JP4576752B2 - 化学発光増強剤 - Google Patents
化学発光増強剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4576752B2 JP4576752B2 JP2001160743A JP2001160743A JP4576752B2 JP 4576752 B2 JP4576752 B2 JP 4576752B2 JP 2001160743 A JP2001160743 A JP 2001160743A JP 2001160743 A JP2001160743 A JP 2001160743A JP 4576752 B2 JP4576752 B2 JP 4576752B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- salt
- chemiluminescence
- acid
- polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光基質が酵素の作用を受けて化学発光する際に用いられる化学発光増強剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
1,2-ジオキセタン類のような化学発光基質にアルカリフォスファターゼのような酵素を作用させて化学発光を起こさせる化学発光反応を利用した化学発光測定は、検体中の測定対象物の存在又は濃度を迅速、高感度に測定することができ、HIV、HCV等のウイルス、その他生体内微量成分などを測定するために広く用いられている。
【0003】
上記化学発光反応における化学発光を増強する化学発光増強剤として、ポリ(ビニルベンジル(ベンジルジメチルアンモニウム)クロライド(BDMQ)やポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロライド(TBQ)など4級アンモニウム基を含んだ水溶性ポリマーが知られている(特開平3−53897号公報及び特開平4−124185号公報)。これらの化学発光増強剤を用いることにより、化学発光強度は約20〜30倍に増強される。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
公知の化学発光増強剤は有効であるが、化学発光増強効果がより優れた化学発光増強剤が提供されれば、同じ化学発光強度を得るために必要な化学発光基質や被検材料、他の構成試薬等の使用量を減らすことができ、又は測定に必要な時間を短縮できるため有利であることは言うまでもない。
【0005】
従って、本発明の目的は、公知の化学発光増強剤よりも化学発光増強効果が優れた新規な化学発光増強剤を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ポリカルボン酸又はその塩で処理した陰イオン交換基含有物質が高い化学発光増強効果を発揮することを見出し本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、ポリカルボン酸又はその塩で処理した陰イオン交換基含有物質から成る化学発光増強剤であって、前記陰イオン交換基含有物質が、3級若しくは4級アンモニウム基を持つポリマー、3級若しくは4級アンモニウム基をもつラテックス粒子、3級若しくは4級アンモニウム基をもつリポソーム、カチオン性のアミノ酸ポリマー又はカチオン性のアミノ酸共重合体である化学発光増強剤を提供する。
【0008】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の化学発光増強剤は、陰イオン交換基含有物質をポリカルボン酸又はその塩で処理したものである。ここで、「ポリカルボン酸」とは、一分子中に複数個のカルボキシル基を有する化合物を意味する。ポリカルボン酸の好ましい例として、不飽和カルボン酸若しくはその塩の重合体又は不飽和カルボン酸若しくはその塩を含む共重合体、炭素数2〜20のアルカン又はヒドロキシアルカンに2個以上のカルボキシル基又はその塩が置換した脂肪族ポリカルボン酸を挙げることができる。
【0009】
ここで、不飽和カルボン酸の好ましい例としては、ビニル基を有するビニルカルボン酸を挙げることができる。ビニルカルボン酸とは、ビニル基を有するカルボン酸を意味し、好ましい例として、下記一般式[I]で表されるものを挙げることができ、特に好ましい例としてアクリル酸及びメタクリル酸を挙げることができる。
【0010】
【化1】
(ただし、式[I]中、Rは水素又は炭素数1〜6のアルキル基)
【0011】
また、不飽和カルボン酸の好ましい例として、炭素数2〜20のアルケンにカルボキシル基が置換した不飽和脂肪族ポリカルボン酸も挙げることができる。好ましい不飽和脂肪族ポリカルボン酸の例としてマレイン酸を挙げることができる。
【0012】
上記不飽和カルボン酸又はその塩は、単独で重合し、又はこれらを組み合わせて共重合し、本発明で用いられるポリカルボン酸又はその塩とすることができる。あるいは、不飽和カルボン酸又はその塩の1種又は2種以上を、他の共重合可能なモノマーと共重合させて本発明で用いられるポリカルボン酸又はその塩とすることができる。この場合、本発明において必要なことは、ポリカルボン酸又はその塩が2個以上のカルボキシル基又はその塩を有するということであるから、他の共重合可能なモノマーは何ら限定されるものではなく、例えばスチレン、ビニルピロリドン、上記一般式[I]で示されるビニルカルボン酸のアルキルエステル(アルキル部分の炭素数は好ましくは1〜6)のようなビニル化合物を挙げることができる。
【0013】
不飽和カルボン酸又はその塩の重合体又は共重合体をポリカルボン酸として用いる場合、該重合体又は共重合体の平均分子量(数平均分子量)は、特に限定されないが200〜200万程度が好ましく、さらには5000〜20万程度が好ましい。また、1分子中のカルボキシル基又はその塩の数は、特に限定されないが2〜2万個程度が好ましく、さらには50〜1万個程度が好ましい。
【0014】
また、ポリカルボン酸の好ましい例としては、例えばクエン酸のような、炭素数2〜20のアルカン又はヒドロキシアルカンに2個以上のカルボキシル基又はその塩が置換した脂肪族ポリカルボン酸を挙げることができる。
【0015】
また、本発明において用いることができるポリカルボン酸の塩の好ましい例としては、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩を挙げることができる。
【0016】
以上述べたポリカルボン酸の好ましい具体例として、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ナトリウム、ポリ(アクリル酸−マレイン酸)、ポリ(1−ビニルピロリドン−アクリル酸)、ポリ(メチルビニル−マレイン酸)を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【0017】
本発明の化学発光増強剤に用いられる陰イオン交換基含有物質は、3級又は4級アンモニウム基を持つポリマー、3級又は4級アンモニウム基をもつラテックス粒子、3級又は4級アンモニウム基をもつリポソーム、カチオン性のアミノ酸ポリマー、カチオン性のアミノ酸共重合体である。前記3級又は4級アンモニウム基を持つポリマーとしては、例えば3級又は4級アンモニウム基を持つ陰イオン交換体を挙げることができ、特に限定されないが、4級アンモニウム基を持つものが好ましい。4級アンモニウム基を持つ陰イオン交換体は周知であり、種々のものが市販されている。本発明では、これらの市販の陰イオン交換体を好ましく採用することができる。3級アンモニウム基としては、例えばジエチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基等から形成されたアンモニウム基を挙げることができる。4級アンモニウム基としては、例えばジエチル−(2−ヒドロキシプロピル)アミノエチル基、トリエチルアミノエチル基、トリメチルアミノエチル基等を挙げることができる。また、前記ポリマーとしては、例えばポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、アガロースゲル、架橋デキストランゲル、セルロース等を挙げることができる。更に、前記アミノ酸ポリマーとしては、例えばポリリジン、ポリアルギニン等を挙げることができる。前記アミノ酸共重合体としては、前記リジン、アルギニン等のアミノ酸の共重合体を挙げることができる。
【0018】
なお、陰イオン交換体の形状は、特に限定されないが、ポリカルボン酸と陰イオン交換体との接触を十分に行わせるために、陰イオン交換体は粉末状あるいは乳濁液状であることが特に好ましい。
【0019】
好ましい陰イオン交換体の例として、トリメチルベンジルアンモニウム−ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)(商品名「AG1 Resins」、Bio-Rad社より市販)、ジメチルエタノールベンジルアンモニウムーポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)商品名「AG2 Resins」、Bio-Rad社より市販)、トリメチルアンモニウム基を持つアガロースゲル(商品名「Qセファロース」、Pharmacia Biotech社より市販)、ジエチル(2−ヒドロキシプロピル)アミノエチル基を持つ架橋デキストランゲル(商品名「QAEセファデックス」、Pharmacia Biotech社より市販)、及びトリエチルアミノエチル基を持つセルロース(TEAEセルロース)等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【0020】
本発明の化学発光増強剤としては、例えば上記陰イオン交換体を上記ポリカルボン酸又はその塩で処理したものである。ここで、「処理」とは、ポリカルボン酸又はその塩の分子を陰イオン交換体分子と接触させることを意味し、これはポリカルボン酸若しくはその塩の溶液又は液状のポリカルボン酸若しくはその塩を陰イオン交換体と接触させることにより容易に行うことができる。ポリカルボン酸若しくはその塩の溶液又は液状のポリカルボン酸若しくはその塩と陰イオン交換体とを接触させる場合、これは好ましくは、陰イオン交換体を該溶液又は液体中に浸漬し、該混合物を室温下で30分以上、好ましくは1時間ないし5時間程度、静置又は撹拌することにより行うことができる。あるいは、ポリカルボン酸又はその塩が、不飽和ポリカルボン酸又はその塩の重合体又は共重合体である場合には、陰イオン交換体の存在下において該重合又は共重合を行うことによっても、生成された不飽和ポリカルボン酸又はその塩の重合体又は共重合体を陰イオン交換体と接触させることができ、このような方法によっても上記「処理」を行うことができる。このような方法で得られる、ポリカルボン酸処理陰イオン交換体も市販されており、このような市販品も好ましく用いることができる。例えば、トリメチルベンジルアンモニウム−ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)でアクリル酸を重合させたイオン遅延樹脂(商品名「AG11 Resins」、Bio-Rad社より市販)を好ましく用いることができる。
【0021】
上記処理により、ポリカルボン酸又はその塩のカルボキシル基又はその塩と、陰イオン交換体の3級又は4級アンモニウム基とがイオン結合してイオン対を形成すると推測され、このイオン対が化学発光増強効果を発揮するものと推測される。
【0022】
上記化学発光増強剤は、単独でも組み合わせても用いることができる。
【0023】
本発明の化学発光増強剤が適用される化学発光反応自体は公知である。化学発光反応を行うための酵素の好ましい例としては、酸フォスファターゼ、アルカリフォスファターゼ及びガラクトシダーゼを挙げることができる。これらの酵素は動物又は植物から公知の方法で精製することができ、また市販もされている。市販品も好ましく用いることができる。これらの酵素は遊離の状態でも、抗原、抗体又はハプテン等の他の物質に結合された状態にあってもよい。
【0024】
化学発光反応の基質としては、従来の化学発光測定に用いられているいずれの化学発光基質をも用いることができる。好ましい一群の化学発光基質として、下記一般式[II]で表される1,2-ジオキセタン誘導体を挙げることができる。
【0025】
【化2】
【0026】
(ただし、式[II]中、R1は水素原子又はハロゲン原子;R2は炭素数1〜6のアルキル基又は炭素数3〜6のシクロアルキル基;Ar1はフェニレン基又はナフチレン基;R3は-OPO3 2-・2M+(ただし、Mはナトリウム原子、カリウム原子又はNH4)又はガラクトシル基を表す。)
【0027】
上記一般式[II]において、R1は水素原子又は塩素、臭素若しくはヨウ素原子のようなハロゲン原子である。R2は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル若しくはヘキシル基のような、炭素数1〜6の直鎖状若しくは分枝状アルキル基;又はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル若しくはシクロヘキシル基のような炭素数3〜6のシクロアルキル基である。Ar1は、フェニレン基又はナフチレン基のような芳香族炭化水素基である。
【0028】
一般式[II]で表される化学発光基質の具体例として、3-[4-メトキシスピロ(1,2-ジオキセタン-3,2'-トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン)-4-イル]フェニルリン酸二ナトリウム塩(以下、「AMPPD」と言う)、7-[4-メトキシスピロ(1,2-ジオキセタン-3,2'-トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン)-4-イル]ナフチル-2-イルリン酸二ナトリウム塩、3-[4-メトキシスピロ(1,2-ジオキセタン-3,2'-トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン)-4-イル]フェニルβ−D−ガラクトピラノース、3-[4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン)-4-イル]フェニルリン酸二ナトリウム塩、3-[4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン)-4-イル]フェニルβ−D−ガラクトピラノース等を挙げることができる。
【0029】
これらのうち、特に、臨床検査薬分野において広く知られ、実用化されている点から、化学発光基質として、AMPPDを用いることが好ましい。
【0030】
化学発光基質としては、下記一般式[III]で表される1,2-ジオキセタン誘導体も好ましい。
【0031】
【化3】
【0032】
(ただし、式[III]中、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に炭素数1〜6のアルキル基又は炭素数3〜6のシクロアルキル基;Ar2は下記一般式(A)ないし(C)のいずれかを示す。)
【0033】
【化4】
【0034】
(ただし、R7は-OPO3 2-・2M+(ただし、Mはナトリウム原子、カリウム原子又はNH4)又はガラクトシル基を表し;R8は水素原子、炭素数1〜20のアルキル基若しくは置換アルキル基、炭素数3〜20のシクロアルキル基若しくは置換シクロアルキル基、5〜20員のアリール、炭素数1〜20のアルコキシアルコキシル基、炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシル基、炭素数6〜20のアリールオキシ基又は炭素数7〜20のアラルキルオキシ基であり;Vは酸素原子又は硫黄原子である)、
【0035】
【化5】
【0036】
(ただし、R7は式(A)において上記した意味を表し;WはC-R9(ただし、R9は水素原子、炭素数1〜20のアルキル基若しくは置換アルキル基、炭素数3〜20のシクロアルキル基若しくは置換シクロアルキル基、5〜20員のアリール、炭素数1〜20のアルコキシアルコキシル基、炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシル基、炭素数6〜20のアリールオキシ基又は炭素数7〜20のアラルキルオキシ基)又は窒素原子を表し;Xは酸素原子又は硫黄原子を表す)
【0037】
【化6】
【0038】
(ただし、R7は式(A)において上記した意味を表し;Yは酸素原子、硫黄原子又はN-R10を表し;Zは水素原子、炭素数1〜20のアルキル基若しくは置換アルキル基、炭素数3〜20のシクロアルキル基若しくは置換シクロアルキル基、5〜20員のアリール、-OR11、-SR12又は一般式(D)
【0039】
【化7】
【0040】
(ただし、R10は水素原子、炭素数1〜20のアルキル基若しくは置換アルキル基、炭素数3〜20のシクロアルキル基若しくは置換シクロアルキル基、5〜20員のアリール、ヒドロキシル基、炭素数1〜20のアルコキシル基、炭素数2〜20のアルコキシアルコキシル基、又は炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシルを表し;R11、R12、R13及びR14はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜20のアルキル基若しくは置換アルキル基、炭素数3〜20のシクロアルキル基若しくは置換シクロアルキル基、5〜20員のアリールを表す(ただし、(i)R10とR11、(ii)R10とR12、(iii)R10とR13、又は(iv)R13とR14は一体となって環を形成していてもよく、この環には2つ以上のヘテロ環を含んでいてもよい))。
【0041】
一般式[II]で表される1,2-ジオキセタン誘導体において、炭素数1〜6のアルキル基は、直鎖状又は分枝状のメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル又はヘキシル基であってよく、炭素数3〜6のシクロアルキル基はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル基であってよい。
【0042】
上記一般式(A)、(B)、(C)及び(D)において、炭素数1〜20のアルキル基若しくは置換アルキル基は、直鎖状若しくは分枝状の炭素数1〜20の非置換アルキル基、すなわち、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル又はエイコサニル基、又はこれらの炭素数1〜20の直鎖状若しくは分枝状アルキル基が、1個以上5個以下のヒドロキシル基、1個以上5個以下の炭素数1〜20のアルコキシル基、1個以上5個以下の炭素数2〜20のアルコキシアルコキシル基、1個以上5個以下の炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシル基、及び/又は1個以上5個以下の5〜20員のアリール基によって置換された置換アルキル基であってよい。ここで、炭素数1〜20のアルコキシル基、炭素数2〜20のアルコキシアルコキシル基及び炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシル基は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチロキシ、ヘキシロキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシのような、直鎖状又は分枝状のアルコキシ含有基であってよい。前記アルキル基上に置いて置換する5〜20員のアリール基は、フェニル、ナフチルのような炭素数6〜20の芳香族炭化水素基;又はフリル、チエニル若しくはピリジルのような、窒素、酸素及びイオウから成る群から選ばれる1〜5個のヘテロ原子を含む5〜20員のヘテロアリール基であってよい。
【0043】
上記一般式(A)、(B)、(C)及び(D)において、炭素数3〜20のシクロアルキル基若しくは置換シクロアルキル基は、炭素数3〜20の非置換シクロアルキル基、すなわち、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシル、シクロトリデシル、シクロテトラデシル、シクロペンタデシル、シクロヘキサデシル、シクロヘプタデシル、シクロオクタデシル、シクロノナデシル若しくはシクロエイコサニル基、又はこれらの炭素数3〜20のシクロアルキル基が、1個以上5個以下のヒドロキシル基、1個以上5個以下の炭素数1〜20のアルコキシル基、1個以上5個以下の炭素数2〜20のアルコキシアルコキシル基、1個以上5個以下の炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシル基、及び/又は1個以上5個以下の5〜20員のアリール基によって置換された置換アルキル基であってよい。これらの置換基についての説明としては、上記置換アルキル基についての説明をそのまま適用することができる。
【0044】
上記一般式(A)、(B)、(C)及び(D)における炭素数1〜20のアルコキシル基、炭素数2〜20のアルコキシアルコキシル基、炭素数3〜20のアルコキシアルコキシアルコキシル基及びアリール基については、アルキル基上のこれらの置換基についての説明をそのまま適用できる。
【0045】
上記一般式(A)、(B)、(C)及び(D)において、炭素数6〜20のアリールオキシ基は、例えば、フェノキシ、ナフトキシ等であってよく、炭素数7〜20のアラルキルオキシ基は、例えば、ベンジロキシ、フェネチロキシ等であってよい。
【0046】
一般式[II]中のAr2が一般式(C)で表される場合には、一般式(C)中のYは好ましくは酸素であり、Z中のR13及びR14は好ましくは共働して3員〜7員環を形成し、さらに好ましくは、Zは次の式で表される基を表す。
【0047】
【化8】
【0048】
一般式[II]中のAr2が一般式(C)で表される場合、Yはまた好ましくはN-R10であってよく、Zは好ましくは-OR11であってよく、R10とR11は好ましくは3員〜7員環を形成する。この場合、さらに好ましくは、R10とR11は下記式で表される基を形成する。
【0049】
【化9】
【0050】
上記した化学発光基質は単独でも組み合わせても用いることができる。
【0051】
化学発光反応液中の上記本発明の化学発光増強剤の濃度は特に限定されず、溶解可能な濃度範囲で用いることができるが、通常、1〜200mg/ml程度、好ましくは10〜100mg/ml程度である。また、化学発光反応液中の上記化学発光基質の濃度も特に限定されず、溶解可能な濃度範囲で用いることができるが、通常、0.2〜2 mg/ml程度である。
【0052】
化学発光測定自体は、上記本発明の化学発光増強剤を反応系中に共存させること以外は、従来の化学発光測定と全く同様に行うことができる。化学発光増強剤を反応系中に共存させる方法は何ら限定されるものではなく、例えば、化学発光増強剤を基質液に添加し、この基質液を酵素液と混合してもよいし、化学発光増強剤を基質とは別途に反応系に加えてもよい。化学発光測定は、好ましくは室温ないし約40℃、さらに好ましくは用いる酵素の至適温度において行われる。反応時間は限定されるものではなく、通常、1分間〜60分間、好ましくは3分間〜20分間である。反応媒体は、従来の化学発光測定と同様、当該酵素反応にとって適当な、リン酸緩衝液のような緩衝液中で行うことができ、そのpHは、用いる酵素の至適pH又はその近傍であることが好ましい。反応生成物からの化学発光は、従来の化学発光測定と同様、周知で市販されているフォトカウンター又はルミノメーターを用いて測定することができる。
【0053】
本発明の化学発光測定は、従来の化学発光測定が適用されているあらゆる分野に適用することができる。これらの分野のうち、酵素免疫分析は重要な分野である。酵素免疫分析自体はこの分野において周知である。酵素免疫分析においては、酵素は標識ないしはマーカーとして抗原、抗体又はハプテン等に結合されて用いられ、酵素は、化学発光基質が化学発光を開始し又はその化学発光強度を変化させる酵素反応を用いて検出又は定量される。酵素免疫分析において化学発光測定を用いることはこの分野において周知である。例えば、酵素免疫分析の代表例であるサンドイッチELISAにおいては、第1抗体が固相に不動化され、該第1の抗体に特異的な、定量すべき抗原を第1抗体と反応させる。洗浄後、該抗原に特異的な、酵素標識した第2抗体を、固相に捕捉された抗原と反応させる。洗浄後、捕捉された第2抗体、すなわち、捕捉された酵素を、化学発光測定を用いて定量する。なお、上記したサンドイッチELISAは単なる一例であり、酵素免疫分析は上記の例に限定されるものではない。
【0054】
酵素免疫分析において、検出又は定量すべき標的物質は何ら限定されるものではなく、例えば、ホルモン、酵素、タンパク質、サイトカイン、細菌細胞及びウイルス等の抗原並びにこれらの抗原に対する抗体を挙げることができる。酵素免疫分析に供される試料もまた何ら限定されるものではなく、例えば、血液、血漿、血清、尿及び組織液のような体液並びに食品及び飲料等を挙げることができる。
【0055】
免疫分析において、抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、特異性の観点から後者が好ましい。モノクローナル抗体はKohlerとMilsteinの方法(Nature, 256, 495(1975))により作製することができ、作製された抗体は常法により精製することができる。精製された抗体は、そのままでも、あるいはFab断片やF(ab')2断片のような抗原結合性断片に断片化した後でも用いることができる。
【0056】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0057】
参考例1 フェライト粒子に結合したコンジュゲートの調製
HBs抗原を結合させた0.04%濃度のフェライト粒子液;1mlに抗HBs抗体結合アルカリホスファターゼ溶液;0.1mlを反応させ室温で30分放置した。その後、フェライト粒子を集磁して余分な液を除き、新たに10mM Tris/HCl pH7.2, 0.01% TritonX-100(登録商標)(以下、「洗浄液」という)を1ml加えた。この洗浄操作を5回繰り返した後、最終的に0.5mlの0.1M ジエタノールアミン/HCl pH10, 1mM 塩化マグネシウム(以下、「基質緩衝液」という)にフェライト粒子を懸濁させ、これをHBs粒子−コンジュゲートとして使用した。
【0058】
実施例1、比較例1 4級アンモニウム水溶性ポリマーとAG11の発光増強効果の比較
4級アンモニウム水溶性ポリマー化学発光増強剤(以下、化学発光増強剤を「エンハンサー」と言うことがある)BDMQ(ポリビニルベンジル(ベンジルジメチルアンモニウム)クロライド)を0.5mg/ml、化学発光基質AMPPDを1mg/ml含む基質液50μlに参考例1のHBs粒子コンジュゲートを5μl添加してルミノメーターで20分間の発光カウントを測定した(比較例1)。また、約50μlのAG11 Resins(商品名、上掲)を最終濃度1mg/mlのAMPPDと混合し、5μlのHBs粒子コンジュゲートを添加して発光カウントを測定した(実施例1)。別にコントロールとしてエンハンサーを入れない、AMPPDのみについても同様の測定を行った(対照)。
【0059】
5分、10分、15分、20分後の各カウントを表1に示す。BDMQ添加基質液でのカウント(比較例1)はAMPPDだけの時(対照)に比べ5分後で約27倍に上昇したのに対し、AG11添加基質液(実施例1)では約300倍に上昇しておりBDMQの10倍以上のカウントを示した。
【0060】
【表1】
表1
注)「対照」はエンハンサーの入らないAMPPDだけの時のカウントを示す。
【0061】
実施例2 AG1粉末のポリアクリル酸処理と化学発光増強効果
AG1 Resins(商品名、上掲)を乳鉢にとり、ビーズの形状がなくなるまですりつぶした。すりつぶした粉末状のAG1を約20mg試験管にとり、4%濃度のポリアクリル酸(平均分子量9万)と混合して室温で2時間放置した。その後、水および基質緩衝液で最終pHが基質緩衝液と同じになるまで洗浄し、最終的に200mg/ml濃度で基質緩衝液に懸濁した。ここから5μl分取し、最終濃度1mg/mlのAMPPDと混合し、参考例1のHBs粒子コンジュゲートを2μl添加して5分後の発光カウントをルミノメーターで測定した。
【0062】
結果を表2に示す。AG1を粉末状にしてポリアクリル酸処理したもの(実施例2)は約180倍にもカウントが上昇した。
【0063】
【表2】
表2
*:「対照」は、AG1添加無し
【0064】
実施例3 AG1粉末の各種ポリカルボン酸処理と化学発光増強効果
実施例2と同様に、AG1 Resins(商品名、上掲)を乳鉢にとり、ビーズの形状がなくなるまですりつぶした。すりつぶした粉末状のAG1を約20mg試験管にとり、各々4%濃度のポリメタクリル酸ナトリウム、ポリ(アクリル酸−マレイン酸)、ポリ(1−ビニルピロリドン−アクリル酸)、ポリ(メチルビニル−マレイン酸)と混合して室温で2時間放置した。その後、水および基質緩衝液で最終pHが基質緩衝液と同じになるまで洗浄し、最終的に200mg/ml濃度で基質緩衝液に懸濁した。ここから5μl分取し、最終濃度1mg/mlのAMPPDと混合し、参考例1のHBs粒子コンジュゲートを2μl添加して5分後の発光カウントをルミノメーターで測定した。
【0065】
結果を表3に示す。いずれのポリカルボン酸を用いても対照よりも35〜95倍程度発光カウントは高くなっていることがわかる。
【0066】
【表3】
表3
*:「対照」は、AG1添加無し
【0067】
実施例4、比較例2 他の陰イオン交換体のポリアクリル酸処理と化学発光増強効果
AG1以外の陰イオン交換体の代表としてQ-セファロース(登録商標、上掲)を選択し、約0.5ml相当のゲルを2mlの4%アクリル酸ポリマー溶液と2時間室温で反応させた。その後、水および基質緩衝液で最終pHが基質緩衝液と同じになるまで洗浄し、最後に基質緩衝液で約50%の懸濁液とした。ここから50μl分取して過剰の基質緩衝液を除去し、最終濃度1mg/mlのAMPPDと混合後、参考例1のHBs粒子−コンジュゲートを2μl添加して5分後の発光カウントをルミノメーターで測定した。
【0068】
結果を表4に示す。Q-セファロース(登録商標)はポリアクリル酸処理をしなくても(比較例2)、入れないときの約40倍の発光カウントを示すが、ポリアクリル酸処理したQ-セファロース(実施例4)は入れないときの約130倍のカウント上昇を示した。
【0069】
【表4】
表4
*:対照は、Q−セファロース添加無し
【0070】
実施例5、比較例3 (α―フェトプロテイン)AFPスタンダードカーブの比較
抗AFP抗体を結合したフェライト粒子0.25mlにAFP抗原0, 10, 100, 800, 2000ng/mlを20μl添加し、37℃で10分間反応させた。その後、磁石を反応液の入った試験管の外から近づけてフェライト粒子を集磁し、吸引操作により余分な液を除いてから0.7mlの洗浄液で3回このフェライト粒子を洗浄した。次に、この試験管に0.25mlの抗AFP抗体結合アルカリホスファターゼを加えて37℃で10分間反応させた後、先ほどと同様にフェライト粒子を集磁して洗浄し、免疫反応まで終了したフェライト粒子を得た。このフェライト粒子の入った試験管に実施例1で使用したBDMQ添加基質液(比較例3)、もしくはAMPPDだけの基質液(対照)を200μl添加して、5分間の発光カウントをルミノメーターで測定した。またAG1を添加した基質液を使う場合には、免疫反応まで終了したフェライト粒子に基質緩衝液を40μl添加し充分懸濁した後にそこから2μlを分取し(全体の粒子量の20分の1相当量)、これに実施例2で使用したアクリル酸ポリマー処理AG1を添加した基質液4μl(実施例5)を加えて5分間の発光カウントをルミノメーターで測定した。
【0071】
結果を表5に示す。AG1添加基質では発光反応に用いるフェライト粒子を他の20分の1量しか使っていないにも関わらず、AFP高濃度域でBDMQ添加基質より高いカウントを示した。また、ゼロブランクを引いた後の10ng/mlと2000ng/mlのカウントの比を各基質で比較するとエンハンサー無しは214倍、BDMQ基質は88倍、AG1基質は187倍であり、従来のBDMQ基質より大幅に標準曲線(横軸に既知AFP濃度、縦軸に発光カウントをプロットした曲線)の直線性が改善された。
【0072】
【表5】
表5
1): エンハンサーなし
2): 対照で用いたフェライト粒子量を1とした相対値
【0073】
【発明の効果】
上記のように、本発明により、従来の化学発光増強剤よりも化学発光増強効果が優れた新規な化学発光増強剤が提供された。また、本発明の化学発光増強剤を用いると、標準曲線の直線性が改善され、より正確な定量が可能になる。
Claims (7)
- ポリカルボン酸又はその塩で処理した陰イオン交換基含有物質から成る化学発光増強剤であって、前記陰イオン交換基含有物質が、3級若しくは4級アンモニウム基を持つポリマー、3級若しくは4級アンモニウム基をもつラテックス粒子、3級若しくは4級アンモニウム基をもつリポソーム、カチオン性のアミノ酸ポリマー又はカチオン性のアミノ酸共重合体である化学発光増強剤。
- 前記3級又は4級アンモニウム基を持つポリマーは、3級又は4級アンモニウム基を持つ陰イオン交換体である請求項1記載の化学発光増強剤。
- 前記ポリマーは、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、アガロースゲル、架橋デキストランゲル又はセルロースである請求項2記載の化学発光増強剤。
- 前記ポリカルボン酸は、不飽和カルボン酸若しくはその塩の重合体若しくは不飽和カルボン酸若しくはその塩を含む共重合体、又は炭素数2〜20のアルカン若しくはヒドロキシアルカンに2個以上のカルボキシル基若しくはその塩が置換した脂肪族ポリカルボン酸である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の化学発光増強剤。
- 前記ポリカルボン酸は、ビニルカルボン酸若しくはその塩の重合体又はビニルカルボン酸若しくはその塩を含む共重合体である請求項4記載の化学発光増強剤。
- 前記ビニルカルボン酸は、アクリル酸若しくはメタクリル酸又はその塩である請求項5記載の化学発光増強剤。
- 前記処理は、ポリカルボン酸若しくはその塩の溶液又は液状のポリカルボン酸若しくはその塩を前記陰イオン交換基含有物質と接触させることを含む請求項1ないし6のいずれか1項に記載の化学発光増強剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001160743A JP4576752B2 (ja) | 2001-05-29 | 2001-05-29 | 化学発光増強剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001160743A JP4576752B2 (ja) | 2001-05-29 | 2001-05-29 | 化学発光増強剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002350352A JP2002350352A (ja) | 2002-12-04 |
JP4576752B2 true JP4576752B2 (ja) | 2010-11-10 |
Family
ID=19004109
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001160743A Expired - Fee Related JP4576752B2 (ja) | 2001-05-29 | 2001-05-29 | 化学発光増強剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4576752B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114685418B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-06-27 | 菲鹏生物股份有限公司 | 用于增强amppd底物的化学发光强度的化合物及其制备方法和增强剂 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63291597A (ja) * | 1987-05-22 | 1988-11-29 | Meidensha Electric Mfg Co Ltd | 生体試料中のグルコ−スの測定方法 |
JPH0353897A (ja) * | 1989-06-27 | 1991-03-07 | Tropix Inc | エンハンサーを用いる化学発光測定法 |
JPH04124185A (ja) * | 1990-09-10 | 1992-04-24 | Tropix Inc | 化学発光性3―(置換アダマント―2′―イリデン)1,2―ジオキセタン化合物,検定法およびキット |
JPH09502253A (ja) * | 1992-07-31 | 1997-03-04 | シンテックス(ユー・エス・エイ)・インコーポレイテッド | 光活性化化学発光基質 |
JPH10158293A (ja) * | 1996-08-08 | 1998-06-16 | Rikagaku Kenkyusho | 3’−デオキシリボヌクレオチド誘導体 |
JPH11507531A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-07-06 | カイロン コーポレイション | 化学発光基質におけるsdsを用いたアルカリホスファターゼの増強および酵素阻害アッセイ |
-
2001
- 2001-05-29 JP JP2001160743A patent/JP4576752B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63291597A (ja) * | 1987-05-22 | 1988-11-29 | Meidensha Electric Mfg Co Ltd | 生体試料中のグルコ−スの測定方法 |
JPH0353897A (ja) * | 1989-06-27 | 1991-03-07 | Tropix Inc | エンハンサーを用いる化学発光測定法 |
JPH04124185A (ja) * | 1990-09-10 | 1992-04-24 | Tropix Inc | 化学発光性3―(置換アダマント―2′―イリデン)1,2―ジオキセタン化合物,検定法およびキット |
JPH09502253A (ja) * | 1992-07-31 | 1997-03-04 | シンテックス(ユー・エス・エイ)・インコーポレイテッド | 光活性化化学発光基質 |
JPH11507531A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-07-06 | カイロン コーポレイション | 化学発光基質におけるsdsを用いたアルカリホスファターゼの増強および酵素阻害アッセイ |
JPH10158293A (ja) * | 1996-08-08 | 1998-06-16 | Rikagaku Kenkyusho | 3’−デオキシリボヌクレオチド誘導体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2002350352A (ja) | 2002-12-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0344270B1 (en) | Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof | |
JP4887530B2 (ja) | 磁性微粒子、およびその製造方法 | |
FI114341B (fi) | Avidiinin tai streptavidiinin käyttö häiriönpoistoaineena immunologisissa määrityksissä ja määritysmenetelmät, joissa käytetään tätä ainetta | |
AU634631B2 (en) | Magnetically responsive fluorescent polymer particles and application thereof | |
US7883903B2 (en) | Dendritic chemiluminescent substrates | |
JP2010540925A (ja) | カスケード酵素免疫測定法 | |
US11543413B2 (en) | Kit and method for quantitative detection of HBsAg | |
JP6289608B2 (ja) | 固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、固相担体の製造方法、及びリガンド結合固相担体の製造方法 | |
US6274325B1 (en) | Method for carrying out a homogeneous-immunoassay based on agglutination | |
JP4576752B2 (ja) | 化学発光増強剤 | |
JP2017509897A (ja) | 多重分析法を実行するための対照 | |
JPH02194360A (ja) | カルボキシル基含有重合体を含む免疫化学試験用剤 | |
US20090081696A1 (en) | Luminescence enhancer and use thereof | |
WO1999060401A1 (fr) | Immunoreactifs et procede de dosage immunologique | |
WO1991006559A1 (en) | Use of polymerized immunoglobulin to reduce the incidence of false-positive responses in immunoassays | |
JP3684454B2 (ja) | 沈殿可能な固相を用いる不均一系イムノアッセイ | |
EP1247096B1 (fr) | Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe | |
JP2010107207A (ja) | 免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法 | |
US20040018564A1 (en) | Physiologically active substance-measuring reagent and method for measuring physiologically active substance | |
JP2001511820A (ja) | サイクロスポリン誘導体およびその使用 | |
JP5559465B2 (ja) | アビジン類結合担体、その製造方法及びその使用方法 | |
EP0411711B1 (en) | Attachment of compounds to polymeric particles using dication ethers and a kit containing same | |
EP0569086A2 (en) | Method and kit for attaching compounds to carboxylated substrates using uronium salt | |
Dou et al. | Preparation of immuno-probes based on europium-chelate-adsorbed silica nanoparticles and magnetic nanoparticles and their application in detection of hepatitis B surface antigen | |
JPH0627109A (ja) | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060324 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080423 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080423 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20100419 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100427 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100618 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100727 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100809 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130903 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130903 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |