发明的化学发光组合物，优选根据公开的实施方案，可以通过将化学发光组合物的组分单独包装到多包装系统中而包含在试剂盒中。在根据本发明的其它实施方案中，可将一些组分组合在一个容器中，而将另外的组分储存在分开的容器中以形成多包装系统。或者，可将组分混合，然后包装成单一混合物。
在第四方面，本发明的根本问题通过试剂盒解决，所述试剂盒优选用于增强致化学发光化合物的化学发光，其包含至少一种致化学发光化合物，其中致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选为如上公开的式(II)或式(III)的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，以及一种、两种或更多种选自由如上公开的式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物。该问题优选通过用于增强致化学发光化合物的化学发光的试剂盒来解决，其中致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选为如上公开的式(II)或式(III)的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，以及一种、两种或更多种选自由如公开的式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物。
优选地，一种、两种或多种选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物是如上所述的根据本发明的增强剂。
在优选实施方案中，将根据本发明的试剂盒的组分单独储存或以一种、两种或更多种混合物的形式储存。
在优选实施方案中，将至少一种致化学发光化合物(优选为本文公开的式(II)或式(III)的化合物)和一种、两种或多种选自由本文公开的式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物一起(任选地，还与氢氧化钠一起)储存在根据本发明的试剂盒中的一种混合物中。优选地,将触发溶液A(优选包含硝酸和过氧化氢)单独储存在根据本发明的试剂盒中。
在优选实施方案中，根据本发明，优选根据公开的优选实施方案中的至少一个实施方案的试剂盒包含在诊断上有用的载体(优选为固体载体)，包含用于捕获液体溶液中的抗原、抗体或自身抗体的工具和用于检测与载体结合的抗原、抗体或自身抗体的工具，其中用于检测与载体结合的抗原、抗体或自身抗体的工具用至少一种致化学发光化合物(即吖啶鎓化合物，优选根据本发明的式(II)的吖啶鎓酯或式(III)的吖啶鎓磺酰胺)标记。根据本发明，进一步优选的是：在诊断上有用的载体选自由以下组成的组：珠粒(优选为顺磁珠)、测试条、微量滴定板、膜(优选来自包括以下的组：蛋白质印迹、线印迹和点印迹)、侧流装置、玻璃表面、显微镜载玻片、微阵列和生物芯片。在进一步优选的实施方案中，在诊断上有用的载体是线印迹、生物芯片或珠粒，最优选为珠粒。优选地，在诊断上有用的载体通过珠粒提供。根据本发明，进一步优选的是至少一种致化学发光化合物结合到珠粒上，其中所述致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选为根据本发明的式(II)或式(III)的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺。该结合可通过非共价蛋白质间相互作用存在，通过蛋白质间相互作用桥接，或者可通过共价结合存在。
在优选实施方案中，根据本发明的试剂盒还包括如上所述的在诊断上有用的载体、触发溶液A和触发溶液B，其中触发溶液A包括硝酸和过氧化氢，触发溶液B包括氢氧化钠和选自由如上定义的式(I)的季胺阳离子物质组成的组的一种、两种或更多种化合物，并且其中至少将触发溶液A和触发溶液B单独储存。
在优选实施方案中，根据本发明的试剂盒还包括用于检测与裁体结合的抗原、抗体或自身抗体的工具，其中用于检测与载体结合的抗原、抗体或自身抗体的工具可以是二抗。优选地，二抗是特异性结合来自抗体类别，优选哺乳动物抗体类别，更优选人抗体类别诸如IgG的所有抗体的抗体。二抗通常识别所述类别的恒定区，但也可识别由目标类别的抗体共享的其它表位，例如跨越3D结构的构象表位。它们中的很大一部分是商购可得的，例如来自Thermo Fisher。其可以是单克隆或多克隆抗体。在优选实施方案中，如本文中所用，术语“被识别的”意指二抗特异性结合待检测的一种或多种抗原、抗体/多种抗体或自身抗体/多种自身抗体。二抗可以特异性结合来自抗体类别的所有同种型。例如，IgG类抗体的二抗可以结合IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。这可通过使用包含特异性结合每种IgG同种型的抗体或与所有目标同种型反应的单一抗体的混合物作为针对该类别抗体，优选针对IgG类抗体的二抗来实现。在The Protein Protocols Handbook(编辑J.M.Walker)，第967页，第1996卷，Springer中的Kruger,N.J.,Detection of Polypeptides on Blots UsingSecondary Antibodies中解释了二抗的使用。简言之，此类二抗可通过用待识别的抗体或待识别抗体的混合物免疫实验动物来产生。
在优选实施方案中，如本文中所用，术语“特异性结合”优选意指结合反应强于特征在于解离常数为1x 10-5M，更优选为1x 10-7M，更优选为1x 10-8M，更优选为1x 10-9M，更优选为1x 10-10M，更优选为1x 10-11M，更优选为1x 10-12M(如使用Biacore设备在25℃下于pH7的PBS缓冲液中通过表面等离子体共振测定的)的结合反应。
在优选实施方案中，根据本发明的化学发光组合物、化学发光反应混合物和/或试剂盒还包括一种或多种，优选所有来自包括以下的组的试剂：稳定剂(优选一组稳定剂)、洗涤缓冲液、抗降解剂。
根据本发明的化学发光组合物、化学发光反应混合物和/或试剂盒还可包括缓冲剂，用于维持反应系统的pH。合适的缓冲剂包括碳酸盐缓冲剂、二乙醇胺缓冲剂、2-氨基-2-甲基-1-丙醇等。缓冲液可以以约10至约500mM的浓度使用。
根据本发明的化学发光组合物、化学发光反应混合物和/或试剂盒还可包括防腐剂，这有利于试剂的保存和长期储存。对防腐剂的类型没有限制，可以使用商购可得的防腐剂诸如Proclin300、叠氮化钠、Kathon和庆大霉素。防腐剂可以以不会影响化学发光反应的任何浓度使用。
在优选实施方案中，根据本发明的试剂盒还包括一种或多种，优选所有试剂，所述试剂来自包括以下的组：校准品(优选一组校准品)、阳性对照和阴性对照。
根据另外的不同的检测用途，根据本发明的试剂盒还可包括相应的酶试剂、标记的酶试剂、固相抗体和/或指导操作者的手册。
在第五方面，通过使用根据本发明的化学发光组合物或化学发光反应混合物制造用于疾病诊断的试剂盒、医疗装置(优选为诊断装置)，解决了本发明的根本问题。根据本发明，医疗装置优选选自包括以下的组：载玻片(优选用于显微镜)、生物芯片、微量滴定板、侧流装置、测试条、膜(优选为线印迹)、色谱柱和珠粒(优选为磁性或荧光珠粒)的组。
在另一方面，本发明涉及用于检测测试样品中目标分析物的免疫测定和/或方法，所述免疫测定和/或方法包括以下步骤：
(a)将怀疑含有目标分析物的测试样品与结合目标分析物上的至少一种表位的第一抗体接触以形成第一抗体-分析物复合物，其中将第一抗体固定在固相上，并且进一步地其中测试样品中至少一种自身抗体结合目标分析物上的至少一种表位，形成自身抗体-分析物复合物，其中所述自身抗体结合固相；
(b)将包含第一抗体-分析物复合物和自身抗体-分析物复合物的所述混合物与已缀合于可检测标记物的二抗接触，以形成第一抗体-分析物-二抗复合物和自身抗体-分析物-二抗复合物；其中所述二抗结合目标分析物上的至少一种表位，并且进一步地其中所述可检测的标记物是至少一种吖啶鎓化合物，更优选为根据本发明的如上所述的根据式(II)的吖啶鎓酯或根据式(III)的吖啶鎓磺酰胺；
(c)产生根据本发明的如上所述的根据式(I)的过氧化氢源和增强剂或向步骤(b)的混合物中提供所述过氧化氢源和增强剂；
(d)向步骤(c)的混合物中加入碱性溶液以产生光信号；以及
(e)测量通过步骤(d)产生的或步骤(d)中发射的光信号，并检测测试样品中的目标分析物。
在上述免疫测定或方法中，测试样品可以是全血、血清或血浆。
在另外的方面，本发明的根本问题通过用于疾病诊断的本发明的化学发光组合物或本发明的试剂盒来解决。
本发明基于发明人的令人惊惊奇的发现，即通过使用选自由本文公开的式(I)的季胺阳离子物质组成的组的增强剂(化合物),可以在化学发光反应中的化学发光反应混合物中提供致化学发光化合物的增强的化学发光信号，所述致化学发光化合物是吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺。
本发明人令人惊奇地发现，与常规物质诸如十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)相比，在季胺阳离子物质的带正电荷的头部基团中加入芳族部分进一步增强了化学发光信号输出。此外，本发明人令人惊奇地发现，与常规物质诸如十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)相比，以及与在带正电荷的头部基团中具有芳族部分但在疏水尾中失去至少三个碳原子的长度的季胺阳离子物质相比，这种季胺阳离子物质的疏水尾中至少三个碳原子的长度对于化学发光信号输出的增强具有额外的重要性。
因此，根据本发明的所述新方法(以及相关的用途、组合物、混合物和/或物质)允许对具有超低浓度的分析物进行甚至更灵敏的定量，而且通常有利于化学发光免疫测定中的信号区分。
根据本发明的化学发光增强剂化合物包括对致化学发光化合物，特别是根据本发明的式(II)和/或式(III)的致化学发光化合物的化学发光具有所需增强效果的简单组分。本发明的化学发光组合物提供稳定、持久和大大增强的化学发光信号，并可用于化学发光免疫测定、DNA探针检测和生物膜蛋白质印迹的化学发光分析。本发明的化学发光组合物可广泛用于临床诊断、科学研究、环境和卫生检测以及法医鉴定领域。一般来说，根据本发明的化学发光增强剂化合物是商购可得的且便宜的。此外，它们适于大规模生产化学发光组合物。
除非另有说明，否则本文使用的术语具有以下含义：
本文使用的术语“增强”意指当使用根据本发明的增强剂时，化学发光反应的总光发射和/或化学发光反应的信号与背景噪声的比率比不存在根据本发明的增强剂时大和/或与在本发明之前一直使用的所谓增强剂(即十六烷基三甲基氯化铵；CTAC)相比更大。
本文中单独使用或与其它基团组合使用的术语“烷基”是指含有1-20个碳原子诸如1-12个、1-8个和1-6个碳原子的直链或支链烷基。提及单个直链烷基诸如“正丙基”具体表示直链烷基，而提及单个支链烷基诸如“异丙基”具体表示支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。相同的规则适用于在整个本说明书中使用的其它基团。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。
本文使用的术语“烷氧基”意指本文定义的通过氧原子附接至母体分子部分的烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
本文使用的术语“芳基”是指苯基，或双环或三环稠环系统，其中一个或多个稠环是苯基。双环稠环系统的实例是与环烯基、环烷基或另一个苯基稠合的苯基。三环稠环系统的实例是与如本文所定义的环烯基、环烷基或另一个苯基稠合的双环稠环系统。芳基的代表性实例包括但不限于蒽基、薁基、芴基、茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。本公开的芳基可以任选地被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自由烷氧基、烷基、羧基、卤素和羟基组成的组的取代基取代。
本文使用的术语“酰基”是指-C(O)Ra基团，其中Ra为氢、烷基、环烷基、环烷基烷基、苯基或苯基烷基。酰基的代表性实例包括但不限于甲酰基、乙酰基、环己基羰基、环己基甲基羰基、苯甲酰基、苄基羰基等。
本文使用的术语“烯基”是指含有2-20个碳并含有至少一个通过除去两个氢形成的碳-碳双键的直链或支链烃。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、2-庚烯基、2-甲基-1-庚烯基和3-癸烯基。
本文使用的术语“炔基”意指含有2至20个碳原子并含有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的代表性实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、3-丁炔基、2-戊炔基和1-丁炔基。
本文使用的术语“酰氨基”是指通过羰基连接至母体分子部分的氨基(其中术语“羰基”是指-C(O)-基团)。
本文使用的术语“氨基”意指-NRbRc，其中Rb和Rc独立地选自由氢、烷基和烷基羰基组成的组。
本文所用的术语“芳烷基”意指通过本文所定义的烷基附接至到母体分子部分的芳基。芳基烷基的代表性实例包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基和2-萘-2-基乙基。
如本文中所用，术语“羧基(carboxy)”或“羧基(carboxyl)”指-CO2H或-CO2。
如本文中所用，术语“羧基烷基”是指-(CH2)nCO2H or-(CH2)nCO2-基团，其中n为1至20。
如本文中所用，术语“氰基”意指-CN基团。
如本文中所用，术语“环烯基”是指具有3至10个碳原子和1至3个环的非芳族环状或双环环系统，其中每个五元环具有一个双键，每个六元环具有一个或两个双键，每个七元和八元环具有1至3个双键，每个九元至十元环具有1至4个双键。环烯基的代表性实例包括环己烯基、八氢化萘基、降冰片烯基等。环烯基可任选被1、2、3、4或5个独立地选自由烷氧基、烷基、羧基、卤素和羟基组成的组的取代基取代。
如本文中所用，术语“环烷基”是指具有3至12个碳原子的饱和单环、双环或三环烃环系统。环烷基的代表性实例包括环丙基、环戊基、双环[3.1.1]庚基、金刚烷基等。本公开的环烷基可以任选地被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自由烷氧基、烷基、羧基、卤素和羟基组成的组的取代基取代。
如本文中所用，术语“环烷基烷基”意指-RdRe基团，其中Rd为亚烷基，Re为环烷基。环烷基烷基的代表性实例是环己基甲基等。
本文使用的术语“卤化物”包括氟化物、氯化物、溴化物和碘化物。
如本文中所用，术语“羟基”意指-OH基团。
如本文中所用，术语“硝基”意指-NO2基团。
如本文中所用，术语“氧代烷基”是指-(CH2)nC(O)Ra，其中Ra为氢、烷基、环烷基、环烷基烷基、苯基或苯基烷基，并且其中n是1至20。
如本文中所用，术语“苯基烷基”意指被苯基取代的烷基。
如本文中所用，术语“磺基”意指-SO3H或-SO3 -基团。
如本文中所用，术语“磺基烷基”是指-(CH2)nSO3H或-(CH2)nSO3 -基团，其中n为1至20。
如本文中所用，术语“可溶的”是指没有沉淀。
如本文中所用，术语“氨磺酰基”指-SO2-NR1-，其中R1选自由以下组成的组：氢、烷基、芳基和烷基羰基。
如本文中所用，术语“磺酰胺”是指磺酸的任何酰胺。
本文使用的术语“化学发光”是化学物质的特定反应中产生的光。单重态分子被激发并形成为在化学反应中分解的高能中间物，然后被激发的单重态分子返回到基态，部分能量以发光的形式发射。因此，化学发光反应包括两个过程：激发过程和发光过程。一些分子能量也将由于系统间和系统内交叉而以激发态耗散。
在优选实施方案中，本文所用的术语“诊断”以其最广泛的可能含义使用，并且可以指任何种类的程序，其目的在于获得有助于评估患者(来自队列的已知或匿名受试者)在过去、在诊断时或在将来是否患有或可能患有或者比平均受试者或可比较的受试者(后者优选具有相似的症状)更可能患有某种疾病或病症的信息、查明疾病如何进展或可能在将来进展、或评价一名或多名患者对某种治疗(例如免疫抑制药物的施用)的总体反应性、或查明样品是否来自这样的患者。这种信息可用于临床诊断，但是也可以由实验和/或研究实验室出于一般研究的目的(例如确定患者队列或人群中患有该疾病的受试者的比例)获得。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，还包括预测和/或监测疾病或病症的过程，包括监测一个或多个患者对药物或候选药物的施用的反应，例如以确定其疗效。虽然可以将结果分配给特定患者用于临床诊断应用，并且可以将结果传送给治疗所述患者的医生或机构，但是对于其它应用，例如在用于研究目的的诊断中，这不一定是这种情况，在其它应用中，将结果分配给来自匿名患者的样品可能就足够了。
在优选实施方案中，术语“诊断”也可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或剂。换句话说，该方法或剂可涉及为受试者选择治疗方案。例如，自身抗体的检测可表明要选择免疫抑制疗法，这可包括向患者施用一种或多种免疫抑制药物。
根据本发明的方法优选是体外方法。
根据本发明，试剂盒可包括如何实施根据本发明的方法的说明书。
在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于非诊断用途，例如确定自身抗体的存在用于除诊断患者外的用途。例如，该方法或用途可用于体外测试设计用于从患者血液中去除自身抗体的医疗装置的功效，其中该测试是在除患者血液外的液体上进行的。
在另一个优选实施方案中，该方法可用于确认诊断测定的可靠性，并且可包括检测针对多肽的抗体。
在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于鉴定有患有或发展疾病和/或肿瘤的风险的受试者。
附图说明
图1显示了在0.5％(w/v)的三种不同的阳离子化合物(每种阳离子化合物具有芳族头部基团)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团的阳离子化合物CTAC存在的情况下1nM NSP-DMAE-NHS的化学发光动力学。
图2显示了在0.5％(w/v)的三种不同阳离子化合物(每种化合物具有芳族头部基团)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团的阳离子去垢剂CTAC存在的情况下1nM NSP-SA-NHS的化学发光动力学。
图3显示了在0.5％(w/v)的三种不同的阳离子化合物(每种阳离子化合物具有芳族头部基团)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团的阳离子去垢剂CTAC存在的情况下0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-DMAE的化学发光动力学。
图4显示了在0.5％(w/v)的三种不同的阳离子化合物(每种阳离子化合物具有芳族头部基团)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团的阳离子去垢剂CTAC存在的情况下0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-SA的化学发光动力学。
图5显示了在0.5％(w/v)的四种不同的阳离子化合物(每种化合物具有芳族头部基团和拥有至少三个碳原子的延长的疏水尾)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵；化合物4：苄基二甲基十二烷基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的含有芳族头部基团但缺少延长的疏水尾的苄基三乙基氯化铵(BTEAC)存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳簇头部基团但含有延长的疏水尾的CTAC存在的情况下1nM NSP-DMAE-NHS的化学发光动力学。
图6显示了在0.5％(w/v)的四种不同的阳离子化合物(每种化合物具有芳族头部基团和拥有至少三个碳原子的延长的疏水尾)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵；化合物4：苄基二甲基十二烷基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的含有芳族头部基团但缺少延长的疏水尾的BTEAC存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团但含有延长的疏水尾的CTAC存在的情况下1nM NSP-SA-NHS的化学发光动力学。
图7显示了在0.5％(w/v)的四种不同的阳离子化合物(每种化合物具有芳族头部基团和拥有至少三个碳原子的延长的疏水尾)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵；化合物4：苄基二甲基十二烷基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的含有芳族头部基团但缺少延长的疏水尾的BTEAC存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团但含有延长的疏水尾的CTAC存在的情况下0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-DMAE的化学发光动力学。
图8显示在0.5％(w/v)的四种不同的阳离子化合物(每种化合物具有芳族头部基团和拥有至少三个碳原子的延长的疏水尾)(化合物1：苄基二甲基十六烷基氯化铵；化合物2：苯扎氯铵；化合物3：烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵；化合物4：苄基二甲基十二烷基氯化铵)存在的情况下或在0.5％(w/v)的含有芳族头部基团但缺少延长的疏水尾的BTEAC存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团但含有延长的疏水尾的CTAC存在的情况下0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-SA的化学发光动力学。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明，从所述实施例中可以获得本发明的进一步特征、实施方案、方面和有利方面。
实施例
吖啶鎓标记和缀合物溶液的制备：
1mg/mL N-磺基丙基-二甲基-吖啶鎓-N-羟基琥珀酰亚胺(NSP-DMAE-NHS；PerkinElmer Inc.,芬兰)和N-磺基丙基-吖啶鎓-磺酰胺-N-羟基琥珀酰亚胺(NSP-SA-NHS；BOC Sciences,USA)的标签原液各自在100％(v/v)N,N-二甲基甲酰胺(Th.Geyer HamburgGmbH&Co.Kg,德国)中制备。将Fcγ片段特异性的AffiniPure山羊抗人IgG(抗人IgG-Fcγ；Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,UK)在pH 7.6的磷酸盐缓冲盐水中稀释至0.33mg/mL的终浓度，随后以10rpm将其在RM-2M型Intelli-混合器(Hassa GmbH,德国)中与10倍摩尔过量的NSP-DMAE-NHS或2.5倍摩尔过量的NSP-SA-NHS一起在室温下孵育2小时。在以10rpm旋转的过程中，通过加入17.4mM L-赖氨酸(VWR International GmbH,德国)在室温下停止该标记反应30分钟。在4℃下，在Heraeus Megafuge 40R离心机(Fisher ScientificGmbH,德国)中，使用Vivaspin 20，截留分子量10kDa浓缩器(VWR International GmbH,德国)在超滤过程中以3.800g从抗体缀合物中除去过量的游离标记，并将缓冲液换成含有0.045％(w/v)叠氮化钠(Merck KgaA,德国)的pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水。将纯化的抗体缀合物储存在含有0.045％(w/v)叠氮化钠、1％(w/v)牛血清白蛋白(Th.Geyer HamburgGmbH&Co.Kg,德国)、0.3％(w/v)P 188(Th.Geyer Hamburg GmbH&Co.Kg,德国)和0.5mM乙二胺四乙酸二钠盐(GerbuBiotechnik GmbH,德国)的磷酸盐缓冲盐水中。
化学发光触发溶液的制备：
制备含有100mM硝酸(VWR International GmbH,德国)和0.2％(v/v)过氧化氢(Roth GmbH&Co.KG,德国)的化学发光触发溶液A和含有0.5M氢氧化钠(GerbuBiotechnikGmbH,德国)的触发溶液B。使用缺少任何去垢剂或者补充有0.05、0.1、0.25或0.5％(w/v)的阳离子化合物十六烷基三甲基氯化铵(Merck KgaA,德国)、十六烷基三甲基溴化铵(MerckKgaA,德国)或十四烷基三甲基氯化铵(Merck KgaA,德国)的触发溶液B，所有所述阳离子化合物都没有芳族头部基团。或者，触发溶液B补充有0.05、0.1、0.25或0.5％(w/v)的阳离子化合物十六烷基苄基二甲基氯化铵(Merck KgaA,Gemany；CAS122-18-9)、苯扎氯铵(MerckKgaA,Gemany；CAS 63449-41-2)、烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵(Alfa Chemistry,USA；CAS 85409-23-0)或苄基二甲基十二烷基氯化铵(VWR International GmbH,德国；CAS139-07-1)(其全部都含有芳族头部基团)、或含有芳族头部基团但缺少至少三个碳原子的延长的疏水尾的苄基三乙基氯化铵(Merck KgaA,德国)。
化学发光信号强度的测量:
将NSP-DMAE-NHS和NSP-SA-NHS标记原液稀释至1nM的终浓度，并将抗体缀合物在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中稀释至0.1μg/mL的终浓度。将10μL的这些稀释液中的每一种转移到96孔LumiNuncTM板(VWR International GmbH,德国)的孔中，在化学发光触发剂A和不同的触发剂B溶液(后者在阳离子化合物的本体和浓度方面不同)各100μL存在的情况下，在LB 960 Centro微板发光计(Berthold Technologies GmbH&Co.KG,德国)上测量化学发光信号强度。在中速注射触发剂A后，在以正常速度的双轨道模式混合期间，将混合物孵育1秒。在以低注射速度加入各种触发B溶液后，在1.5秒的总时间内，每隔50ms记录以相对光单位(RLU)计的化学发光强度。以四次技术重复测量所有样品。在对照实验中，将所有不同的触发剂B溶液与触发剂A组合注射到96孔板的空孔中。后面的实验反映了由不同触发溶液产生的信号背景。
数据分析:
为了图示所观察到的化学发光动力学，从四次技术复制中选择代表性数据集，并将以RLU计的信号强度相对时间作图。另外，通过将在1.5秒时间范围内观察到的所有RLU值相加来计算总信号强度。从总信号强度中减去不同触发剂B溶液的背景信号强度，并将所有经背景校正的总信号强度设置用于比较。
实施例1
选择根据本发明的三种代表性增强剂化合物(化合物1-3)进行分析。这些分子都基于含有与季铵相邻的芳族部分的阳离子季铵化合物。针对常用增强剂物质CTAC(例如在US 4,927,769中提出的)测试了根据本发明的增强剂化合物。相反，CTAC不包含与季铵相邻的芳族部分。
选择了四种代表性分析物来研究根据本发明的增强剂化合物与现有技术中已知的普通增强剂物质相比对由这些分析物产生的化学发光信号的影响(图1-图4)。选择的分析物包括呈游离形式(图1-图2)和呈抗体结合的形式(图3-图4)的吖啶鎓化合物NSP-DMAE-NHS和NSP-SA-NHS。选择来自山羊的多克隆抗人IgG-Fcγ抗体与两种类型的吖啶鎓标记物缀合。
根据上面公开的方法获得吖啶鎓标记物、缀合物溶液和化学发光触发溶液。如上所述进行化学发光信号强度的测量并分析数据。
结果:
使用苄基二甲基十六烷基氯化铵(化合物1)和分析物NSP-DMAE-NHS(图1，表3)与用于相同分析物的增强剂物质CTAC相比，观察到信号输出增加43％。
以NSP-DMAE-NHS作为分析物，苯扎氯铵(化合物2)和氯化烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵(化合物3)与CTAC相比也分别导致19％和15％的信号增加。
当分析物转换为NSP-SA-NHS时，获得了类似的结果(图2，表3)。
与物质CTAC相比，化合物1(苄基二甲基十六烷基氯化铵)导致信号增加67％。此外，对于该分析物，与CTAC相比，观察到对于化合物2和3信号分别增加了58％和40％。
另外，发现当将探针共价连接到抗体上时，也可以观察到针对以游离形式存在的基于吖啶鎓的探针的两个实例观察到的信号输出的增强，后者通常是免疫测定所需要的。
在这种情况下，化合物1(苄基二甲基十六烷基氯化铵)导致与在CTAC存在的情况下分析物抗人IgG-Fcγ-NSP-DMAE(图3，表3)和抗人IgG-Fcγ-NSP-SA(图4，表3)的信号产生相比，这些分析物的信号分别增加45％和66％。化合物2(苯扎氯铵)也分别使这两种抗体缀合物的信号增加了40％和52％。此外，与在CTAC存在的情况下的信号产生相比，在化合物3(烷基(C12-C14)二甲基乙基苄基氯化铵)存在的情况下，观察到两种分析物的信号增加了25％和35％。
表3:
在0.5％(w/v)的三种不同的阳离子增强剂化合物(每种化合物具有芳族头部基团)(化合物1-3)存在的情况下或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团的阳离子去垢剂CTAC存在的情况下，四种不同分析物的经背景校正的总信号强度的比较。
实施例2
描述:
为了测试物质的疏水尾内的链长对化学发光增强的影响，用化合物1-3(如实施例1中所述)、常用的增强剂CTAC、根据本发明的另外的阳离子增强剂(化合物4；苄基二甲基十二烷基氯化铵)和另外的物质BTEAC(苄基三乙基氯化铵)(其在疏水尾中含有少于三个碳原子的链长)进行进一步的实验(图5-图8)。分别如上所述和如实施例1中所述进行这些额外的实验。
结果:
与化合物1-3类似，与常用增强剂CTAC相比，化合物4增强了1nM NSP-DMAE-NHS(图5)、1nM NSP-SA-NHS(图6)、0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-DMAE(图7)和0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-SA(图8)的化学发光。在该实验中，与常用增强剂CTAC相比，化合物1-3使1nM NSP-DMAE-NHS的化学发光增加了45-79％，使1nM NSP-SA-NHS的化学发光增加了62-102％，使0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-DMAE的化学发光增加了46-63％，使0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-SA的化学发光增加了47-50％(表4)。类似地，与常用增强剂CTAC相比，化合物4使1nMNSP-DMAE-NHS的化学发光增加了50％，使1nM NSP-SA-NHS的化学发光增加了47％，使0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-DMAE的化学发光增加了50％，使0.1μg/mL抗人IgG-Fcγ-NSP-SA的化学发光增加了40％(表4)。
对于BTEAC，与常用的增强剂CTAC相比，对于所有四种分析物均观察到减少的化学发光(图5-图8和表4)。尽管这种物质含有芳族头部基团，但这种物质并不起到等同的化学发光增强剂的作用，很可能并且不受任何理论的约束，因为疏水尾的链长太短而不能形成胶束结构。
表4:在0.5％(w/v)的四种不同的阳离子增强剂化合物(每种化合物具有芳族头部基团和拥有至少3个碳原子的延长的疏水尾)(化合物1-4)存在的情况下，或在0.5％(w/v)的含有芳族头部基团但缺少延长的疏水尾的苄基三乙基氯化铵(BTEAC)存在的情况下，或在0.5％(w/v)的缺少芳族头部基团但含有延长的疏水尾的阳离子去垢剂CTAC存在的情况下，四种不同分析物的经背景校正的总信号强度的比较。
总之，在所述实施例中获得的数据表明，与相同的基于吖啶鎓的分析物在常用增强剂如CTAC存在的情况下产生的信号相比，代表本发明提出的增强剂的实施例的所有四种测试化合物能够增加由所有测试的基于吖啶鎓的分析物产生的信号。
此外，这些新的化学发光增强剂都共有分子结构，该分子结构包含与芳族部分(即芳族头部基团)相连的阳离子季铵化合物和增强剂的疏水尾中至少三个碳原子的最小链长。与缺少这些分子部分(即芳族头部基团和疏水尾中至少三个碳原子的最小链长)的增强剂物质相比，所有含有这些分子部分(即芳族头部基团和疏水尾中至少三个碳原子的最小链长)的物质都可能类似地增强由基于吖啶鎓的分析物产生的化学发光。疏水尾中链长度较短的物质不会类似地增强化学发光，很可能是因为它们不会形成胶束结构，而胶束结构被认为有利于化学发光增强。虽然不受理论的束缚，但进一步认为根据本发明的新提出的阳离子化学发光增强剂通过与吖啶鎓环直接相互作用形成所谓的疏水π-π堆积相互作用而有利于化学发光反应过程。以这种方式，吖啶鎓标记物可以被高效地募集和定位以与过氧化氢阴离子反应，后者被相邻阳离子铵离子的正电荷吸引。
本文中的数据、图、仪器、试剂和步骤应该理解为是说明性的，而不是限制性的。尽管参考上述具体实施方案描述了本公开，但许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。所有的修改和变化也落入本公开的精神和范围内。
Claims (14)
1.一种用于在化学发光反应中增强化学发光反应混合物中的致化学发光化合物的化学发光信号的方法，所述方法包括在有效量的增强剂存在的情况下氧化所述致化学发光化合物以获得增强的化学发光信号，
其中所述致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，
其中所述增强剂是化合物或两种、三种或更多种化合物的混合物，并且
其中所述增强剂化合物或每种增强剂化合物选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；并且X1-为卤化物或氢氧根离子，优选为氯化物或溴化物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中
-R1为C5-C18烷基或烯基；
-R2和R3彼此独立地为甲基、乙基、丙基或丁基，优选为甲基；
-R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基，优选为氢、甲基或乙基；和/或
-X1-为氯化物或溴化物，优选为氯化物。
3.根据前述权利要求至少一项的方法，其中所述增强剂、所述增强剂的至少一种化合物或所述增强剂的每种化合物选自由以下组成的组：
-苄基二甲基二十烷基氯化铵、
-苄基二甲基十九烷基氯化铵、
-苄基二甲基十八烷基氯化铵、
-苄基二甲基十七烷基氯化铵、
-苄基二甲基十六烷基氯化铵、
-苄基二甲基十五烷基氯化铵、
-苄基二甲基十四烷基氯化铵、
-苄基二甲基十三烷基氯化铵、
-苄基二甲基十二烷基氯化铵、
-苄基二甲基十一烷基氯化铵、
-苄基二甲基癸基氯化铵、
-苄基二甲基壬基氯化铵、
-苄基二甲基辛基氯化铵、
-苯扎氯铵、
-苄基二甲基庚基氯化铵、
-苄基二甲基己基氯化铵、
-苄基二甲基戊基氯化铵、
-苄基二甲基丁基氯化铵、
-苄基二甲基丙基氯化铵、
-苄基三丙基氯化铵、
-苄基二丙基乙基氯化铵、
-苄基二乙基丙基氯化铵、
-苄基二丙基甲基氯化铵、
-苄基丙基乙基甲基氯化铵、
-苄基三丁基氯化铵、
-苄基二丁基丙基氯化铵、
-苄基二丙基丁基氯化铵、
-苄基丁基丙基乙基氯化铵、
-苄基丁基丙基甲基氯化铵、
-苄基丁基乙基甲基氯化铵、
-苄基二乙基丁基氯化铵、
-C12-14-烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵、
-十二烷基(乙基苄基)二甲基氯化铵、
-十四烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵、
-十八烷基二甲基(ar-乙基苄基)氯化铵，以及含有溴化物而不是氯化物的相应的上述化合物。
4.根据前述权利要求至少一项的方法，其中所述化学发光反应混合物中所述增强剂的有效量为0.001％重量/体积(w/v)或更大，优选0.01％w/v，更优选0.1％w/v或更大，最优选0.2％w/v或更大，在每种情况下均基于化学发光反应混合物的总体积。
5.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中将所述增强剂在所述化学发光反应开始之前、同时或之后不久与所述致化学发光化合物在化学发光反应混合物中组合，优选在所述化学发光反应开始的同时，将所述增强剂与所述致化学发光化合物在化学发光反应混合物中组合。
6.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中检测由所述化学发光反应产生的所述化学发光信号，所述检测持续固定的持续时间，优选地，形成所述化学发光反应混合物，开始所述化学发光反应并同时检测所述信号，更优选地，所述检测的持续时间为0.01至360秒，甚至更优选为0.1至30秒，甚至更优选为0.3至15秒，最优选为0.5至10秒，其中在每种情况下，所述检测的持续时间从所述化学发光反应开始时开始。
7.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中所述化学发光反应混合物还包含过氧化氢、硝酸和/或氢氧化钠。
8.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中所述致化学发光化合物是根据式(II)的吖啶鎓酯
其中R1为烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、磺基烷基、羧基烷基和氧代烷基；并且
其中R3至R15各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、氨基、酰氨基、酰基、烷氧基、羟基、羧基、卤素、卤化物、硝基、氰基、磺基、磺基烷基、氨磺酰基、羧基烷基、琥珀酰亚胺酯和氧代烷基或任何其它离去基团；并且
任选地，如果存在，X1-为阴离子；
或根据式(III)的吖啶鎓磺酰胺
其中R1选自由以下组成的组：烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、磺基烷基、羧基烷基和氧代烷基，并且
其中R2至R15各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基、氨基、酰氨基、酰基、烷氧基、羟基、羧基、卤素、卤化物、硝基、氰基、磺基、磺基烷基、氨磺酰基、羧基烷基、琥珀酰亚胺基和氧代烷基或任何其它离去基团；并且
任选地，如果存在，X1-为阴离子。
9.选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物的用途
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；并且X1-为卤化物或氢氧根离子，优选为氯化物或溴化物，用于在化学发光反应中，优选在化学发光免疫测定中增强吖啶鎓化合物，优选吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺的化学发光信号。
10.根据权利要求9所述的用途，其中
-R1为C5-C18烷基或烯基；
-R2和R3彼此独立地为甲基、乙基、丙基或丁基，优选为甲基，
-R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基，优选为氢、甲基或乙基；和/或
-X1-为氯化物或溴化物，优选为氯化物。
11.一种化学发光组合物，其包含至少一种选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；并且及X1-为卤化物或氢氧根离子，优选为氯化物或溴化物，和
至少一种致化学发光化合物，其中所述致化学发光化合物为吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选为根据前述权利要求之一的式(II)或式(III)的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺。
12.一种优选用于增强致化学发光化合物的化学发光的试剂盒，其包含至少一种致化学发光化合物，其中所述致化学发光化合物是吖啶鎓化合物，优选为吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺，更优选为根据前述权利要求之一的式(II)或式(III)的吖啶鎓酯或吖啶鎓磺酰胺
和
一种、两种或更多种选自由式(I)的季胺阳离子物质组成的组的化合物
其中R1为C3-C20烷基或烯基；并且R2和R3彼此独立地为C1-C4烷基或烯基；并且R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地为氢、烷基、烯基；并且X1-为卤化物或氢氧根离子，优选为氯化物或溴化物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其包含在诊断上有用的载体，优选为固体载体，包含用于捕获液体溶液中的抗原、抗体或自身抗体的工具和用于检测与所述载体结合的抗原、抗体或自身抗体的工具，
其中用于检测与所述载体结合的所述抗原、抗体或自身抗体的所述工具用所述至少一种致化学发光化合物标记。
14.根据权利要求11的化学发光组合物或根据权利要求12或13所述的试剂盒，其用于疾病的诊断。
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