JP3464798B2 - 光活性化化学発光基質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、光活性化化学発光基質、ならびに試料中の
分析物を測定するための方法、組成物および測定用キッ
トに関する。

臨床診断分野は、容易かつ正確に測定できる物質（分
析物）並びに測定方法の多様性に関して、近年幅広い展
開がなされてきた。液体中の低濃度の物質の存在を検出
するための便利で信頼でき、かつ危険ではない手段が望
まれている。臨床化学では、これらの物質は、10^-12モ
ル以下の濃度で体液中に存在することがある。これらの
低濃度物質を検出する難しさは、利用できる試料のサイ
ズが相対的に小さいことにより増大する。

アッセイを発展させる場合に多くの検討がなされる。
一つの検討課題は、分析物の濃度の変化に対するシグナ
ル応答である。第２の検討課題は、アッセイのプロトコ
ールを実施できる容易さである。第３の検討課題は、試
料間の干渉の変化である。試薬の製造および精製の容易
さ、設備の入手可能性、自動化の容易さ、および対象物
質との相互作用は、有用なアッセイの開発において付随
的な検討課題となる。

広義の技術分野は、分析物の存在の機能として標識さ
れたリガンドの特定の空間的極性構造に特異的に結合す
ることができる受容体の使用に関する。受容体により観
測された結合の効果は、標識に応じて異なる。ある場合
には、受容体の結合は、単に結合および非結合標識リガ
ンド間の分子量の区別を提供するだけである。他の場合
には、受容体の結合は、遊離標識リガンドから結合標識
リガンドの分離を容易にするかまたは、標識から得られ
るシグナルの性質に影響を及ぼし、シグナルが標識リガ
ンドに結合した受容体量に応じて変化し得るようにす
る。別の変法は、受容体を標識し、リガンドを非標識に
することである。別法としては、標識がきわめて接近し
たとき相互作用するか、もしくは存在するリガンドの量
が受容体の標識が相互作用できる程度に影響を及ぼす場
合は、受容体およびリガンドを両方とも標識するか、ま
たは、異なる受容体を異なる標識で標識する。

異なるリガンドの幅広いスペクトルに適用することが
できるか、または、他の方法が容易に適用できない特異
な場合に使用することができる、新しい正確な技術の絶
えまない必要性がある。

均一系イムノアッセイは、以前は小分子量のものにつ
いて記載されている。これらのアッセイは、シバのフラ
ット（商標）アッセイ、エミット（商標）アッセイ、酵
素チャネリングイムノアッセイおよび蛍光エネルギー転
移イムノアッセイ（FETI）、酵素阻害イムノアッセイ
（ホフマン・ラロシェおよびアボット・ラボラトリー
ズ）、蛍光分極イムノアッセイ（ダンドリッカー）、そ
の他を含む。これらの全方法は、感度が限られており、
FETIおよび酵素チャネリングを含むほんのわずかしか大
型の多エピトープ分析物には適しない。

蛍光化合物および化学発光化合物のような発光化合物
は、光を放射する能力があるため、アッセイ分野におい
て幅広く適用できる。この理由で、発光体は核酸アッセ
イおよびイムノアッセイのようなアッセイの標識として
利用されている。例えば、特異的結合対のメンバーは、
発光体にコンジュゲートし、様々なプロトコールが採用
される。発光体コンジュゲートは、分析物を含む可能性
のある試料中の分析物量に関連して、固相および液相間
で分配することができる。いずれか一方の相の発光を測
定することにより、観測発光レベルを試料中の分析物濃
度に関連させることができる。

リポソームおよび赤血球ゴーストのような粒子は、カ
プセル化水溶性物質の担体として利用されている。例え
ば、リポソーム類が、薬物をリポソーム製剤中に密封し
処置すべき患者に投与する薬剤送達システムのような、
多様な用途のために、生物学的に活性のある物質をカプ
セル化するために使用されている。

ラテックスビーズおよびリポソームのような粒子はま
た、アッセイにも利用されている。例えば、均一系アッ
セイでは、酵素が抗体または抗原で標識されたリポソー
ムの水相で密封する。リポソームは、試料および成分が
存在すると、酵素を遊離させる。水相小胞内にカプセル
化した水溶性蛍光もしくは非蛍光染料または脂質の脂質
二重層に溶解した脂溶性染料を有する抗体または抗原標
識リポソームはまた、表面に結合した抗体または抗原の
免疫化学反応に携わることができる分析物のアッセイに
利用されている。界面活性剤は、リポソームの水相から
染料を遊離するのに使用されている。

化学発光標識は、リガンド結合アッセイにおいて格別
の感度を提供するが、１つまたはそれ以上の化学的活性
化段階が通常必要とされる。蛍光標識はこの欠陥がない
が、感度は低い。

化学発光標識は、結合相手に共有的に結合しており、
化学活性化で光を放射する基のイムノアッセイおよび核
酸アッセイについて記載されている。アクリジニウムエ
ステルを利用する核酸アッセイキットが、ジェンプロー
ブペイス２システム（商標）、サンディエゴ、カリフォ
ルニア）により市販されており、この型の標識を使用す
るマジックライト（商標）イムノアッセイキットが、チ
バ−ガイギー（バーゼル、スイス）により市販されてい
る。標識核酸プローブから第２プローブに結合する蛍光
受容体へのエネルギー転移は、ヘラー等、ＩおよびII
（下記参照）のサンドイッチ核酸アッセイに記載されて
いる。マギオＩ（下記参照）は、イムノアッセイの同様
の製造を述べている。ポリヌクレオチドに共有的に結合
した発光体からインターカレートする発蛍光団へのエネ
ルギー転移は、ヘラー等、IV（下記参照）により記載さ
れている。ポリヌクレオチド上の挿入染料から発光体へ
の転移は、近年カルデュロ等（下記参照）により最近記
載された。さらに、マックカプラ（下記参照）は、標識
としての光増感剤の使用を記載しており、その光増感剤
は、発熱時に光を産生する化合物と順番に反応するシン
グレット状態に酸素を活性化する。

2.関連技術の簡単な説明 ヨーロッパ特許出願第０ 421 788 A2号は、液体試
料中の分析物の存在または量を測定するハロペルオキシ
ダーゼ−酸−オキシダント化学発光アッセイシステムを
記載している。そのシステムは、ハロペルオキシダー
ゼ、ハライド、オキシダントおよび化学発光基質を利用
する。指示薬システムは、化学発光基質と反応して反応
産生物を酸化した励起状態をもたらす高反応性シングレ
ット分子酸素のシンセサイザーとして作用する。励起状
態反応産生物をその後、各反応関与物の量に関連する量
において、測定できる光の放射をもつ低いエネルギー状
態に緩和する。化学発光基質は、標識として使用し、蛋
白質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、レクチン、核
酸、代謝物質、抗原、抗体、核酸プローブ、バクテリオ
ファージまたはウイルスのようなリガンドに結合する
（第10頁、第８−17行）。

オサー等、アンゲバンテ・ヘミー・インターナショナ
ル・エディション・イングリッシュ、第29巻、第1167−
1169頁（1990年）は、純液相での三重Tb（III）複合体
のDNA鋳型媒介形成によるDNAハイブリッド形成の非放射
性アッセイを記載している。

米国特許第5,017,473号は、光吸収物質を使用する均
一系化学発光イムノアッセイを記載している。

ヨーロッパ特許出願第0,345,776号（マックカプラ）
は、標識として増感剤を利用する特異的結合アッセイを
記載している。光増感剤は、１つまたはそれ以上の波長
または他の化学的または物理的刺激（例えば、電気転
移、電気分解、電界発光またはエネルギー転移）の放射
をもつ励起により刺激される場合に、励起状態に達する
任意の部分を含み、その励起状態は、（ａ）分子酸素と
の相互作用時に、シングレット酸素を産生し、または
（ｂ）ロイコ染料との相互作用時に、過酸化水素の産生
をもたらす分子酸素との相互作用によりその本来の励起
していない状態にもどすことができる還元型を呈する。
どちらか一方の励起した光増感剤との相互作用は、試薬
の添加で検出できるシグナルを産生する。

ヨーロッパ特許出願第0,070,685号（ヘラー等、Ｉ）
は、非放射エネルギー転移による診断の均一系核酸ハイ
ブリッド形成を記載している。

光放射ポリヌクレオチドハイブリッド形成診断方法
は、ヨーロッパ特許出願第0,070,687号（ヘラー等、I
I）に記載されている。

ヨーロッパ特許出願第0,232,967号（モリソンＩ）
は、標的ポリヌクレオチドストランドのアッセイを実施
する方法および組成物を記載している。その方法は、試
料と、第１および第２ポリヌクレオチドプローブを含む
試薬との接触を含む。第１および第２プローブは、それ
らのプローブがお互いに結合する第１位置、およびそれ
らのプローブが標的に結合する第２位置を呈することが
できる。それらのプローブは、位置する２つのうちの１
つであるプローブを示すシグナルを産生するために相互
作用することができる標識部分を含む。

ヨーロッパ特許出願第0,315,364号は、流体の抗原ま
たは抗体の存在または濃度を測定する免疫化学的アッセ
イを記載している。そのアッセイは、（ａ）第１標識抗
体または抗原、第２標識抗体または抗原、および測定さ
れるべき抗原または抗体の三重複合体の形成、および
（ｂ）抗原物質に結合しているために互いに接近してい
ることによって増大した第１標識および第２標識間の相
互作用により、少なくとも１つの基質の存在中に、産生
されたシグナルを検出することを含む。

ヨーロッパ特許出願第0,229,943号（ヘラー等、III）
は、ポリヌクレオチドハイブリッド形成アッセイのため
の蛍光ストークスシフトプローブを記載している。

米国特許第4,226,993号（バッカー等）は、化学発光
フタルヒドラジド標識コンジュゲートの合成の中間体と
して利用される免疫官能付与性フタルヒドラジドを記載
している。コンジュゲートは、液体媒体のリガンドまた
はそれらの特異的結合相手を測定する特異的結合アッセ
イの試薬として利用される。

他の関連する技術文献は、ヨーロッパ特許出願第0,51
5,194号に記載されている。

発明の要約 本発明は、最広義の態様では、例えば（ａ）媒体中の
分析物、（ｂ）流体システム中の漏出、（ｃ）機械部分
の摩耗、または（ｄ）光の放射について、それらが存在
するかまたは存在しないような状況を測定する方法を含
む。その方法は、該状況から生じるかまたはそれに付す
組成物を照射することを含む。その組成物は、（ａ）照
射時にシングレット酸素を発生することができる光増感
剤および（ｂ）シングレット酸素により活性化すること
ができる化学発光化合物を含む非粒子状の固体基質また
は粒子状の基質を含む。粒子状の基質は、固体または流
体である。

他の態様では、本発明は、（ａ）媒体中の分析物の存
在または量に相関する分子、（ｂ）流体システム中の流
体物質、または（ｃ）機械部分からの摩耗物質、（ｄ）
細胞、または（ｅ）生物学的組織のような物質を標識す
る方法に関する。本方法は、これらの物質を（１）照射
時にシングレット酸素を発生することができる光増感
剤、および（２）シングレット酸素により活性化するこ
とができる化学発光化合物、と合わせることを含んでな
る。光増感剤および化学発光化合物は、非粒子状固体ま
たは粒子状固体または流体であることができる基質中に
包含されたものである。

本発明の他の態様は、物質を検出する方法である。こ
の方法は、（ａ）これらの物質を（１）照射時にシング
レット酸素を発生することができる光増感剤、および
（２）シングレット酸素により活性化することができる
化学発光化合物と合わせることを含んでなる。光増感剤
および化学発光化合物は、固体基質または粒子状固体ま
たは流体中に含められ、（ｂ）200−1000nmの波長の光
でのこれらの物質を照射し、さらに（ｃ）化学発光化合
物により放射された光を検出する。

本発明の他の態様は、遅延した発光を発生させる方法
に関する。その方法は、（１）照射時にシングレット酸
素を発生することができる光増感剤、および（２）シン
グレット酸素により活性化することができる化学発光化
合物、を含めた非粒子状、固体基質または粒子状固体ま
たは流体基質を含む組成物を照射する段階を含んでな
る。

本発明の他の態様は、分析物を測定する方法に関す
る。この方法は、分析物を含む可能性のある媒体を、特
異的結合対（sbp）メンバーの複合体が分析物の存在と
相関して形成される条件に付し、そして光増感剤特性の
活性化時にシングレット酸素が発生し、化学発光特性を
活性化するような化学発光および光増感剤特性を共に有
する単一の組成物を標識として使用することにより、sb
pメンバー複合体が形成したかどうかを測定する段階を
含んでなる。

分析物を測定する方法の他の態様は、（ａ）（１）上
記分析物を含む可能性のある媒体と、（２）光増感剤特
性の活性化時にシングレット酸素が発生し、化学発光特
性を活性化するような光増感剤および化学発光特性を共
に有する単一組成物とアソシエートする第１特異的結合
対（sbp）メンバー、ただし、この第1sbpメンバーは、
分析物または分析物の存在に相関して複合体を形成する
第2sbpメンバーに結合できるものである、を含む標識試
薬とを組合わせで提供し、（ｂ）光増感剤特性を活性化
し、さらに（ｃ）化学発光特性により発生した発光量
（その量は、媒体の分析物量に相関する）の検出するこ
とを含む。

本発明により分析物を測定する他の方法は、（ａ）分
析物を含む可能性のある媒体と、（２）照射時にシング
レット酸素を発生することができる光増感剤および、光
増感剤の活性化時にシングレット酸素が発生し、化学発
光特性を活性化するような、シングレット酸素により活
性化することができる化学発光化合物を有する粒子とア
ソシエートする、第１特異的結合対（sbp）メンバー、
ただし、この第1sbpメンバーは、分析物または分析物の
存在に相関して複合体を形成する第2sbpメンバーに結合
できるものである、を含む標識試薬とを組合わせで提供
し、（ｂ）光増感剤を活性化シ、さらに（ｃ）化学発光
化合物により発生した発光量（その量は、媒体中の分析
物量に相関する）を検出することを含む。

上記方法の好ましい態様は、少なくとも１つの上記光
増感剤および上記化学発光化合物が上記基質に共有的に
連結している場合である。

本発明の別の態様は、活性化時にシングレット酸素を
発生することができる光増感剤、およびシングレット酸
素により活性化できる化学発光化合物を含めた非粒子状
固体基質または粒子状固体または流体を含む組成物であ
る。

本発明による他の組成物は、シングレット酸素を発生
することができる光増感剤、およびシングレット酸素に
より活性化できる化学発光化合物を含めた、固体または
流体のいずれかの粒子を含むものであって、その粒子
は、分析物の検出に有用な分子に結合しているものであ
る。この分子は、特異的結合対のメンバーである。

本発明の他の態様は、活性化時にシングレット酸素を
発生することができる光増感剤、およびシングレット酸
素により活性化できる化学発光化合物を含めた油滴、リ
ポソームおよび乳化剤からなる群から選択される流体粒
子を含む組成物である。

本発明の他の態様は、発光組成物により放射された光
強度を検定する方法である。この方法は、（ａ）照射時
に光を放射できる発光組成物と、本発明の上記組成物の
１つとを媒体中で組合わせ、その際、組成物の１つは、
光により活性化する場合、他の組成物の衰退時間より実
質的に大きい光放射の衰退時間をもつものであり、
（ｂ）発光組成物および本発明の組成物を活性化するた
めに媒体を照射し、（ｃ）短い方の衰退時間をもつ活性
化組成物の衰退中に放射した光の強度を測定し、（ｄ）
段階（ｃ）の測定後および短い方の衰退時間をもつ活性
化組成物の少なくとも部分的な衰退後に放射された光の
強度を測定し、さらに（ｅ）短い方の衰退時間をもつ活
性化組成物の衰退中に放射された光の強度と、内部検定
に提供するための段階（ｄ）で放射された光の強度と比
較する各段階を含む。段階ｂおよびｃは、段階ｄより前
に１回またはそれ以上繰り返してもよい。ある態様で
は、本発明の活性化組成物は、短い方の衰退時間をも
つ。本発明の別の態様は、上記組成物の１つおよび特異
的結合対のメンバーを含むキットである。

具体的実施態様の記載 本発明は、光増感剤および化学発光化合物を含む、固
体基質または固体または流体粒子である組成物、を入手
可能にする。これらの組成物の照射は、その発光衰退の
寿命が、化学発光化合物の構造、固体物質または粒子の
組成物、化学発光化合物とシングレット酸素との反応時
に生成した分子、通常ジオキセタン類の分解率を増大す
る温度および活性化剤の存在を含む多くの因子により決
まってくる遅延した発光を生ぜしめることができる。こ
れらの組成物は、例えば乾燥状態で細胞表面に結合シた
とき、またはそれらが安定である他の媒体中で発光する
ことができる。

これらの組成物は、最初に活性化し、次いで活性化後
数秒ないし数分で検出できるため、例えば非常に感度の
高いトレーサーとして使用することができる。例えば、
これらの組成物は、流体中に懸濁する場合、液体または
ガスであり得る流体システムの漏出を追跡するのに使用
できる。漏出を検出するトレーサーの適用は、当業者に
よく知られている。一般に、本発明の組成物の約10^-14
−10^-2％を、液体またはガス中に分散させる。次に、流
体は、光で照射して光増感剤を活性化し、その後この流
体を本システムに通す。この適用では、以下に記載する
技術の１つを使用して発光を遅延させることが望まし
い。本システムは、漏出が存在するかどうかの測定を逃
れたかもしれないどんな発光をも試験する。

これらの組成物はまた、散布剤として法犯罪学に利用
することもできる。かかる目的のための散布剤の使用は
非常によく知られており、本書に記載するまでもない。
この目的には、本組成物を粒子状とし、直径約0.01−10
μｍとする。粒子中の光増感剤および化学発光化合物の
濃度は、一般に約10^-5Mないし10^-1Mとする。

本発明の組成物の他の使用例を下記するが、例示とし
てであり、限定されるものではない。これらの組成物
は、摩耗した物質の検出により摩耗査定を可能にするた
め機械部分に含ませることができる。それらはまた、光
線量計または固体蛍光検定計としても使用できる。線量
計として使用する場合、シングレット酸素と化学発光化
合物との反応により形成したジオキセタンが、組成物が
加熱されるまで発光が起こらないほど充分に安定である
ことがしばしば望ましい。好ましくは、これらの適用で
は、組成物はフィルム形状である。組成物はまた、光源
および光度計を検定するのにも使用できる。一般に、本
発明の粒子状組成物は、これらの数値が他の物質のより
早い衰退時間との比率をはかり、光強度測定および光電
子倍増適用での検定を提供するのに使用できるように、
比較的に長い衰退時間をもつように選ばれる。

本発明の粒子状組成物は、それらが標識としてまたは
標識した試薬の１部分として使用することができる場
合、診断アッセイの分野で特定の適用が見られる。多く
の場合、組成物は、その表面に結合する特異的結合対
（sbp）のメンバーをもつ。sbpメンバーは、分析物また
は、その存在が分析物の存在を示す分子に結合して、複
合体を形成することができる。この複合体は、標識を照
射し、それに伴って放射する光をモニターすることによ
り検出できる。このアッセイは、競合またはサンドイッ
チモード、またはそれらのバリエーションで実施でき
る。

検出すべき分子が細胞に関連する場合、細胞は本発明
の粒子状組成物で標識できる。例えば、本発明の組成物
は、細胞の表面上のsbpメンバーに相補的なsbpメンバー
を含むことができる。標識した細胞を照射し、その後そ
れ以上照射しないで顕微鏡を通して見ることができる。
結果として、蛍光顕微鏡検査で重大な問題であるバック
グラウンド蛍光を避けることができる。

本発明の組成物は、蛍光測定法の内部検定に利用する
ことができる。発光が媒体の照射により生成するアッセ
イ培地中にこれらの組成物の粒子を含めることにより、
これらの組成物は、アッセイで生成した放射とは検出で
きるほど異なる放射を生成する。この相違は、異なる波
長の放射、または発光の異なる衰退速度の結果であり得
る。

例えば、蛍光イムノアッセイでは、蛍光強度を最初に
測定する。媒体の照射を止め、本発明の組成物から放射
する発光を、光強度、検出器の感度、および試料干渉の
正確な内部標準を提供するために測定する。これらの組
成物は、ヨーロッパ特許公開第0,515,194号（EP−515,1
94）に記載された、アッセイの内部および外部検定と同
様の方法で利用することができる。その点で、上記した
ように、本発明の粒子状組成物は、EP−515,194の物質
の衰退時間と比較する場合、相対的に長い衰退時間をも
つように選ぶことができる。結果として、本粒子状組成
物は、EP−515,194の物質を利用するアッセイの内部検
定に使用することができる。EP−515,194の物質と本発
明の粒子状組成物とを含有する媒体は照射することがで
き、照射に続いて放射した光強度を測定することがで
き、EP−515,194の物質からの放射を部分的にまたは完
全に衰退させるために充分な時間を経過させることがで
き、媒体はその後再び照射することができ、光強度を測
定し、放射を所望により衰退させ、この過程は、測定の
信頼性を最大にするのに充分なだけ何度も繰り返すこと
ができる。最終経路に続いて、本粒子状組成物からよう
やく主として放射してくる光の強度は、本粒子状組成物
の衰退時間が非常に長いので、独立して測定することが
できる。照射期間の経過中に本粒子状組成物により放射
した残留光強度は、照射光強度に照射時間をかけたもの
に正比例する。EP−515,194の放射物質の衰退の前に測
定した光強度は、内部検定に供する本粒子状組成物の残
留強度との比率をはかることができる。逆に、本組成物
の崩壊時間をEP−515,194の組成物の衰退時間より短く
することができ、急速に衰退する光強度が参照として役
立ち残留光強度がＰ−515,194物質からのものであるこ
とを除いて、同様の操作を検定に使用することができ
る。

光強度は幅広く変化し得る。一般に、定常状態に達す
るまで照射を実施できる急速衰退種では、光源が明るけ
れば明るいほど、多くの活性化種が定常状態で存在し、
続いて起こる放射の強度が強くなる。低速衰退組成物で
は、照射期間が長ければ長いほど、多くの活性化種が蓄
積され、放射の強度が強くなる。この場合では、照射お
よび光強度の時間を犠牲にすることができる。前者の場
合では、光強度は重要である。照射は、１マイクロ秒か
ら20分、好ましくは0.1から60秒、さらに好ましくは、
0.1から10秒、通常約１秒、実施できる。光源は、多波
長であり得るが、その場合は瀘過して短波長の光を除去
する。例えば、650カットフィルターとともにタングス
テン−ハロゲンランプ（100ないし1,000ワット）を使用
できる。別法としては、He/Neレーザー源を利用するこ
とができる。他のやり方では、５ないし100mワット出力
の通常630nmまたはそれ以上のLEDを使用する。本書で以
下に記載する試験は、直接試料に導かれた400ワットハ
ロゲンランプ光を使用する。

分析物のアッセイは、分析物またはその存在が分析物
の存在を示すsbpメンバーが結合しており、標識として
使用した本発明の粒子状組成物を、未結合組成物から分
離することにより達成できる。分離した結合または未結
合画分のいずれかを、通常、光の照射により、光増感剤
を活性化するために処理した後、その画分の発光を試験
する。化学発光化合物の放射は、触媒および／またはエ
ネルギー受容体で修飾することができ、それらは本発明
の組成物中に含めることができる。エネルギー受容体
は、蛍光であるべきであり、通常放射の波長を修飾す
る。触媒は、通常、放射の割合および／または効率を増
加する。蛍光および触媒特性は、同じ化合物中にまたは
異なる化合物中にで存在し、それらの１つまたは両方が
本発明の組成物に含まれ得る。

主題のアッセイは、簡単で、効果的に再現できる方法
で、試料中の幅広い多様性のある分析物を検出し、測定
するための便利な方法を提供し、それは反応中に生成す
る光の量を測定するための目視検査またはありきたりの
装置を使用することができる。

さらに本発明の具体的な態様の記載を進める前に、多
数の用語を定義し、詳細に述べる。

分析物：検出すべき化合物または組成物。分析物は、
特異的結合対（sbp）のメンバーであり得、さらにリガ
ンドでもあり得るが、それは一価（モノエピトープ）ま
たは多価（ポリエピトープ）性で、通常、抗原またはハ
プテンであり、また少なくとも共通エピトープまたは決
定基部位を共有する、単一化合物または多種化合物であ
る。分析物は、細菌のような細胞、またはＡ、Ｂ、Ｄ等
のような血液型抗原を有する細胞、またはHLA抗原、ま
たは例えば細菌、真菌、原生動物またはウイルスのよう
な微生物等の一部であり得る。

多価リガンド分析物は、ふつうポリ（アミノ酸）、す
なわち、ポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸およ
びそれらの組合わせである。それらの結合は、細菌、ウ
イルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜
及び同種物の成分を含む。

多くの場合、主題の発明に適用できるポリエピトープ
リガンド分析物は、少なくとも約5,000、さらに通常は
少なくとも10,000の分子量を有する。ポリ（アミノ酸）
カテゴリーでは、対象となるポリ（アミノ酸）は、一般
的に約5,000から5,000,000の分子量、さらに一般的には
約20,000から1,000,000の分子量を有する。対象となる
ホルモンでは、分子量は通常約5,000から60,000の範囲
内である。

幅広い種類の蛋白質が、類似の構造特徴を有する蛋白
質、特定の生物学的機能を有する蛋白質、特定微生物、
特に病原性微生物等に関連した蛋白質の部類に属すると
みなされる。そのような蛋白質は、例えば、免疫グロブ
リン類、サイトカイン類、酵素類、ホルモン類、癌抗原
類、栄養マーカー類、組織特異的抗原類を含む。

次記は構造関連の蛋白質分類である。： プロタミン類、ヒストン類、アルブミン類、グロブリン
類、硬蛋白質類、リン蛋白質類、ムコ蛋白質類、色素蛋
白質類、リポ蛋白質類、核蛋白質類、糖蛋白質類類、Ｔ
細胞受容体類、プロテオグリカン類、HLA、未分類蛋白
質類（例えばソマトトロピン、プロラクチン、インスリ
ン、ペプシン）。

ヒト血漿中に見出される多数の蛋白質は、臨床的に重要
であり、 プレアルブミン、アルブミン、α_１−リポ蛋白質、α_１
−抗トリプシン、α_１−糖蛋白質、トランスコルチン、
4.6S−ポストアルブミン、トリプトファン欠乏α_１−糖
蛋白質、α₁X−糖蛋白質、チロキシン結合グロブリン、
インター−α−トリプシン阻害剤、Gc−グロブリン
（（Gc1−１）、（Gc2−１）（Gc2−２））、ヘプトグ
ロビン（（Hp1−１）、（Hp2−１）（Hp2−２））、セ
ルロプラスミン、コリンエステラーゼ、α_２−リポ蛋白
質（類）、ミオグロビン、Ｃ−反応蛋白質、α_２−マク
ログロブリン、α_２−HS−糖蛋白質、Zn−α_２−糖蛋白
質、α_２−ノイラミノ糖蛋白質、エリスロポイエチン、
β−リポ蛋白質、トランスフェリン、ヘモペキシン、フ
ィブリノーゲン、プラスミノーゲン、β_２−糖蛋白質Ｉ
およびβ_２−糖蛋白質II、 免疫グロブリンＧ（IgG）またはγＧ−グロブリン、分
子式：γ_２κ_２またはγ_２λ_２、 免疫グロブリンＡ（IgA）またはγＡ−グロブリン、分
子式：（α_２κ_２）^ｎまたは（α_２λ_２）^ｎ）、 免疫グロブリンＭ（IgM）またはγＭ−グロブリン、分
子式：（μ_２κ_２）^５または（μ_２λ_２）^５）、 免疫グロブリンＤ（IgD）またはγＤ−グロブリン（γ
Ｄ）、分子式：（δ_２κ_２）または（δ_２λ_２）、 免疫グロブリンＥ（IgE）またはγＥ−グロブリン（γ
Ｅ）、分子式：（ε_２κ_２）または（ε_２λ_２）、 遊離κおよびλＬ鎖、 補体因子:C'1（例えばC'1q、C'1r、C'1s）、C'2、C'3
（例えばβ₁A、α₂D）、C'4、C'5、C'6、C'7、C'8、C'9 を含む。

重要な血液凝固因子は、 国際称号 名称 Ｉ フィブリノーゲン II プロトロンビン IIa トロンビン III 組織トロンボプラスチン ＶおよびVI プロアクセレリン/Acグロブリン VII プロコンベルチン VIII 抗血友病グロブリン（AHG） IX クリスマス因子 血漿トロンボプラスチン成分（PTC） Ｘ スチュアート−プラウワー因子 オートプロトロンビンIII XI 血漿トロンボプラスチン前駆体（PTA） XII ハーゲマン因子 XIII フィブリン安定化因子 を含む。

重要な蛋白質ホルモンは、 ペプチドおよび蛋白質ホルモン 副甲状腺ホルモン（例えばパラトルモン）、チロカル
シトニン、インスリン、グルカゴン、レラキシン、エリ
スロポイエチン、メラノトロピン（例えばメラニン刺激
ホルモン；インターメジン）、ソマトトロピン（成長ホ
ルモン）、コルチコトロピン（副腎皮質刺激ホルモ
ン）、チロトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホル
モン（間質細胞刺激ホルモン）、黄体腫刺激ホルモン
（ルテオトロピン、プロラクチン）、ゴナドトロピン
（胎盤性性腺刺激ホルモン）のようなペプチド 組織ホルモン セクレチン、ガストリン、アンギオテンシンＩおよび
II、ブラジキニンおよびヒト胎盤性ラクトゲン シトキニン IL I、IL II、IL VI、EGF、TNF、NGF 癌抗原 PSA、CEA、α−フェトプロテイン、酸性ホスファター
ゼ、CA19.9、CA125 組織特異性抗原 アルカリ性ホスファターゼ、ミオグロビン、CPK−M
B、カルシトニンおよびミエリン塩基性蛋白質 神経下垂体からのペプチドホルモン オキシトシン、バソプレッシン、終結因子（RF）:CR
F、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、GRF、FSH−RF、PI
F、MIF を含む。

他の対象となる高分子物質は、ムコ多糖類および多糖
類である。

実例となる微生物は、 コリネバクテリア属 コリネバクリテウム・ジフテリア 肺炎球菌属 ジプロコッカス・ニューモニアエ 連鎖球菌属 ストレプトコッカス・プロゲネス ストレプトコッカス・サリバルス ブドウ球菌属 スタヒロコッカス・オーレウス スタヒロコッカス・アルブス ナイセリア属 ナイセリア・メニンギティディス ナイセリア・ゴナレア 腸内細菌 大腸菌 アエロバクター・アエロゲネス 大腸菌型 クレブシエラ・ニューモニアエ 細菌 サルモネラ・チホサ サルモネラ・コレラエスイス サルモネラ菌属 サルモネラ・チフリムリウム ジゲラ・ジセンテリア シゲラ・シミツイ シゲラ・アルビノタルダ 赤痢菌属 シゲラ・フレクスナー シゲラ・ボイディ シゲラ・ソンネイ 他の腸内細菌 プロテウス・ブルガリス プロテウス・ミラビリス プロテウス属 プロテウス・モルガニ シュードモナス・アエルギノサ アルカリゲネス・ファエカリス ビブリオ・コレラエ ヘモフィルス−ボルデテラ群 インフルエンザ菌、デュクレー菌 ヘモフィルス・ヘモフィルス ヘモフィルス・アエギプティカス ヘモフィルス・パラインフルエンザ ボルデテラ・ペルツシス パスツレラ属 パスツレラ・ペスティス パスツレラ・ツラレウシス ブルセラ属 ブルセラ・メリテンシス ブルセラ・アボルタス ブルセラ・スイス 好気性胞子形成細菌 バシラス・アントラシス バシラス・スブチリス バシラス・メガテリウム バシラス・セレウス 嫌気性胞子形成細菌 クロストリジウム・ボツリヌス クロストリジウム・テタニ クロストリジウム・ペルテリンゲンス クロストリジウム・ノビイ クロストリジウム・セプティクム クロストリジウム・ヒストリチクス クロストリジウム・テルチウム クロストリジウム・ビフェルメンタンス クロストリジウム・スポロゲネス ミコバクテリア ミコバクテリウム・ツベルクロシス・ホミニス ミコバクテリウム・ボビス ミコバクテリウム・アビウム ミコバクテリウム・レプラエ ミコバクテリウム・パラツベルクロシス 放線菌属（真菌様菌） アクチノマイセス・イスラエリ アクチノマイセス・ボビス アクチノマイセス・ネスルンディ ノカルジア・アステロイデス ノカルジア・ブラシリエンシス スピロヘータ属 トレポネーマ・パリデュム スピリルム・ミナス トレポネーマ・ペルテニュー ストレプトバシルス・モ
ノイリホルミス トレポネーマ・カラテウム ボレリア・レクレンティス レプトスピラ・イクテロヘモラジアエ レプトスピラ・カニコラ トリパノソーマ属 マイコプラズマ属 マイコプラズマ・ニューモニアエ 他の病原体 リステリア・モノシトゲンズ エリシペロトリックス・ルシオパチアエ ストレプトバシラス・マニリホルミス ドンバニア・グラヌロマティス バルトネラ・バシリホルミス リケッチア属（細菌様寄生虫） ウイルス リケッチア・プロバゼキ リケッチア・モオセリ リケッチア・リケッツイ リケッチア・コノリ リケッチア・アウストラリス リケッチア・シベリカス リケッチア・アカリ リケッチア・ツツガムシ リケッチア・ブルテッティ リケッチア・クインタナ クラミジア属（分類未能寄生虫細菌／ウイルス性） クラミジア剤（名称不詳） 真菌 クリプトコックス・ネオファルマンス ブラストミセス・デルマティディス ヒストプラズマ・カプスラタム コクシジオイデス・イミティス パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス カンジダ・アルビカンス アスペルギルス・フミガツス ムコール・コリムビファー（アブシディア・コリムビフ
ェラ） リゾプス・オリザエ リゾプス・アリヒズス 藻菌類 リゾプス・ニグリカンズ スポロトリクス・ジエンキ フォンセセア・ペドロソイ フォンセセア・コムパクト フォンセセア・デルマティディス クラドスポリウム・カリオニ フィアロフォラ・ベルコサ アスペルギルス・ニデュランス マズレラ・ミセトミ マズレラ・グリセア アレステリア・ボイディ フィアロスフォラ・ジェアンセルメイ ミクロスポルム・ギプセウム トリクロフィトン・メタグロフィテス ケラチノマイセス・アジェロイ ミクロスポルム・カニス トリクロフィトン・ルブルム ミクロスポルム・トードウイニ ウイルス類 アデノウイルス類 ヘルペスウイルス類 単純ヘルペス 水痘（水ぼうそう） 帯状ヘルペス（帯状疱疹） Ｂウイルス サイトメガロウイルス 痘疹ウイルス 痘瘡（天然痘） 完全痘疱 ポックスウイルス・ボビス パラワクシニア モルスカム・コンタジオスム ピコルナウイルス属 ポリオウイルス コクサッキーウイルス ECHOウイルス ライノウイルス ミクソウイルス類 インフルエンザ（Ａ、ＢおよびＣ型） パラインフルエンザ（１−４型） おたふくかぜウイルス ニューキャッスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス イヌジステンパーウイルス 呼吸性シンチウムウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス類 東部ウマ脳脊髄炎症ウイルス 西部ウマ脳脊髄炎症ウイルス シンドビスウイルス チクングニヤウイルス セムリキフォレストウイルス マヨラウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフォルニア脳炎ウイルス コロラドマダニ熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス属 レオウイルス１−３型 レトロウイルス類 ヒト免疫不全ウイルスＩおよびII型（HIV） ヒトＴ細胞向性ウイルスＩおよびII型（HTLV） 肝炎類 Ａ型肝炎 Ｂ型肝炎 Ｃ型肝炎 腫瘍ウイルス類 ローシャー白血病ウイルス グロスウイルス マロニー白血病ウイルス ヒト乳頭腫ウイルス を含む。

モノエピトープリガンド分析物は、一般に約100から
2,000の分子量、さらに通常125から1,000の分子量であ
る。分析物は、薬剤、代謝生成物、殺虫剤、汚染物質及
び同種物を含む。対象となる薬剤に含まれるものは、ア
ルカロイド類である。アルカロイドの中は、モルヒネ、
コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファンを含むモ
ルヒネアルカロイド類、それらの誘導体および代謝生成
物；コカインおよびベンジルエクゴニンを含むコカイン
アルカロイド類、それらの誘導体および代謝生成物；リ
セルグ酸ジエチルアミドを含むエルゴットアルカロイド
類；ステロイドアルカロイド類；イミナゾイルアルカロ
イド類；キナゾリンアルカロイド類；イソキノリンアル
カロイド類；キニンおよびキニジンを含むキノリンアル
カロイド類；ジテルペンアルカロイド類、それらの誘導
体および代謝生成物である。

次の薬剤群は、エストロゲン類、アンドロゲン類、副
腎皮質ステロイド類、胆汁酸類、強心性グリコシド類を
含むステロイド類、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンを
含むアグリコン類、サポニン類およびサポゲニン類、そ
れらの誘導体および代謝生成物を含む。また、ジエチル
スチルベストロールのような疑似ステロイド物質も含ま
れる。

次の薬剤群は、バルビツル酸塩類、例えば、フェノバ
ルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダン
トニン、プリミードン、エトサキシミドおよびそれらの
代謝生成物を含む、５ないし６員環ラクタムである。

次の薬剤群は、アンフェタミン類を含む、炭素原子２
から３個のアルキルを有するアミノアルキルベンゼン
類；エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリンを含むカ
テコールアミン類；ナルセイン；パパベリン；および上
記の代謝生成物である。

次の薬剤群は、オキサゼパム、クロルプロマジン、テ
グレトールを含むベンズ複素環類、それらの誘導体およ
び代謝生成物であり、該複素環は、アゼピン、ジアゼピ
ンおよびフェノチアジンである。

次の薬剤群は、テオフィリン、カフェインを含むプリ
ン類、それらの代謝生成物および誘導体である。

次の薬剤群は、カンナビノールおよびテトラヒドロカ
ンナビノールを含む、マリファナに由来した薬剤を含
む。

次の薬剤群は、チロキシン、コルチゾール、トリヨー
ドチロニン、テストステロン、エストラジオール、エス
トロン、プロゲステロンのようなホルモン類、アンギオ
テンシン、LHRHのようなポリペプチド類、およびシクロ
スポリン、FK−506、ミコフェノール酸その他のような
免疫抑制剤等である。

次の薬剤群は、Ａ、Ｂ、例えば、B₁₂、Ｃ、Ｄ、Ｅお
よびＫ、葉酸、チアミンのようなビタミン類である。

次の薬剤群は、水酸化および不飽和の程度および部位
により異なるプロスタグランジン類である。

次の薬剤群は、イミプラミン、ジメチルイミプラミ
ン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプ
チリン、トリイミプラミン、クロムイミプラミン、ドキ
セピンおよびデスメチルドキセピンを含む３員環抗抑圧
剤である。

次の薬剤群は、メトトレキサートを含む抗新生物薬で
ある。

次の薬剤群は、ペニシリン、クロロマイセチン、アク
チノマイセチン、テトラサイクリン、テルラマイシンを
含む抗生物質、それらの代謝生成物および誘導体であ
る。

次の薬剤群は、ATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノ
シン、チミジンおよびシチジンを含み、それらの適当な
糖およびリン酸塩置換基をもつヌクレオシドおよびヌク
レオチドである。

次の薬剤群は、メタドン、メプロバメート、セロトニ
ン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセ
チルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフ
ルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン、
クロラムフェニコール、アトロピンのような抗コリン性
薬剤、それらの代謝生成物および誘導体を含む種々の各
薬剤である。

病的状態に関連する代謝生成物は、スペルミン、ガラ
クトース、フェニルピルビン酸およびポルフィリン１型
を含む。

次の薬剤群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブ
ラマイシンおよびアミカシンのようなアミノ配糖体類で
ある。

対象となる殺虫剤の中は、ポリハロゲン化ビフェニル
類、リン酸エステル類、チオリン酸塩類、カルバメート
類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それらの代謝
生成物および誘導体である。

受容体分析物では、分子量は一般的に10,000から２×
10⁸、さらに通常は10,000から10⁶の範囲である。免疫グ
ロブリンであるIgA、IgG、IgEおよびIgMでは、分子量は
一般的に約160,000から約10⁶に変化し得る。酵素類は、
標準的に約10,000から1,000,000の分子量の範囲であ
る。天然の受容体は、幅広く変化し、一般的に少なくと
も約25,000の分子量であり、10⁶またはそれ以上の分子
量であることができ、アビジン、DNA、RNA、チロキシン
結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トラ
ンスコルチン等のような物質を含む。

分析物という用語は、さらに以下に定義するポリヌク
レオチドのようなポリヌクレオチド分析物を含む。これ
らは、ｍ−RNA、ｒ−RNA、ｔ−RNA、DNA、DNA−RNA二重
体等を含む。分析物という用語は、また例えば、制限酵
素、活性化剤、抑制剤、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、
ヒストン、修復酵素、化学療法剤等のようなポリヌクレ
オチド結合剤である受容体も含む。

分析物は宿主から、体液を含む生物学的組織のような
試料中に直接見出される分子であることができる。試料
は直接試験でかるが、より容易に検出できるように分析
物を前処理してもよい。さらに、対象となる分析物は、
対象となる分析物に相補的な特異的結合対メンバーのよ
うな対象となる分析物が試料中に存在する場合にだけそ
の存在が検出される、対象となる分析物を証明する試剤
を検出することにより測定することができる。こうし
て、分析物を証明する剤は、アッセイで検出される分析
物になる。生物学的組織は、器官または宿主および体液
の他の部分、例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、精
液、大便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液等から切除した組
織を含む。

特異的結合対メンバー（「sbpメンバー」）：表面上
または空洞の中に、他の分子の特定の空間的および極性
の構造に特異的に結合する領域を有し、それ故にそれと
相補的と定義される、２つの異なる分子の１つ。特異的
結合対メンバーは、リガンドおよび受容体（抗リガン
ド）を意味し得る。これらは通常抗原−抗体のような免
疫学的対のメンバーであるが、但しビオチン−アビジ
ン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二本鎖分子、IgG
−プロテインＡ、ポリヌクレオチド結合剤、DNA−DNA、
DNA−RNAのようなポリヌクレオチド対等のような他の特
異的結合対は、免疫学的対ではないが、本発明およびsb
pメンバーの定義に含まれる。

ポリヌクレオチド：自然な状態で約50から500,000ま
たはそれ以上のヌクレオチドを有し、単離した状態で約
15から50,000またはそれ以上のヌクレオチドを有し、通
常は約15から20,000のヌクレオチド、さらに頻繁には15
から10,000のヌクレオチドを有するポリマーヌクレオチ
ドである化合物または組成物。ポリヌクレオチドは、任
意の資源由来の精製または未精製形態の核酸を含み、天
然に生成するかまたは合成的に製造され、DNA（dsDNAお
よびssDNA）およびRNA、通常はDNAを含み、ｔ−RNA、ｍ
−RNA、ｒ−RNA、ミトコンドリアDNAおよびRNA、クロロ
プラストDNAおよびRNA、DNA−RNAハイブリッド、または
それらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、微生
物、例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、かび、
真菌、植物、動物、ヒト、およびそれらのフラグメン
ト、及び同種物のような、生物学的物質のゲノムである
ことができる。

リガンド…それに対する受容体が天然に存在するかまた
は製造することができる任意の有機化合物。

リガンドアナログ…通常100以上の分子量を有する修飾
リガンド、有機ラジカルまたは分析物アナログであり、
それは受容体の類似したリガンドと競合することがで
き、修飾は、リガンドアナログを別の分子につなぐため
の手段を提供する。リガンドアナログは、リガンドアナ
ログを中心または標識に連結する結合で水素を置換する
以上に、リガンドとは異なるが必要はない。リガンドア
ナログは、リガンドに類似する方法で受容体に結合する
ことができる。例えば、アナログは、抗体のイディオタ
イプに対してリガンドに向けられた抗体であり得る。

受容体（「抗リガンド」）…分子の特定の空間的および
極性の構造、例えばエピトープまたは決定基部位を認識
できる全ての化合物または組成物。例となる受容体は、
天然に生成する受容体、例えば、チロキシン結合グロブ
リン、抗体類、酵素類、Fabフラグメント類、レクチン
類、核酸類、プロテインＡ、補体成分C1q及び同種物を
含む。

特異的結合…他の分子に対するかなり低い認識と比較
し、２つの異なる分子の１つを特異的に認識すること。
一般に、その分子は、それらの表面上または空洞に２分
子間の特異的認識を起こす領域をもつ。特異的結合の典
型例は、抗原−抗体相互作用、酵素基質相互作用、ポリ
ヌクレオチド相互作用、その他である。

非特異的結合…特異的表面構造から相対的に独立してい
る分子間の非共有結合。非特異的結合は、分子間の疎水
性相互作用を含む数種の因子から生ずる。

抗体…他の分子の特定の空間的および極性構造に特異的
に結合し、そのためそれと相補的であると定義される免
疫グロブリン。抗体は、モノクローナルまたはポリクロ
ーナルであることができ、宿主の免疫および血清（ポリ
クローナル）の収集のように当業者によく知られた技術
によって、または連続的なハイブリッドセルラインの調
製と分泌蛋白質（モノクローナル）の収集によって、ま
たは少なくとも天然の抗体との特異的結合に必要なアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその変異
版のクローニングおよび発現によって製造できる。抗体
類は、完全な免疫グロブリンまたはそれらのフラグメン
トを含むことができ、その免疫グロブリンは、IgA、Ig
D、IgE、IgG1、IgG2aおよびIgG3、IgM等のような様々な
種類およびイソタイプを含む。それらのフラグメント
は、Fab、FvおよびＦ（ab'）_２、Fab'等を含むことがで
きる。さらに、凝集体、ポリマー類および免疫グロブリ
ン類またはそれらのフラグメントのコンジュゲートは、
特定の分子の結合親和性が維持される限り、適当な場合
に使用することができる。

抗体（ポリクローナル）を含む抗血清は、適当な免疫
源での、ウサギ、モルモットまたはヤギのような動物の
免疫に関与し、適当な時間をおいて免疫した動物の血液
から抗血漿を得る充分に確立した技術によって得られ
る。最新の批評は、パーカー、ラジオイミノアッセイ・
オブ・バイオロジカリー・アクティブ・コンパウンズ、
プレンティス・ホール（イングルウッド・クリフス、ニ
ュージャージー、アメリカ合衆国、1976年）、バトラ
ー、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、第
７巻、第１−24頁（1975年）、ブロートンおよびストロ
ング、クリニカル・ケミストリー、第22巻、第726−732
頁（1976年）およびプレイフェアー等、ブリティッシ・
メディカル・ブレタン、第30巻、第24−31頁（1974年）
で提供される。

抗体はまた、体細胞ハイブリッド形成技術によって得
られ、上記抗体は、モノクローナル抗体と通常称する。
モノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュタイ
ン、ネイチャー、第265巻、第495−497頁（1975年）の
標準技術により産生することができる。モノクローナル
抗体の批評は、リンパ球ハイブリドーマ、メルチャーズ
出版等で見られる。スプリンガー−ベルラグ（ニューヨ
ーク1978年）、ネイチャー、第266巻、第495頁（1977
年）、サイエンス、第208巻、第692頁（1980年）、およ
びメソッズ・オブ・エンザイモロジー、第73巻（パート
Ｂ）、第３−46頁（1981年）。適当な免疫製造の試料
は、ネズミのような動物に注射して、充分に時間がたっ
た後、その動物を犠牲にして脾臓の細胞を得る。別法と
して、非免疫動物の脾臓の細胞を試験管内で免疫源に増
感することができる。所望の免疫グロビンの塩基配列を
コード化する脾臓細胞染色体は、一般に、例えばポリエ
チレングリコールのような非イオン性界面活性剤の存在
下、骨髄腫セルラインで脾臓細胞を融合することによっ
て圧縮することができる。融合したハイブリドーマを含
む生じる細胞は、HAT媒体のような選択的な媒体で成長
させ、残存する不滅の細胞を限界希釈条件を使用して上
記媒体で成長させる。その細胞は、微量滴定ウエルのよ
うな適当な容器で成長させ、上清を、所望の特異性をも
つモノクローナル抗体にスクリーンにかける。

モノクローナル抗体の収率を増大するためには、様々
な技術があり、例えばハイブリドーマ細胞を、細胞を受
け入れる哺乳類の宿主の腹腔に注入し、腹水を集める。
腹水中で集めたモノクローナル抗体の量が不充分な場合
は、抗体を宿主の血液から集める。別法としては、所望
の抗体を産生する細胞は、中空糸細胞培養または撹拌フ
ラスコ装置で成長することができ、これら両方とも当業
者によく知られている。他の蛋白質および他の混入物か
らのモノクローナル抗体の単離および精製するために
は、様々な常法が存在する（ケーラーおよびミルシュタ
イン参照、前掲）。

抗体の製造のための別の接近法では、抗体結合部位に
コードする配列は、染色体DNAから切除して、細菌中で
発現することができるクローニングベクターに挿入し
て、相当する抗体結合部位をもつ組換え蛋白質を産生す
ることができる。

一般に、抗体は、DEAEクロマトグラフィー、ABxクロ
マトグラフィー等のようなクロマトグラフィー、濾過、
その他のような既知技術によって精製することができ
る。

アルキル基…脂肪族炭化水素から１つのＨ原子を除去し
て誘導される一価の分枝または非分枝ラジカルで、低級
アルキルおよび高級アルキル基の両方を含む。

低級アルキル基…例えばメチル、エチル、プロピル、ブ
チル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペン
チル等のような１ないし５個の炭素原子を含むアルキ
ル。

高級アルキル基…６個以上の炭素原子を含むアルキル
で、通常６ないし20個の炭素原子で、例えばヘキシル、
ヘプチル、オクチル等である。

アルキリジン…脂肪族炭化水素から誘導される二価の有
機ラジカルで、例えば２個の水素原子は同じ炭素原子か
ら得られたエチリジンである。

アリール基…芳香族炭化水素から１つの原子の除去によ
り誘導され、１つまたはそれ以上の芳香族環を含み、通
常は例えば、フェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナ
フタレンから）等のような１ないし４個の芳香族環を含
む有機ラジカル。

アラルキル…アリール基に結合するアルキル基を含む有
機ラジカル、例えばベンジル、フェネチル、３−フェニ
ルプロピル、１−ナフチルエチル等。

アルコキシ…酸素原子による分子の残留物に結合するア
ルキルラジカル、例えばメトキシ、エトキシ等。

アリールオキシ…酸素原子による分子の残留物に結合す
るアリールラジカル、例えばフェノキシ、ナフトキシ
等。

アラルコキシ…酸素原子による分子の残留物に結合する
アラルキルラジカル、例えばベンゾキシ、１−ナフチル
エトキシ等。

置換は、ある分子のある水素原子が別の原子と置き換
わることを意味し、ここで別の分子は、ハロゲン等のよ
うな単一原子であるか、または１から50個の原子を有す
る置換基のような官能性を形成する（それらの原子の原
子価を満たすのに必要な所要水素原子以外の）原子群の
一部であり、それらの原子は、独立して炭素、酸素、窒
素、硫黄およびハロゲン（塩素、臭素、ヨウ素、フッ
素）からなる群から選択されたものであり、１つまたは
それ以上の金属原子と結合し得るかまたは結合し得ない
ものである。

アルキルチオ…硫黄原子による分子の残留物に結合する
アルキルラジカル、例えばメチルチオ、エチルチオ等。

アリールチオ…硫黄原子による分子の残留物に結合する
アリールラジカル、例えばフェニルチオ、ナフチルチオ
等。

電子供与基…分子に結合する場合、電子供与基の電子が
乏しくなり、分子の別の部分に比較して陽性に荷電す
る、すなわち低下した電子密度をもつように、分子を分
極化することができる置換体。上記の基は、アミン、エ
ーテル、チオエーテル、ホスフィン、ヒドロキシ、オキ
シアニオン、メルカプタンおよびそれらのアニオン、ス
ルフィド等であるが、例示的にかつ非限定的にあげられ
る。

１から50個の原子をもつ（それらの原子の原子価を満
たすのに必要な所要水素原子以外の）置換基で、それら
の原子は、独立して炭素、酸素、窒素、硫黄、ハロゲン
およびリンからなる群から選択される。…有機ラジカ
ル；有機ラジカルは、ラジカルでの原子の原子価を満た
すのに必要な所要水素原子以外の１−50個の原子を有す
る。一般に、優勢な原子は、炭素（Ｃ）であるが、酸素
（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびリン（Ｐ）でも
あり、Ｏ、Ｎ、ＳまたはＰは、それらが存在する場合、
炭素とまたは各々互いに１つまたはそれ以上とまたは水
素とまたは金属原子と結合して、例えば、カルボン酸、
アルコール、チオール、カルボキサミド、カルバメー
ト、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エス
テル、リン酸、リン酸エステル、尿素、カルバメート、
ホスホルアミド、スルホンアミド、エーテル、スルフィ
ド、チオエーテル、オレフィン、アセチレン、アミン、
ケトン、アルデヒド、ニトリル等のような様々な官能基
を形成する。そのような有機ラジカルまたは基の例とし
ては、アルキル、アルキリジン、アリール、アラルキ
ル、および前述の官能性の１つまたはそれ以上に置換し
たアルキル、アリールおよびアラルキルが、例示的にか
つ非限定的にあげられる。

連結基…分子間の共有結合。連結器は、連結する分子、
すなわち光増感剤、化学発光化合物、sbpメンバーまた
は粒子に関連するかまたはその部分である分子の性質に
より異なり変化し得る。光増感剤または化学発光化合物
上に標準的に存在するかまたは導入される官能基が、こ
れらの物質を、sbpメンバーまたは、リポソームまたは
油滴の親油性成分、ラテックス粒子、シリコン粒子、金
属ゾルまたは色素微結晶のような粒子に連結するのに使
用される。

カルボニル官能性群は、多くの場合、例えばアルデヒ
ドのようなオキソカルボニルおよび例えばカルボキシ、
アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチオノカ
ルボキシのような非オキソカルボニル（窒素および硫黄
アナログを含む）の両方に使われる。

オキソの別の官能性群は、活性ハロゲン、ジアゾ、メ
ルカプト、オレフィン、特に活性化オレフィン、アミ
ノ、ホスホロ及び同種物を含む。連結基の記載は、アメ
リカ特許第3,817,837号に見ることができ、その記載
は、引用して本明細書に包含させる。

連結基は、１ないし100個の原子、通常は約１ないし7
0個の原子、好ましくは１ないし50個の原子、さらに好
ましくは１ないし20個の原子からなる結合から鎖まで変
化し、各々は独立して、標準的に炭素、酸素、窒素、硫
黄、ハロゲンおよびリンからなる群から選択される。連
結基中のヘテロ原子の数は、標準的には約０から20個、
通常は約１から15個、さらに好ましくは２から６個の範
囲である。鎖中の原子は、１から50個の原子を有する置
換基について記載したのと同様の方法で、水素以外の原
子群で置換され得る。一般的に、ある特定の連結基の長
さは、合成上の利便性および、エネルギー受容体、発蛍
光団、重原子等のようなシステム内交差分析のための基
といった任意の所望基導入の利便性のために随意に選択
することができる。連結基は、脂肪族または芳香族であ
り得るが、ただしジアゾ基を伴うときは、通常芳香族基
が関与する。

ヘテロ原子が存在する場合、酸素は標準的に、炭素、
硫黄、窒素またはリンに結合しているオキソまたはオキ
シとして存在し、窒素は、標準的に炭素、酸素、硫黄ま
たはリンに結合しているニトロ、ニトロソまたはアミノ
として標準的に存在し、硫黄は、酸素と同様であるが、
リンは、通常はホスホネートおよびリン酸モノまたはジ
エステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合して
いる。

連結基とコンジュゲートすべき分子間の共有結合を形
成する共通の官能性群は、アルキルアミン、アミジン、
チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、
アゾ、チオエーテルおよびカルボキシレート、スルホネ
ート、およびホスホン酸エステル、アミドおよびチオエ
ステルである。

多くの場合、連結基が光増感剤に結合する場合、光化
学的に活性化できる化学発光化合物または本発明の粒子
状組成物は、窒素および硫黄アナログを含む非オキソカ
ルボニル基、リン酸基、アミノ基、ハロまたはトシルア
ルキルのようなアルキル化剤、オキシ（ヒドロキシルま
たは硫黄アナログ、メルカプト）オキソカルボニル（例
えば、アルデヒドまたはケトン）、またはビニルスルフ
ォンまたはα，β−不飽和エステルのような活性オレフ
ィンを有する。これらの官能性群は、アミノ基、カルボ
キシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えばブロ
モアセチルに連結する。アミンおよびカルボン酸または
その窒素誘導体またはリン酸が連結する場合、アミド、
アミジンおよびホスホルアミドが形成する。メルカプタ
ンおよび活性オレフィンが連結する場合、チオエーテル
が形成する。メルカプタンおよびアルキル化剤が連結す
る場合、チオエーテルが形成する。アルデヒドおよびア
ミンが還元条件下で連結する場合、アルキルアミンが形
成する。カルボン酸またはリン酸およびアルコールが連
結する場合、エステルが形成する。

親水性または水溶性を与える基または官能性群は、親
水性官能性群であり、それは、水で固体の湿潤性を高
め、それが結合する化合物の水溶解度を高める。そのよ
うな官能基または官能性群は、１ないし50またはそれ以
上の原子をもつ置換基であり、スルホネート、スルフェ
ート、ホスフェート、アミジン、ホスホネート、カルボ
キシレート、ヒドロキシル、特にポリオール、アミン、
アミド及び同種物を含む。例となる官能基は、カルボキ
シアルキル、スルホンオキシアルキル、CONHOCH₂COOH、
CO−（グルコサミン）、糖、デキストラン、シクロデキ
ストリン、SO₂NHCH₂COOH、SO₃H、CONHCH₂CH₂SO₃H、PO₃H
₂、OPO₃H₂、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトンおよ
びそれらの組合わせである。ほとんどの上記官能性群は
また、結合基として利用されており、それは、sbpメン
バーが光増感剤および化学発光化合物を含む粒子状組成
物と結合するのを可能にする。

親油性または脂溶性を与える基または官能性は、親油
性官能性群であり、それは、水で表面の湿潤性を低め、
それが結合する化合物の水溶解度を低くする。そのよう
な官能基または官能性群は、１ないし50またはそれ以上
の原子をもち、通常は水素またはハロゲンと置換する炭
素原子であり、アルキル、アルキリデン、アリールおよ
びアラルキルを含むことができる。脂溶性基または官能
性群は、少なくとも６個の炭素原子、通常少なくとも10
個の炭素原子、好ましくは少なくとも12個の炭素原子、
通常30個以下の炭素原子の、標準的に１ないし６個の直
鎖または分枝鎖の脂肪族基を含むことができる。脂肪族
基は、５ないし６員環に結合し、脂環性、複素環性また
は芳香族性である。脂溶性基は、光増感剤または化学発
光化合物に結合して、非水性基質でそれらの溶解度を高
める。

光増感剤…光での励起により通常シングレット酸素を発
生する増感剤。通常、光増感剤は、化学発光化合物より
長い波長で吸収し、化学発光化合物より低いエネルギー
トリプレットをもつが、但し、どちらも本発明の成功に
は重要ではない。光増感剤は、光活性化できる（例え
ば、染料および芳香族化合物）。光増感剤は、通常共有
結合した原子を含む化合物であり、通常多重にコンジュ
ゲートした二重または三重結合をもつ。化合物は、励起
波長で、その吸収最大値が500M^-1cm^-1、好ましくは少な
くとも5000M^-1cm^-1、さらに好ましくは50,000M^-1cm^-1以
上の吸光係数である、200ないし1100nm、通常300ないし
1000nm、好ましくは450ないし950nmの範囲の波長で光を
吸収すべきである。酸素なしでの光の吸収に続いて産生
された励起状態の寿命は、通常少なくとも100nsecであ
り、好ましくは少なくとも1msecである。一般に、その
寿命は、エネルギーを酸素に転移するのを可能にするた
めに充分に長くしなければならなく、それは標準的に媒
体により異なるが、10^-5ないし10^-3Mの範囲の濃度で存
在する。光増感剤励起状態は、通常その基底状態より異
なるスピン量子数（Ｓ）をもち、よくあることである
が、基底状態がシングレット（Ｓ＝０）である場合は、
トリプレット（Ｓ＝１）である。好ましくは、光増感剤
は、高いシステム内交差率をもつ。すなわち、光増感剤
の光励起は、少なくとも10％、望ましくは少なくとも40
％、好ましくは80％以上の効率をもつ長命状態（通常ト
リプレット）を産生する。励起状態は、基底状態に比例
して、少なくとも20Kcal/モル、好ましくは少なくとも2
2Kcal/モル、通常65Kcal/モル未満のエネルギーをもつ
が、但しそれより高いエネルギーも使用される。光増感
剤は、通常アッセイ条件下最も弱い蛍光である（通常0.
5未満、好ましくは0.1未満の係数率）。

光により励起される光増感剤は、相対的に光安定であ
り、シングレット酸素と効果的に化学反応しない。数種
の構造特性が、ほとんどの有用な光増感剤に存在する。
ほとんどの光増感剤は、強固でしばしば芳香族構造をも
つ、少なくとも１つ、しばしば３つまたはそれ以上のコ
ンジュゲートした二重または三重結合をもつ。それら
は、しばしばカルボニルまたはイミン基のようなシステ
ム内交差を促進する少なくとも１個の基または周期表の
第３−６列から選択された重原子、特にヨウ素または臭
素を含むか、またはそれらは延長した芳香族構造をも
つ。典型的な光増感剤は、アセトン、ベンゾフェノン、
９−チオキサントン、エオシン、9,10−ジブロモアント
ラセン、メチレンブルー、ポルフィリン、ヘマトポルフ
ィリンのようなメタロポルフィリン、フタロシアニン、
クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフレ
レン等および、そのような化合物をより親油性にまたは
より親水性にさせるため、および／または例えばsbpメ
ンバーに結合する結合基として１ないし50個の原子の置
換体をもつこれらの化合物の誘導体を含む。好ましい光
増感剤は、メチレンブルー、ポルフィリン、フタロシア
ニン、クロロフィルおよびローズベンガルのような染料
である。本発明で利用し得る他の光増感剤の例として
は、上記特性をもち、N.J.テュロ、「分子光化学」、第
132頁、W.A.ベンジャミン・インコーポレイテッド、ニ
ューヨーク（1965年）に列挙されている。

光増感剤が油滴、リポソーム、ラテックス粒子等に含
まれる場合、光増感剤が親油性メンバーに確実に溶解す
るために相対的に非極性であるのが好ましい。

活性化がシングレット酸素によるものである場合、光
増感剤は光活性化を促進する。通常、光増感剤は光を吸
収し、こうして形成した励起光増感剤は、酸素を活性化
させて、シングレット酸素を生成し、そのシングレット
酸素は化学発光化合物と反応して、準安定な発光中間体
を得る。望ましくは、化学試薬を加えずに本発明の組成
物を活性化することが必要で、光増感剤および化学発光
化合物は１種の組成物内で見られる。

光増感剤は、化学発光化合物を活性化するシングレッ
ト酸素を生成するための多くの異なったやり方でで使用
する。光増感剤は、粒子に溶解または結合し、さらにsb
pメンバーに結合する。一般に、使用される光増感剤の
量は、化学発光化合物の活性化をもたらすある濃度のシ
ングレット酸素を生成するのに充分な量である。

固体基質…多孔性または非多孔性の水不溶性物質を含ん
で成る支持体または表面。この表面は、ストリップ、ロ
ッド、ビーズを含む粒子及び同種物のような、多種の任
意の形のものを有し得る。この表面は、親水性であるか
または親水性となし得るものであり、シリカ、硫酸マグ
ネシウムおよびアルミナのような無機粉末；天然のポリ
マー物質、特にセルロース系物質および、例えば濾紙、
クロマトグラフィー紙のような紙を含む繊維のようにセ
ルロースから誘導される物質；ニトロセルロース、酢酸
セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミ
ド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレー
ト、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチル
ブテン）、ポリスチレン、ポリメトアクリレート、ポリ
（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニル
ブチレート）等のような合成のまたは修飾した天然産生
ポリマー類；それ自体でまたは他の物質と併用で；バイ
オガラスとして入手できるガラス、セラミックス、金属
及び同種物を含む。

支持体または表面へのsbpメンバーの結合は、文献で
通常入手できるよく知られた技術により達成することで
きる。例えば、「固定化酵素」、イチロー・チバタ、ハ
ルステッド・プレス、ニューヨーク（1978年）およびク
アトレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第245巻、第3059頁（1970年）を参照。

表面は、通常多機能であるか、または多機能にするこ
とができるか、または特異的、非特異的、共有または非
共有相互作用によってオリゴヌクレオチド、sbpメンバ
ー、光増感剤および／または光化学的に活性できる化学
発光化合物、に結合することができる。様々な官能基が
入手可能であるかたは導入できる。この官能基は、カル
ボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン
基、ヒドロキシル基、メルカプト基及び類似物を含む。
幅広く多様な化合物を表面に結合させる方法が、よく知
られており、文献に十分説明されている。例えば、クア
トレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第245巻、第3059頁（1970年）参照。オリゴ
ヌクレオチドまたはsbpメンバーの連結基との長さは、
連結しようとする化合物の性質、連結しようとする化合
物間の距離の影響および特異的結合特性の表面及び類似
物により異なり、幅広く変化し得る。

粒子…少なくとも約20nmで約20ミクロン以下、通常少な
くとも約40nmで約10ミクロン未満、好ましくは直径が約
0.10から2.0ミクロンで、標準的に１ピコリットル以下
の容量を有する粒子。この粒子は、有機、無機、膨張性
または非膨張性、多孔質または非多孔質である固体また
は流体で、それは、任意の密度をもつが、好ましくは水
に近い密度をもち、一般に約0.7から約1.5g/ml、好まし
くは水中に懸濁でき、透明、部分的に透明、または不透
明である物質からなる。この粒子は、電荷を有するかま
たは有しないことができ、荷電している場合は、好まし
くはマイナス荷電である。この粒子は、固体（例えばポ
リマー、金属、ガラス、有機物および無機物、例えば鉱
物、塩およびけいそう）、油滴（例えば、炭化水素、フ
ッ化炭素、シリコン液）または小胞（例えば、リン脂質
のような合成のまたは細胞やオルガネラのような天然
の）である。この粒子はラテックス粒子または、有機も
しくは無機ポリマーを含む他の粒子；例えばリポソー
ム、リン脂質小胞のような脂質二重層；油小滴；シリコ
ン粒子；金属ゾル；細胞；多糖；ヒドロゲル；架橋蛋白
質；けいそう；および色素微結晶を含む他の粒子であ
る。

有機粒子は、標準的にポリマー類、付加または濃縮ポ
リマー類のいずれかであり、それらはアッセイ培地中で
容易に分散することができる。有機粒子はまた、それら
の表面でsbpメンバーに直接または間接的に結合し、光
増感剤または光化学的に活性化できる化学発光化合物に
それらの表面で結合するかまたはその内部に含めるよう
に、吸着性または官能付与性でもある。

この粒子は、天然産生物質、合成的に修飾した天然産
生物質、および合成物質から調達できる。例えばリポソ
ームや非リン脂質小胞のような脂質二重層のような天然
または合成アセンブリが好ましい。特に有利な有機ポリ
マーの中には、多糖類、特にアガロースのような架橋し
た多糖類、それはセファロースとして入手できる、があ
り、セファデックスおよびセファクリルとして入手でき
るデキストラン、セルロース、デンプン及び同種物；ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、アクリレートやメタ
アクリレートの誘導体、特にヒドロゲルや同種物を含む
遊離ヒドロキシ官能性を有するエステルやアミドのホモ
ポリマーおよびコポリマーのような付加ポリマーがあ
る。無機ポリマーは、シリコン、バイオガラスとして入
手できるガラス等を含む。ゾルは、金、銀セレンおよび
他の金属を含む。粒子はまた、ポルフィリン、フタロシ
アニン等のような水不溶性染料を分散し、それはまた、
光増感剤として役立つ。粒子はまた、けいそう、細胞、
ウイルス性粒子、マグネットゾーム、細胞核及び同種物
を含む。

粒子が商業的に入手できる場合、粒子径は、粉砕、音
波破砕、撹拌等のような機械的手段により、大きい粒子
を小さい粒子に細かくすることにより変え得る。

粒子は、通常多機能であるかまたは多機能にすること
ができるか、またはsbpメンバーに結合することができ
るおよび／または特異的、非特異的、共有または非共有
相互作用を通じて、光増感剤および／または化学発光化
合物に結合することができる。幅広く多様な官能基が入
手できるかまたは含むことができる。官能基の典型例
は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エ
チレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基及び同種物を
含む。sbpメンバー、化学発光化合物または光増感剤と
粒子との共有結合を実施する場合、連結する方法は、よ
く知られており、文献で十分に説明されている。例え
ば、クアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第245巻、第3059頁（1970年）参
照。連結基の長さは、連結しようとする化合物の性質、
粒子の性質、連結しようとするる化合物間の距離の影響
およびsbpメンバーおよび分析物の結合上の粒子及び類
似物により異なり、幅広く変化し得る。

粒子に共有結合しない場合、光増感剤および／または
光活性化する化学発光化合物を、粒子の表面で溶解する
かまたはそれに非共有結合するように選択し得る。この
場合、これらの化合物は、粒子から解離する可能性を減
少するために疎水性であることが好ましい。一般に、光
増感剤および化学発光化合物と粒子との関連を好むよう
に、粒子状組成物が選択される。

粒子に関連する光増感剤または光活性化できる化学発
光化合物の分子の数は、平均して通常少なくとも１個で
あり、粒子が完全に光増感剤および光化学的に活性化で
きる化学発光化合物分子からなるように充分に高い。好
ましい分子の数は、アッセイのような特定の用途につい
てバックグラウンドへのもっとも高いシグナルを提供す
るために経験上選択される。いくつかの場合では、この
ことは、いくつもの異なった光増感剤分子を粒子に関連
づけることによって最善に達成することができ、または
エネルギーを光増感剤に転移することができるいくつも
の同様または異なった蛍光染料分子は、光エネルギーを
集め、それを光増感剤分子に転移する粒子に含むことが
できる。通常、粒子での光増感剤または光活性化できる
化学発光化合物対sbpメンバーの割合は、少なくとも0.
1、好ましくは少なくとも10、最も好ましくは100対１以
上である。

油滴は、乳化剤で被覆および安定化した親油性化合物
を含む流動粒子で、その乳化剤は、例えばリン脂質、ス
フィンゴミエリン、アルブミン及び同種物のような両親
媒性の分子である。

リン脂質は、脂肪族ポリオールの脂肪族カルボン酸エ
ステルに基づいており、少なくとも１つのヒドロキシル
基から約８〜36個、通常は約10から20個の炭素原子のカ
ルボン酸エステルに置換する場合、それは０から３個、
通常０から１個のエチレン不飽和の部位を有し、少なく
とも１つ、通常１つのみであるヒドロキシル基は、リン
酸塩と置換してリン酸エステルを形成する。リン酸基
は、さらに２つまたはそれ以上の官能性群、一般にヒド
ロキシルまたはアミノ基をもつ小さな脂肪族化合物と置
換する。

油滴は、適当な親油性化合物と、界面活性剤が混合物
の約0.1から５、通常約0.1から２重量パーセントで存在
する場合、アニオン、カチオンまたは非イオン性の界面
活性剤との組合わせにより、そして水性媒体の混合物を
音波処理または渦まきのような撹拌をすることにより通
常の製法に関連して実施され得る。例となる親油性化合
物は、炭化水素油、フルオロカーボンを含むハロカーボ
ン、アルキルフタレート、トリアルキルホスフェート、
トリグリセリド等を含む。

sbpメンバーは、通常油滴の表面に吸着するかまた
は、油滴の表面成分に直接または間接的に結合する。sb
pメンバーは、液体粒子の製造間または後のいずれかで
液体粒子に含ませる。sbpメンバーは、粒子の表面上に
存在する分子の約0.5から100、通常１から90、しばしば
約５から80、好ましくは約50から100モルパーセントで
標準的に存在する。

次は、油滴を安定化するために利用される両親媒性化
合物のリストであり、例示的にかつ非限定的にあげられ
る。：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホス
ファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、ジアパル
ミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、カ
ルジオリピン、レシチン、ガラクトセルブロシド、スフ
ィンゴミエリン、ジセチルホスファート、ホスファチジ
ルイノシトール、２−トリヘキサデシルアンモニウムエ
チルアミン、1,3−ビス（オクタデシルホスフェート）
プロパノール、ステアロイルオキシエチレンホスフェー
ト、リン脂質、ジアルキルホスフェート、ドデシル硫酸
ナトリウム、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活
性剤、アルブミンのような蛋白質、非イオン性界面活性
剤等。

親油性をもち、前に記載した他の化合物もまた使用す
ることもできる。多くの場合、これらの化合物は、６か
ら20個の炭素原子をもち、通常アルキル基の混合物をも
つアルキルベンゼン類で、それは直鎖または分枝鎖であ
り、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ポリオキシアル
キレン基（２−３個の炭素原子をもつアルキレン）、カ
ルボン酸基、スルホン酸基またはアミノ基をもつ。標準
的に約10から36個、通常12から20個の炭素原子である脂
肪族脂肪酸を使用する。また、脂肪酸に対して示された
炭素限界をもつ脂肪アルコール、同様の炭素限界をもつ
脂肪アミンおよび様々なステロイドもまた使用する。

油滴は、フッ化炭素油またはシリコン油（シリコン粒
子）を含むことができる。そのような小滴は、米国特許
第4,634,681号および第4,619,904号のギアエバーにより
記載されている。ギアエバーはまた、小滴の製造および
sbpメンバーがその小滴に結合することができる方法を
記載している。ギアエバーにより記載された他の油滴も
また、本発明で使用する。

リポゾーム…ほぼ球状型で、本発明の使用に好ましい物
質の１つである微小小胞。リポゾームは、直径が少なく
とも約20nmで、約20ミクロン以下、通常少なくとも約40
nmで約10ミクロン未満である。好ましくは、リポゾーム
の直径は、沈降または浮遊を制限するように約２ミクロ
ン未満である。

リポゾームの外郭は、水または水性溶液の１容量を含
む両親媒性二重層からなる。１つ以上の二重層をもつリ
ポゾームは、多重膜小胞と称する。１つだけの二重層を
もつリポソームは、単一膜小胞と称する。親油性光増感
剤または化学発光化合物を使用する場合、多重膜小胞
は、これらの物質を単一膜小胞よりも多量に含むことが
できるので、本発明に好ましい。両親媒性二重層は、し
ばしばリン脂質を含む。本発明で利用できる粒子の製造
で使用するリン脂質は、レシチンを含む天然膜で見られ
る任意のリン脂質またはリン脂質混合物、または飽和ま
たは不飽和12−炭素の合成グリセリルリン酸ジエステル
または24−炭素の直鎖脂肪酸であり、そのリン酸塩は、
モノエステルとして、またはエタノールアミン、コリ
ン、イノシトール、セリン、グリセロール及び同種物の
エステルとして存在することができる。特に好ましいリ
ン脂質は、Ｌ−α−パルミトイルオレオイル−ホスファ
チジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイルホスフ
ァチジルグリセロール（POPG）、Ｌ−α−ジオレオイル
ホスファチジルグリセロール、Ｌ−α（ジオレオイル）
−ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）およびＬ−
α（ジオレオイル）−ホスファチジル−（４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシア
ミド）エタノール（DOPE−MCC）を含む。

二重層でのリン脂質は、コレステロールで補足し、通
常荷電した極性基および通常２個の直鎖炭化水素鎖を含
む疎水性部分をもつ他の両親媒性化合物で置換すること
ができる。そのような置換体の例は、ジアルキルホスフ
ェート、アルキル基が炭素原子12−20個の直鎖をもつジ
アルコキシプロピルホスフェート、1990年１月30日に発
行された米国特許第4,897,355号に記載されているよう
なＮ−（2,3−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキ
シ））−プロプ−１−イル−N,N,N−トリメチルアンモ
ニウムクロリド（DOTMA）、スフィンゴミエリン、カル
ジオリピン及び同種物を含む。

本発明で利用するリポソームは、懸濁液を安定化さ
せ、自然におこる凝集を防ぐために高い陰性の荷電をも
つことが好ましい。

本発明の使用では、リポソームは、sbpメンバーに結
合することができ、水性または非水性相のいずれかに関
連する光増感剤および／または化学発光化合物をもつこ
とができる。本発明に利用するリポソームは、通常脂質
小胞の外部表面に結合するsbpメンバーをもつ。

リポソームは、水溶液の乾燥したリン脂質またはリン
脂質置換体の水和および機械的分散を含む様々な方法に
より産生する。本方法で製造されるリポソームは、様々
な面積、組成物および挙動をもつ。機械的に分散したリ
ポソームの挙動の不均質および矛盾を軽減する方法の１
つは、音波処理である。そのような方法は、リポソーム
の平均サイズを小さくする。別法としては、リポソーム
の産生間の最終段階として押出しを用いることができ
る。米国特許第4,529,561号は、均一サイズを改良する
ために、圧力をかけて均一細孔膜に通して、リポソーム
を押出す方法を記載している。

脂質二重層に溶解する疎水性または両親媒性光増感剤
および／または化学発光化合物を含むリポソームの製造
は、様々な方法で実施でき、オルセン等により、ビオシ
ミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ、第557巻、第９頁（1
979年）に記載されている方法を含む。

小滴およびリポソームの標識は、例えば、チオールま
たはマレイミドまたは脂質二重層を含む分子上のビオチ
ン基を包含することをしばしば含む。光増感剤、化学発
光分子および／またはsbpメンバーは、その後粒子と、
それぞれ、スルフヒドリル反応試薬、スルフヒドリル基
またはアビジンに結合するこれらの物質の１つとの反応
により、表面に結合する。スルフヒドリル反応基は、ブ
ロモアセトアミドおよびマレイミドのようなアルキル化
試薬を含む。

sbpメンバーは、弱い疎水性相互作用によりリポソー
ム粒子の表面に誘引することができるが、しかしなが
ら、そのような相互作用は、インキュベーションや洗浄
間に起こるせん断力に耐えることが一般的に充分ではな
い。sbpメンバーは、リポソーム粒子に共有的に結合す
ることが好ましく、その粒子は、例えば上記に示したよ
うなDOPE−MCCの使用により、そのようなリポソームと
メルカプタン基で官能性化した選択sbpメンバーとを組
合わせることにより官能性化される。例えば、sbpメン
バーが抗体である場合、それは、Ｓ−アセチルメルカプ
トコハク酸無水物（SAMSA）と反応し、加水分解して、
スルフヒドリル修飾抗体を提供する。

ラテックス粒子…「ラテックス」は、粒子状で水に懸濁
でき、水に不溶性のポリマー物質を意味し、それは、直
径が20nmないし20mm、好ましくは10ないし100nmである
粒子面積をもつ。ラテックスは、しばしば下記のような
置換したポリエチレンである。：ポリスチレンブタジエ
ン、ポリアクリルアミドポリスチレン、アミノ基をもつ
ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタアクリル酸、
アクリロニトリルブタジエン、スチレンコポリマー類、
ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピリ
ジン、ビニルクロリドアクリレートコポリマー類及び同
種物。スチレンの非架橋ポリマーおよびカルボキシル化
スチレンまたはアミノ、ヒドロキシル、ハロ及び同種物
のような他の活性基で官能性化したスチレンが好まし
い。しばしば、スチレンをブタジエンのようなジエンで
置換したコポリマーが使用される。

光増感剤および化学発光化合物と本発明で利用するラ
テックス粒子との関連は、重合による粒子の形成間の導
入を伴うが、通常粒子への非共有溶解により予備形成し
た粒子への導入を伴う。通常、化学発光化合物および光
増感剤の溶液が使用される。利用できる溶媒は、エタノ
ール、エチレングリコールおよびベンジルアルコールを
含むアルコール類；ジメチルホルムアミド、ホルムアミ
ド、アセトアミドおよびテトラメチル尿素及び同種物の
ようなアミド類；ジメチルスルホキシドおよびスルホラ
ンのようなスルホキシド類；およびカルビトール、エチ
ルカルビトール、ジメトキシエタン及び同種物のような
エーテル類および水を含む。粒子が不溶性である、高い
沸点をもつ溶媒の使用は、化合物が粒子に溶解するのを
促進するために、高い温度の使用を可能にし、特に適用
する。溶媒は、単独または組合わせて使用する。光増感
剤を導入するのに特に好ましい溶媒は、それらの本来の
特性またはそれらが、粒子に不溶性である水のような溶
媒に溶解する能力によって、粒子から実質的に除去する
ことができることのいずれかによって、光増感剤のトリ
プレット励起状態を抑制しないものである。ヒドロキシ
ル化溶媒、すなわち、１つまたはそれ以上のヒドロキシ
ル基を含むものが好ましく、一般に膨張するが粒子に溶
解しない溶媒が使用できる。粒子での化学発光化合物の
導入では、それらの本来の特性またはそれらが粒子から
除去することによって、発光を妨害することができない
ような溶媒を選択すべきである。しばしば、ヒドロキシ
ル化溶媒も好ましい。ジブチルフタレート、ベンゾニト
リル、ナフトニトリル、ジオクチルテレフタレート、ジ
クロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベン
ゼン等を含む典型的な芳香族共存溶媒は、粒子の溶解を
避けるために充分に低い濃度で使用されるが、粒子を膨
張するのに充分な濃度で使用される。

光増感剤および／または化学発光化合物が粒子に共有
的に結合すべきである場合を除いて、電子的に中性であ
る光増感剤または化学発光化合物を使用するのが通常好
ましい。選択された液体媒体は、固着の点でポリマーを
軟らかくしないのが好ましい。好ましい技術は、光増感
剤および／または化学発光化合物が少なくとも限定され
た溶解度をもつ液体溶媒で選択されたラテックス粒子を
懸濁することを含む。好ましくは、液体媒体の光増感剤
および化学発光化合物の濃度は、最も高いシングレット
酸素形成効率および媒体の化学発光化合物からの最も高
い放射量子収率をもつ粒子を提供するように選択される
が、時にはあまり濃縮されていない溶液が好ましい。溶
媒の粒子のゆがめまたは溶解は、粒子が不溶性である混
合できる共存溶媒を加えることにより避けることができ
る。

一般に、操作中に採用した温度は、粒子に伴われる光
増感剤のシングレット酸素形成、および粒子に伴われる
化学発光化合物の量子収率を最大にするように選択され
るが、但し、粒子は選択した温度で溶融または凝集して
はならない。高い温度が標準的に使用される。操作のた
めの温度は、一般的に20℃から200℃、さらに通常50℃
から170℃の範囲である。室温でほとんど不溶性である
いくつかの化合物は、高い温度で、例えばエタノールお
よびエチレングリコール及び同種物のような低分子量の
アルコールに溶解することが観測されている。カルボキ
シル化した修飾ラテックス粒子は、そのような温度で、
低分子量のアルコールを許容するように示している。

sbpメンバーは、ラテックス粒子の表面で物理的に吸
着するかまたは粒子に共有的に結合する。sbpメンバー
がラテックス粒子の表面に単に弱く結合する場合、結合
は、ある場合、インキュベーションおよび洗浄間に起こ
る粒子−粒子間のせん断力に耐えることができない。そ
れ故、吸着を最小限にする条件で、sbpメンバーがラテ
ックス粒子に共有的に結合することが好ましい。このこ
とは、ラテックスの表面を化学的に活性化することによ
り達成する。例えば、表面カルボキシル基のＮ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステルが形成し、アッセイ成分の
粒子表面への非特異的結合を減少させる活性化粒子は、
その後エステル基と反応するかまたはアミノ基をもつsb
pメンバーと直接反応するアミノ基をもつリンカーと接
触する。リンカーは、通常アッセイ成分の粒子表面への
非特異的結合を減少させるように選択され、ラテックス
粒子への結合およびsbpメンバーの結合のための適当な
官能性群を提供することが好ましい。適当な物質は、マ
レイミド化アミノデキストラン（MAD）、ポリリジン、
アミノサッカライド及び同種物を含む。MADは、ハーバ
ート等により、プロシーディングス・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシーズ、第75（７）巻、第3143
頁（1978年）に記載されているように製造することがで
きる。

１つの方法では、MADを、例えば１−（３−ジメチル
アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドのような
水溶性カルボジイミドを使用して、最初にカルボキシル
含有ラテックス粒子に結合する。被覆した粒子をその後
非特異的結合をさけるために試薬で平衡させる。そのよ
うな試薬は、ウシガンマグロブリン（BGG）のような蛋
白質、およびツイーン20、トリトンＸ−100及び同種物
のような界面活性剤を含む。スルフヒドリル基をもつか
またはスルフヒドリル基を導入するように適当に修飾し
たsbpメンバーは、その後粒子の懸濁液に加えると、共
有結合が粒子上でsbpメンバーとMAD間に形成される。任
意の余剰未反応sbpメンバーは、その後洗浄により除去
することができる。

金属ゾルは、重金属、すなわち例えば、金または銀ま
たは、セレニウムまたはテルリウムのようなカルコゲン
のようなIB群金属のような、原子番号が20以上の重金属
を含む金属ゾル粒子である。

金属ゾル粒子は、例えば米国特許第4,313,734号のリ
ューバリングにより記載されている。上記ゾルは、金属
のコロイド状水性分散、金属化合物、または金属または
金属化合物に被覆されたポリマー核を含む。

金属ゾルは、金属または金属酸化物、金属水酸化物お
よび金属塩のような金属化合物であるか、または金属ま
たは金属化合物で被覆されたポリマー核である。そのよ
うな金属の例は、白金、金、銀、水銀、鉛、パラジウ
ム、および銅であり、上記金属化合物の例は、ヨウ化
銀、臭化銀、含水酸化銅、酸化鉄、水酸化鉄または含水
酸化鉄、水酸化アルミニウムまたは含水酸化アルミニウ
ム、二酸化クロムまたは含水酸化クロム、酸化バナジウ
ム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、硫化鉛、硫化水銀、硫
酸バリウムおよび二酸化チタンである。一般に、有用な
金属または金属化合物は、既知技術によって容易に実施
できる。

上記記載した金属または金属化合物で被覆したポリマ
ー核からなる分散粒子を含むゾルを使用することが時に
は有利である。これらの粒子は、純粋な金属または金属
化合物の分散相と同様の特性をもつが、大きさ、密度お
よび金属接触は、最適に組み合わせることができる。

金属ゾル粒子は、それ自体知られている多くの方法で
製造することができる。例えば、金ゾルの製造について
は、リューバリングは、ネイチャー・フィジカル・サイ
エンス、第241巻、第20頁（1973年）のG.フレンスによ
る論説を引用している。

金属ゾル粒子は、sbpメンバー、光増感剤および化学
発光化合物に連結するための上記したような様々な官能
基を含むように修飾することができる。例えば、高分子
結合剤は、多くの重金属に強く結合するチオール基、ま
たは結合して、例えば金属粒子と、磁気粒子を被覆する
ためにアドバンスド・マグネティックスによりヨーロッ
パ特許出願第84400952.2号に記載されているトリアルコ
キシアミノアルキルシランとの反応によるような、高分
子被覆を形成できるシリル化剤、を含むポリマーのよう
な粒子を被覆するのに使用することができる。

染料微結晶…純粋または混合した固体水不溶性染料の微
結晶で、上に記載した光増感剤として役立つ染料が好ま
しい。本発明に有用な染料微結晶は、20nmないし20nmの
範囲の大きさをもつ。

染料微結晶を製造する１つの方法は、米国特許第4,37
3,932号（グリブナウ等）に記載されている。グリブナ
ウは、コロイド状粒子、および疎水性染料または色素の
水性分散液を記載しており、それは免疫学的に反応する
成分、および直接または間接的に結合する化学発光化合
物をもち得る。染料粒子は、一般に、水中に染料を分散
させた後、遠心分離することにより製造される。

染料微結晶を製造する他の方法は、水と混合できる溶
媒で染料の溶液を水にゆっくり加えることである。別の
方法は、水中で固体染料の懸濁液を音波処理することで
ある。

染料粒子へのsbpメンバーの結合は、直接または間接
的、吸着または共有化学的結合により達成できる。後者
は、化学発光化合物の結合にも使用でき、任意の被覆物
質および染料中の適当な官能基の存在により制御され
る。例えば、官能基は、ジアゾ化した芳香族アミノ基お
よび所望の官能基を含む化合物を、染料のフェノール基
またはアニリノ基とカップリングすることにより、染料
微結晶の表面上に導入することができる。

染料がカルボキシル基をもつ場合、染料微結晶は、カ
ルボジイミドにより活性化でき、第１級アミノ成分とカ
ップリングすることができる。脂肪族第１級アミノ基お
よびヒドロキシル基は、例えば臭化シアノーゲンまたは
ハロゲン置換ジまたはトリアジンにより活性化すること
ができ、その後第１級アミノ成分、または例えば−SHま
たは−OH基を含む成分との結合を行うことができる。二
官能性反応化合物も使用できる。例えば、グルタルアル
デヒドは、染料の第１級アミノ成分とsbpメンバーとの
相互カップリングに使用することができ、また例えばＮ
−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロビ
オネートのようなヘテロ二官能性試薬は、チオール基を
含む成分への第１級アミノ成分のカップリングに使用す
ることができる。

本発明の乳化剤は、次のように製造することができ
る。金属ゾルは、還元的沈殿により、例えば硝酸銀溶液
に対するヒドラジンの作用により、製造することができ
る。油類は、水性油懸濁液の音波処理により、および／
または細孔フィルターを通した押出しにより、乳化する
ことができる。油乳化剤はまた、メタノールのような水
と混合できる溶媒に油を溶かした溶液を水で希釈するこ
とにより得られる。アニオン界面活性剤、蛋白質、リン
脂質及び同種物のような、水中に存在する界面活性剤が
ある場合のみ安定な乳化剤が形成する。

化学発光化合物（CC）…光により直接または増感した励
起時、またはシングレット酸素との反応時に、化学的反
応を受けて、通常250ないし1200nmの波長範囲内の、同
時にまたは続けて行う光の放射により分解することがで
きる、準安定な反応生成物を形成する光活性化物質。
「光活性化する」という用語は、「光化学的に活性化す
る」ことを含む。本発明の好ましいCCは、シングレット
酸素と反応してジオキセタン類またはジオキセタノン類
を形成するCCである。後者は、通常電子が豊富なオレフ
ィン類（１）である。上記の電子が豊富なオレフィンの
典型例は、エノールエーテル類、エナミン類、９−アル
キリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類、アリールビニル
エーテル類、ジオキセタン類、アリールアミダゾール
類、９−アルキリデンキサンタン類およびルシゲニンで
ある。本発明で特に対象となるものは、エノールエーテ
ル類、エナミン類および９−アルキリデン−Ｎ−アルキ
ルアクリダン類である。「CC」という用語に含まれる他
の化合物は、ルミノールおよび他のフタルヒドラジン類
および、光化学的に不安定な保護基によりそれらが保護
されることにより、化学発光反応を受けることから保護
される化学発光化合物を含み、そのような化合物は、例
えばホタルルシフェリン、アクアホリン、ルミノール等
を含む。

対象とするCCは、300ナノメートル以上、好ましくは5
00ナノメートル、さらに好ましくは550ナノメートル以
上の波長で放射するのが好ましい。試料成分が光吸収に
顕著に寄与する場合、領域を越えた波長で吸収および放
射する化合物が、本発明で特に使用される。血清の吸収
は、500nm以上で急速に少なくなり、600nm以上で取るに
足らないものになる。それ故、600nm以上で光を放射す
る化学発光化合物は、特に重要となる。しかしながら、
短い波長で吸収する化学発光化合物は、試料の干渉吸収
が存在しない場合に有益である。

化学発光化合物の自己感作を避けるために、光増感剤
を励起するのに使用する光を吸収しないことが好まし
い。一般的に、増感剤は、500nmより長い光波長で励起
することが好ましいので、化学発光化合物による光の吸
収が500nmより上の波長では非常に低いことが望まし
い。

化学発光化合物からの長波長放射が望ましい場合、化
学発光化合物に結合する、ピレンのような長波長エミッ
ターを使用することができる。別法としては、蛍光分子
は、化学発光化合物を含む媒体中に含めることができ
る。好ましい蛍光分子は、活性化した化学発光化合物に
より励起され、通常550nm以上である化学発光化合物の
放射波長より長い波長で放射する。蛍光分子はまた、光
増感剤を活性化するのに使用する光の波長では吸収しな
いことが通常望ましい。有用な染料の例は、ローダミ
ン、エチジウム、ダンシル、Eu（fod）_３、Eu（TT
A）_３、Ru（bpy）₃ ⁺⁺（bpy＝2,2'−ジピリジル等）を含
む。一般に、これらの染料は、エネルギー転移過程にお
いて受容体として作用し、好ましくは高い蛍光量子収率
をもち、シングレット酸素と急速に反応しない。それら
は、粒子中への化学発光化合物の導入と同時に粒子中に
導入することができる。下記のCCの１は、一般に化学的
に反応性のアリルCHまたはNH基を含まない。

電子が豊富にあるオレフィン類１は、一般に、オレフ
ィン： ［式中、Ａは、例えばＮ（Ｄ）_２、OD、ｐ−C₆H₄N
（Ｄ）_２、フラニル、Ｎ−アルキルイミダゾール、Ｎ−
アルキルピロリル、２−インドイル等のような電子供与
基であり、Ｄは、例えばアルキルまたはアリール、Ａは
オレフィン炭素に直接結合するかまたは他のコンジュゲ
ートした二重結合の中間体により結合されるかのいずれ
かである］ とのコンジュゲーションで電子供与基をもつ。オレフィ
ン１中のＣ原子の他の原子価は、一緒になって融合また
は非融合する１つまたはそれ以上の環群を形成すること
ができる１ないし50原子の置換体であり、例えばシクロ
アルキル、フェニル、７−ノルボルニル、ナフチル、ア
ントラシル、アクリダニル、アダマンチル、その他であ
る。

通常、原子が小さい二環式系の橋頭位置のような二重
結合を許容できない位置でない限り、オレフィンに直接
結合する水素原子をもつ原子はない。室温で急速に衰退
する（60分未満、好ましくは５分未満、望ましくは30秒
未満）ジオキセタンをもつオレフィン類がさらに好まし
い。ジオキセタン類は、単独でまたは蛍光エネルギー受
容体と一緒になって発光性であり得る。

エノールエーテル類２は、一般に構造： ［式中、Ｒは、１ないし20個の炭素原子のアルキルであ
り、オレフィン上の残りの置換体は、Ｈおよび好ましく
は１ないし50個の原子をもつ置換体からなる群から選択
される］ をもつ。アリール環が蛍光を与える位置で電子供与基と
置換されている場合、エーテルと同一の炭素上にアリー
ルをもつエノールエーテル化合物が有用である。電子供
与基は、例えばｍ−ヒドロキシフェニル、ｍ−ジメチル
アミノ−フェニル、１−（５−アミノナフチル）、ピリ
ル、１−（３−ヒドロキシピリル）、アントラシル、ク
リシル等であることができる。１位炭素を酸素で置換え
ることにより形成されるケトンが、蛍光性の、例えばβ
−ナフチルまたは２−アントリルである場合、２位の１
つまたは両方の基は、アリールであり得る。エノールエ
ーテル類の典型例は、次のものであり、それは例示的に
かつ非限定的にあげたものである： 米国特許第4,956,477号のブロンスタイン等により記載
された ［式中、X₁は、Ｈ、OC（Ｏ）CH₃、OCH₃、OHである］； 米国特許第4,956,477号のブロンスタイン等により記載
された P.シャープにより、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティー、第104巻、第3504頁（198
2年）に、およびP.シャープにより、フォトケミカル・
アンド・フォトバイオロジー、第30巻、第35頁（1979
年）に記載された ［式中、X₂は、Ｈ、OH、Ｎ（CH₃）_２またはOCH₃であ
る］； P.シャープにより、U.S.アーミー・リサーチ・オフィス
の報告、1986年10月15日に、およびS.D.ガグノン、Ph.
D.テシスにより、ウエイン・ステイト・ユニバーシティ
ー（1982年）に記載された ［式中、X₂は、上記と同意義であり、X₃は、Ｈ、OCH₃ま
たはＮ（CH₃）_２である］； P.シャープにより、オフィス・オブ・ネイバル・リサー
チの報告、1987年３月17日に記載された ［式中、X₄＝Ｏ、Ｓ、CH₃NまたはPhNで、Ｙ＝Ｏ、Ｓま
たはCH₃Nで、Ph＝フェニルである］； P.シャープにより、U.S.アーミー・リサーチ・オフィス
の報告、1986年10月15日に記載された エナミン類７は、一般的に構造： ［式中、R¹は、独立してアリールまたはアルキルであ
り、オレフィン上に残りの置換体は、Ｈおよび１ないし
50個の原子の置換体からなる群から選択される］ を有する。一般に、有用なエナミン類は、エノールエー
テル類について上記した規則に従う。

有用なエナミン類の例としては、OCH₃のかわりにＮ
（CH₃）_２をもつ上記エノールエーテル類３−５が、例
示的にかつ非限定的にあげられる。さらなる例は、 である。９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類
10は、一般的に構造 ［式中、R³はアルキルであり、オレフィン上の残りの置
換基は、Ｈおよび１−50個の原子の置換基からなる群か
ら選択され、好ましくはフェニル、ナフチル、フェナン
トリル、ｍ−メトキシフェニル、ジメチルアミノ、トリ
チル、メトキシ、Ｎ−モルホレノであり、一緒になって
例えばアダマンチル、Ｎ−メチルアクリダニリド、キサ
ンタニリジン、１−（3,4−ベンゾ−５−ヒドロフリリ
デン）、及び同種物、のような環を形成することもあ
る］ を有する。

本発明で標識として有用な９−アルキリデン−Ｎ−ア
ルキルアクリダン類の具体例としては、次のものが、例
示的かつ非限定的にあげられる。： シンガーにより、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケ
ミストリー、第41巻、第2685頁（1976年）に記載された E.ホワイトにより、ケミカル・レターズ、第1491頁（19
79年）に記載された シンガー等により、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ、第102巻、第3823頁（1983
年）に記載された ［式中、R₄およびR₅は独立してＨまたはフェニルであ
る］； マッカプラにより、ケミカル・コミュニティー、第944
頁（1997年）におよびシンガー等により、同書に記載さ
れた マッカプラにより、同書に記載された マッカプラにより、同書に記載された 上記文献の適切な箇所は、引用して本書に包含させ
る。

９−アルキリデンキサンタン類は、一般に構造 ［式中、オレフィン上の置換基は、Ｈおよび原子１−50
個の置換体からなる群から選択され、好ましくはフェニ
ル、ナフチル、フェナントリル、ｍ−メトキシフェニ
ル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−モルホ
レノであり、一緒になって例えばアダマンチル、Ｎ−メ
チアクリダニリド、キサンタニリジン、１−（3,4−ベ
ンゾ−５−ヒドロフリリデン）、及び同種物、例えば９
−フェニルメチリデンキサンテンのような環を形成す
る］ を有する。

他のCC類は、2,3−ジヒドロ−1,4−フタルアラジンジ
オン類である。最も代表的な化合物は、５−アミノ化合
物であるルミノールである。この類の他のメンバーは、
５−アミノ−6,7,8−トリメトキシおよびジメチルアミ
ノ［ca］ベンズアナログを含む。ルミノールはアッセイ
で標識として使用されていることに注意すべきである
が、しかしながら、ルミノールの励起は、本発明の場合
のような光活性化によるのではなく化学的に達成されて
いる。これらの化合物は、シングレット酸素により、そ
して光放射で分解するスーパーオキシドまたは過酸化水
素との次の反応で1,4−フタルアジニジオン類に酸化さ
れる。

別のCC類は、親産生物の通称名がロフィンである2,4,
5−トリフェニルイミダゾール類である。化学発光アナ
ログは、パラジメチルアミノおよびパラメトキシ置換体
を含む。

上にあげた必要条件を満足させる他の化学発光化合物
は、ヨーロッパ特許出願第0,345,776号に見出される。

シングレット酸素と化学発光化合物との反応により形
成されるジオキセタン類は、炭素（Ｃ）上の置換体が相
当するオレフィン上に存在する場合、以下の一般式をも
つ： あるジオキセタン類は自然に分解し、他のものは光を
放射しながら熱により分解する。いくつかの場合では、
ジオキセタンは、自然にヒドロペルオキシドに変換する
と、塩基がジオキセタンを再生するのに必要になり、分
解と光放射を可能にする。

エネルギー受容体は、本書では蛍光エネルギー受容体
とも称する。310nmより高く、標準的に350nmより高く、
好ましくは約400nmより高いかなりの吸収をもつ発色
団。エネルギー受容体の選択はまた、特定のCCにより制
御される。エネルギー受容体は、CCにより放射した光を
吸収することができる。好ましくは、エネルギー受容体
の吸収最大値は、化学発光化合物の放射最大値と同様の
波長であるべきである。高い吸光度が望ましく、通常10
より多く、好ましくは10³より多く、特に10⁴より多いの
が好ましい。エネルギー受容体は蛍光であるべきで、通
常少なくとも0.1、好ましくは0.4以上の高い蛍光量子収
率をもつことが好ましい。

エネルギー受容体として有用な多くの異なる分子は、
ウルマン等により、Ｉ、II、IVおよびＶの第８および９
欄に記載され、その適切な箇所は、引用して本書に包含
させる。上記した多くの望ましい特性をもつ蛍光体の１
つの群は、3,6−ジヒドロキシ−９−フェニルキサント
ヒドロールから誘導されるフルオレセイン、および3,6
−ジアミノ−９−フェニルキサントヒドロールから誘導
されるローザミン類、およびローダミン類を含むキサン
テン染料である。ローダミン類およびフルオレセイン類
は、９−ｏ−カルボキシフェニル基をもち、９−ｏ−カ
ルボキシフェニルキサントヒドロールの誘導体である。

これらの化合物は、結合部位としてまたは結合官能性
群として使用することができる、置換分をフェニル基上
に有するものとして商業的に入手できる。例えば、アミ
ノおよびイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物
が入手できる。

蛍光化合物の別の群は、アルファまたはベータ位、通
常アルファ位にアミノ基をもつナフチルアミン類であ
る。ナフチルアミノ化合物の中には、１−ジメチルアミ
ノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナ
フタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６
−ナフタレンスルホネートが含まれる。

蛋白質と反応するために活性化する染料前駆体は、３
−フェニル−７−イソシアナトクマリン;9−イソシアナ
トアクリジンのようなアクリジン類;N−（ｐ−（２−ベ
ンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド;4−クロロ−７
−ニトロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾールのよう
なベンゾキサジアゾール ;4−ジメチルアミノ−4'−イソチオシアナトスチルベン
および４−ジメチルアミノ−4'−マレイミドスチルベン
のようなスチルベン類を含む。sbpメンバーと組合わせ
るために官能性化され得る他の染料は、アクリジンオレ
ンジ、７−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）−４−ニト
ロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾール;N,N'−ジオク
タデシルオキサカルボシアニンｐ−トルエンスルホネー
ト;8−ヒドロキシ−1,3,6−ピレントリスルホン酸のよ
うなピレン類、および他の容易に利用できる蛍光性分子
と共に、１−ピレンブチル酸、メロシアニン540、ロー
ズベンガルを含む。

ポリヌクレオチドアッセイでは、多様なエネルギー受
容体が使用されるが、二重鎖核酸に結合したとき、蛍光
を増大させるものが好ましい。臭化エチジウムおよびア
クリジンオレンジのようなインターカレートする染料が
典型的な例である。バートン（ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ソサイエティー、第112巻、第4960頁（1990
年））により発展されたルテニウム誘導体は、インター
カレーション時に劇的にスイッチオンするため、特に魅
力的である。あるいは、エネルギー受容体は、プローブ
に標識した化学発光化合物の近くで結合することができ
る第２ポリヌクレオチドプローブに結合するか、また
は、エネルギー受容体は、結合せず、溶液中で自由に分
散し得る。

光増感剤およびCCは、いずれも、粒子とアソシエート
して本発明の基質を形成する。この基質は、sbpメンバ
ーと共同する。このことは、上に記載した多くの方法で
達成される。例えば、光増感剤またはCCまたは粒子は、
sbpメンバーに結合する官能性群を含むか、またはsbpメ
ンバーは、光増感剤、CCまたは粒子に結合する官能性群
を含む。これらの結合は、分子間の直接結合により達成
されるか、またはsbpメンバーおよび光増感剤、CCまた
は粒子間で連結基を使用することができる。別の態様で
は、光増感剤およびCCは、sbpメンバーにも結合する粒
子に結合するかまたは導入することができる。sbpメン
バーは、分析物に結合することができる。光増感剤およ
びCCは、少なくとも粒子の１つの相に溶解できるため、
粒子中に導入することができる。光増感剤またはCCは、
粒子中に導入されない場合は、粒子に結合する。この目
的では、光増感剤またはCCまたは粒子またはそれらの成
分は、光増感剤および／またはCCが粒子に結合する手段
を提供するために官能性化する。油滴または脂質二重層
である粒子では、光増感剤および／またはCCは、粒子組
成物と適合し得る長い炭化水素鎖への結合により、粒子
に結合することができる。しばしば、８ないし20個また
はそれ以上の炭素原子をもつ、少なくとも１個、好まし
くは２個の炭化水素鎖が使用される。粒子がフッ化炭素
の油滴である場合、光増感剤および／またはCCは、溶解
度を増大させ、交換を減少させるためにフッ素化するこ
とができ、連結に使用する炭化水素鎖は、フッ化炭素鎖
で置き換えるのが好ましい。シリコン粒子では、光増感
剤および／またはCCは、ポリシロキサンに結合する。通
常、光増感剤およびCCの交換および極性を最小限にする
ことが望ましく、このやり方では、それらは粒子の非水
性部分内に滞留する。sbpメンバーへの光増感剤の結合
は、本出願に十分に記載されている。

上に記載したように、光増感剤および化学発光化合物
は、少なくとも粒子の１つの相に溶解するので、粒子中
に導入することができ、その場合、粒子内では光増感剤
および化学発光化合物は、バルクアッセイ培地内よりも
ずっと高い濃度にある。光増感剤および化学発光化合物
が粒子に共有結合する場合、光増感剤および化学発光化
合物が粒子に共有的に結合する場合、光増感剤および化
学発光化合物または粒子、またはそれらの成分は、光増
感剤および化学発光化合物および粒子に結合する手段を
提供するために官能性化する。油滴またはリポソームで
ある粒子では、光増感剤および化学発光化合物を、各々
一般に少なくとも10ないし30個の炭素原子をもつ、１つ
またはそれ以上の長い炭化水素鎖に結合させることがで
きる。粒子がフッ化炭素の油滴である場合、これらの粒
子中に導入される光増感剤または化学発光化合物は、溶
解度を増大させるため、および他の標識と結合している
他の粒子中への交換を減少させるためにフッ素化し、連
結に使用する炭化水素鎖は、フッ化炭素鎖に置き換える
のが好ましい。シリコン流体粒子では、光増感剤および
化学発光化合物は、ポリシロキサンに結合させることが
できる。粒子あたりの光増感剤および化学発光化合物の
数を最大にするために、粒子中の非水性部分に滞留する
ように光増感剤および化学発光化合物の電荷および極性
を最小にすることが望ましい。粒子がリポソームで、リ
ポソームの水相中に光増感剤および化学発光化合物を保
有することが望ましい場合、極性または電荷が高い光増
感剤および化学発光化合物を使用することが好ましい。

以下は、本発明のポリスチレン粒子の典型的な製造法
を、例示的にかつ非限定的にあげたものである。ポリス
チレン粒子（175nm）を、光増感剤およびCCの混合物の
存在下、加熱により製造する。使用する媒体は、水、エ
チレングリコールおよびベンジルアルコールの容量割合
が、およそ1:8:1の混合物である。この混合物は、水性
および有機特性のバランスを提供する。水様溶媒は、ビ
ーズのコロイド状安定性を維持するのに好ましく、一方
有機様溶媒は、染料を溶解するのに好ましい。他の溶媒
混合物を媒体として使用できる、しかしながら、上記媒
体は、本発明に従った多様な粒子の製造に一般的に許容
できる。

光増感剤およびCCは、ベンジルアルコールの溶液（5m
M）として個々に製造される。様々な割合で一部が、エ
チレングリコール、ベンゼン9:1容量混合物に加えら
れ、その混合物を100ないし110℃まで加熱する。光増感
剤およびCCが導入されるべき適当な部分の粒子を、激し
く撹拌しながら熱い混合物に加える。加熱を短く続け、
その後混合物を冷却し、エタノールで希釈する。余剰の
染料および溶媒混合物を遠心分離を繰り返して除去す
る。最終的に、洗浄した粒子を好便な量の水（一般に１
−10mlの水あたり100mg）に再懸濁させて、暗所に貯蔵
する。

光増感剤、CCおよびsbpメンバーは、粒子と「アソシ
エート」して、本発明の基質を形成する。本書中で使用
されるとき、「アソシエートする」という用語は、次の
ことを含む。：アソシエートは、共有または非共有結合
をにより、または、光増感剤およびCCの場合と同様に粒
子中への導入を経ることである。一般に、光増感剤およ
びCCを含ませる懸濁可能な粒子は、それに結合するsbp
メンバーを有する。このsbpメンバーは、一般に分析物
または分析物に結合できるsbpに結合することができ
る。別のsbpメンバーが使用され、それが分析物に結合
し得る場合、サンドイッチアッセイプロトコールが生じ
る。基質のsbpメンバーはまた、分析物に類似したもの
であってもよく、その場合は、競合アッセイプロトコー
ルが生じる。

補助物質：様々な補助物質が、本発明のアッセイで頻
繁に使用される。例えば、緩衝液は、アッセイ培地およ
びアッセイ成分の安定剤とともに標準的にアッセイ培地
に存在する。しばしば、これらの付加物に加えて、アル
ブミンのような蛋白質類；ホルムアミドのような有機溶
媒；第４級アンモニウム塩類；硫酸デキストランのよう
なポリアニオン類；界面活性剤類、特に非イオン性界面
活性剤類；結合エンハンサー、例えばポリアルキレング
リコール及び類似物を含むことができる。

完全または部分的逐次配列性…本発明で利用する試料お
よび様々な試剤が付随的に（同時に）でなく結合する場
合、１つまたはそれ以上が１つまたはそれ以上の残りの
剤と結合して副結合を形成する。各副結合は、その後、
本発明の方法の１つまたはそれ以上の段階に付すことが
できる。こうして、各副結合は、それぞれの条件下に培
養して、１つまたはそれ以上の所望の結果を達成するこ
とができる。

本発明は、診断アッセイ領域に格別の適用を有する。
（１）分析物を含む可能性のある媒体、および（２）光
増感剤およびCCの両方をもつ単一組成物とアソシエート
する第１特異的結合対（sbp）メンバーを含む標識試薬
を含む組成物が提供される。sbpメンバー複合体が分析
物の存在に関して形成するように条件を選択する。例え
ば、第1sbpメンバーは、分析物または第2sbpメンバーと
結合して、分析物の存在に関する複合体を形成すること
ができる。さらに、本方法は、光増感剤を光活性化し、
CCによって発生した発光量を検出することを含む。発光
量は、媒体中の分析物の量に関連する。

一般に、光増感剤は、光の照射により活性化し、照射
時に分子酸素をシングレット酸素に変換させる。その後
シングレット酸素は、CCを活性化する。シングレット酸
素でのCCの活性化により形成した生成物は、通常10マイ
クロ秒ないし10時間、好ましくは100マイクロ秒ないし
２時間、好ましくは１秒ないし10分の寿命で、光を放射
しながら自然に分解するのが好ましい。

発光に至るまでの時間を制御する因子の１つは、CCの
構造である。発光で衰退に寄与する構造特性は、複雑で
あり、部分的にのみ予測できる。シャープ、前掲、およ
びマッカプラ、前掲は、関連するいくつかの定義を論議
しており、これらの文献の適切な箇所は、引用して本書
に包含させる。

発光までの時間を制御する別の因子は、組成物または
粒子である。一般に、粒子が、CCが溶解する非極性物質
からなる場合、衰退時間および量子効率は、極性物質に
関連して増加する。

発光までの時間を制御するのに使用する別の因子は、
温度である。一般に、温度の上昇は、衰退時間を減少さ
せる。

発光までの時間を制御する別の因子は、反応中に産生
するジオキセタンの分解速度を増大させる活性化剤の存
在である。上記活性化剤は、ハロカーボンのような分極
性溶媒およびユウロピウムキレートのようなある金属キ
レートを含む。活性化剤は、通常発光までの時間を望ま
しく遅らせるのに十分な量で存在する。この量は、活性
化剤の性質により異なり、一般的に10^-3ないし10^-1Mで
ある。

光増感剤は、上記反応物を含む媒体が照射される場
合、CCを活性化するのに役立つ。基質は、十分なエネル
ギーの波長をもつ光で照射して、光増感剤を励起状態に
変換して、それを分子酸素を活性化してシングレット酸
素にすることができるようにさせる。基質の光増感剤濃
度は、通常最大収率のシングレット酸素を得るようにで
きるだけ利用して、しばしば10^-4から10^-1Mである。

光増感剤の励起状態は、通常最も低いトリプレット状
態であり、少なくとも20Kcal/モル、好ましくは少なく
とも23Kcal/モルであり、基底状態よりエネルギーをも
っている。一般に、基質は、約300ないし1200nm、通常4
50ないし950、好ましくは550ないし800nmの波長をもつ
光で照射される。照射期間は、活性化CCの寿命、光強度
および所望する放射強度により異なる。短命の活性化CC
では、その期間は、１秒未満で、通常約１マイク ロ秒であるが、激しいフラッシュランプまたはレーザー
が使用される場合、１マイクロ秒と同じくらい短い。長
命活性化CCでは、照射期間は、長く、激しくない定常光
源が使用できる。一般に、照射期間中の面積光強度は、
光増感剤分子の少なくとも0.1％、好ましくは少なくと
も30％で励起するのに十分であるべきで、最も好ましく
は、すべての光増感剤分子が少なくとも１回励起する。

上記接近法で生産した発光または光は、可視的、写真
的、光量測定的に、分光測定的にまたは任意の他の好便
な手段により測定し、媒体の分析物の量に関するそれら
の量を測定することができる。

ヘリウムネオンレーザーは、632.6nmで励起する安価
な光源である。この波長で光を吸収する光増感剤は、ヘ
リウムネオンレーザーの放射ラインと適合し、それ故、
本発明に特に有用である。他の光源は、例えばアルゴ
ン、YAG、He/Cdおよびルビーのような他のレーザー；ホ
トダイオード；水銀、ナトリウムおよびキセノン蒸気ラ
ンプ；タングステンおよびタングステン／ハロゲンのよ
うな白熱ランプ；およびフラッシュランプを含む。

本発明の方法および組成物の格別な適用の１つは、分
析物を測定する方法である。本方法は、分析物を含む可
能性のある媒体を、sbpメンバーの複合体が分析物の存
在に関して形成する条件に付し、sbpメンバー複合体が
形成するかどうか測定する段階を含む。本発明の粒子状
組成物は、測定の助けとなる標識として使用する。標識
試薬に関するsbpメンバー複合体は、媒体中の分析物の
存在に相関して形成する。組成物はその後、光で照射
し、化学発光化合物からの光エネルギーは、例えば目視
検査、機器または蛍光エネルギー受容体の使用によって
測定され、それらの存在または強度は、媒体中の分析物
の存在に相関する。

本発明の別の態様は、活性化時にシングレット酸素を
発生することができる光増感剤およびシングレット酸素
により活性化することができる化学発光化合物を含む固
体基質を含む組成物である。光増感剤は、化学発光化合
物に共有結合することができるが、通常結合しない。光
増感剤および化学発光化合物の１つまたは両方は、基質
に共有的に連結できるかまたは共有結合しないで基質と
アソシエートすることができる。その組成物は、１つま
たは複数の異なる化学発光化合物および１つまたは複数
の異なる光増感剤を含むことができ、光エネルギーを集
め、それを光増感剤に転移するかまたは化学発光化合物
からのエネルギーを受け入れることができる１つまたは
複数の蛍光化合物をさらに含む。異なる化学発光化合物
は、放射の衰退速度の相違、続いてシングレット酸素に
よる活性化により異なる。組成物はまた、蛍光性である
かまたは蛍光性ではなく、活性化化学発光化合物の衰退
を増大させる活性化剤を含む。組成物はさらに、組成物
が通常粒子状であるものに結合する特異的結合対（sb
p）のメンバーを含む。

本発明の別の態様は、シングレット酸素を発生するこ
とができる光増感剤およびシングレット酸素により活性
化することができる化学発光化合物を含む粒子であり、
その粒子は分析物の検出に有用な分子に結合することを
含む組成物である。分子は、特異的結合対のメンバーで
ある。

光増感剤は、化学発光化合物に共有結合することがで
きるが、標準的に、粒子中でCCと非共有的にアソシエー
トする。光増感剤および化学発光化合物は、粒子中に溶
解する。

本発明の方法および組成物は、リガンド受容体、例え
ば、抗原抗体反応、ポリヌクレオチド結合アッセイその
他のようなsbpメンバーに関するほとんどのアッセイに
適用できる。これらのアッセイは、通常競合およびサン
ドイッチを含む非均一系であるが、特にエネルギー受容
体が利用される場合、均一系であり得る。

蛍光エネルギー受容体を活性化するために活性化CCに
より生成される発光能力は、２つのsbpメンバーの結合
により制御されるか、または、活性化CCを含む基質で相
対的に高い濃度のエネルギー受容体の結果であり、その
濃度は通常少なくともマイクロモル、通常少なくともミ
リモルである。活性化が結合により制御される場合、ア
ッセイ培地中のエネルギー受容体の最初の濃度は、かな
り低く、しばしば10^-15ないし10^-6M、通常10^-12ないし1
0^-8Mである。

非均一系アッセイのやり方では、分析物を含む可能性
のある試料は、sbpメンバーであり、相補的sbpメンバー
を含む本発明の粒子状基質と結合する。基質をその後、
液相から分離して、固相または液相のいずれかを、通
常、問題の特定相を照射し、放射した光の量を測定する
ことにより、発光エネルギーの存在を試験する。別法と
しては、アッセイは、分離段階を使用しない均一系様式
で実施することができる。この条件では、別のsbpメン
バーに関連するエネルギー受容体を使用し、そのsbpメ
ンバーが分析物に相補的（サンドイッチ）または類似
（競合）するかいずれかである。エネルギー受容体は、
しばしばsbpメンバーが結合する粒子に導入される。こ
れらの物質は、一般に同時に、または完全または部分的
逐次配列性のいずれかで組合わせる。sbpメンバーの結
合は、存在する分析物の量に相関して起こり、活性化CC
に近接させ、放射したエネルギーを受け入れることがで
きるエネルギー受容体をもたらす。試行で得られた数値
と既知濃度での対照を使用して得られた数値との比較
は、存在の測定および分析物の量の測定を可能にさせ
る。

特異的結合アッセイでは、試料は必要ならば不必要な
物質を除去するために前処理する。サンドイッチ型アッ
セイの免疫学的反応は、分析物に相補的で、粒子状基質
に結合するsbpメンバー、例えば抗体、分析物にも相補
的であるような第2sbpメンバー、例えば抗体および対象
とする試料に関する。競合プロトコルの免疫学的反応
は、通常、分析物に相補的であるsbpメンバーおよび分
析物に類似し、通常分析物の誘導体であるsbpメンバー
に関する。これらのsbpの１つは、粒子状基質に関連す
る。

分析物のアッセイは、標準的に、中性pHで、一般的に
最適アッセイ感受性を提供する水性緩衝媒体で実施す
る。上記で説明したように、アッセイは、粒子状基質の
結合および未結合画分の分離（非均一系）で通常実施さ
れる。

水性媒体は、水単独であるかまたは0.01から80または
それ以上の容量％の共存溶媒を含む。媒体のpHは通常、
約４ないし13の範囲、さらに通常は約５ないし10の範
囲、好ましくは約6.5−9.5の範囲にある。pHは、通常、
結合メンバーの最適化結合および非特異的結合を最小に
し、量子効率の最大にするpH最適化間の妥協である。例
えば、活性化CCは、発光を産生するのに衰退するために
あるpH範囲を必要とする。

所望のpHを達成し、かつ測定中pHを維持するために様
々な緩衝液を使用することができる。緩衝液の例として
は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビター
ル及び類似物がある。使用した特定の緩衝液は、本発明
で限定的ではなく、個々のアッセイでは、１つまたは多
種の緩衝液が好ましい。

緩和な温度が標準的にアッセイを実施するのに使用さ
れ、測定中は、通常一定の温度、好ましくは室温が使用
される。インキュベーション温度は、標準的に約５℃か
ら99℃、通常約15℃から70℃、さらに多くの場合約20℃
から45℃である。測定中の温度は、一般的に約10℃から
70℃、さらに多くの場合約20℃から45℃、さらに多くの
場合20℃ないし25℃の範囲である。いくつかの例では、
活性化CCは、発光を産生するのに衰退するために100℃
まで加熱する必要がある。

アッセイできる分析物の濃度は、一般的に約10^-5から
10^-17M、さらに多くの場合約10^-6から10^-14Mで変化す
る。測定が定性的、半測定的、測定的であるかどうかの
考慮、個々の検出技術、および対象となる分析物の濃度
が、通常各種試薬の濃度を決める。

アッセイ培地の各種試薬の濃度は、一般的に分析物の
対象となる濃度範囲により定めるが、各試薬の最終濃度
は、通常その範囲内で測定法の感受性を最適化するため
に実験的に決定される。すなわち、重要な分析物の濃度
の変更は、正確に測定できるシグナルの差異を提供す
る。

添加の順序は幅広く変更し得るが、測定法の性質によ
り異ってある優先がある。最も簡単な添加の順序は、全
ての物質を同時に加えることである。別法としては、試
薬類を全部または一部ずつ順次に合わせることができ
る。場合によっては、インキュベーション段階は、試薬
を結合した後、一般的には約30秒から６時間、さらに多
くの場合約２分から１時間の範囲で行うことができる。

非均一系アッセイでは、全ての試薬を合わせた後、所
望するならば、それらをインキュベートする。その後、
固体および液体相を分離し、１つの相を照射し、生じる
放射した光を測定する。放射した光は、試験した試料の
分析物の量に関する。非均一系アッセイで使用した本発
明の試薬の量は、分析物の性質により異なる。

次の組成物およびアッセイは、本発明の範囲を認識
し、試験を台なしにしないで本発明を実行することを、
当業者に可能にさせることを提供し、例示的にかつ非限
定的にあげられる。分析物、光増感剤、CC、表面、粒子
および反応条件の選択は、本書の記載および続く実施例
を考慮して当業者に提案することが適切である。

次のアッセイでは、成分は、主としてpH6ないし8.5の
水性媒体で合わせる。

本発明の１つの態様では、化学発光化合物である９−
ベンザル−10−メチルアクリダンは、甲状腺刺激ホルモ
ン（TSH）の抗体に共有的に連結する。フェニル環に結
合するカルボキシル基のＮ−ヒドロキシサクシンイミジ
ルエステルと官能性化する、９−ベンザル−10−メチル
アクリダンは、抗体のアミノ基と反応する。連結基は、
カルボキサミドである。利用する光増感剤は、ローズベ
ンガルである。抗体に結合する光増感剤および化学発光
化合物は、平均面積が0.5ミクロンをもつラテックス粒
子に共有結合して、試薬１を得る。ラテックス粒子およ
びローズベンガルおよび化学発光化合物は、ラテックス
上のクロロメチル基によってお互いに共有結合する。エ
ステル連結基を提供するクロロメチル化したラテックス
へのローズベンガルの共有結合は、ジャーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー、第97巻、
第3741頁（1975年）に記載されている。TSHの第２抗体
は、マイクロタイタープレートウエル（試薬２）上に吸
収される。使用した両方の抗体は、標準ハイブリッドセ
ルライン技術により製造したモノクローナル抗体類であ
る。一方の抗体は、TSHのα−サブユニットを認識し、
他方は、TSHのβ−サブユニットを認識する。アッセイ
を実施する場合、TSHを含む可能性のある血清試料は、
患者から得られる。

50マイクロリットルの試料を、pH8.0のトリス緩衝液
で緩衝した500mlの水性媒体で、上記の試薬１と合わせ
る。試薬１の量は、約10^-8モルの抗体濃度を提供するの
に十分である。反応混合物をその後マイクロタイタープ
レートウエル（試薬２）に加え、25℃で１時間インキュ
ベートする。反応混合物をその後ウエルから除去して、
プレートをpH8.0の緩衝水性媒体で洗浄し、その後560nm
の光で30秒間照射する。照射に続いて放射した光強度を
測定し、30秒にわたって検出された総光エネルギーを、
既知濃度のTSHをもつ試料の同様の製法で得られた数値
と比較して、未知のTSHの濃度を測定する。別法として
は、インキュベーションおよびウエルからの除去に続い
て、未結合ラテックス粒子を含む反応混合物を、同様に
照射して、システムから放出した光の量を測定し、前記
のような対照数値と比較する。

別のやり方では、同じ試薬１を使用する。試薬２は、
第２抗体が非共有的に結合する炭素粒子（エネルギー受
容体）である。アッセイは、50マイクロリットルの試
料、50μｌの試薬１の懸濁液、50μｌの試薬２の懸濁液
および500μｌのpH8.0トリス緩衝液を混合し、１時間イ
ンキュベートし、光で照射することにより実施する。分
析物の存在は、炭素粒子が試料中にTSHが存在するため
に活性化化学発光化合物に接近することによって、対照
と比較する場合、分析物の存在が光放射での還元により
示される。

本発明による別の態様では、油滴（試薬３）は、ギア
エバー、前掲による、鉱物油の光増感剤、クロロフィル
の溶液から製造される。直径が0.1から２ミクロンの範
囲の油滴は、官能性化してヒト絨毛性ゴナドトロピン
（hCG）のモノクローナル抗体に連結する。クロロフィ
ルは、親油性であり、それ故、親油性油滴に不可逆的に
溶解する。９−（ジフェニルメチリンデン）−Ｎ−メチ
ルアクリダンはまた、アクリダンのフェニル基の１つに
結合するN,N−ジドデシルカルボキサミド基を含むこと
により、親油性油滴に不可逆的に溶解する。上記に引用
する第１モノクローナル抗体により認識部分と異なるhC
G分子の部分を認識する、hCGの第２モノクローナル抗体
は、マイクロタイタープレートの表面に吸着する。モノ
クローナル抗体は、標準ハイブリッドセルライン技術に
より製造される。hCGを含む可能性のある尿試料（50マ
イクロリットル）を、pH7.5の水性緩衝媒体（500ml）の
余剰の試薬３と合わせて、マイクロタイタープレートの
ウエルに置く。媒体を20分間25℃でインキュベートす
る。媒体をその後プレートから分離して、プレートをpH
8の緩衝液で洗浄する。プレートを１分間カットオフフ
ィルターをもつタングステン／ハロゲンランプを使用し
て650nm以上で照射し、放射した光を上記記載のように
測定する。光の量を、hCGを既知量含む試料を使用して
上記方法に続いて放射した量と比較し、未知試料のhCG
の量を数値を比較することにより測定する。このように
して、hCGの好便で感度のよいイムノアッセイを実施す
る。鉱物油のクロロフィルと共に、 （米国特許第5,039,818号に記載されたように製造さ
れ、これは引用して本書に包含させる）を含むことによ
り、多くの光を吸収し、クロロフィルに転移し、与えら
れたhCGの濃度の放射した光の強度は増加することがで
きる。

本発明の別の態様では、リポソーム（直径0.2ミクロ
ン）が、上記目的のために設計した商業的に入手可能な
機器を使用した0.2ミクロン細孔膜を通って、pH7.4のｎ
−アセチルチロキシンのアミド連結を通してコンジュゲ
ートした、ホスファチジルセリンｘ％、ホスファチジル
グリセロールｙ％、ホスファチジルエタノールアミンｚ
％およびホスファチジルエタノールアミンｑ％の懸濁液
の高圧押出しにより形成される。トリピロールジメチン
染料（34）は、リポソームの親油性部分に溶解する。エ
ノールエーテルである、１−［１−（10−カルボキシデ
シルオキシ）−２−ビニル］ピレン（33）およびリポソ
ームは、カルボキサミド連結基（試薬４）により水溶性
カルボジイミドにより共有的に連結する。

チロキシンのモノクローナル抗体は、マイクロタイター
プレートの表面に吸着する。試薬４は、結合蛋白質（50
マイクロリットル）からチロキシンに置換するアニリノ
ナフタレンスルホン酸を含むチロキシンを含む可能性の
ある血清試料と一緒になってpH8.0の水性緩衝アッセイ
培地（500ml）中で合わせる。アッセイ培地は、その後
マイクロタイタープレートに合わせて、室温で１時間イ
ンキュベートする。媒体をプレートから分離して、それ
をpH8の緩衝液で洗浄して、その後１分間650nmで照射し
て、生じる放射した光を発光計により測定する。得られ
た数値を、既知量のチロキシンで同様のアッセイを実施
することにより得られた数値と比較する。このようにし
て、血清試料のチロキシンの量を測定する。

別の態様では、アッセイは、赤い血液細胞、すなわち
Ａ型抗体の表面上の特定の血液型抗原の測定である。カ
ルボキシル基を含む表面および150−500nmの粒子径をも
つ商業的なラテックス粒子を利用する。ラテックス粒子
は、増感剤、すなわちクロロフィル、および化学発光化
合物36、すなわちジオキセタン と共にエチレングリコールで加熱すると、２つの化合物
は、非共有的に粒子に溶解する。粒子の懸濁液を水溶性
カルボジイミドで処理し、続いて抗体を添加、インキュ
ベーション、G100サイズ排除カラムのクロマトグラフィ
ーによる粒子の分離およびトリスpH8緩衝液での画分を
含む粒子の希釈により、粒子はＡ型抗原の抗体に共有的
に連結する。このラテックス粒子試薬は、水性媒体（50
0ml）で全血液（100ml）と合わせる。媒体は、25℃で10
分間インキュベートする。次に、細胞を簡単な遠心分離
により分離して、緩衝液で洗浄し、650nmカットオフフ
ィルターを取り付けたタングステン源で650nm以上の光
で30分間照射する。照射時間に続いて細胞から放射した
光を測定し、Ａ型抗原赤血液細胞がないと知られている
試料で得られた光の量と比較する。すなわち、閾値レベ
ルを越えた光の量は、Ａ型抗原の存在を示唆する。

別の態様では、Eu（TTA）₃35が、光増感剤および化学
発光化合物と共にビーズに溶解し、表面に結合する抗体
類は、血液型Ｂ抗原に対することを除いて、次の実施例
のラテックスビーズは、同一であるラテックスビーズと
一緒に使用する。

Ｅμ（TTA）_３は、活性化CCの発光の衰退速度を増加
し、光エネルギーを受け入れて長波長（380nmのかわり
に615nm）でそれを再放射することができる。アッセイ
は次の例のように実施する。照射後、細胞からの光放射
をモニターする。380nmの放射は、Ａ抗原の存在に関連
し、615nmの放射は、Ｂ抗原の存在に関連する。異なる
衰退速度のために、615nmの放射は、最初の20秒間モニ
ターし、380nmの放射は約１分後にモニターする。２つ
の強度は、衰退曲線の解析および／または放射波長バン
ドの１つだけを光検出計に選択的に伝達するように設計
したフィルターを使用することにより、測定することが
できる。閾値を越える各波長の光の量は、相当する血液
型抗原の存在に相関する。

DNAを含む試料の標的ヌクレオチド配列のアッセイで
は、標的配列に相補的である25塩基ヌクレオチドは、９
−フェニルメチリデンキサンタンであるCC23に関連す
る。CCおよび光増感剤であるテトラオクタデシルポルフ
ィリンは、上記記載のようなラテックス粒子に共に溶解
する。ラテックス表面上のカルボキシル基は、エチレン
グリコールのカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサク
シンイミドを活性化し、その後粒子に結合する目的でア
ミノ基に付加するオリゴヌクレオチドに共役する。ラテ
ックス粒子試薬を試料および、標的配列に異なる部位に
結合することができる第２の25塩基オリゴヌクレオチド
をそれらに結合させる磁気粒子の懸濁液と混合する。媒
体をその後75℃まで加熱し、55℃に冷却して、存在する
任意の標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリッド
形成を可能にする。磁気粒子はその後、磁石により分離
する。ペレットをその後He/Neレーザーからの115nm光で
照射して、照射の終結に続く化学発光化合物23（約350n
m）により放射した光の強度を測定する。光の強度は、
標的配列の存在に直接相関する。

本発明の別の態様では、本発明の粒子は、アッセイで
検定を提供する対照ビーズとして使用する。ラテックス
ビーズ（180nm）の１つのセットは、クロロフィルで染
色される。「受容体ビーズ」と呼ばれるラテックスビー
ズ（180nm）の別のセットは、２秒の半減期で衰退する
化学発光受容体である1,2−ジフェニル−３−ｐ−ジメ
チルアミノフェニル−Δ^5'6−モルホリンを含み、製造
される。クロロフィル染色ビーズは、抗蛍光抗体で被覆
され、受容体ビーズはそれらの表面に結合するアビジン
をもつ。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を含む可能
性のある血清試料50μｌを、蛍光で標識した抗α鎖抗体
およびビオチンで標識した抗hCGβ鎖抗体を含む溶液200
μｌを合わせる。混合物を10分間インキュベートした
後、各上記ビーズ２μｇおよび、クロロフィルおよび１
−フェニル−２−ｐ−ジメチルアミノフェニル−5,6−
ジヒドロ−1,4−ジオキセン、２分の半減期で衰退する
化学発光化合物両方を含む180nm対照ビーズ（本発明の
粒子）１μｇを含む懸濁液の混合物200μｌに加える。
混合物を10分間インキュベートして、その後650nm長パ
スカットオフフィルターで装備したタングステン−ハロ
ゲンランプで１秒間照射する。次の10秒間試料からの放
射した光（S_T）を測定して、続いて別の10秒間隔にわた
る放射した光（S_C）を測定する。第２間隔の間に放射し
た光は、全て対照ビーズからである。光強度、光電管感
受性、照度時間変化、温度等のような計量値を訂正した
シグナルＢはその後、式:B＝S_T/CS_C−１（分析物が存在
しない場合はＣ＝S_T/S_C）から計測される。所望する場
合、１秒照射および10秒測定配列は、S_Cの最終10秒測定
より前に数回繰り返すことができる。この場合、S_Tは、
最終数値を除く各数値の合計であり、Ｂは同じ方法で計
測する。Ｂはその後、既知量のhCGを含む１つまたはそ
れ以上の検定で測定する。最後に、シグナルＢを検定か
らのシグナルＢと比較して、試料のhCGの濃度を測定す
る。

本発明は、さらに化学発光化合物および光増感剤に関
連する20ナノメーターないし20ミクロンの懸濁できる粒
子を含む組成物を含む。化学発光化合物および光増感剤
は、粒子基質に共有的に結合するかまたは粒子基質に非
共有的に結合するか溶解する。粒子は、高分子であるか
または油滴またはリポソームのような小胞であるのが好
ましい。粒子がリポソームである場合、化学発光化合物
および光増感剤は、脂質二重層に関連するかまたはリポ
ソームの水性内部で溶解する。アッセイの使用では、sb
pメンバーは、粒子に結合する。好ましくは、sbp結合粒
子は、平均直径が100ないし1000nmである。本発明の別
の態様は、分析物を含む可能性のある試料で分析物の存
在または量を測定するための本発明のアッセイ方法を好
便に実施するのに有用なキットに関する。主題の発明の
多能性を増大させるために、試薬の割合が方法およびア
ッセイの実質的な最適化を提供するように、試薬が同じ
または分離した容器の組合わせパッケージで提供するこ
とができる。試薬は、各々分離した容器であるかまた
は、様々な試薬は、試薬の交差反応性および安定性によ
り異なる１つまたはそれ以上の容器で合わせることがで
きる。キットは、化学発光化合物および光増感剤と関連
する懸濁できる粒子であり、その粒子は、それに結合で
きるsbpメンバーをもつことを含む組成物を含む。光増
感剤は、sbpメンバーが結合する粒子に関することがで
きる。キットはさらに、sbpメンバーに結合するエネル
ギー受容体、付加的なsbpメンバー、補助試薬その他の
ようなアッセイを実施する他の個々にパッケージした試
薬を含む。

実施例 本発明は、次に示す実施例によりさらに説明する。本
書に列挙する部分およびパーセントは、異なる記載がな
い限り重量である。温度は摂氏（℃）である。

実施例１ 光増感剤および化学発光化合物を含有するポリスチレン
粒子の製造 使用した粒子は、0.716μカルボキシレート修飾ラテ
ックス（CML）（デューク・サイエンティフィック、ロ
ット番号7638）であった。

光増感剤染料は、ベンジルアルコール中のテトラnC₁₀
フタロシアニン（nC₁₀PC）（ウルトラ・ダイアグノステ
ィクス、ロット番号GR11−82）2.5mg/mlであった。分子
量1180（2.1mM）。

化学発光化合物は、ベンジルアルコール中のｐ−（N,
N−ジオクタデシルカルボキサミドメトキシ）ベンジル
−９−メチルアクリダン（C₁₈ベンザルアクリダン）10m
Mであり、次のように製造した：無水テトラヒドロフラ
ン（THF）の10−ジメトキシホスフィニル−９−メチル
アクリダン（モナトシ・ケミストリー、第114巻、第３
頁（1988年））（分子量303.27、0.100g、3.3ミリモ
ル）に、アルゴン下−78℃（アセトン／乾燥氷浴）でヘ
キサン中の1.6M ｎ−ブチルリチウム溶液0.413mlを加
えた。ｎ−ブチルリチウムの添加時に、溶液は黄色を示
す。THFの上記アミド溶液が、ｎ−ブチルリチウムの添
加後20分で加えられた。反応溶液は、一晩中室温に保温
した。

次の日、生成物をTLC（シリカゲル、3:7酢酸エチル／
ヘキサン）により単離した。単離した生成物を質量分析
およびNMRにより分析して、暗所に貯蔵した。

粒子製造のプロトコル：エチレングリコール0.8ml、
ベンジルアルコール0.1ml、光増感剤染料（nC₁₀PC）そ
れぞれ１、２、４、または８μｌ（それぞれ粒子製造
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）およびC₁₈ベンザルアクリダン10μｌ
を共に混合して、混合物を１分間100−110℃に加熱し
た。その後、0.716μｌのCML0.1mlを混合物に加え、そ
れを100−110℃で５分間加熱した。混合物を室温まで冷
却した。エタノール等量を加え、混合物を30分間15Kで
遠心分離した。遠心分離したものをデカントし、粒子を
エタノール2mlを加え、上記記載のように遠心分離し
た。洗浄および遠心分離段階を水を使用して繰り返し
た。粒子を水に再懸濁させて、最終容量が約1mlで1.0％
固体、すなわち、1mlあたり4.95×10¹⁰粒子であった。

粒子により放射した光をターナーTD−20e発光計を使
用して記録した。衰退時間は０で、インテグラルは20秒
であった。しばしば、余分に20秒間の数値を読み取り、
粒子の衰退半減期を測定した。粒子をハロゲンランプお
よび650nmカットオフフィルターを使用して60分間照射
した。

典型的に、上記からの粒子懸濁液10μｌをリン酸緩衝
生理食塩水（PBS）で1mlまで希釈した。希釈した粒子10
0μｌを放射した相対光ユニット（RLU）を測定するのに
使用した。結果は、次の第１表に要約される。

第１表 粒子 RLU（20秒インテグラル） Ａ 2611、2104、1778、1552 Ｂ 3260、2600、2191、1923、1710 Ｃ 3725、3032、2587、2272、2034 Ｄ 3896、3210、2739、2403、2147 界面活性剤の効果：粒子10μｌを、上記記載のよう
に、PBSで希釈するかわりに１％トリトンＸ−100（製造
Ｆ）1mlに希釈した。結果は、次の第２表で要約され
る。

第２表 粒子 RLU（20秒インテグラル） Ａ 2929、2323、1951、1699、1493 界面活性剤の効果はほとんどないことが観測された。
このことから、光増感剤およびCCは、ポリスチレン粒子
に深くインターカレートするという結論が引き出され
る。

実施例２ 光増感剤、化学発光化合物およびエネルギー受容体を含
有するポリスチレン粒子の製造 試行A.試薬：（１）0.175μCML（10％水性懸濁液）1m
l、（２）反応媒体（X₂がＮ（CH₃）_２である10mMジオキ
セン10、20mMユウロピウムテノイルトリフルオロ酢酸
（EuTTA）、60mMトリオクチルホスフィン酸化物（TOP
O）を含むエトキシエタノール1ml）および（３）光増感
剤貯蔵溶液（ベンジルアルコール2.5mg/ml（分子量118
0）、およそ2.1mMの分離溶液から製造したテトラnC₁₀フ
タロシアニン（実施例１参照）（nC₁₀PC）） CML粒子1mlをエトキシエタノール1mlと合わせ、油浴
で約100℃に温めた。激しく撹拌しながら、上記反応媒
体1mlを粒子に加えた。この直後にnC₁₀PC（10、25また
は50μｌ）を加えた。混合物を水の沸点よりわずかに低
く保つよう努力したが、時々沸騰が観測された。

試行B.上記Ａと同様の方法は、クロロフィル（クロル
ａ）が光増感剤貯蔵溶液でnC₁₀PCのかわりの光増感剤で
ある粒子を製造するのに使用した。光増感剤貯蔵溶液の
クロルａの濃度はベンジルアルコール中5mMであった。1
0、25および50μｌのクロルａを使用した。

10分間の加熱に続いて、混合物を油浴から除去し、室
温まで冷却した。混合物をその後エタノール6mlで希釈
し、30分間15Kで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレッ
トを50％エタノール溶液で音波処理することにより再懸
濁した。遠心分離を繰り返し、続いて50％エタノールで
別に洗浄した。遠心分離の最終ペレットを10％エタノー
ル溶液で再懸濁させて、１重量％、すなわち10mg/ml（1
mlあたり3.35×10¹²粒子）の粒子濃度を得た。

上記で製造した粒子の化学発光を調査した。粒子（試
行Ａまたは試行Ｂ）を0.1Mトリス0.3MNaCl、25mM EDT
A、1mg/mlBSApH8.2の10μg/mlで希釈した。希釈した混
合物0.1mlを610nmのロングパスフィルターを装備したハ
ロゲンランプで60秒間照射した。化学発光の最初の20秒
インテグラルをターナーTD20e発光計で記録した。結果
は、第３表で要約される。

第３表 試行Ａ（nC₁₀PC） RLU 10μｌ 522 25μｌ 675 50μｌ 597 試行Ｂ（クロロフィルａ） RLU 10μｌ 386 25μｌ 207 50μｌ 130 粒子の検出能力:1μｇ＝3.35×10⁸粒子または5.56×1
0^-16モル。検出能力を1RLUと定義し、その後上記粒子
（試行Ａ）の10^-18モルが検出できる。これは、１ミク
ロン粒子よりわずか少ない。

およそ1mg/mlでの粒子（試行Ａ）懸濁液をハロゲンラ
ンプおよび610nmフィルターで30秒間照射した。粒子を
その後蛍光計に置き、放射した波長を走査した。わずか
なジオキサン10の放射が約420nmで観測されるが、放射
した光の大部分は、約613nmでのEuTTAからのものであっ
た。

同じ実験が試行Ｂからの粒子で実施され、同様な結果
が得られた。

実施例３ 甲状腺刺激ホルモン（TSH）のアッセイ 略語： Ab₁−ビオチン−TSHのビオチルニル化抗体 Ab₂−フルオレセイン（AB₂−Ｆ）−フルオレセインがコ
ンジュゲートするTSHのモノクローナル抗体 Ab_FまたはIG（Ab_F）−上記で引用したような標準ハイブ
リッド細胞技術により製造したセルライン3G1からのフ
ルオレセインの抗体 BSA−ウシ血清アルブミン、シグマ・ケミカル・カンパ
ニー、セント・ルイス、ミズーリ、カタログ番号Ａ−78
88 Ｄ−H₂O−脱イオン水 EDAC−１−エチル−３−（３−ジメメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩、シグマ・ケミカル・カンパ
ニー GB−アビジン−アビジンで被覆したガラスビーズ（直径
0.5cm）、ニコルズ・インスティテュート・ダイアグノ
スティクス、サン・ジュアン・カピストラノ、カリフォ
ルニア Napi−リン酸ナトリウム PBS−リン酸緩衝生理食塩水、0.02M NaPi、0.15M NaC
l、pH7.3 RLU−相対光ユニット SATA−Ｓ−アセチルチオグリコール酸−NHSエステル、
シグマ・ケミカル・カンパニー スルフォ−NHS−スルフォ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミド、ピアース・ケミカル・カンパニー βTSHおよびフルオレセイン（Ab₂−Ｆ）の抗体のコンジ
ュゲートの製造： A.物質： ６−カルボキシフルオレセイン（コダック、ロチェス
ター、ニューヨーク）;4,9−ジオサ−1,12−ドデカンジ
アミン、アルドリッチ・ケミカル・コーポレイション、
ミルウォーキー、ウイスコンシン）；酸化カルシウムか
ら蒸留した乾燥DMF;Ag−MP−１（C1^-）陰イオン交換樹
脂、バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモンド、カリ
フォルニア）；ケラーおよびミリシュタイン、ネイチャ
ー、第265巻、第495−497号（1975年）により記載され
た方法と同様の方法を使用して標準ハイブリッド細胞培
養技術により製造したハイブリッドセルライン9G3から
のTSH（Ab₂）のモノクローナル抗体。

B.フルオレセインアミン塩酸塩（Ｆ−LC−アミン）： ６−カルボキシフルオレセイン（10g、26.6モル）を
乾燥ジメチルホルムアミド（DMF）（25ml）に溶解し
た。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（NHS）（シグマ・
ケミカル・カンパニー）（3.22g、28ミリモル）を、固
体としてDMF溶液に加え、溶解させた。混合物をその後
氷浴で冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ア
ルドリッチ・ケミカル・コーポレイション）（5.8g、28
ミリモル）を乾燥DMF（10ml）に溶解して、直ちに全部
を冷DMF溶液に加えた。混合物を30分間氷浴の温度で撹
拌し、室温にもどした。反応の経過を薄層クロマトグラ
フィー（TLC）（１％酢酸を含む10％メタノール−CH₂Cl
₂）で追った。３時間後、フルオレセインNHSエステルの
形成が完全であった。

4,9−ジオキサ−1,12−ドデカンジアミン（25.5g、12
5ミリモル）を乾燥DMF（10ml）で希釈した。フルオレセ
インNHSエステル反応混合物をアルゴン気流下氷で冷却
し、ジアミン溶液を５分間にわたって滴下して加えた。
冷却浴を除去し、室温で撹拌を続けた。反応の経過を上
記系を使用したtlcで追った。反応が完全であると判断
したとき、混合物を水（100ml）で希釈し、氷で冷却し
て、ジシクロヘキシル尿素を沈殿させて、濾過により除
去した。

濾液をAG−MP−１（C1−）陰イオン交換樹脂でスラリ
ーし、クロマトグラフィーカラムに注いだ。遊離アミン
がニンヒドリンによってこれ以上検出されなくなるま
で、樹脂を50％水性メタノールで洗浄した。樹脂をその
後50％水性メタノールで0.1N塩酸で溶出した。フルオレ
セインアミン塩酸塩を最初に溶出し、続いて６−カルボ
キシフルオレセインを溶出した。純画分を貯蔵し、回転
エバポレーター（ロートバップ）で乾燥させた。高圧で
乾燥後、純フルオレセインアミン塩酸塩3.4gを回収し
た。

C. Ｆ−LC−ジクリコレート（Ｆ−LC₁₈−COOH）の製
造： 上記Ｂで記載したように製造したＦ−LCアミン（500m
g、0.87ミリモル）をDMF6mlに溶解した。トリエチルア
ミン（TEA）（121μ、0.87ミリモル）をDMF溶液に加え
た。ジグリコール無水物（アルドリッチ・ケミカル・コ
ーポレイション）（101mg、0.87ミリモル）をDMF1mlに
溶解して、混合物に加えた。さらにジグリコール無水物
25mgを余分に、シリカゲルTLC、メタノール−ジクロロ
メタン−酢酸（20:79:1）により判断して、反応が完了
となるまで加えた。

溶媒をロートバップで除去して、残留物をメタノール
に溶解した。メタノール溶液をポリスチレンバイオビー
ズSM−２（バイオラド・ラボラトリーズ）でスラリー化
した。ビーズを水で洗浄して、ジグリコール酸およびTE
Aを除去した。生成物をその後大量のメタノールでバイ
オビーズから取り除いた。ロートバップでのメタノール
の除去後、生成物560mgを回収した。この物質は、さら
に精製またはキャラクタリゼイションせずに使用した。

D. Ｆ−LC₁₉−NHSエステルの製造 Ｆ−LC₁₉−NHSエステルを、Ｆ−LC₁₈−COOH（上記Ｃ
に記載したように製造した無水DMF300μ）と、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（DCC）（無水DMF100μ）12mg
との混合により製造した。反応混合物を、堅く密閉した
バイアルで、５時間室温で静かに撹拌した。その後、反
応混合物をガラスウールに通して濾過して、シクロヘキ
シル尿素（本反応の副産物）を除去した。濾過した反応
混合物を、（未反応DCCを除去するために）ヘキサン2ml
で抽出した。Ｆ−LC₁₉−NHSの形成は、ジクロロメタ
ン：メタノール（80:20）溶媒系を使用したTLCで確証し
た。

E. Ab₂−Ｆ Ab₂IgGは、標準方法により、免疫したプロテインＡ
（リプリゲン・インコーポレイテッド、ケンブリッジ、
マサチュセッツ）によるAb₂の精製により製造した。Ab₂
−Ｆは、室温で２時間、0.05MNaPi、0.1MNaCl/pH7.6の
5.6mg/mlAb₂IgG1mlと、Ｆ−LC₁₉−NHS（IgG:F−LC₁₉−N
HS＝1:20）を含む無水DMF20μとの反応により製造し
た。その後、反応混合物を、0.02MNapi、0.15MNaCl、pH
7.4で平衡させたセファデックスＧ−25（1.5×20cm）カ
ラムにより精製した。ハプテン数は、標準方法により測
定し、2.9（IgGあたり2.9フルオレセイン分子）である
と見出した。最終生成物を分割して冷凍保存した。

TSHのビオチニル化抗体（Ab₁−ビオチン）の製造 ベータ−TSHの抗体（Ab₁）は、ビイオスパシフィッ
ク、405ハーレン・ストリート、エマリービル、カリフ
ォルニアからのハイブリッドセルライン2101からのもの
であった。TSHの抗体（Ab₁、0.05MNaPi、0.05MNaCl/pH
7.8中約２−2.5mg/ml）およびビオチン−LC₇−NHS（ピ
アース・ケミカル・コーポレイション、ロックフォー
ド、イリノイ）（DMFで最初溶解させて、反応として少
量使用する）を共に混合して、４℃で３時間インキュベ
ートした。反応混合物では、反応物のモル比は、Ab₁:ビ
オチン−LC₇−NHS＝1:25であった。未結合ビオチンをセ
ファデックス（商標）Ｇ−25カラムにより除去した。最
終コンジュゲートを0.05MNaPi、0.001％チメロサール/p
H＝7.4で、４℃または冷凍貯蔵した。

粒子で被覆した抗フルオレセイン抗体の製造： 本実施例で使用した粒子は、シングレット酸素受容体
染料C₁₈ベンザルアクリダン、および実施例１で記載し
たようにして製造したシングレット発生剤または増感染
料（nC₁₀PC）をもつ、0.04μカルボキシル化ポリスチレ
ンビーズであった。

EDAC/スルフォ−NHSコンジュゲーション化学は、Ab_F
をこれらのポリスチレンビーズ（Ab_F−ビーズ）に結合
させるのに使用される。典型的には、実施例１からのカ
ルボキシル化したポリスチレンビーズ6mg/ml、およびス
ルフォ−NHS（pH5.5に調整）11mg/mlを含む、0.02MNaPi
10mlを、新しく製造したＤ−H₂O中EDAC200mg/ml1mlと混
合した。室温（暗所）で25分間インキョベートした後、
ビーズを遠心分離にかけて、余剰EDACを除去した（EDAC
はこれらのビーズの微量凝集を引き起こすため、15000r
pmでSA−600ローターを使用したソルバル遠心分離機を
用いる通常の遠心分離により、それらをペレットにする
ことができる）。ペレットにしたビーズを、音波処理に
より0.005MNapi/5.8の3mlで再懸濁し、その後0.02Mボラ
ックス（シグマ・ケミカル・カンパニー）15ml、0.08MN
aCl、3G1IgG（Ab_F）の2mg/ml、およびBSA/pH8.9の8mg/m
lを含む撹拌した蛋白質溶液中に移した。混合物を４℃
で一晩静かに（撹拌しないで）混合した。ビーズ上の残
留する反応基（もしあれば）は、pH8.9、４℃で60分間
0.083MグリシンおよびBSA15mg/mlで処理して遮蔽した。
未結合蛋白質をpH7.6で0.05MNaPi、0.15MNaClで連続し
て洗浄することにより除去した。最終ペレットを洗浄す
る緩衝液で再懸濁して、音波処理して、４℃で貯蔵し
た。これらのビーズの最終サイズは140nmであった。

TSHアッセイ： TSHアッセイは、TSH遊離血清（０、0.1、１、10およ
び100ng/ml）のTSH検定200μｌを、12×75nmグラス試験
管に移し、続いてアッセイ緩衝液（0.05MNapi、0.15MNa
Cl、BSA/pH7.6 4mg/ml）のAb₁−ビオチン２μg/mlおよ
びAb₂−フルオレセイン（9G3）１μg/mlにより実施し
た。この混合物を室温で１時間インキュベートした。こ
の混合物に、1MNa₃クエン酸/pH7.17の100μｌを加え、
続いてアッセイ緩衝液の1.0mg/mlAb_F−ビーズ1.0mg/ml
の100μｌを加えた。形成した免疫複合体を、アビジン
で被覆した0.5cmガラスビーズにより未結合画分から分
離した（使用した試験管あたり１グラスビーズ）。アッ
セイ混合物を室温で2.5時間ガラスビーズでインキュベ
ートした（暗所で撹拌）。インキュベーション後、各ガ
ラスビーズをPBS1ml、１％トリトンＸ−100、0.5MNaCl/
pH7.2で４回洗浄した。最終的に、各ガラスビーズを１
分間照射して、放射した光をターナー・デザインズ、モ
デル20eの発光計を使用して20秒ごと計測した。

第４表に要約した結果は、TSHに関連した特異的シグ
ナルが発生していたことを示す（検定中0.1−0.5ng/mlT
SHの感度） 第４表 TSHアッセイ TSH（ng/ml） RLU 0 350 0.1 550 1 800 10 1400 100 2200 以上の発明は、明瞭化ならびに理解の目的で、例示的
に、かつ実施例としてかなり詳細に記載されているが、
添付する請求の範囲内で変更または修飾して実施できる
ことは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キラコシアン、レイア アメリカ合衆国95129カリフォルニア州、 サン・ホゼ、ウィリアムズ・ロード4851 番 (72)発明者 ウェグナー、ダニエル・ビー アメリカ合衆国94087カリフォルニア州、 サニーベイル、ティコンデロガ951番 (72)発明者 ウルマン、エドウィン・エフ アメリカ合衆国94025カリフォルニア州、 アサートン、セルビー・レーン135番 (56)参考文献 特公 平３−17480（ＪＰ，Ｂ２) 特表 平３−505373（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】物質を、（ａ）照射時にシングレット酸素
   を発生することができる光増感剤、および（ｂ）シング
   レット酸素により活性化することができる化学発光化合
   物と合わせることを含んでなり、ただし、該光増感剤お
   よび化学発光化合物は、非粒子状固体基質または粒子状
   基質中に含められているものである、該物質を検出する
   方法。
2. 【請求項２】該方法が、さらに、 （ａ）上記物質を波長200−1000nmの光で照射し、 および （ｂ）上記化学発光化合物により放射した光を検出する ことを含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】（ａ）照射時にシングレット酸素を発生す
   ることができる光増感剤、および（ｂ）シングレット酸
   素により活性化することができる化学発光化合物、を含
   めた固体または粒子状基質を含んでなる組成物を、照射
   する段階を含む、遅延した発光を発生させる方法。
4. 【請求項４】（１）分析物を含む可能性のある媒体、
   （２）活性化時にシングレット酸素を発生することがで
   きる光増感剤、および該光増感剤の活性化時にシングレ
   ット酸素を発生して化学発光化合物を活性化するような
   シングレット酸素により活性化することができる化学発
   光化合物、を有する粒子とアソシエートするする第１特
   異的結合対（sbp）メンバー、ただし、上記第1sbpメン
   バーは、上記分析物または第2sbpメンバーに結合して、
   上記分析物の存在に相関する複合体を形成するものであ
   る、を含む標識試薬との組み合わせを提供し、 上記光増感剤を活性化し、さらに 上記化学発光化合物により発生する、ただし、その量が
   上記媒体中の分析物の量に相関するものである、発光量
   を検出することを含んでなる、分析物を測定する方法。
5. 【請求項５】該光増感剤が、メチレンブルー、ローズベ
   ンガル、ポルフィリン、クロロフィルおよびフタロシア
   ニン類からなる群から選択される染料である、請求の範
   囲第４項記載の方法。
6. 【請求項６】該化学発光化合物が、オレフィン基、およ
   び該オレフィンとのコンジュゲーションにおいて電子供
   与する１つまたはそれ以上の置換基を含有する、請求の
   範囲第４項記載の方法。
7. 【請求項７】該化学発光化合物が、９−アルキリデン−
   Ｎ−メチルアクリダン、エノールエーテル類およびエナ
   ミン類からなる群から選択される、請求の範囲第４項記
   載の方法。
8. 【請求項８】活性化時にシングレット酸素を発生するこ
   とができる光増感剤、およびシングレット酸素により活
   性化することができる化学発光化合物を含ませた固体基
   質を含んでなる組成物。
9. 【請求項９】活性化時にシングレット酸素を発生するこ
   とができる光増感剤、およびシングレット酸素により活
   性化することができる化学発光化合物を含ませた油滴、
   リポソームおよび乳化剤からなる群から選択される流体
   粒子を含んでなる組成物。
10. 【請求項１０】（ａ）請求の範囲第８項の組成物、およ
    び （ｂ）特異的結合対のメンバー、 または、 （ａ）請求の範囲第９項の組成物、および （ｂ）特異的結合対のメンバー を含んでなるキット。
11. 【請求項１１】（ａ）照射時に光を放射することができ
    る発光組成物および請求の範囲第８項の組成物、ただ
    し、該組成物の１つは、光によって活性化する場合に、
    他方の衰退時間より実質的に長い光放射の衰退時間を有
    するものである、を媒体中で合わせ、 （ｂ）該発光組成物および請求の範囲第８項の組成物を
    活性化させるために該媒体を照射し、 （ｃ）短い方の衰退時間を有する活性化組成物の衰退中
    に放射した光の強度を測定し、 （ｄ）段階（ｃ）の上記測定後および短い方の衰退時間
    を有する活性化組成物の少なくとも部分的な衰退の後の
    放射光強度を測定し、さらに （ｅ）短い方の衰退時間を有する活性化組成物の衰退中
    に放射した光の強度と、内部検定を提供するための段階
    （ｄ）で放射した光強度とを比較する、 各段階を含んでなる、発光組成物により放射した光強度
    を検定する方法。