JPH04124185A - 化学発光性３―（置換アダマント―２′―イリデン）１，２―ジオキセタン化合物，検定法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明１；、改良さｎｒこ化字発′ｙｔ注１，２−ジオ
千セタン１ヒ合物に関する。更に詳細に一；１本発明ヲ
；。

＃索によっ℃−裟し得る改良さｔ（た１ヒ字晃尤性１゜
２−ジオキセタンｆヒ合物であって、酵素によって脱離
ム」舵な不戒足な基？ｈ″′ｆるものに関するコこの批
り不安定な基１；１分子が分解するの１妨けて。

過当なｗ素？Ｄ口えてそり不安定な基を除去するまで１
元２丁なわちｉＪ視元線また１丁適当な計測ｊ器による
測定によりて桝め用油な元？生する。

１個の酵素分子が、Ｊ！１２媒回路ケ遡って、酵素によ
って開裂し得る化学発光性１．２−ジオ千セタン分子の
測子（至）もの分子からその相補的で不安定な基σ〕除
去４行なうものであるうこれは、化学的に開裂し得る化
学発光性１，２−ジオキセタンの１分子？、各ジオキセ
タン分子から相補的で不安定な基？除去するのに必要と
する。化学的に開裂し得る薬剤の一合と１工著しく異な
る。飼えは、　　３−Ｊ２’−スピロ−アダマンタン）
−４−メト千シー４−１３″−ヒドロ干シ〕フェニルー
１．２−オ千セタンのフェニル蒸上σクヒドロキシル置
換基から水氷イオン１分子Ｙド裂するりに、水酸ｆヒナ
トリウム１分子が必要であるが、１．０００〜５．ＯＬ
ｌ　０モル７秒３−（２’−スピロアダマンタン）−４
−メト干シー４−１３”−ホスホリルオキシ〕フェニル
−１，２−ジオ千セタンニナトリウム塩のホスホリルオ
千シ基をー裂するのには、アルカリ性ホスファターゼｔ
　［ＡＰＪ３１モルのみ必要であるＣヤフロンスａ？　
−（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ　）の「感染症用ＤＮＡ検査（
ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
　ＤｉＳ８ａＳ８Ｓ月。

ボカ・ラドンＣＢｏｃａ　Ｒａｔｏｎ）　、　　７　Ｃ
ｌリダ、シー・７−ル、シー−ニア１／ス（ＣＲＣＰｒ
ｅｓｓ）、　１９８９゜２２負ケ参照されたい〕。

酵素［工って開裂し得る発光性１．２−ジオキセタン化
合物は１通常更に、ジオキセタン環の６−辰素原子にス
ピロ結合したアダマンチリデン基のような安定化基を含
むものであり、これか、酵素により″Ｃ開裂し得る不安
定な基１分子の残基に結合させている結合を、意図的に
開裂させる前に。

ジオキセタン化合物が室温Ｃ約２５℃〕で爽賀的に分解
さねないように助けるもので夛、るという、ライ−リン
ガ（Ｗ　ｉ　Ｓｒ　ｉｙｎｇａ　）らｃ）　Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、１ｏ９（１９７２Ｊおよ
びマクカフう（Ｍａ　Ｇａｐｒａ〕らＴ７Ｊ　Ｊ、Ｃｈ
ｅｍ、Ｓｏｃ、　、Ｃ；ｈａｍ、　、　ｔｙ１４４（１
９７７）　　によって１．２−ジオ千セタンｆヒ′：！
０−に提唱されｆこ歎念である。したかって、これらの
安定化基か、このようなジオキセタンＹ、使用舶の適当
な長期間ｒＩＪ間１例えは杓１２か月〜約１２年までの
間、約４〜約６０℃までの範囲ｃｖ呈室温実賓的に分解
されることなく保存すること？ム」舵にする。

不発Ｅ！Ａは更に、既知の技術の免疫学的検定法。

化学的検定法および核酸プローブ検定法でのそのジオ千
セタン分子の取込みに関し且つ各種Ｃ１，）高分子１合
成ポリマー、タンパク質、杉酸、触媒性抗陣等の分子構
造または微細構造を研究するためＫ。

分析物１丁なわちその存在、蓋または輌造？誤り定する
ｆヒ字的１にン工生物学的物漬ケ同定または定量するこ
と％′＋ｌｉＪ靜にする直接の化学的／物理的プローブ
としてのその利用に関する。

化学発５１ｅ性１．２−ジオキセタンは、特に、フロア
　スタイ７　（５ｒｏｎｓｔｅｉｎ）の、１９８６年７
月２４日に提出された米＠特計出り第Ｓ、Ｎ、８８９．
８２６号明１１Ｆ（ｒ’８２３出駄」）；ブロンスメイ
ンらの。

１９８７年１２月６１日ＫＮ出さｊた米国特許出願第Ｓ
、Ｎ、１４０，０３５号ｔｈ細壷；ニド’７−　／（（
ｇｃｉｗａｒｄｓ）の、１９８７年１２月６１日に提出
された米ｌ！ｉｌｉ％許出に第Ｓ、Ｎ、１４Ｑ、１９７
号明細書（「’１９７出願」〕；エドワーズらの、１９
８８年６月６０日に提出された米国特許出に第Ｓ、Ｎ、
２１３，６７２号明細書（Ｖ６７２出願」）に開示され
た。酵素によって開裂し得る化学発光性１．２−ジオキ
セタンの出現に伴い、近年重要性が増していると思われ
ている。

更に、酵素によって開裂し得る１、２−ジオキセタンと
は著しく異なって、現在ｆでに知られている各種の化学
的に開裂し得る化学発光性１．２−ジオキセタンには、
任意ＣＶｍ類の分析方法で、しかも餉らかに生物検定法
ではない方法でのリポータ−分子としての有用性がたと
えあったとしてもほとんとない。これは、＃＃：、知の
化学的に開裂し得る化合物が、有機溶媒ｅｉ′Ｉ＃性の
みならずある程度水浴性であるある種のアセト守シ置換
１．２−ジオ千セタンのはか１；大部分か水不溶性であ
り、しかもそれ夕えに、こＱノ化合物に、抗陣などの生
物物質に結合できる基またｉ了＊＊基を加えることＫよ
っである桂度修飾して、それＴによっ℃その結合した化
学的に開裂し得る１、２−ジオ千セタン會、化字的に活
性化した化学発光に適したｍ繊とし℃用いることＹ可能
にすることができるということがなければ、生物恢定に
有用であることができないためである。

また−万において、典温的な、酵素により”１１裂し得
る化学発光性１．２−ジオキセタン例えば。

アダマンチルＹ付加した。酵素によって開裂し得る１、
２−ジオキセタンであって１発光する好適な酵素１例え
ば速記法で下記本文中にアダマンデリデンメト千りフェ
ノキシホスホリル化ジオヤセタン（［ＡＭＰＰＤＪ　）
として同定された３−（４−メト千シスピロ［１，２−
ジオキセタン−３，２’−）リシクロ［３，３，１，１
３°７〕デカン〕−４−イル）フェニルホスフェートと
ニナトリウムーの、Ｊ：うなその塩、お工ひ３−（４−
メト千シスピロＣＩ、２−ジオ千セタン−３，２’　−
トリシクロ［３，３，１，１３・７〕デカン）　−４−
イル）フェニルオ干シー３’−＃−Ｄ−カラクトビラノ
シドとそり塩（ｒＡＭＰＧＬＩＪ　Ｊの存在下で分解す
るもりの水浴性が、この化合物ケ、水！Ｅ１ｊｉｋ′ｊ
ｌｉ中で行なう多くの種類の分析法、特に生物恢定法で
リポータ−分子として用いるのに極め℃好適なものにす
る。

水性溶液中の、そして夫にポリマー性アンモニウム塩、
ホスホニウム塩まタハスルホニウム塩などの化学発光二
ンノ・ンブー、例えばポリ〔ビニルベンジルＣベンジル
ジメチルアンモニウムクロリド）］　ｃ　ｌＢＤＭＱＪ
　）および他の異極性ポリマー（ヴオイタ（Ｖｏｙｔａ
　）らの、１９８８年６月１日に提出さｊた米国特許出
り第Ｓ、Ｎ、２０３．２６３号明細１１ケ参照されたい
）の存在下でのＡＭＰＰＤは１発光％注を一定にするの
に、最適時間（一定の、定常状態発光水準で最大化学発
光強度會２分（は１にするのに必要な時間として定義さ
れたＩ　ｔｌ　／２Ｊであり、こり発光半減期は、ｍ々
な環境でのジオキ七タンオキシアニオンの安定性の＠能
とし１：変化する）よりも長い時間ケ示すことか分かつ
ている。

統計学的に、定常状態の発光送度＠に遅するσ〕に約７
のｔ１／２崗期？必要とする。水注浴液中豹２×１０−
５モルの濃度で、ｐＨ９，５でＢＤＭＱの存在下ｃｙｒ
ＡＭＰＰＤｃｖｔＭ２４？、　　７．５分間であること
が見出たされているっＢＤＭＱ不在で。

４Ｘ１０−３モルでのｔｌ／２ｉｊ、約６０〜６０分間
であるが、水性溶液中、２Ｘ１０−５モルでのＡＭＰＰ
Ｄのｔ１／２は、２．５分間であることが見出だされて
いる。

酵素ＫＪ：っで開裂し得る化学発光性１．２−ジオ千セ
タンヲリポーター分子として用いる速やかな生物検定法
において、その検定法での「終点」Ｙ検出するのに可能
なほど速い定常状態の発光速度論に達することか望まし
い。化学発５ｔ！Ｊ度は、定常状態の速度論に遅する前
に測定することができるか、定常状態の発光速度論のｌ
ｉＩ＋に１薙なデータを侍にい場合、高度Ｋａ雑な、熱
による調節ケ行なっｒこ発光測定計１１１１］器による
シ］定Ｙ行なわなければならない。

更に、ＢＤＭＱのような化学発光エンハンサー存在およ
び不存在の双方でＱノ水性緩伽浴液中のＡＭＰＰＤで）
工２次望の熱によって且つ非酵集的に活性化した発光ま
ｒこＩｓ　ｌノイズ」よりも更に高くなる。こりような
ノイズは、アダマンタノンおまひ、ＡＭＰＰＤ分子の芳
香族部分から誘導されたｍ−オーｖ−７安息査酸メチル
アニオンの励起状態からの発光に起因することかある。

こりノイズは。

検出の水準會制限することがあり、したがって。

ＡＭＰ）’Ｄの測定さｔ″ｌたノイズ水準の、標準ルミ
ノメータ−のＶｉｋ流付近での大きさの程度が約２であ
ると、極限感度に達するのを妨げることかある。

ＡＭＰＰＤのアルカリ性ホスファターゼによる＃集的な
開裂は更に、非イオン性で脱ホスホリル化ＡＭＰＰＤ１
丁なわちアダマンテリテン−メト平ジメチルフェノラー
トジオ千セタ／、またはｌＡ、ＭＰ　　Ｄｌｒ生する。

このフェノラート隘イオンもまた。少量で加水分解によ
って生成して。

ミセル　リポソーム、ラメラ層、薄層、脂賀二ムＩｉ＋
１．リポソーム小弛、逆向きミセル　ミクロエマルシ、
ン、ミクロケル、ラテックス、ｍまにはポリマー表面の
ような有機分子アセンブリーにおいておよびＢＬＩＭＱ
などｃｖｆヒ学発光エンノ・／ｖ−によって生じによう
な疎水性環境におい℃、強力な高水準の発光？生じるバ
ックグラウンド化学発光信号？生じることができ、それ
により℃優れたパックバラランド信号？生じ且つＡＭ）
ＰＤの酵素による加水分解によって生じる信号の動的範
囲Ｖ笑漬的に低下させる。

前記Ｑ観察に一致して、我々は、下記の機序？仮定して
いる。

ＢＤＭＱのような促進ポリマーの存在下、ＡＰ　　　　
　　緩慢 （Ｔ、１／２は、７５分間〕 ２゜ 熱による反応経路（ ＡＰ不在） 促進ホリマー不在であっても、ＡＭＰＰＤＹＸ。

ｌＩＥ集捧とし℃水性浴液中に存在することができるっ
６、　酵素による反応経路 Ｐ ＣＡＭＰＰＤＩ、　−＋　ｃＡＭｐ（”Ｊ。

高速 一＊　　４７７ｎｍＴ９’）ＯＬ （１，は、２．５分間） は　　ＵＯ３は、ｆヒ学発光Ｖ表わ丁、２）水註飯翫浴
液中のＡＭＰＰＤｔＸ、少量の脱ホスホリル化、ヒドロ
キシルｆヒ１．２−ジオ千セタン（［ＡＭＰＨＤＪ　）
％’含んでいる。溶液のｐＨが十分に高い（＋１？）９
．　Ｓ陶土）場合２脱ホスホリル化ジオキセタンｉｊ、
ＡＭＰＤとじ″Ｃ非イオン性状塾で存在することかでき
ろつ ３）　　Ｉ　ＯＬ、Ｊお；びｌ　ＣＬ　２　Ｊ　’ｒ１
−・くツクグラウンドｆヒ竿晃九ケ表わ丁つ ４）　　ｆＡＩＪ’ｌ了、ｒノ起工滞ルキー状態に訃、
るアダマンタフフケ表わ１つ １記の機序において、ｎ＞＞＞ｍ”ｃあり、ｎおＪひｍ
　’Ｉ！　、促進ポリマー存在また１丁不任の開数であ
り且つＡＭＰＰＤ襄度である。

ｋ　集ｋＤ＆ノアダマンタノンー電珈の励起ｔＫＪｉ（
ｎま辷ｋｊ　ｍ）　Ｉ　Ｊ　’＋！、こ、：”’（−ｊ
ｌ’ｃ、　Ｂ　Ｄ　Ｍ　Ｑ＋７．）ような化学発光エン
ハンサ−の存在によるように。

特に、「安定化して」更に発光する場合、非−集アダマ
ンタノノの加起工坏ルキー状塾か発光するよりも高収率
の偽号発″Ｊｔ、ケ示すことかできる。こｎ　’、ｓ、
前者が、後者；りも−１項状態か低く、項間父差；なを
；より緩慢な項間又差の収率か低いこと、また１丁合の
ところまた禾知の要因によると思わする。通常、ルミノ
メータ−′−了、九子のエネルキーまｒこは波＆にかカ
トりなく、放出された全ての光子ｌｋ′検出する工うに
設計さｔｌ又いるので２４１５ｎｌＩ！および４７７ｎ
ＩＩｌｖノ比学発光の双方を。

バックグラウンドノイズ発光とし℃検出する。筒様に、
写真また）ヱＸ軸フィルムケ用いて化字発尤ケに録する
場合、になる成長の弁光り間の畝別に。

容８に行なうことかできないので、恢出感Ｈｖバックグ
ラウンドノイズにより″Ｃ制限するう最終的に、前記に
記載された条件下で銃撃されたＡＭＰＰＤの成果は、Ａ
ＭＰＰＩ）またシ；そのフェノラート鴎イオンおよび類
似の分子σり両親＠注したがって１本発明の目的？；、
検定法、符に酵素によって開裂し得る１こ学発光注１．
２−ジオキセタンシリホーター分子として用いる生物検
定法ケ付なうＱノに２戴な時Ｉｌ！Ｉｌゲ蝮縮１にとて
°あるう本発明の目的！ゴまた。酵素によって開裂し得
る化学発光性１．２−ジオ千セタンケリポーター分子と
［、て検定法、特に生物検定法に用いる砺台に。

検定ケ完了するのに公費とさする時山ＩＹ短翻する。

ｔｒ規な且つ吹長さｔ１ρ計累によって開鋭り得る化学
発光性１．２−ジオキセタンを提供することである。

本発明の目的１；更に、バックグラウンドの挙動に対す
る信号ケ改良し、しかもそｔｌによって検出水ｆ！Ａを
改良する。酵素？基剤とした検定、特に生物検定用の基
質として用いるための、　１！ＩＴ現な且つ改良された
酵素によって開裂し得る化学発光性１゜２−ジオキセタ
ン？提供することである。

本発明の目的盲；また更に、こ４らり改良さ４た酵素に
よって開裂し得る１、２−ジオ千セタンを合成するのｖ
Ｃ有用な、１現な中間棒を悔供することである。

本発明の別の目的は２酵禦によって開裂し得るこれらの
ｆヒ学発光注１，２−ジオ干セタンＶ製造する方法およ
びそりにダ、の中間内？提供することである。

こ１らのおＪびｍの目的）；１本発明の％性、範囲およ
び木」用と同様に、下記の祝１おまひ編付された杵Ｆ艙
釆の範囲から、当該技術者にとって容易に明らか罠なる
ものである。

本発明１丁、溶液中の陣液試料などの水性媒質中で１シ
；ナイロン族のような膜表面などの固−表面上で、酵素
またｉｓｅ集で修飾された特定の結合対と反応し℃光学
的に検出可能なエネルキー？放出することができる。安
定で、酵素にＬｖｌ開裂し得る化学発光性６−（置換ア
ダマント−２′−イリデンＪ−１．２−ジオ千セタンの
新規な種類Ｖ提供する。

水性媒質中で、これらの修飾されたアダマンチリデンジ
オ千セタンｖ；、これをリポータ−分子とし℃用い”Ｃ
，ＡＭＰＰＤｌに’用いて促米ａｊ能であったよりも速
く且つ感度を大きくして行なう検定法？町に１にする。

我々は、この意外な優れた挙動を脱明１６σりに行われ
たい′１″れの機序または理論にも拘束された＜ヲ；な
いか１本文中で一示された種類の置換基がアダマンプリ
テン残本上またし；中に存在することが、ジオ井セタン
分子ケ有効に取り込むσｐ＋ｒｇけ。

しかもそｔｌによってジオ千セタン分子が、ミセル１７
）形態かｌたは他り献集込態のい１′れにゼよ。

１女定イヒし」１組社化されたアセンブリーＹ形収する
こと２妨けていると思わｔする。若干のこれらのＩｉ［
換基は更に、それ１陣か水？含んでいるその７に性瓜境
におい℃他の物質に水素結合することができ、そｔｌに
よって更に凝集陣形氏會妨げている。

そして史に　を子および双極子作用が、より短いｔ１／
２おＪびより小さいパックグラウンドノイズによって明
らかにされたようなこの玩象り一因である可能性がある
と思われる。

第１図〜第５図は、それぞれ実施例１２に記載のように
得られた。各々ＡＭＰＰＤおよびそのフロモー、Ｂ−ヒ
ドロ千シー、Ａ−ヒドロ千シーおよびクロロアダマント
−２′−イリデン類似陣九つぃてのＴＳＨ，ＴＳＨＫ対
するＦｔＬＶケ丞１゜躯６図〜第１０図で）；、そねそ
１実九飼１６に記載Ｑフよ５に得られｆこＡＭＰＰＤお
よびそのＡ−ヒドロキシ−１Ｂ−ヒドロ干シー、クロロ
−およびブロモアダマント−２′−イリデン類似−から
得らｔｌニ全ての発光ヶ比較している。

第１１図ｉ工、核＠検定法でのリポータ−分子として（
は　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄそれ１陣と比較した一合の。

ＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２／−イリデン類似−
Ｙ用いて得られた。改良されたｆヒ学発光強度Ｙ示す（
実施−１４％’参照されたい〕っ＃＃１２図を＠、ＡＭ
ＰＰＤのクロロアダマント−２′−イリデン類似捧お工
びＡＭＰ）’Ｄそれ１陣？。

核ａｍ定法でのリポータ−分子として用いて得られた発
光の速度論Ｖ示すＣ＠記の実施例１６ケ参照されたい〕
。

第１３図は、ポリ〔ビニル（ベンジルジメデルアンモニ
ウムクロリド））　ｔ　［ＢＤＭＱＪ　）ｋ加えたＡＭ
ＰＰＤのクロロアダマント−２′−イリデン類似体を有
するアルカリ性ホスファターゼ稀釈度につい℃の５分間
て−σフ用量−反応曲線を、ＢＤＭＱｖ加えニＡＭＰＰ
Ｄそれ１陣についてＣＩ）５分間での円蓋−反応曲線と
比軟したものて：あるＣ実施例１９１￥β照さｔ’ｌｒ
こい〕っ 第１４区）；、第１６区に用菫−反応す紛？示している
同じ物′ｊＭについての２０分間でσり用倉−反応曲脚
であるっ 第１５区ｉ、、ＢＤＭＱ−フルオレセインＣ［エメラル
ドＪ）％−加えたＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２’
−イリデン類似体ケ有するアルカリ性ホスファターゼ稀
釈度につい℃の５分間での用量−反応曲線？、エメラル
ドケ加えたＡＭＰｆ’Ｄそれ自−についての５分間での
用量−反応凹線と比較したものであるＣ再度実施例１９
を参照されたい〕。

第１６図は、第１５図に用飯−反応曲線を示している同
じ物質についての２０分間での用量−反応曲線である。

第１７図は、ｉｔｌＡＭＰＰＤおよび（２）ＡＭＰＰＤ
リクロロアダマント−２７−イリデン類似−を用いて実
施例２０に記載のように得られたＴＰＡ配列ｍヶ示す。

本発明の１規な化学発光性６−（置換アダマン）−２’
−イリデン）１．２−ジオキセタン１丁次σンー紋式１
はケ有する。

Ｉ ここで、ＸとＸｌはそれぞれ独立［５’と７′　におけ
る削紀アマダントー２７−イリデンの置換基である。そ
れは、水素、ヒドロキシル基Ｃ水に水素結合するとき少
し電子引き抜き基である）、フルオロ又Ｙ′ｓクロロ（
電子引き抜き基）又？；ブロモ又はイオドＣ分極可能な
共鳴基〕のようなハロゲン基、非置換直鎖又は分収鎖低
級アルキル基Ｃ好ましくはメチル基）；モノ置換された
又を；同−又は異なる二以上のｌｋ！！！基により置換
された置換直鎖又は分枝鎖低級アル千ル基Ｃ例えば。

ヒドロ千シルメチル基のようなヒドロキシルアルイル基
トリフルオロメチル基のようなノ・ロアルキル基、その
他）；非倉侠アリール基イ好ましくにフェニルＭ）：ｌ
ｌｌアリール基、好ましくは、モノ置換された又２１同
−又）；異なる二ち上り置換基により！ＩＬ換された。

６個の炭素原子Ｙ有するアリール珈ｒ句する基Ｃか」え
は、ｐ−７０モフエニル又はｐ−クロロフェニルのよう
なノ・口置換基、ｐ−メトキシフェニル（を子供４基）
のよウナアルコ千シ１１換＆、　　ヒドロキシエトキシ
、ヒドロ千ジプロポキシのようなヒドロ千ジアルコキシ
＃換Ｉ。

シアノ基、ホルムアミド又はアセトアミド基のようなア
ミド基、そσ〕他、でよい。ここで、Ｘ及びＸｌの少な
くとも一つは水素以外のものである。

本発明の１規な化学発光性３−（ｌｉｌｉ：換アダマン
トー２′−イリデン）１．２−ジオキセタンの範囲に含
まれる化合物は式（はで５′及び／又は７′の位置に水
素Ｎ外の置換基’ａ’に！ＩＩＬするのではなり、４′
　　の［＆［メデレン基％’に換したもりであるつアダ
マンチリデン基が水素以外の前述の置換基の一つでモノ
（置換さねろとき、シン−及びアンチ−インマーの混合
物かそのような化合物か合成さするときえｌｌ−１ｔ’
するで）ろうっ−足の場合１例えは。

モノイオド置換アダマンチリデンジオキセタンの場合、
ひとつのインマーか他よりも分解時、より大きな化学＠
：元強度を示１であろうっ他の場合。

沙＋、＋ｔは、モノヒドロヤシ置換アダマンチリデンジ
オキセタンの場合、二つσツインマーは腋度のようなイ
ヒ学発光の性質においては等しいか又シ丁殆ど等しいで
あろう。い１１の場合でも、エドワーズ等（米国出願第
２４４，００６号、１９８８年９月１４日〕によって開
示さまた技術［よって飼えば、生物検定中のレポーター
分子として、イソマーは使用される＠に分離されるかも
しねないか、又シ丁分離されることなく、クロマトグラ
フで処理した異性体混合物として使用さ４るかもしれな
い。

ｎＬｋＬ　　５’−ヒドロ千シー７′−クロロー及ヒ５
′−クロロ−７′−ヒドロキシ置換アダマンプリデンジ
オキセタンのような二つの異なった置換本カ存在すると
き、勿論１位置イソマーは可能だげれども５アダマンデ
リデン置Ｉ！！−がさＩ−１に水素Ｎ外（Ｘ及びＸ′≠
水紮）のｎＪ記の！ｌＩ［崇湊の二つで置換すｔ′ｌル
シオ千セクセタプシン／アンプ異性ケ示さないｊ Ｈ及びＲ２）Ｘ　ｐｉｍ述のブＣ２７７、ｊｌイｙ　（
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）　；フロンスタイン等；エドワー
ズ（ｇｃｉｗａｒｃｉｓ　）　　；エドワーズ等及びが
イタ等（Ｖｏｙｔａ、ｅｔ　ａｌ）の出願に開示さまた
ジオキセタンの４−炭Ｘ原子の置換体であることかでき
ろ。Ｒ１及びＲ２が個々のｌｔ換陣であるとき、　Ｆｔ
２１Ｌ換１丁芳香族、ヘテロ芳香族又Ｉ丁芳香族壌と結
合した不飽和置換（４）であり。

酵素［よって脱離可能な不安定なその置換体が酵素によ
って脱離されるとき、Ｒ及びＲ２の少なくとも−万又は
両方）丁酵素によって開裂し得る不安定な基で置換した
螢光発色団であり、この螢光発色団は螢光物質Ｙ生成す
る。

このように１例えば、Ｒ２がスピロ結合してジオキセタ
ン環に結合した置換体であるとき、又は元の発生Ｙ妨げ
なく、結合するジオキセタン環の縦索原子の原子価を満
足し、４価のジオ千セタン劇の炭素原子となるとき、Ｒ
１は水素又警ゴ結合基でよいっＲ，）ゴ、９４ｊえは、
アルキル、アリールアルアルキル、アルカリル、ヘテロ
アル千ル、ヘテロアリール　シクロアルキル又’＋１シ
クロヘテロアルキル、例えは、１〜７炭糸原子ゲ有する
直知又は分板釦アル千ル基：１〜７炭素原子シ有する直
虻又は分ａ＠ヒドロモジアルキルＭ、Ｒが０１〜０２０
分ａ鎖又倉丁非分奴鎖。非ｆｌ換又ｉ丁置換。

飽和又を；不飽和アルキル、シクロアル千ル、シクロア
ルケニル、アリール、アルアル千ル又ハアルアルケニル
基でおり（そ４そ塩が付加的［８２に付き、その断片が
ラクトン塩又はＮ、Ｏ又ン；Ｓヘテロ原子含有基’に’
倉む）、又はジオキセタン環の４−炭素原子に直接結合
した酵素＃によって開裂し得ル基、又１丁酵素によって
開裂可能な基？含み。

直接若しくはｐＨの調節によって電子りヴデ部分（例え
は、ジオキセタン環に結合した窒素アニオン（例えば、
オ千シム又’ｔｔスルホンアばドアニオンのようなアミ
ドアニオン）、＠素アニオン、＊黄アニオン）？作る他
１７）前述のＲ１基のーつである。Ｒ２か単一でジオキ
セタンの４−炭素原子にｇ台するとき、Ｈｌは好ましく
１了アルコそシ１％に、メト千シであるっ Ｒ２もまた元σつ発生ケ妨けす、結合するジオキセタン
環ＩＩ）　４−炭素原子の原子価？満足する何機置換陣
であることができる。好ましくｉ了、Ｒ２ｋＸ収鋏の元
ケ放つ発蛍元団ケ杉成する蛍光発色団基であり、この偏
光発色団基か対応するジオ斥セタン分解断片に工坏ルキ
ー？吸収させ、刷起状態ケ形成し、そり状態からその動
片か任意の検出可能なエネルキ−ケ放出し、基底状態に
戻り、＠接又は引き絖きｐＨ？１Ｘｆｆｉすることによ
り電子りヴデなり泣、　ｆｌｌえば、ジオキセタン環に
結合した酸素アニオン、硫黄アニオン又ハ輩累アニオン
ケ生成するため、＃ｌ！素で開裂ｉＪ能なボンドＹ含む
酵素で開裂可能な基でｍＰする。

このようＫして、　ｆｌＪえば、Ｒ２のみＣ又はジオキ
セタン環の４−炭素原子に結合したスピロ置換体ケ与え
るＲ２と共Ｋ））言ｂ＊発色団基を示すことがて−きる
。例えば。

フェニル及びフェニル誘導−； ナフタレン並びに５−ヅメデルアミノナフタレ／−１−
スルホン酸及びヒドロ千シナフタレンのようなナフタレ
ン紡導洟； アントラセン基ひに９．１０−ジフェニルアントラセン
、９−メチルアントラセン、９−アントラセンカルボ千
シアルテヒド、アントリルアルコール及Ｌ）’９−フェ
ニルアントラセンのＪうなアントラセン豹導陣； ローダミン並びにロードール、テトラメチルローダミン
、テトラエデルローダミン、ジフェニルジメデルローダ
ミン、ジフェニルジエチルローダミン及びジナフチルロ
ーダミンのようなローダミン誘導−； フルオレセイン並びに５−イドアセトアミドフルオレセ
イン、６−イドアセトアミドフルオレセイン及びフルオ
レセイン−５−マレイミドのようなフルオレセイン誘導
−； クマリン並び［７−ジアル千ルアミノー４−メデルクマ
リン、４−ブロモメチル−７−メドーｒシクマリン及び
４−７０モメデル−７−ヒドロキシクマリンのようなり
マリン０４−： エリトロシン並びにヒドロキシエリトロシン。

エリトロシン−５−イドアセトアミド及びエリトロシン
−５−マレイミドのようなエリトロシン誘導体； アクリジン並びにヒドロ千シアクリシフ及び９−メチル
アクリジンのようなアクリジン誘導体；ピレン並びＫＮ
−（１−ピレン）イドアセトアミド、ヒドロキシビレ７
及び１−ピレンメチルイドアセテートのようなピレン窮
導体； スデにベアＭＵに６．６’−ジブロモスチルベン及びヒ
ドロキシスチルベンのよウナステルベン誘導棒； 二トロベ７ゾ千すジアゾール並ヒにヒトｏ４ジニトロヘ
ン／＝ｓｒｆジ１ゾール、４−／ロロー７−二トロベン
ズー２−オ干サー１．３−シア：／’　−ル。

２−（７−ニドロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾ
ールー４−イル）メゾルアミノアセトアルデヒド及び６
−（７’−二トロベン〆−２−オ千サ−１．６−ジアシ
ールー４−イル）アミンへ千すン緻のようなニトロベン
ゾ千すジアゾール紡導俸；キノリン並び［６−ヒドロキ
シキノリン及び６−アミノキノリンのようなキノリンｖ
５嬶不；アクリジン並びＶｃＮ−メチルアクリジン及び
Ｎ−７エニルアクリジンのようなアクリジンａＳ導捧；
アシドアクリジン韮び１に９−メチルアシドアクリジン
及びヒドロヤシ−９−メチルアシドアクリジンのような
アシドアクリジン飴導陣； カルバゾール並びＫＮ−メチルカルバゾール及びヒドロ
キシ−Ｎ−メチルカルバゾールのようなカルバゾール誘
導体： ＤＣＭ（レーザー染料）、ヒドロヤシシアニン。

１．６−ジフェニル−１，３，５−へ千すトリエン、１
−（４−ジメチルアミノフェニル〕−６−フェニルヘキ
サ）　ＩＪエン及び対応する１、６−ブタジェンのよう
なりｋ元シアニン； カルボシアニン並びに７エニルカルポシアニン及ヒヒド
ロ千シカルボシアニ／のようなカルボシアニン酩４−； ４（４−シアル千ルジアミノステリル〕−Ｎ−メチルビ
リジニウムイオテート及びヒドロ千シ置換ピリジニウム
鳴りようなヒリジニウム塩；オクンノール；及び レゾロフィン及びヒドロヤシレゾロフィンでおる。

Ｒ２ｉｔ　Ｒ□と共に縮合した螢光発色−基を示すこと
ができ、スピロ結合ケ通してジオキセクン環の４−戻累
原子に結合している。Ｒ２は次の一般式％式％ は−ＮＦ１６であり、Ｒ４，Ｒ５及びＲ８のそれぞれは
独立に水素、１〜２０の炭素原子會有する分枝鎖又は直
鎖アルキル基１例えは、メチル　ｎ−ブチル又はデシル
、１〜７炭素原子シ有する分枝鎖又１工ｉ＆釦ヘテロア
ルキル基１例えば、メトキシ、ヒドロ千ジエチルヒドロ
千シフロビル：１又ｉ２２のリング會有するアリール基
１例えば、フェニルナフチル又Ｖ了アントリル；１又１
工２のリング會有するヘテロアリール基１例えば、ピロ
リル又ハヒラゾリル：３〜７の炭素原子會有するシクロ
アル’！’／’ｉ、ｍ中Ｋ例えば、シクロヘキシル：６
〜６炭素原子ケ有するヘテロシクロアル千ル基、塩中に
例えば、ジオ千サン：１又は２のリング會有するアルア
ルキル基１例えば、ベンジル：又）’！１又は２のリン
グ會有するアルカリル基１例えは、トリル；並びに各Ｒ
３は独立に水素：１〜７炭素原子Ｙ有するパーフルオロ
アルキル基のような電子引き抜き基、　ｆｐＨえは、ト
リフルオロメチル；ハロゲン：ＣＯ□Ｉ（、−ＺＣＯ２
Ｈ，−８ｏ３）１．−ＺＳＯ３ｆ（。

−Ｎｏ□、−ＺＮＯ□、　−Ｃ：ＥＮ又は−ＺＣ＝Ｎ　
（ここで、ｚｔｓｉ〜７の炭素原子會有する分枝鎖又は
直鎖アルキル基、　９’ｌＪえは、メチル〕；１又は２
のリングを有するアリール基１例えば、フェニル；電子
供与基１例えば１分枝鎖又ｌＬ丁Ｉｔ鎗０１−０７アル
コヤシ基１例えば、メトキシ又はエトヤシ：１又は２の
リング會有するアルアルコ千シ基、飼えは。

フェノ平シ：分ａ鎖又は直鎖Ｃ１〜Ｃ７ヒドロキシアル
キル基１例えは、ヒドロキ７メテル又）エヒドロイシエ
テル：１又は２のリング％”ｂ−ｆるヒドロキシアリー
ル基、　’ＦＩＪえは、ヒドロ千ジフェニル：分枝録又
は直輸Ｃ工〜Ｃ７アル千ルエステル基１例えば、アセテ
ート；１又は２のリング會有するアリールエステル基１
例えば、ベンゾエート；又は１又は２のリング１有する
ヘテロアリール基１例えは、ペンツ千すゾール　ベンズ
チアゾール、ベンズイミダゾール又はベンズトリアゾー
ルである。

さらに、２以上のＲ３はそれ自身置換され、又は置換さ
れないリング又は縮合したリンフケ形成できる。

Ｒ２は単独で又はＲｏと共に同様に、開裂するとき縮合
した多環式＋７）部位Ｉｋ−電子リッチにし、順にジオ
千セタ／化合物ケ分解可能としｙｆ：、１に一放出させ
るボンドを含む不安定なリング置換に？有する特別なり
ラスの縮合した多環式リング含有発餐光圓酢位であるこ
とかできる。ジオ斥セタンリンク（＄に合又はＲｏかボ
ンド、スピロ結せケ示すとき）Ｋ付層しｒここのリング
１１７）廣に関連し℃、１合した多塩式リングに付層し
た不安定なリングＩｆ僕本の点が、付着の点でのｓｐ　
　リンク炭巣原子？含めて。

これらり河渣の点ケ分龜するＢｐ　　ＩＪング炭Ｘ原子
の全ｂの紅か奇数である。こりようにこのクラスか４成
されろＣエドワーズ等′６７２出願参照〕。

残怪物かこの発ｉ光団を形成するために使用できる縮合
した多環式リング化合物の中にをゴ、上述の綜合した多
環式３香族炭化水素リンク発螢光団化合物が含まれる。

、特に、９〜３０のリンクの炭素原子ケ含むもの３例え
ば、ナフタレンであるつここで、に楔結合は１．６−１
を換パターンヶ示す。

例えば、ジンジウム６−（ ４−メメトキシスビロ 〔１，２−ジオ千セタン−３，２’　−（５’−ヒドロ
キシ〕トリシクロ［３，３，１，１”］］デカン〕−４
−イルンー１−ナフタレニルホスフェートペンタレン。

アスレン、ヘフタレン、ａＳ−イノダセン、Ｓ−インダ
セン、ヒフエニレン、ペリレン、アセテフテレン、フェ
ナントレン、アントラセン、アセフェナントリレン、ア
セアントリレン、トリフェニレン、ピレン、チリセン、
ナフタセン、そＱ）袖である。Ｉｂ」様に、上記したＲ
３．Ｒ，及びＲ５で示した一つ以上の安定なｍ：換隣で
ｆｉｌ！＊ｔ、たそれらのＢ導体も含まれる。

Ｒ巣独又を工Ｒ１と共に示される奇数パターン置換発螢
光部位の縮合しに多環式リング部分は非芳香族の残基で
もまたよい。即ち、開裂するとき。

縮合した多産式部位ｒ全部が芳香族の多環式部位よりも
少なく電子りヴテとし、順に、ジオ千セタン化合物を分
解可能として光？発生させるボンドを含む不安定なリン
グ置換体會有する。芳香族の少ない縮合しに多環式炭ｆ
ヒ水素すンク発紮尤団化合物でよい、フルオレン、６．
４−ジヒドロ−６，５−シメナルナフタレン、ジベンゾ
スベレン、９．１０−ジヒドロフェナントレン、インデ
ン、インデン（１，２−ａ〕インデン、７エナレ／、フ
ルオロアントレンその他のような１０〜６０の珈状炭巣
原子を含み、ＰＪＩ］述の一つ以上の安定な直！１！不
で置伊さｔ″ｌたものされないものも言む。

さらに、Ｒ＄独又’ＴＸ　Ｒよと共に示さｔ′ｌる発彊
光上部位の縮合した多塩式リング部分１了縮合した多環
式へテロ芳香族又は金座的に芳香族性のエリ小さい縮合
したリングへテロ環式発４Ｍ光団形成基の残基であって
もまたよい。ｂえば、ジベンゾチオ７エ／、ジベンゾフ
ラン、２．２−ジメチル−２Ｈ−クロメン、千サンテン
、ピペリジン、千ノリンインキノリ／、フエナントリジ
ン、カルボステリル、７アエノ千サジン、フェノデアジ
ン、フェナントロリン、プリン、フタラジン、ナフチリ
ジン。

Ｎ−７シリンドール、クロマン、インクロマン。

Ｎ−アシリントリン、インインドリン等、一つ以上り前
述の安定なＩＬ埃内と置換したもの又は置換しないもの
、かつ、９〜６０の環状原子ｔその大部分を１炭素原子
である。）である。

酵１Ｅによって脱離しうる番であって、少なくともＲ１
とＲ２のうちのひとつかに声さｊているもσ」の好まし
いものｉ了以下の一般式で表されるホスフェートエステ
ル基である： ここに、Ｍ”　）２列えはナトリウム、カリウムＱ）よ
うなアルカリ金楓、アンモニウム、またはＣ１−Ｃ７の
アル千ル、アラル千ルまたは芳香ｉ４＆アンモニウムカ
チオン、　Ｎ　（Ｒ７）＋４．ここで、それぞれの８７
を丁メチルまたｃ２エチル等のアルキル。

ｆｌＪ、ｔばベンジルのＪうなアラルキル、または例え
ばピリジンのような複素環であることができるウニナト
リウムｔＪｉ）ま特に肚ましい。そのようなホスフェー
トエステルは飼えはアルカリ性ホスファターゼによって
開裂され、＃に累アニオン置換基？生成し、これ）工次
いでその酸素−酸素結合の破断によりジオキセタ７ヶ不
安テにし光４発する。七のＪ’ｌなホスフェートエステ
ル基中り４級アンモニウムカチオンはポリマー骨格にそ
の４数基ＩＸ′通しくＩＶ） ここで、ｎは１Ｊりも大きく、またはポリ４級アンモニ
ウム塩、すなわちイオネンホリマーの一部であることが
できる。

他の好ましい酵素によっ℃転移しうる基はβ−Ｄ−カラ
クトサイド基であり、これは酵素ガラクトシダーゼによ
り開裂させることができ、ジオ千セタンフェル−トの共
役酸か得られ、これ）了調整されｅｐｆ（において化学
発光性である。

使用できる酵素により開裂しつる＆換基には。

酵素開裂ｌ１ｌＴ舵なオ千すカルボ千シレート、１．ｉ
−ホスホ−２，６−ジアジルアリセライド基、１−チオ
−ローグルコサイド基、アデンシントリホスフエートア
ナローグ基、アテノシンシホスフェートアナローグ基、
アデノシンモノホスフェートアナローフ基、アテノシン
アナローグ基、α−Ｄ−ガラクトサイド基、β−Ｄ−カ
ラクトサイド基、α−Ｄ−グルコサイド基、／ｊ−Ｄ−
クルコサイド基。

α−Ｄ−マンノサイド基、β−Ｄ−マンノサイド基、β
−Ｄ−フルクトフラノサイド基、β−Ｄ−グルコサイデ
ュロネイト基、ｐ−トルエンスルフォニル−し−アルギ
ニンアミド基がある。

置換さｔまたアダマント−２−イリデン部分であり、ジ
オキセタン環の６−炭素にスピロ結合した部分２前記式
ＩＫ示されている。は他の同様に置換された。２以上の
連結されたＢＸＸ官有る連結されたポリシクロアル千リ
デン基であり１例えばビシクロ（３，３，はノナン−９
−イリデン、へ千サシクロ［３，３，１，０，”−６０
，３・１００．４・８０９“１３〕トリデカン−５−イ
リデン、ペンタシクロ（３，４，０，０゜３°６０．３
・１００．５・９〕ウンデカン−４−イリデンおよび類
似のものであり、そ４そｔ’ｔ１７）ｆｆｉが６から１
２の炭素原子ゲ有する。

ＰＣＴ出転ＡＷＯ８８１００６９３，１９８８年１月２
８日［Ａ開さｔ’ｌ　、　Ｂｒ０ｎＳｔ６ｉｎ’　Ｆ３
２５の出願に基づ＜、’＋２ｍ紫により″Ｃ開裂し得る
１、２−ジオキセタン類であり、３−炭素が＠Ｔ−Ｖ”
で定義さハる１１ｔ、換基および４−炭素が３Ｘ”およ
び１Ｙ−Ｚ″で定義される１換基で置換されているもの
ケ開示する。この公開さｊた出願はさらに以下Ｖ開示す
るり 第３頁６−１２行： 好ましい実施態様を了、１またはそれ以上のＴ。

Ｘ、Ｙが可溶性の置換基１例えばカルボン散、スルホン
酸、または４＠アミノ塩？有しニジオキシエタンのＴｔ
！ポリシクロアル千ル基であり、好ましくはアダマンチ
ル基であり酵素により開裂可能な基はホスフェート？含
み：酵素はホスファターゼ活性Ｙ有するものである 躯２２頁３３行から２６員６行 例えは、酵素によって開裂可能な基ＺはＹ基で１丁なく
ジオキセタンのＸ番と結合することができる。代表的な
親相性物１ｉは酵素ではなくＸ、Ｙ。

またはＴ＆、好筐しくけＸ番、ケ通してジオキセタンと
結合し榊るっこの場合には代表的な親和性物質が結合さ
れた基１例えはカルボン葭、アミンまた２丁マレイミド
のような番が結合ケ谷易にするために供さｒるつ 第２６頁１１−２１行 ジオキセタンのＸ、Ｙまたを；Ｔ基Ｙ丁１例えはビニル
基のような１合ｃｉＪ舵でホモポリマーまた）言コポリ
マー２形成できる基と結合することができる。

ジオキセタンのＸ、Ｙまたシ丁Ｔ基は９′１．１えば膜
。

フィルム、ビーズまたはポリマーと結合され、免疫検定
またシ；核＃の定量の用途に使用されろうこの基１Ｊ例
工はカルボン酸、アミンまたはマレイミド置換基ととも
に供され、結合ケ容易にする。

ジオキセタンＣはＸ、ＹまたはＴｌは例えば電子の多い
部分１例えばメ）−？シ基のようなジオキセタン酵素の
デグラデーシッンの動力学ケ高める置換基り含むことが
できる。

ジオキセタンのＹまたシアＴ蟇シ了Ｘ基と伝ｊ様口」溶
性ａ換基を含むことかできるっ ここＶｃ開示されクレームさＶた。６−Ｃ置換アダマン
ト−２′−イリデン）−１，２−ジオキセタン類により
解決された問題１丁この公開さｒたＰＣＴ出願＆？ｊ二
機出されておらす、こｔらの１１合物は開示され１いず
１発明者かそ１に気付いｒこといういかなる言及もされ
ていない。

３−（ＩＩ換アダマント−２７−イリデン）−１，２−
ジオキセタン類の金木の合成は例えは上述のＢｒ０ｎＳ
ｔｅｉｎとＥｄｗａｒｄｓ　ｃｔｙ出り、およびＥｄＷ
ａｒｄＳらの１９８９年９月６日出願の米国特許出願番
号２７９．１７６（’　１７６出願〕に開示されている
。ゆえＫ例えは上記の式１で表さ４る１、２−ジオキセ
タンであって、Ｘはヒドロキシ基、Ｘ′は水素、Ｒ□は
メト千シ基、Ｒ２はホスホリルオキシ塩置換フェニル基
、好ましくはメタ−ホスホリルオキシ塩１ｉｌｉ換フェ
ニル基であるもＱ〕が′１７６出願（開示されに、ｖＡ
式的ＫＷ下のように表される反応経路により合成され得
ろう 以下ＫＥ９４確に劉示されているように、出発物質０−
Ｃ；Ｈ−ＯＲ，は望むならば１例えばトリメチルオルト
フォルメートりようなオルトフォルメート。

メタノールおよびｐ−トルエンスルホン酸と反応させ以
下の中間生成１１！１％’与えることができへ：ここて
７．　（Ｒ８の３Ｐ　　おＪひルイス酸と反応させた町
１；以下σヲホスホネートエスデル中間（４）Ｖ与える
： 前述の反応転路においてＲ８は駅素原子１２から約１４
の低級アルキル基であり、アセチル、７０ピオニル、メ
シトイルおよびピバロイル？含み。

Ｑは例えば場素、臭＊’、）！うなハロゲンまたシボＯ
ＦＩ。

であり　Ｍ　）丁独立に水素１例えばＮａ＋やに＋のよ
うな金楓カチオン、アンモニウム基、１［Ｌアンモニウ
ム基、四級アンモニウム基またはＣＨ＋）ビリジニウム
カテオンケ示す。Ｅｄｗａｒｄｓの出願′１９７に述べ
られているように、デオレートー裂は上述の反にｋＥ路
のステツ７’　５　ＫおけるＯＲ，基の塩基開裂の代わ
り［＆用することができ、その場合Ｒ９ハ＄４えはメチ
ル２アリ先およびベンジルのような低級アルキル、低級
アルケニルまたはアラルキル基であることができるっ塩
基またシ丁デオレート開裟の生成物はＲ９σつ代トリに
水素また１ば倒えにリチウム、ナトリウム、カリウムの
よ５　ｆｘアルカリ金楓カデオン１句することかでさる
（同日に出願さｊた四時粘絖出１であるＥｄｗａｒｄｓ
らの米国出に、１に４ＥｊＣ代理人贅理査号１９１／２
８９ノド照）。

上記り中間体は以下の式で表さｔする。

ここに、ＸおよびＸ′　の内のひとつが水素でない化合
物のみが公知であるか、または公知の手段により公知の
出発物置から合成可能である。例えば、モノａｍアダマ
ンタンー２−オンｒｘｈｗびＸ′　のひとつが水素であ
る〕がある：５−ヒドロ千シアダマンタンー２−オンは
Ｇｅ１ｕｋ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　、　３７４　（１９
７２）　に記眠すｊている方法で合成できる： ５−クロモアダマンタン−２−オンおよび５−クロロア
ダマンタン−２−オフ１丁ＣｒｅｌｕｋらのＴ８’Ｃｒ
ａｎ８ｄｒＯｎ、２４．５３６９（１９６８）Ｋ記載す
れている１方法で合成できろう ここで、Ｘまにに２Ｘ”を丁フロオロ基、ｔ−ブチル基
りような非置換（瘍；級〕アル千ル基、トリフルオロメ
チルのＪうなＩＬ換Ｃ砿級ンアルキル基。

フェニルのような非ｍ換アリール基またはｐ−クロロフ
ェニル、ｐ−メトキシフェニル、マたヲ；ｐ−ニトロフ
ェニルのような＠Ｌ換アリール基である。

Ｓｏｃ、、１０９．６７１９（１９８７）ｗ＃解（Ｘま
たはＸ′　はヒドロキシメテル基である）。

簡単な単位操作または他の公知技術により上記のＸまた
はＸ’　　Ｉｉｉ換基のいくつか％−５−Ｘ−またｈｔ
Ｘ’−７ダマンタンー２−オンに変える事ができ。

ここでＸまたはＸ′　はトリアル千リシリルオキシ。

ヨードまたをゴシアノ基であることができる。これらの
部分は前述の反応シーフェンスのステップ４でのマイル
ドな条件下では安定である。例えは。

５−ヒドロキシアダマンタン−２−オンシェフ時１Ｓｔ
ｌ。

５７％のｘ５（ヒ水素素緻とともに還流さ１．５−ヨー
ドアダマンタン−２−オン（融点７３−７５度）か得ら
れる。５−カルボ千シアダマンタンー２−オン）Ｘ　Ｌ
ａｎｔｖｏｅｖ、　Ｊ、０ｂｓｈｃｈ、Ｋｈｉｍ、　、
　１２　。

２３６１　（１９７６）まｆ：２’Ｚ　Ｌｅ　Ｎｏｂｌ
ｅらＪ、Ｑｒｇ、Ｃｈｅｍ、　。

４８．１１０Ｈ１９８３）Ｋ記載さ７１”Ｃ−い４Ｊ５
［合成さね、メチルエステルのけん化によりＴａｂｕｓ
ｈ　１Ｅ−）　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　、　３８　、
３４４７　（ｉ　９７５）の６段階の手順により５−シ
アノアダマンタン−２−オンに変化さｔｌ、ケトアミド
の中間体を経由してインメリック１−シアノアダマンタ
ン−２−オンへと変化される。５−ヒドロキシアダマン
タン−２−オンの保護された形として有用である５−ト
リメテルシリルオ′ｆ７アダマンタンー２−オン（融点
３４−３１Ｈｌ）ｈｘ前述の反応シーフェンスのステッ
プ４における塩基と等当量と反応し対応するエノールエ
ーテルされ、さらに常用の手段＆にリジ７リル化される
。

当業者にとって紹緻されるように、他のＸおよよびＸ′
　基は反応経路全Ｋにおいて静的である必要はないが、
どの段階においても他の構造？考慮してふされしい反応
［Ｊ’７を化させることができる。例えば、ＸまたはＸ
′　がａ累またを丁巣累原子である時、前述の反応鮭鮎
のステップ４と５リ工ノールエーテル中間午成＊は、高
温容器中のジオールまたハ敵陣アンモニアのモル過剰の
存在下でンルボリシスに供される。エデレ／グリコール
または１０ピレングリコールのようなジオールとの反応
速度は１例えば炭酸カリウムのようなプロトン受答−の
存在下、昇温条件下（１０５−１２０度）においてのみ
感知さられようＫなる。一般に。

この反応は遅いが１！ｌ］反応はなく銀また一工重金属
の塩がヒドロ千シアル牟ルエーテル形成を刺激するため
Ｋしばしは利用される。３−（メト呼シー５−（２−ヒ
ドロ千シェド雫シ）トリシクロ（３，３゜１．１３°７
〕デック−２−イリデンメチル）フェノールはトリメチ
ルアセデルクロライドとトリメチルアミンによりエステ
ルｆヒさ九対応するジエステルヶ与え、それはその後メ
タノ−、ル中で炭酸カリウムの存在下選択的に開裂され
、フェノール性モノエステルケ与える。加燐酸反応のス
テップを確実にするために、保論されるエステルＶメタ
ノール中ナトリウムメトキシド［Ｊり四時にβ脱離とけ
んｆｔＪ’Ｌ、　　ヒドロ千シェド千シエノールエーテ
ルホスフェイトケ得るう 加田下、ジオキサン中の敵陣アンモニアトノ反応で３−
（メトキシ−５−アミノトリシクロ〔６゜３、ｔ、ｉ”
・７〕デック−２−イリデンメチル）フェノールを与え
る反応は対ｒのｆる５−臭化化合物より。

Ｈｕｍｍｅｌｅｎ、　ＤｉＳＳ６ｒｔｉＯｎ、　Ｕｎｉ
Ｖ８ｒＳｉｔｙｏｆｅｒｏｎ　ｉ　ｎｇｅｎ　、オラン
ダ、　ｐ、６［］（１９８５）　　に記載された手法に
より行われる。得られたアミノエノールエーテルフェノ
ールの直接のアクリル化は。

アセデルクロライドまた）ゴアセティブクホルミックア
／ハイドライドと塩基としての４−ジメデルアミノビリ
ジンＹ当量使用し、（５−ヒドロ平シアダマンデリデン
）エタノールのエステル化につイテ使用さｔｌ　ｅ　Ｇ
ａＷｒＯｎＳｋｉら、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

１０９．６７２６（１９８７）の手法で行われ、ホルム
アミドまた管；アセトアミドフェノリツクエステルケ与
え、そｔ’Ｎ丁上紀上記示されているように選択的にけ
んずヒされ、筐たち下［開示さ４℃いるように加燐酸化
さ４１元酸化される。

Ｍｅｉ３ｅｒ　、　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔ７ｏｎ、　Ｌｌ
ｎｉｖｅｒｓｉ　ｔｙＯｆｅｒｏｎｉｎｇ６ｎ、　オラ
ンダ（１９８２）　；　Ｎｕｍａｎら。

Ｊ、Ｏｒｇ、Ｇｈｅｍ、　、　４３　、２２３２１９７
８）　；　　およびＦａｕｌｋｎｅｒら、　Ｊ、Ｃｈｅ
ｍ、Ｓｏｃ、　、　Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍ、　。

３９０６（１９７は　　は、前述の反応経路のステップ
４および適当なホスホネー）ＫＪり安定化されたカルバ
ニオンとの反応サブシーフェンスのための出発物置４−
メチレンアダマンタン−２−オン（Ｘおよびｘ′＝水素
、メチレンであって上記の式ＩＫおける４′　位）への
道筋Ｙ提供するう一重項酸素はエキンメテレン基よりも
エノールエーテルに対して反応性があるのでｙｔ＃！化
の生成物としてＭＷにジナトリウム３−Ｃ４−メト牟７
スビロー（１，２−ジオキセタン−３，２／　　ｒ　４
／−メデレン〕トリシクロ（３，３，１，１３・７〕−
４−イル）フェニルホスフｓ　−）が俸らねる。

リン酸エステル基のような＃Ｘによって脱離し得る基の
付加ケ直ちに進行せしめる反応１’ｍＪ：りて。

選択的に開裂し得るピバロイルオキシアリールエノール
エーテルが得られるならば、ヒドロキシエノールエーテ
ルの分離Ｖより簡便に回避できるであろうつこれ一丁、
メタノール中でピバロイルエステルイー当量のナトリウ
ムメトキシドで分割し。

反応後の全ての揮発成分ケ除去しアリールオキシドナト
リウム化合物會乾燥固形物として分離することＫよって
達成されろ、そのような場合、先の反応であるＷ、６段
階においては、かかる頃？乾燥した非７°ロトン性極性
溶媒１例えばルイス塩基を用いないジメチルホルムアミ
ド中で引き続き用いることができ、ａ生成物である無機
塩は第７段階又は第８段階において除去さｒ−る。

Ｉｌ！７段階の生成物である２−シアノニブルホスフェ
ートジエステルはβ脱離？起こし第８段階ではりン畝モ
ノエステルとなる。第８段階では、Ｘ又はＸ　か塩素又
は臭素である豹導体は好ましくはアンモニアのような揮
発性アミンと反応するか。

又は例えばメタノールのようなアルコールに可溶な溶ａ
ａＪ溶性有機アばンであるＤＢ（Ｊ（１，８−シアサビ
シクロ〔３，４，のウンデカ−７−エン）と反応するっ
過無の塩基は反応の終了時に真空下で容５３に揮発する
ため、大気圧下又１；それより高い圧力下で、塗龜にお
いてアンモニアＹ用いることは特に脣効である。

先の反応である第９段階でン；、引き続きエノールエー
テルホスフェートの酸化が光化学的に起きる５反応はハ
ロゲン化さねた溶媒中で一重項酸素（１０，）　　とと
もに起きるうハロゲン化された溶媒とはガえばクロロホ
ルムのようなハログ／化辰化水累であり、さらにメタノ
ールのような低分子量アルカノールを共存溶媒として含
んでもよい、−ム璃＃Ｘは光増感剤を用いて発生させる
。光増感剤としては、高分子忙結合したＲｏｓｅ　Ｂｅ
ｎｇａｌｔＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ、）　
、メチレンブルー、又は５．１０．１５．２０−テトラ
フェニル−２は１．２３Ｈポルフインｒ　”ＴＰＰ“）
がある。

先の反応のＩＥ７段階で得られに２−シアノエデルホス
フェートジエステルは−ＩＬ墳緻素と反応して酸化さｔ
ｌｌ、２−ジオキセタンの相当物となる。

さらにメタノール中、室温でメタオキシドナトリウムと
反応させ、引き続き水溶液中で操作し２逆相為圧ｆＩ！
Ｌ体クロマトグラフィーによって、純粋な１．２−ジオ
平セタンホスフェートモノエステル塩のシン（５ｙｎ−
）とアンチ（ａｎｔｉ−）　の’ＩＭｓ合勧か得られる
つ又、三１項眼集の存在下でトリエチルシリルヒドロト
リオ千シト、ホスフェートオシニド又はトリアリルアミ
ンのラジカルカチオン媒陣の一電子酸化ケ含む１，２−
ジオキセタン生成の化学的方法も用いることもできる。

出発物置の構造は以下のうりである。

ここでＸとＸｌは同じであり、かつ水素以外のものであ
る。従来技＃によって合成された出発ｍ質の中間−も既
知である。例えは、先の反応の第４段階における対称に
ｒＩＬ換された５、６−ビス−Ｘ。

Ｘｌ−アダ”１７タンー２−オフｆｇ、Ｓｙｎ　、！：
　ａｎｔｉの関係ともＸ及びＸｌが置換さねジオキセタ
ンの四Ｍ環？もつ対称な１，２−ジオキセタンとなる。

ＳＴ、ｅｔ、ｔｅｒ　らの千ノンモノアセタールにもと
づく合成方法は、ビシクロ［：３．３．はノナン−３，
７−シオンー９−エチレンアセタール？触る５、７−ジ
ヒドロ千シアダマンタンー２−オンの合成１に′可能［
Ｌ　ｅ　ｔ　５ｔｅｔｔｅｒ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｌｉｅ
ＤｉｇＳ　　Ａｎｎ、Ｃｈｅｍ、。

１　８０７（１９７７））　　。　　Ｈａｍｉｉｌ　　
ｅ’電：、ａｌ、、Ｔ６’電；、ｒａｈｅ−ｄｒｏｎ、
２７．、Ｒ３１７（１９７はも参照のこと。

５、７−シヒドロキシアダマンタンー２−オンを５．７
−ジプロモアダマンタンー２−オン又はその５．７−ジ
クロロ及び３，７−ジ■−ド誘導−にすることができる
。このためＫ　’ｔｔ　Ｇｅ１ｕｋ　　らが述べている
条件下で、臭化水素酸の４７％水Ｌｌ液、塩化チオニル
又はヨウ化水素酸の５７％水Ｌ！し％’用いる。３，７
−シメチルアダマンタンー２−オンのような５．７−ジ
アルキルアダマンタンはＫｉｒａらの方法によって合成
することができる（　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓａｃ、、１１１．８２５６（１９８９））。炭酸カリ
ウムの存在下でエチレングリコール又ハ１．４−ブタン
ジオールのようなジオールと３−（メトキシ−３，７−
ジブロモトリシクロ［３，３，３，１３・７〕デカ−２
−イリデンジメチル）フェノールは加溶媒分解し℃。

対応する対称のビスーヒドロ千ジアルコキシ基が１１１
１さまた１、２−ジオキセタンとなるっＸ基によって生
成さｒＬにＦｆｂ１酋」的効果ケ有効に用いるＫは、異
性体の混合物として＃Ｘによって開裂し得る１、２−ジ
オ千セタンタ用いることが有効であり、非対称（は５．
７（Ｘ、Ｘ”）　　アダマンタン−２−オン？先の反応
の第４段階で用いるっＸ基は水素以外のものでＸ　基と
は異なる。５−ブロモ−７−ドリフロオロアダマンタ／
−２−オンは５ｏｒｏｃｈｉｎｓｋｉ　ｉ　　らの方法
によりてｌＸ製することかできル（Ｚｈ、　０ｂｓｈｃ
ｈ、　Ｋｈｉｍ、　、　１７　、２５５９（１９８は几
　５−クロロ−７−ヒトロキシアダマンタンー２−オン
及び５−メゾルー７−とドロ千シアダマンクンー２−オ
ンｊＸ　５ｔｅｔｔｅｒ　　ラによって述べられている
うそして、５−ブロモ−７−ヒトロキシアダマンタンー
２−オンは７−メテレｙビシクロ（３，３，はノナン−
６，９−ジオン−９−エチレンアセタールも５ｔ６ｔｔ
６ｒ　らの手＃ｉに従って合成することができる。この
手動ＫＪｒば、かかる化合物ｖ煕水エタノールに溶解さ
せ、＃液を０℃において共化水素ガスでｔｅｒ和させる
。美１ヒ水集カスは塩化物鰐導体Ｖ得るための塩化水素
ガスの代わりである。

構造式１で示さする化合物の合成方法とその中間−ハ前
述１７）ＢｒＯｎＳｔ８ｉｎ、　ｆｉ：ｄｗａｒｄｓら
の出願（’６７２）ｖｃ開示さねている。構造式１中、
Ｒ８は低分子皺のアルコ千シ基鈎外のもので、Ｒ２はホ
スホリルオキシ塩で置換さまたフェニルＩｋ以外のもの
である。

前述のように１本願発１ｊ１３は従来技術の分析法にお
いて、化学発光性、酵素によりて開裂し得る置換さｔｉ
た１、２−ジオキセタンの用途ケ目的とするものであり
、あわせて試料中の酵素検出の分析。

その分析装置及びその用途を達成するための手段４目的
とするものである。

例えは１本願発明？試料中ｆＪｆｉｌ素の検出に用いた
場合には、試料は検出さ４るべき酵素によっ℃開裂さｔ
ｔ４るジオキセタン産生基と隘触せらｉるっ酵素−エジ
オ千セタンのｍ木によって開裂され得る２Ｍ％４ｉ４鋏
し、ジオキセタンに結合した負に帯電した置換基（例え
ば＃に寓イオン）ｋ形ｇ、する、かかる負に帯電した置
換基は逆にジオ平セタン會不安定化し、ジオ律セタンの
分解によって光エネルギーケ発する蛍光発色団を杉成す
る。酵素σつ存在會検出するのシ；この発色団である。

発光強度Ｙ叱定することＫよって＃ｉＩ：料中の＃巣の
濃度ケ決定することができるう 試料中の特定の物質の濃度又は存在Ｙ知るための視覚的
な検出方法にも広く適用できるｅ＃述のジオキセタンは
かかる方法に用いることができるっそｃｖ！５な分析方
法の例とじてを丁、γ−又はβ−ｈＧＧのような抗原又
は抗体を検出するイムノアッセイ、酵素分析、カリウム
又はナトリクムイオンを検出する化学的分析、ウィルス
（例えばｆ（ＴＬＶ鳳若しくはサイトメガロウィルス又
はバクテリア）Ｖ検出するＭ［分析などがある。

検出さ４るべき物質が抗体、抗原又は核酸である場合、
ジオキセタンの酵素−裂基Ｖ−裂し得る酵素は、検出さ
れるべき物質と特定の親和力なもつ物質と結合する（丁
なわち、検出さｔするべき物質と特定の結合ケする′＠
負である〕っカルボジイミドのカッブリングのような通
常の方法によって。

特定の親和力ＹもつｇＩＪ質と酵素と２結合させるっ結
合は好ましくはアミド結合によってなされるっ一般に分
析は以下の様に行われる。検出丁べき！１１！ｌ１ｉｊ
！か含まれているとおもわれる試料ケ、検出丁べき′４
ｔＪ質と特定の親和カケもつ物質と結合した酵素ケ含む
緩衝溶液と接触させる。そして特定の親和カケもつ酵素
化合物の特定の親和力Ｙもつ部位と検出されるべき物質
が結合するように、その溶液Ｙ培養するつ過剰の特定の
親和力Ｙもつ酵素化合物Ｙｅ＃：、い流し１％定の親和
カケもつ酵素化合物の酵素ＦｉＢ位によって開裂され得
る基ＹもつジオキセタフＶ加える。１１１１木ヲ：、酵
素によって開裂され得る基を開鋏せしめ、ジオキセタン
は分解して二つりカルボニル化合物となるイ例えばエス
テルケトン又はアルデヒド〕。酵素によって開裂さね得
る基が結合している発色団は励起さｔ′１発光する。

発光な検出することで試料中の桝出丁べき物質の存在が
示唆さ４るＣ検出には例えばキエベヴト、カメラルミノ
メータ−ＱＪＷ＆光性フィルム、元電七ル又は元電子壇
倍電を用いる）。発光強度から物質の濃度ケ決定する。

以下に検定＋７Ｊガケ述べる。

Ａ、ヒトＩｇＧの検定 ９６個のシェルｒ４つマイクロタイター板に羊抗ヒトｒ
ｇＧ（Ｆ（＆ｂ）２断片）　’に’１ｌｌＦＴ　ｋ、　
と）ＩｇＧ％’含む液Ｙウェルに加え、そのウェル１ｊ
ｆ１時間呈温で培養する。所定時間経過後、試料溶液を
ウェルから除去し、０．１５Ｍの塩化ナトリウム。

０．０１Ｍのリン酸塩及び０，１％のウシ血清アルブミ
ンＹ含むｍ＊＊液ｃｐＨ７−４）で四回洗浄すル。

抗ヒ）ＩｇＧ［結合しているアルカリ性ホスファターゼ
？各々のウェルに加え、１時間培養する。

ウェルＶ前記緩ｌ１ｉＩＷ液で四回洗浄し１本願発明の
リン酸塩を含むジオキセタンの緩衝賂液を加える。

ジオキセタンの酵素による分解で生じた発光しルミノメ
ータ−又はカメラルミノメータ−の写真フィルム［Ｊ：
つ℃検出する。

Ｂ、　　ｈｃＧの検定 ウサギ抗−α−ｈｃｃ、　ｖナイロンメツシュｍ上に＠
着させる。ｈｃｅ　　ケ含むに科浴液０例えば姶娠した
女性の尿Ｖ膜［［じｆゼる。０．１５Ｍの塩化ナトリウ
ム、０．０１Ｍのリン酸塩及び０．１％のウシ血清アル
ブミンな含む＊＊溶液ｔｐＨ７，４）１１でＩＩＩＩｌ
ｋ′洗浄する。アルカリ性ホスファターゼケ＃敵した抗
−β−ｈｃＧ　％’ｉ［加え、膜シ前記緩ｇｆＩ溶液２
ＩＩ７で再度洗浄する。験？ルミノメータ−の千エペッ
トに据えるか又はカメラルミツメ−ターに据え１本発明
のリン酸塩？含むジオキセタンと接触させる。そして、
ジオキセタンの酵素分解による発光Ｙ検出する。

Ｃ，血清アルカリ性ホスファターゼの検定０．８Ｍの２
−メゾルー２−アミノブロバノール？含むａｍ水溶液２
．７ｙａｌｌｋ−１２Ｘ　７５ａｘ角のパイレブクス試
験管に入れ、これにアルカリ性ホスファターゼ？含む血
清試料０．１ｄ％’加えるっこの溶液？３０℃で平衝状
態にてるつそして本願発明のリンａ＆Ｙ含むジオキセタ
ンＵ、　２　ｌ１ｔｋ加え、直チニｘｍｔｖルｉツメ−
ターに据え付叶発党ケ記録するつ光放射のレベルはアル
カリ性ホスファターゼの活性度の割合に比例するう サイトメガロウィルスが含まれているとおもわれる脳１
４′蝕液（ｃｓＦ）試料Ｙ集め、ナイロン又はニトロセ
ルロース膜上におく、尿素又はグアニジニウムイソデオ
シアネート？用いて試料？ｒ’ｆヒ学的に処理し、ｍｕ
壁ケ破壊してウィルス性ＤＮＡのみ％−喉り出丁つかか
るウィルス性ＤＮＡ鎖は１分離さねニトロセルロースフ
ィルターに付着する。

ウィルス性ＤＮＡに特異的でかつアルカリ性ホスファタ
ーゼで＊＊＊されたＤＮＡプローブケフィルターに加え
る。プローブはウィルス性ＤＮＡ鎖とと相補的にハイブ
リダイズする。ハイブリダイゼー７曹ン後、過剰のプロ
ーブ分子はＱ、　２Ｍ　ＮａＧｔＥｔＵ　Ｏ，Ｉ　ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝ｉ　０　）　％’含む１１貴水
溶液で洗い流丁５本願発明のリン酸塩？含むジオ千セタ
ンＶ加え、ジオキセタンのａＸ分解によるａｌｅをルミ
ノメータ−で演ＩＩ定するか又は写真フィルムで検出す
るっ Ｅ、カラクトシダーゼの検定 Ｍ１述の恢定におい℃、拭料（α−Ｄ　−又’＋＄β−
〇−ガラクトシドイカラクトヒラノシド）基ｆ１ｒ−開
裂し得るα−または！−カラクトシダーゼＹ含むジオキ
セタ７を加え、Ｓ部分の酵素開裂による発光Ｙルミノメ
ータ−で叱定するか又は写真フィルムで検出する。

Ｆ、　　［気泳動 電気泳動を用いてタンパク質と核酸の混合物會分離する
ことができる。これは、各々の分子量と電場中のゲル支
持棒上での構造に起因する。この手法はグロテオリシス
後のタフバク質断片の分離ヤ、制限エンドヌクレアーゼ
による切断後のＶ＆阪断片の分離（ＤＮＡ塩基配列とし
て〕にも応用できる。ゲル上の化合物の電気泳動による
分離後。

又′Ｔ；ゲルから膜上へ化合物Ｙ移動させｒＳｉ、Ｑガ
ントと結合した６酵素でプローブ分子成する。ｆＩＩえ
は、ペプチド断片ヲ１．アルカリ性ホスファターゼに一
価で結合した杭棒で７０−ブ化される。又他Ｑ）　９Ｊ
として、ＤＮＡ配列決定においてアルカリ性ホスファタ
ーセ化さねたアビジノはビオチン化されたヌクレオデド
ベースに結合するうその優１本発ｚ１７）ＡＭ）’ＦＤ
類似物をグル又はメンブランフィルタ−に添加する。短
時間の培養後、ジオキセタンが酵素によって活性化され
た結果１発元比合物を形成し発光が匙きる。発光はＸ線
若しくはインスタント写真フィルム又はルミノメータ−
で走査することＫより検出する。マルチチャンネル分析
をすることにより−ｍ以上の断片の検出？同時に行うこ
とができろう Ｇ、固′ｉｌ！Ａ！！ＩＬ定 画廊検定においては、非特異性の結合部位？ウシ血清ア
ルブミンｃ　ｌ１３ＳＡ　）又はゼラチンのような非特
Ｊ！性のタンパク質で前処理することにより。

マトリックスへの非特１４性結合ケ阻止することが望ま
しい。市販のＢＳＡにはＡＭＰＰＤの化学発光のバック
グランドとなってしまうホスファターゼ活性を示す物質
が少量含まねていることがある。また、水溶性の合取巨
大分子物９ｉ４には、ジオ纜セタンＹ用いる固無分析に
おける非瞥異性結合の効果的な耐正物になるものがある
。そのような物置のなかで好ましいものＹ工、水溶性Ｑ
−）ｋ台柱四級アンモニウム塩でトるＢＬＩＭＱ、ポリ
（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム〕ＣＴＭ
Ｑ）及びポリ（塩ＩＵヒニルベンジルトリブデルアンモ
二ウつ）（ＴＢＱ）である。そのような動電としては他
に前述＋７）　Ｖｏｙｔａらの出ｋ（’２６５号）Ｋｌ
示されているもの及び下記表３に掲けるものがある。

アデノシン三リン酸分解酵素のアッセイは２段階で行う
、第１段階でｌ；、この酵素？２発色団で置換さｔ′Ｉ
ｑ　１．２−ジオキセタンに末端リン酸エステル結合ヶ
介して共有結合したＡＴＰｒ−含有する基質と、至適ｐ
Ｈ（ｐＨ１４が典型的〕におい℃反応させ、リン酸発色
団で置換された１、２−ジオキセタフ？得るうそして、
＠２段陥では、凱１に階の生成物Ｓ′鈑付加によりて分
解、してｐＨｋ６以下。

好ましくは２−４にＬ、、発光シルミノメーターまり１
１クロマトグラフイーのフィラムで検知するっこねに類
似する方法として１本５＃明り発色団で置換した１、２
−ジオ千セタンのＡＤＰあ導体イ基質として使用し″Ｃ
酵素ケアグセイし１本発明の発色団で置換した１、２−
ジオ千セタンのアデニル＃ｌ酵導体ケ基質として使用し
て５′　−ヌクレオチダーゼＹアプセイする方法もある
。第２段階では、アルカリホスファターゼ１ｆｉｆｉ加
してリン＃！発色１ｉｌｔ換１．２−ジオキセタン４分
解することもできる。

■、核酸シークエンシンク（塩基配列決定〕シーフェン
シングの工程においてｖ４１１１！！されるＤＮＡまた
はＦＩＮＡは１本発明の化学発光１．２−ジオキセタｙ
？用いた電気泳動により分離した後。

検知することができる。

ＤＮＡシークエンシングはジデオキシ鎖末端法によって
行うこともできる〔サンガー、Ｆら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　、　７４　：５４６
３Ｃ１９７７）］つ４つのシーフェンシング反応の各々
のために，−重鎖鋳型ＤＮＡをジデオ千ジヌクレオチド
およびビオチンと結合した一重鎖ＤＮＡと混合するウア
ニーリング後、クレノウ酵素およびチオキシアデノシン
三リン＠ｔｉｅ　４つのシークエンシンク反応混合物の
各トイン千エベーシロンし。

そｑ）後、チェースチオ千シヌクレオデド三リン酸頃？
！／添加しインキエペーション？続ケろっ七〇、）ｆｋ
、反応混合物中のＤＮＡフラグメンｌＦｒ−ポリアクリ
ルアミドケル電気泳動（ｆ’ＡＧＥ）で分能する。この
フラグメントを腺、好ましくＹ；ナイロン膜に移し、紫
外縁、好テしくｌ１短波長の光を照射して架橋する。

非特異的結合部位ケボリマー（例えば、ヘパリン、カゼ
イン、血清アルブミン）で保護し、膜上のＤＮＡ７ラグ
メントＹ１本発明の特種な１．２−ジオ千セタン基漬の
酵素で切断可能な原子団のための特異的酵素に共有結合
したストレプトアビジンまたはアビジンと接触させる。

アビジンまたはストレプトアビジンはビオチンとよく結
合するので、ビオチンと結合したＤＮＡ７ラグメントは
酵素でタグされるであろう５例えば、化学発光体が５−
（４−メト平シスビｅ’（１，２−ジオ千セタ／−３，
２’−（５’−クロロ〕トリシクロＣ３，３，１，１３
−’］デカｙｌ−４−イル〕フェニルリン酸ジｔｑセタ
ンナトリウム頃（Ｏｌ−ＡＭＰＰＤ）でとるとき。

アビジンまたバストレグドアビジ／ンエリン酸化酵素に
変化するであろう、同様に、化学発光（４）が６−Ｃ−
メト千シスヒロＣ１，２−ジオ千セタン−３゜２′−Ｃ
５′−クロロ）トリシクロｉ、３．１．１３・７〕デカ
ン〕−４−イル〕フェニルβ−Ｄ−ガラクトビ５、／−
ｘ（ＧＡ−ＡＭＰＧＤ）であ６と＃、７に’ジンまたは
ストレプトアビジンはβ−ガラクトシダーゼとなる。

ＤＮＡフラグメントービオテ／−アビジ／（またはスト
レプトアビジン〕−酵素の鋸台−と適当な１．２−ジオ
呼セタンと？アルカリル）ｌｆｉ（例えば、約８．５以
上〕で嶺触させ、ＤＮＡ７ラグメ／）％’ｌｌ１元性フ
ィルム上または光電ルミノメータ−内で目に見えるよう
にする。

上記の検知法は、チャープらのゲノミックＤＮＡシーキ
、エンシンク処方にも適用することができる〔チャープ
ら、　　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ、　ＡＣａｄ、ｓｃｉ　、　
（ＵＳＡ）、８１　：　１９９Ｈ１８４））、ｆヒ字的
に切断し電気泳動により分離したＤＮＡ［マ千サムら。

ＰｒｏＣ，Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＬＩＳ
Ａ　）　、　７４　：５６Ｑ１１９７７月ｌｊｆ映、好
ましく８１ナイロン膜に移し。

紫外ｌ／ＩＭによって膜に架橋する。その後、特異的Ｄ
ＮＡ）Ｘ、ハイブリダイズのプローブとしてビオチンと
結合したオリゴヌクレオチドＹ添加し、酵素により切断
可能な化学発光体である本発明の１．２−ジオ平セタン
ジオキセタンに％異的な酵素に共有結合するアビジンま
たはストレプトアビジンを添加することＫより℃、検知
してもよい６ＰＡ（ｒＥによりできた配列のｇｌは上記
の方法により得ることができる。

加熱した洗剤Ｃ例えば、約８０〜約９０℃の約α５％〜
約５％のドデシルｉｕｉナトリウム水溶液（５Ｄ５）と
膜とＶ接触させることによって、まずハイブリダイズし
たプローブと化学発ｙｔ、本な膜から剥ぎとり１次いで
これ１約５０〜約７０’ＣＫ冷却し、得たＤＮＡフラグ
メントな他のビオデント結合したオリゴヌクレオチド７
０−ブとハイフリダイズして異なりｒ、Ｊｃ夕１１％′
つくり、上記のょ５にイメージング化学ルミネセンスケ
発することによって、配列の連続的な７０−ビングを行
うこともできる。

類似の検出方法シＲＮＡシークエンス法によってｐ４製
しｒ：　ＲＮ　Ａ　Ｋも適用することができる。

当業者が本発明を十分に理解することができるように、
以下に実施例ケ記載する。これらの実施例は単に説明の
ためにあり、添付の特許請求の範囲に記載されていない
制限？付するよ５に解するべきものではない、実施例中
の部およびパーセントは断りのない限り重量／本積であ
る。ただし。

ＴＬＣ混合嬉媒は本積／本積である。

一部の実施例にあるエノールエーテル型中間体Ｖ示す１
ＨＮＭＲデータは、ダラシ−ｔＬ　　〕を付した数字は
芳ＩＩ環ケ示し、ダヴシｊＬｖ付していない数字ハアダ
マ／トー２−イリデｙＨＬｗ示す。

実施例　　１ １ｔの塩化メチレンが入った水浴中のフラスコに、３−
ヒドロキシベンズアルデヒド２００Ｐ（１，６４ｍｏｌ
）およびトリｚ　？　ルアミ／２７０ｍｒ　１，９３　
ｍｏｌ）　Ｙ添加した。生成した茶色溶液ケ機械的に撹
拌し、トリメチルアセチルクロリド２１２ｙｄ（１，７
２ｍｎは　？滴下漏斗から１５分かけて少量ずつ流し込
んだ。次に、こうして得られたスラリーケさらに１５分
撹拌し、その後水浴を取り去ってなお２時間反応ケ進行
させた。反応混合物５−ＴＬＣ（Ｋ５Ｆ：２５％アセト
ン−へ平サン〕で分析したところ、出発物質は消失し、
Ｒｆ＠が高い箒−化合物が虫取していることが判明した
。

そこで１反応混合物？分液漏斗に移し、１Ｍ塩酸２５０
１と混合した。その混合物から有機１１？分離し、その
有機層ケ水（２Ｘ４００紅〕で洗浄して、硫酸ナトリウ
ムケ用いて乾燥した。この乾燥溶液？さらにシリカゲル
７−ラゲケ通し１回転蒸留器で溶媒會除去して款圧下（
１，０ａｌｇ　）で乾燥したところ、に茶色油状物とし
てろ一ピバロイルベンズアルデヒド６４８１が得られた
。この化合物１了アルゴン雰囲気下で保存した。

実施例　２ 夫ＩＦＩＪ１の３−　ｋ”　ハロイルオキシベンズアル
デヒド［２５ｍのメタノールに溶かしたｐ−）ルエンス
ルホン９４００〜？撹拌しながら加えた５次にトリメチ
ルオルト７オーメート（’２ｄｉｕ：２．０５　ｍｏｌ
）　％’１ｌｉｉ下Ｌｍ。混合物１に一１時間撹拌する
間、微量の発熱か続いたがそのまま撹拌ケ続けた。炭酸
水素ナトリウム１５１Ｙ加えフラスコ１回転蒸留器（設
置し、（水浴温度４０℃〕全℃の伽発性物質？とりのそ
いた。得られた油状物を墓素圧力下で短いシリカゲルカ
ラムに通し橙茶油状物Ｖ得た。これ？減圧下（１，０ａ
ｌｇ　）Ｋ撹拌して３−ビバロイルオ千シペンズアルデ
ヒドジメデルアセタール粗生成物Ａ２６ｔｋ侍ｒこ、赤
外線分析で））アルデヒドのカルボニルの吸収ｔ　１６
９５ｏｎ−’）はみら１なかった。

実施例　６ 実施％ｊ２の６−ヒパロイルオキシベンメアルデヒドシ
メチルアセタール％＝、５１フラスコ中でアルゴン算囲
気下で、Ｐ２０！Ｉから新たに蒸留した塩化メチレン１
１に溶かした。次に亜りｙ＠）リエデル３４７ｍｔ　２
．０３ｍｎはを全部−度に加えた。

フラスコにセフタムインレットアダプターＶ取りつけ、
わずかなアルボ／圧下で、ドライアイスーアセトン水浴
中で冷やした。三フッ化ホウ素エーテル化物（２４９ａ
ｌ　：　２．０３　ｍｏｌ）　１９Ｍ＜撹拌しながら、
シリンジで数回に分けて加えた。得られた反応混合物４
２時間−５５℃で撹拌し１次に。

−２０℃Ｑ）冷凍庫で夜通し保存した。

次にフラスコ？室温まで温め４時間撹拌した。

橙茶溶液を、水８００１ＬＩＫ＃解した重炭酸す）　Ｉ
Ｊウム１７０ｔのスラリーに泡立ち丁ぎない速度で注意
深く注いた。１時間二層混＠物ケ強く撹拌したｔｋ、　
Ｊｉｉｉｊ分ａ漏斗で分離し、水鴫會塩化メチレン（２
ｘ２５０ｍ）で再び抽出した。混合した有ｍｍ出１ｍ７
ｖｋ叡ナトリウムで乾燥し、残線し、真空蒸留して、ｍ
んた明るい員ｆＦＢ状物（０，２５ｍＨｇでｐ、ｉ’、
１５８−１６１ｉＣＪのジエチル１−メトキシｌ　　（
３−ヒ／＜ロイルオ千ジフェニル〕メタンホスフォネー
ト５５５ｔ？侍た。収率は、笑施力１−６の全ての工框
ゲｄじ９１％であった。

’ＨＮＭｆ（（４００ＭＨｚ；　ｃＤｃｃ３〕：δｔ２
１ａｎｄ１．２５　（６Ｈ、ｔｏｏ℃、７Ｈｚ、０ＣＨ
２Ｃ旦、）；３．３７（６Ｈ，ｓ、ＡｒＣＨＯＣ旦、）
；　３．８０（３Ｈ，ｓ。

Ａｒ０ＣＨ）；３．９０−４．１０（４Ｈ，ｍ、ＱＣ旦
２ＣＨ３）；４．４６（１Ｈ，ｄ、１５．６Ｈ２，Ａｒ
ＣＨＰＯ）；　６．８５（ＩＨ。

ｍ）；　７．００（２Ｍ、ｍ）；　７．２６（ＩＨ，ｍ
）。

ＩＲ（ニー）　）：　２９７４．１５９６．１５８２．
１４８ｕ１２５５（Ｐ２Ｏ）、１０９８．１０５０．１
０２０．９６５５に−” 実施例　４ テトラヒドロフラン７５ＨＩＫ溶解したジイソプロピル
７＜ン（１１，６＋ｒＲｔ、８２．８ｍｍ０６）１１９
％’アルゴン雰曲気下て一ドライアイスーア七トン水浴
中で一７８℃に冷却したつヘキサン１丁ルドリツｆ　７
５．０　ｍｍｏｚ　）中ｏ−ｒ　ｎ−ブチルリチウム２
．５Ｍ浴ｔＬ３０紅ケシリンジで８口え、２０分間、得
られたりテウムシイングロビルアミド！　ａ　％’　ｈ
−拝した故、テトラヒドロ７ラン２５１中のジメチル１
−メトキシ−１＋　（３−ヒｉ：ロイルオキシフェニル
）メデレンホスフォネート１３．４７７　（３７，６ｒ
ｎｍｏｔ）？、５分備上湯下漏斗から酬下した。俸られ
た赤色溶液を、６０分低温で撹拌し、ホス７オネートカ
ーボアニオンＹ完全に生成させた。

テトラヒドロ７う／２５１中の５−ヒドロキシアダマン
タン−２−オン４゜９９１（り０．１　ｍｆｌｌｏｔＪ
溶液Ｖ次に＆下した。得られた少し濁った混合物！’、
−７８℃で５分間撹拌し、次［４０分以上かけてゆっく
り室温に温めた。オレンジ色の浴液２９０分間還流し、
冷却し″Ｃ１炭鈑ナトリウム飽和溶液２００１Ｌｌで薄
め、酢１ｌ−ｒ−？ル（３ｘ　７５１１７）で抽出した
。混合有機抽出物ヶ、塩化ナト１１ウム飽和溶液で洗浄
し、硫酸す）　ＩＪウムですばやく乾燥し、＊縮して、
オレンジガムとして１２．４９１の芳ｆ３糸エノールエ
ーテルとヒバル酸エステルとの混合物ケ得た。

’ＨＮＭＲ（ビバリ７ｅｉｋエステル、　４Ｑ（ＩＭＨ
２，１ｎＧＤＧｔ３：δ７．３３（ｔＨ，ｍ、Ｈ−５′
）、７．１２（ＩＨ。

ｄ、Ｊ：Ｚ７１（Ｚ、　　入ｒＨ）、６．９５−７．０
２（２ｆ−１，ｍ。

Ａｒｃ）　、　５．４５（１Ｈ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−は
　、　＆２８（３Ｈ。

ｓ、　ＯＭｅ）　、　２．７９（１Ｈ，ｂｒ、　ｓ、　
Ｈ−３）　、　２．２３ｔ　１Ｈ，ｂｒ、　ｓ、　ｆ（
−７）　、　ｔ５９−１．８７（１１Ｈ，ｍ）　。

１．３４（９Ｈ，ｓ、Ｃ０ＣｃＣＨ３）３）。

硯ｔｃＨａｔ、中）　：　！１５９０．３４４２（ＯＨ
）　。

２９２４．２８４８．１７４２１、エステルＣ＝Ｏ）。

１６６５．１６０２．１５７８．１＆２６．１２７４．
１１５２゜１１１８−９１８ｃｍ−１ この混合物？、メタノール１００１中に溶解し。

無水炭酸カリクム１０．７Ｐり存在下、６．５時間還流
した。メタノール１次にとりのそき、その残留物を水と
酢酸エチル間で分割した。有ｍｍｖ、　ｆＩｊ！和塩化
ナトリウム溶液で洗浄し１回転蒸留した。

ａ＃ｉＶクロロフォルム−石油エーテルから再結晶り、
　オフホワイトｃｒｍｔｘ＜　ｍ、ｐ、ｔ７１−１７２
℃〕としてろ−（メトキシ−５−ヒドロキシドリンクロ
（３，３，１，１３°７〕デカ−２−イリデンメチル）
フェノール６．５ｆ％’傅たつさらに母液から０．８ｒ
１に一得た。５−ヒドロキシアダマンタン−２−オンに
基つくフェノリブフェノールエーテルの収率はあわせて
７９％でおった。もとり外液から得たはＩＮＭＢ（４０
Ｑ　Ｍｉ（Ｚ、　ＣＤＣ／、３中〕：δ７．１８（ＩＨ
，ｄｄ、　Ｊ＝８．４．７．７Ｈｚ、　Ｈ−５’）、　
６．７５−６．８８（３）ｉ、ｍ、ＡｒＨ）、６．３６
（ＩＨ，ｂｒ、ｓ。

Ａｒ０Ｈ）、３．４１（ＩＨ，ｂｒ、Ｓ、Ｈ−は、３．
２８（５Ｈ０ｓ、ＯＭｅ）　、　２．７９＋１Ｈ，ｂｒ
、　ｓ、　）（−３）　。

２．２２（１Ｈ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−７）　、　１．５
６−１９８（１１Ｈ。

ｍ）。

ＩＲ（Ｃ；ＨＣｌ３中）　：　３５８６．３３２０ｃＯ
Ｈ）。

５０００．２９２０．２８４４．１６６５．１５９０．
１５７８゜１ａａ５．１２９６．１０９２．８８５側−
１ＨＦｉＭＳ　Ｃｌ８Ｈ２□０３（Ｍ）計算値２８６．
１５７３゜実御＋１ｔＬ２８６．１５６９゜ 実施例５ アルゴン算囲気下で１１１１製されたテトラヒドロフラ
ン３５ＩＬｌ中の６−Ｃメト千シー５−ヒドロ千シトリ
シクロ（３，３，１，１３・７〕デカ−２−イリデンメ
デル）フェノール５．０４’の溶液？、トリエデレンア
ミ７５．４ｉｘｌ（２４，６ｍｍ０はと混合し１次に水
浴中で０℃に冷却しに。２−クロロ−２−オ千ンー１．
３．２−ジオキサホス７オラン（１，９５社。

２１．１　ｍｍｏｔ）　？撹拌しながら滴下した。５分
後水浴ケ取り）；ずし、室温で４５分間撹拌？続けた。

得られた混合物ケ、乾燥ジエチルエーテル３０ｉｄで薄
め、アルゴン下でろ過し、湿気ケ除いた。トリエチルア
ミン塩酸塩ｔジェデルエーテル２０Ｉ！７でさら（洗浄
した後１回転蒸留器で濃縮して粘性の四槽油状物である
リン酸トリエステルｌｋ’得り。

アルゴン下で、モレ千ニラーシーブで乾燥したヅメデル
ホルムアミド３０Ｒ１中に！解したトリエステルケ、挑
拝しながら一度に全部加えた。乾燥シアン化ナトリウム
１．０：ｌ（２０，８ｍｍ０６）とともに３，５時間、
室温で反応させた。次に５０℃に龜めながら減圧してＣ
１，０闘Ｈの溶媒Ｖ取りのそいた。水に溶解し、ＰＬＲ
Ｐ　　ポリスプレンカラム（ポリマーラボラトリーズ〕
Ｋよる分析用逆相クロマトグラフィ〔０，１％重炭酸ナ
トリウム（水〕−アセトニトリル混合勾酸展＠４ｇ］’
ｉ’行ったところ、得られた！！ｉ茶残笛物のサンプル
は中間体であるシアノエチルホスフェートジエステルナ
トリウム塩に完全に反応していることが明らかになった
。

残留物ケ次にメタノール６５１中に溶解し、室温で６０
分間撹拌しながらメタノール中のナトリウムメト千シト
の４．３７Ｍ溶液（２１２ｍｍＯｔ）４．８５ｍ／％’
Ｍ下した。逆相分析用ＨＰＬＬ　［よりホスフェートモ
ノエステルのβ−説離が完全に行われていたことが確か
められた。溶媒Ｙとりのぞさ、！！笛物％＝１０％水／
ア七トンで粉砕し、粘着性の溶液？得た。６％氷水／ア
セトン中さらに粉砕したところ固くてオフホワイトの固
体？得た。

ろ過し減圧下（１，０ａｘＨので乾燥して、無機塩を不
純物として含む６−（メソ千シー５−ハイドロキシトリ
シクロ（３，３，１，１３・７〕デク−２−イリデネメ
テル〕フェニルリン酸二ナトリウム塩粗収物ｌｊ、３Ｆ
１％’得た。　）’ＬＰ？ｆ’ポリスチレンカラム（ボ
リマーラボラ）　ＩＩ−ズ）？用いて水−アセトニトリ
ル混合勾配展開液によりて逆相調製用Ｈ）’ＣＬ　ゲ行
い、さらに１ｉ！ｉ切な画分ケ親液化することによって
、１２０℃で軟化し、１５３−１６８℃で溶融して明茶
色のカムになる白くて粒状の固陣＠製物５．２１、（７
２％〕？得た。

”ＨＮＭＲｃ４００　ＭＨｚ、　Ｄ２０中）　：δ７．
１６１ｉＨ。

ｄｄ、　Ｊ　＝８．５　、７．４Ｈ２，Ｈ−５’　）　
、　７．０５（ＩＨ，ｄ。

Ｊ　＝８．３　Ｈｚ、　ＡｒＨ）　、　６．９３（１Ｈ
，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−２’）。

６．８６（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝７．４Ｈ２，ＡｒＨ）、３．
２（３Ｈ。

ｓ、ＯＭｅ）、３．１７ｒｌＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−は、２
．６１ｔＩＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−５）、２．０６（ＩＨ，
ｂｒ、ｓ。

Ｈ−７）　、　１．４２−１．７３（１０Ｈ，ｍ）。

元素分析により二水和物として、ホス７オネート塩が存
在していることか確認された。

Ｃ，、Ｈ２，Ｎａ２Ｏ，Ｐ−２Ｈ２０計算ＩＩｔ：Ｃ，
４８，４４゜Ｈ，３，６３，Ｐ、６．９４．冥測籠：　
Ｇ、４８．３７．Ｈ。

５．９０．Ｐ、６．８７５ 実施例　６ ５．３５Ｘ１０　　Ｍメチレンブルー感元染料ケ含む、
無水メタノール／クロロフォルム２５％の９６ｖ中の６
−（メトキシ−５−とドロ千シトリシクロ（３，３，１
，１３°７〕デカ−２−イリテンメデル）フェニルリン
酸二ナトリウム？６つのガラス管に分けた。それぞれの
管ケ矢に水浴中で５℃に冷却し、浴液中にガスケ吹込む
ことによって＃ｋＸで飽和した。５分後、溶液を散票で
泡立たせ続ける間。

管Ｖ、５℃に維持しながら、冷却した２５０ワツトの高
圧す）　ＩＪウム蒸気ラングから元Ｖ照射した。

ナトリウム蒸気ラングと管の間に設置したカプトンポリ
イミドフィルム（ｄｕ　Ｐｏｎｔ　）の厚さ５１ミルの
破片により、不要な紫外線？とりのぞいた。

２０分照射後、溶液はピンク色に変化した。ＰＬＢＰポ
リスチレンカラムＣポリマーラボラトリーズ）１用いた
逆相分析用）１ＰＬｃ［０，１％重炭酸ナトリウム（水
〕−アセトニトリル混合勾配展開液〕を行つたところ２
つの生成物のピークが１！１１１１された。

始めの溶出物５エムがったピークであり（保持時間６．
７９分）、後の溶出物は鋭いピークであった（保袴時間
５．７７分）。始めの生成物の溶出（Ｎと恢の生成物の
溶出＋Ｂｌとの比ヲ：、そねぞれり管の溶液で１．３：
１であった。

溶液ケ混合し、浴剤Ｙ水浴中において減圧下（２３，０
ｍＨｇ］でとりのそいたっ残笛物ケ、水７０ｍ１に溶か
し、０．４５μｍ　のナイロン膜に通してろ過した。逆
相分取用ＨＰＬＣ（水−アロトニトリル＃１斜展開液）
により容易に２つの生成物に分けた。

た。

分取用ＨＰＬＣで→た目的とする画分ケ分析用ＨＰＬＣ
で分析したところ、均一であることが確認された。凍結
乾燥したところ生成物ｌＡｌ０．３２１、。

生成物β１０．２６？が得られた。これらは”）ＩＮＭ
Ｂ分析の結果、シン型およびアンチ槃の異性体？含む１
，２−ジオ平セタンであることがわかった。丁なｈ　ち
シン−３−（４−メトキシスピロ−（１，２−ジオ千セ
タン−３，２’　−（５’−とドロキシ〕トリジクロー
（３，３，１，１３°７〕デカン〕−４−イル）フェニ
ル、リン酸二ナトリウム スピロ−〔１，２−ジオ千セタン−３，２’　−（５’
−ヒドロキシ）トリシクロ（３，３，１，１３°７〕テ
ヵン〕−４−イルノフェニルリン酸二テトリウムノこれ
らの異性体それぞれは、アル千ルホス７アターセで水性
緩衝媒陣中ｐＨ１０″ｒ：開裂し、特徴的な光１時間、
ノイズ會有する化学ルミネセンスＹ放りた。

”ＨＮＭＲ（Ａ　　異性陣、４０口Ｍｆ（Ｚ　、ｔ　ｎ
　Ｄ　ｚ　Ｏ）　　：δ６．９８−７．６（ＡＨｌｍ、
ＡｒＨ）、６．１１（３）１．Ｓ。

ＯＭｃ３）、２．９７（１Ｂ、ｔ）ｒ、Ｓ、Ｈ−１ノ、
２．３４ｒｌＬｂｒ、ｓ、Ｈ−５）、１．７９（１Ｈ，
ｏｒ、ｓ、Ｈ−Ｂ。

ｔ３−１．６８（８Ｈ，ｍ）、１．Ｃ＋Ｈ１Ｈ，ｄ、Ｊ
＝＝１３．５ｌ−１ｚ）　、　０．８ｒ　１Ｈ、ｄ、　
Ｊ　：１５Ｈｚ）。

はＩＮＭＲｒＢ　異性体−ａｏｏ　ＭＥ（ｚ　、　ｔｎ
　ＤｚＯ）　：δ６．９４−７．６２（ＡＨ，ｍ、　Ａ
ｒＨ）、　３．０９（３Ｈ，Ｓ。

ＯＭｅ）、　２．９１（は１．　ｂｒ、　Ｓ、　ｌ−１
−は、　２．２７（１Ｈ。

ｂｒ、　Ｓ、　Ｈ−！は　、　１．８４（ＩＨ、ｂｒ、
　Ｓ、　Ｈ−７）　。

ｔ２１−１．７５（８Ｈ，ｍ）、　ｔ０２（ＩＨ，ｄ、
Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、０．８７（ＩＨｏｄ、Ｊ＝１２．
８Ｈｚ）。

元素分析によって異性体Ｂが二水和物で存在しているこ
とが示された。Ｃ□８Ｈ□、Ｎａ２Ｏ，Ｐ−２Ｈ，ＯＣ
異性＃−Ｂ】計算ｆｌ：　Ｃ，４３，２，Ｈ，３，２７
，Ｐ。

６．４７．実＋１１Ｊ［：　Ｃ，４３，５３，Ｈ，３，
５３，ｐ、６．ｔ　１゜得られた２つの異種陣か　”Ｈ
ＮＭＲのデータにもとづいて５ｙｎ−異樵体とａｎｔｉ
−鼻注捧であったと特定するの７丁不旬能であった。

実施？ｌ！７ Ｉ！ｔＩ記夾禿例６の１樵に公って、テトラヒドロフラ
ン３５１中のジイソフロビルアミン３，３５ａｕ（３８
，２ｍｍｏｚ　）浴液ゲアルコン雰囲気下の水浴中で一
７８℃Ｋ　？１ｆｒａ　Ｌ　Ｉｓ　、　ヘ千す：’　（
３３，Ｏｍｍｏｇ中のｎ−ブテルリデウム、２．５Ｍ＃
−液１４１ケシリンジで加え、２０分間撹拌した後、テ
トラヒドロフラン６０１中の１−メト臂シー１−（３−
ピバロイルオキシフェニル）メタンリン酸二ニブル１０
．８６ｔ　（３０，３ｍｍｏｚ）ｖｌ　０分以上かげて
滴下した。得られたオレンジ色の溶液を１時間。

低温で撹拌し１次に撹拌しなから、７分以上かげ℃テト
ラヒドロフラン２ＯＵ中の５−ブロモアダマンタン−２
−オン、　５．２１　？　（２２，７５ｍｍｏｔ）溶液
？混合した。さら［１０分間、撹拌を絖け。

冷浴Ｙとりのぞき２反応混合物ｖ１時間以上かけ″ｃ室
温までゆっくりあたためた。

溶液を次にさら［１時間リフラックスし、冷却してへ千
サン１００１１１″Ｃ−薄め１重炭酸ナトリウム飽和水
溶液ケ含む分液１斗へ注ぎへそサンＣ３ｘ５０Ｒｔ）中
で１０％の酢酸エテルで抽出したつ混合有機抽出物ケ塩
化ナトリウム溶液１５％テ洗浄し、硫酸す）　１１ウム
″ｒ：′ｆばやく乾燥し、濃縮して、明るいオレンジ色
の粘性油状物１１．６２Ｐ會得たっｎ−へ千サン中の酢
酸エチル１０％浴液によって短かいシリカゲルヵラムケ
用い℃浴出した結１黄緑ガム１１．０１得た。

”）ｌＮＭＨｒビバリ７酸エステル、４ｏｏＭＨ２゜ｉ
　ｎ　Ｇ　Ｄ　Ｃｔ　３　）　：δ７．３４（ＩＨ，ｔ
、Ｊ＝７．８Ｈｚ。

Ｈ−５’　）　、　７．１　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ　＝７．
７　Ｈｚ、　ｋｒＨ）　。

６．９５−７．０２（２Ｈ，ｍ、　ＡｒＨ）　、　３．
３９（ＩＨ、ｂｒ。

ｓ、Ｈ−は、３．２８（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．７４
（１Ｈ。

ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−３）　、　２３２−２．５１　（６
Ｈ，ｍ、　Ｈ−４゜８−６　、　Ｈ−９）　、　２ｊ　
７（１Ｈ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−７）　。

１．６７−１．９２ｒ４Ｈ１ｍ、　Ｈ−８、Ｈ−１の　
、　１．６４（９Ｈ，Ｓ、Ｃ０ＣｔＯＨ３）、）。

ＩＲ（ニー　ト　）　　：　　２９２４．　２８５０．
　１７ａ５．　　ｔ　　エステルＣ＝Ｏ）　、　１６５
４．１６０２．１５７８゜１４７８．１２７４．１１１
０．１０１８．８０８．７５８ｃＰＲ−１こσ】ガムケ
メタノール３０ｙｓｔに溶解し、　＃水炭鈑カリウム２
．４？で２岡間違流した。メｌ／−ル１；次ｌＣ＃去し
、残拍物−；、水と、へ千サン中の酢酸エチル３０％溶
液との間で分６二した。有機層？飽和鴫、化ブトリウム
水＋ａで氏浄し、ｋｍナトリウムで乾燥させ、寝縮して
、黄色カム９．３２５’％’得た。このカムをクロマト
グラフィし℃、結晶化しない淡黄色ガム７．０６１５−
ブロモアダマンタン−２−オンにもとづく収率８８％）
を得た。

しかしながらＩＲ，！：ＮＭＨによると得られた化合物
ｉｔ　３−　（メト平シー５−ブロモトリシクロ（３，
３゜１．１３°７〕デカ−２−インデンメチル）フェノ
ールを示した。得られた化合物はリン酸化反応に便用す
るのに十分なほど靴度が高かった。

純粋なフェノール系合成物のサンプルは、６−Ｃメトキ
シ−５−ブロモトリシクロ（３，３，１，１３．７〕デ
カ−２−イリデンメチル）フェニルｉ！￥酸から以下の
ようにして得た。不純物ケ含むフェノール系化合物（３
，５７？、１５．９５ｍｍｏｚ）１ｊｆアルゴ／雰囲気
下でモレキエラーシープで乾燥したビワ９フ３０ ジン５０ｍ９％’触媒として加えた。次に，無水酢酸１
。８ｍ（　１　９．１　５ｍｍ０６）Ｖシリンジで加え
１反応混合物？６時間Ｎ温で撹拌した。

反応混合物１に′飽和ム炭酸ナトＩＪウム水溶液２５０
ｍ／會含む分液漏斗へ移し１次にヘキサンＣ２ＸＩＱ（
１＋ｊ）中の酢酸エチル１０％浴液で抽出したつ混合抽
出物を水で数回洗浄し，硫酸ナトリウムで丁はやく乾燥
させた。乾燥混合物ケ回転蒸笛器で濃縮し．残留物ケ，
酢酸エテル数滴Ｖ含むｎ−ヘキサンから再結晶化させた
。得られたオフホワイトの固陣Ｖ再度．再結晶し，アセ
テ−）　（　ｍ．ｐ。

１０８−１１０℃）５．２１ｔＣＢ５．５％）を得た。

ＨＦＩＭＳ　Ｃ　　Ｈ　　ＢｒＯ　　（Ｍ”）計算ｆｉ
二３９０。

０８３３、東側（ｉ［３９０．０８３１。

ｌＨＮＭＲＣ４００　ＭＨｚ，　ＣＤＣｌ３中）　：　
ａ　Ｚ３５ｔ　ＩＨ．　ｄｄ．　Ｊ　＝８．　７．７，
　Ｈｚ．Ｈ−５’）　、　７．１３（ＩＨ，ｄｄ，Ｊ＝
７．７．はｆｚ．ｋｒＨ）、７．０３ｒ１ｆ（。

ｄｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＡｒＨ）、６．９９ｔ　１Ｈ，
ｄ。

ＩＨ２．Ｈ−２’　）、　３．５９（ＩＨ，ｂｒ．ｓ，
Ｈ−は。

３、２７（３Ｈ．ｓ．ＯＭｅ）、２．７５ｎＨ，ｂｒ．
ｓ，Ｈ　−３　）　　、　２．３２　−２．５１　（６
Ｈ，　ｍ，　Ｈ−４，　Ｈ−６．　ｆ（−９３。

２、２９（　３Ｈ，Ｓ，ＯｋＣ，）、２．１８（　ＩＨ
，ｂｒ．ｓ，Ｈ−７）、１．６９　−　１．９２（ａＨ
，ｍ．Ｈ−８．８−１の。

胆ｔｃＨｃｔ３中）　：　３０００．　２９３０．　２
８５０。

１７６ＯｒエステルＣ＝Ｏ）、１６６０．１６０２。

１５７７、１３６８．１１９２．１０９５．１０７０．
１０１６。

８０４国−１ 室温で１５時間，炭酸カリウムのメタノール溶液で再結
晶化したアセテートヶ処理することにより℃．結晶化し
ない．白くてもろい泡状−として。

３−（メトキシ−５−ブロモトリシクロＣ５．５Ａ。

１３・７〕デカ−２−イリデンメチル）フェノール（ｍ
．ｐ．４２−４５℃〕を得た。

”ＨＮＭＲｔ　４００　Ｍｆ（ｚ．ＣＤＣ６３中）　：
　８　７．２１ｔ　１８．　ｔ，　Ｊ　＝　７．２Ｈｚ
．　Ｈ　−５’　）　、　６．７３　−６．８５（５Ｈ
，ｍ，Ａｒ）ｉ）、５．１８（ＩＨ，ｓ．Ａｒ０Ｈ）。

６、６８のｉ．　ｂｒ．　ｓ．　Ｈ−は　、　３．２８
（３ｆ（、　Ｂ。

０Ｍ６）　、　２．７４（　ＩＨ　、　ｂｒ．　ｓ，　
Ｈ−５）　、　２．５−２５２（６Ｈ，ｍ．Ｈ−４．Ｈ
−６．８−９）、２．１７（ＩＨ，ｂｒ。

ｓ、　Ｈ−７）　、　１．６８−１．９２（４Ｈ，ｍ、
　Ｈ−８、Ｈ−１０３゜１ＢｃＧＨＣｔ３中）　：　３
５８４．３５２０（ＯＨ）　。

２９２５、２８５０．１６６５．１５８８．１５７８．
１４４５゜１４３５、１０９２．１０８０．１０１５．
８８０．８０８ｎｙ−１実施例　８ 本実施例の合成も、実施例４の工程にしたカーって付っ
魁テトラヒドロフラン２１ｗＬｔに浴賄しにジインプロ
ピルアミン２．９７ｊＩ７！（２１，３ｍｍｏｚ　）Ｙ
アルゴン雰囲気下においてドライアイス−アセトン中で
一７８℃に冷却した。２．５ＭＪ）ｎ−ブチルリチウム
のへ千サン（２１，３ｍｍ０６）溶液イシリンジで黴下
して混合し、２０分間撹拌した。

２０１１７のテトラヒドロフランに溶解した１−メトキ
シ−１−（３−ピパロイルオキシフェニル）メタｙｌＪ
　：ｙｅｌＲシｌｆＡ’（７，２６Ｓ’　：　２０．３
ｍｍ０６）２１０分かけてシリンジで酬下し、低温で１
時間撹拌した。

１５１１１１７のテトラヒドロフランに溶解した５−ク
ロロアダマンタン−２−オン２．７９１１５．２ｍｍｏ
ｔ）　Ｖ　５分かけて添加した。低温で１０分間撹拌し
た汝、冷却用バスケ除去し℃反応混合物Ｙ室温にしｆこ
、その後、１．５時間リフラヴクスし℃２冷却り、５０
ＷＬｌのｎ−ヘキサンで希釈しに。その後１反り混合物
？、炭酸水素すｌ−ＩＪウム飽和水溶液１５０ｍ／か入
りた分次南斗に桜したつ５％酢酸エテル／ｎ−へ士サン
で抽出した後、有機層ケあつめて乾燥、磁動し、真窒蒸
笛して、粗生成物ケ得た。こｔｌｔｖ、シリカゲルカラ
ムクロマトクラフィーによりＦｌｌｔ製して、８１価の
高い３−ｃメトキシ−５−クロロトリシクロ（３，３，
１，１ｍｌデカ−２−イリデンメデル〕フェニル酢酸ト
リメチルケ無色の油状物として５．１５ノ得た。−造１
まＩＲおよびＮＭＦＩで確認した。該化合物の鏝に、対
応するフェノール？含有する画分０．８６５）が流出し
た。この−分？、塩化メチレン中のトリエチルアミンお
Ｊびピバル酸クロリド（実施例１参照〕で再度アシル化
し、クロマトグラフィーにより精製シテ、ピバリン酸エ
ステルＶさらに０．３５Ｆ得た（５−クロロアダマンタ
ン−２−オン？基準にした収率９３％〕５ ”ＨＮＭｆ（（ビパリ７　酸Ｚ　Ｘチル、４［］ＱＭＨ
２゜７ｎ　ＧＩＪＣＬ、〕：６７．３６（ＩＨ，ｔ、Ｊ
＝１８Ｈｚ、Ｈ−５’　）、７．１３（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝
７．７Ｈｚ、ＡｒＨ）。

６．９８−７．０４（２）１．ｍ、Ａｒｆｉ）　、５．
４５（ＩＨ、ｂｒ。

ｓ、Ｈ−は、５．５＋６Ｈ６ｓ、ＯＭＢ）、２．８（Ｉ
Ｈ。

ｂｒ、ｓ、）１−３）、２．１３−２．３２（７Ｈ，ｍ
、Ｈ−４゜Ｈ−６、Ｈ−７，８−９）　、　ｔ６５−１
．９　（４Ｈ、ｍ　、ｆｉ　−８，８−１の、　ｔ５６
（９Ｈ，８，Ｃ０ＣにＨ３）３）。

ＩＰ（（ニート）：　２９３２．２８６５．１７５０　
（エステルｃ＝ｏ）、１６６４．１６０２．１５７８．
１４７８゜１２７４．１１１２．１０２２．８２７．７
５８ｃ！Ｒ−”得ｈ　ｉｔ　ｒｓピバリン酸エステルＹ
合わゼ”Ｃ（３，５ｐ、　　１４．１　ｍｍｏｔ）　４
３ａｔのメタノールに溶解し。

５．３７５’の無水炭酸カリウムとともに４０分間１】
フラツクスした。メタノールケ除去した後の残渣？、水
と３０％０％酢酸ニブル／ヘキサン間に分配した。有機
層％’１ｌｌｌし℃短いシリカゲルカラムケ通して精製
した。その結果、６−（メトキシ−５−クロロトリシク
ロ［：３，３．１．１　　１デカ−２−イリデンメチル
）フェノール４．０７ｔ％’白色泡状物とし′Ｃ得た１
５−クロロアダマノタン−２−オンを幕準にした収率８
８％）。骸動電１了窒気に触れるとわ丁か（べたついた
。

）ｉＥ（ＭＳ　ｔｔｊ１Ｍｃ１８）（２、Ｃ６Ｏ□（Ｍ
”）３０４゜１２２７、実＄１１１＠３０１１２３０゜
ｌＨＮＭＦｔＣａｏｏＭＨｚ、ＣＤＣｔ３中）：δ７．
２３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝７．７．７．６Ｈｚ、）ｉ−５
Ｍ、６．８５（ＩＨ。

ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、ＡｒＨ）、６．７７−６．８３（
２Ｈ，ｍ。

ＡｒＨ）　、６．４４（ＩＨ，ｌ）ｒ、Ｓ、Ｈ−は、３
．３１（３Ｈ。

ｓ　、ＯＭｅ）　、　２．８（Ｉ　Ｈ、ｂｒ、ｓ　、Ｈ
−３）　、２．１−２．３１（７Ｈ、ｍ　、Ｈ−４、Ｈ
−６、Ｈ−７、Ｈ−９）　、　１．６５−１８９（、ａ
Ｈ，ｍ、Ｈ−８，８−１ＯＬＸＦｌ（ＣＨＣＬ３中）：
３５９０．３３３０（ＯＨ）。

２９り０．２８５５．１６５５．１５９０．１５８０．
１，１１４０゜１２９５．１０９４．１０８０，１０２
２．８８０．８２６ｍ”” 冥施例　９ ６−（メト千シー５−ブロモトリシクロ〔３，５゜１．
１３・７〕デカ−２−イリデンメチル〕フェノール（１
，４９Ｆｌ、　４．２６　ｍｍｏｚ　）　％’８．５＋
ｊノ無水エテレンゲリコールに溶解した。こり）ｆ＠液
ケ、０．２８ｔσり戻敵カリウムとともに力ラステエー
ブ中に密刺しｒこ。このカラスチューブ１１１ロ 物Ｙ加熱しながら諷出下で宸縮した，残虐？飽和塩１ヒ
ナトＩＪウムと酢飯エデルとの間に分配した。

有！！ｌＩ＃％’分離し．知いシリ刀Ｑツカラムクロマ
トグラフィーを通丁ことＫｌって．オフホワイトの泡状
物たる３−（メトキシ−５−（２−ヒドロ千シ〕エトキ
シトリシクロ（３．３．１．１３°７〕テカー２−イリ
デ／メデル）フェノール１．３１Ｐを得たつ”ＨＮＭＲ
（４００ＭＨｚ　　ＧＤＣｌ，）δ７．１９（はｆ。

ｔ，Ｊニア、６Ｈ７．Ｈ−５’）β８３（　ｉｆ（、ｄ
，Ｊ＝Ｚ６Ｈｚ，ＡｒＨＪ　、６．７５−６．８Ｏｒ２
Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）。

５、８６（は１，Ｓ，Ａｒの−ｉ）、３，６７ｒ２Ｈ，
ｍ，０ＣＨ２Ｃ）１２０Ｈ）、３．５１　（２Ｂ　、ｔ
，Ｊ＝４．６Ｈ２，ＱＣ旦２Ｃ）ｉ２０Ｈ）　、３．４
４（　ＩＨ　、ｂｒ．ｓ　、Ｈ−１　）　、３．２８（
３１（、Ｓ．０Ｍ８）、２．８１（ＩＨ，ｋ）ｒ．ｓ，
Ｈ−３）。

２、２４（ＩＨ．ｂｒ．Ｓ，ｆ（−７）、１．５５−１
．９０（　１０Ｈ。

ｍ）つ Ｉｆ？（ＯＨｃ／＝３）：３５８０．３３２０ｒＯ酌．
２９２９。

２８ａ２．１６６４．１５８６．１ｂ７５．１ａ４０．
１０９２。

１０７８、８８５閤−１ 実誇例　１０ ６−（メト千シー５ークロロトリシクロ［３．３。

１、１３°７〕デカ−２−イリテンメチル）フェノール
（　１．　２　６Ｎ．　４．０　ｍｍ０ｔ）　％’，　
１７モニ”！（はｊ　ｌノール浴液？β−脱離剤？使用
した点Ｖ除き上記実施ｆＰＪ５の方法ケ用いてリン酸化
した，得られた粗り／酸アンモニウムケアセトンと混合
し，真空蒸留（１，ＱｍｍＨのしてオフホワイトのｆｉ
！ｉｉ本１．２１を得た５分析用逆相ＨＰＬＣ，ｖｃよ
り調べたところ，得ろねたリン酸化エノールエーテル瞥
寥，直接光ｆｌｌヒして対応する１．２−ジオ平セタン
にするのに十分な程，純粋であった。

３−（メトキシ−５−クロロトリシクロｉ．３。

１、１３・７〕デカ−２−イリデンメチル〕フェニルリ
ｙ＠塩（Ｑ．６５ｆ−）ｔ．増感染料トｔ，’Ｃ５．３
５Ｘ１０−ｓＭメテレノブルーケ含有する飽和１０％メ
タノール／クロロホルムの１００Ｍｔ中に外語した。

外液４６本のカラステエーブに分配し。上記の実施例４
に記Ｓ！される方法で照射した５本実施例でヲ；，後処
理として．蒸留残渣を２５８〜の吹酸水素ナトリウムケ
含有″′ｒろ水７０Ｋｌに浴鱗する工程を言むっ分析用
逆相）ＩＰＬＣケ行つに恢，シン型とアンチ型Ｑ．．）
異性体を不純物とも併せて一緒に収集Ｌｒ．：、ＨＰＬ
Ｃ分Ｍ（０．ｔ％Ｎａｆ（Ｃｏ３（Ｈ２Ｏ）−アセトニ
トリル傾斜混合展開液〕の結果，２つの生成物のピーク
が認めらねたＣ保持時間８．０１および８．３２分〕。

先に流出する画分とｉに流出する画分との面積比（２７
０ｎｍ）は０．４：１であった，　１ＨＮＭＲ分析の結
果．得らまた親液性白色園内はシン型とアンチ型の６−
１４−メトキシスピロ−〔１，２−ジオキシエタン−３
．２’−（５’−クロロトリシクロ［３．３．１．１３
・７〕デカン〕−４−イル〕フェニルリン酸二ナトリウ
ムの混合物であることが判明した。

元素分析の結果は，生成物−；二水和物として存在して
いることヶ示していた。

Ｃｌ８Ｈ２ｏＣｔＮａ２０，Ｐ−２Ｈ２０：計算ｆ［Ｇ
．４３．５２：Ｈ　、４８７　：Ｇｔ．７．１ｄ，　実
ｔｉｔｔｌｆｆＸ：Ｃ．ａ５．２３　：）１　。

４、９９：Ｇｔ．７．６５。

”ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ．ｉｎ　Ｄ２Ｑ．２１！−ｅ
＝体）：δ６．９　７−７、６８　（　４Ｈ　、　ｍ　
、　ＡｒＨ　）　、　３．０８および３、０９（３Ｂ，
２ｓ，ＯＭｅ）、２．９５（ＩＨ，ｂｒ．ｓ。

１（−１　）、０．７６−２．３５（１　２Ｈ，ｍ）　
５実施例　１１ ３−Ｃメト希シー５−ブロモトリシクロ（３．３。

１、１３°７〕デカ−２−イリデンメデル）フェノール
％＝　Ｉ３　７酸化し．上記実施例１０の５−クロロ誘
導棒のよ５に光酸化した。０．６％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素
ナトリクム水溶液中の後処理によって，粗１．２ージオ
キセタンリン酸塩の水溶液を得た，逆相ｆ−ＩＰＬＯ（
水−アセトニトリル鯵斜展開混合液〕Ｋよって．シン型
とアンプ型の異性体％−親液化のために併ゼて収集した
，親液化した白色の毛羽だった固陣を分析用）ｉ）’Ｌ
Ｏに通したところ．８．５２と８．９４に２つのピーク
が認められた。先に流出した両分と険に流出した画分と
の面積比（２７０ｎｍ）ｔｔ．０．５：１であツタ。、
’）Ｉ　ＮＭＦＩ！’）生放物は、シン型とアンチ梨の
５−（４−メト牟シスビロー〔１，２−ジオキセタン−
３，２’−（５’−ブロモ）トリシクロＣ３，３，１，
１３°７〕デカン〕−４−イル〕フェニルリン酸二ナト
リウムの混合物であることが確認された。

”ＨＮ　Ｍ　Ｒ（４００ＭＨＺ　−ｉｎ　Ｄ　２０−２
　Ｊ’！注本〕：δ６．９９−７．５２（４Ｈ、ｍ、Ａ
ｒｔ（）　、３．０７オ！ヒ３．０９（５Ｈ，２ｓ、Ｏ
Ｍｅ）、２．９１（ＩＨ，ｂｒ、ｓ。

Ｈ−は　、　０．８２−２．３２　（１２Ｈ，ｍ）。

実＃１例　１２ 抗ＴＳ）１アル力リ性ホスファターゼ複合陣イン雫ユベ
ーシ曹ン工程及び洗浄が終了したら、プラスチックビー
ズ％’、Ｑ、ＩＭジェタノールアミン。

１ｍＭ１ｍ化マグネシウム、０．２％ナトリウムアジド
緩衝液（ｐＨ１０，ので史に洗浄した後、同一のｆ１衝
液２００μを中で短時間保存した外は、キットに添付さ
れた製造者の指示に従って。

Ｈｙｂｒ　ｉ　ｔｅｃｈ　　Ｔａｎｄｅｍ−Ｅ　ＴＳＨ
’Ｐ　　９　　ト　ｔ　Ｈｙｂｒ　ｉ　ｔｅｃｈ。

Ｉｎｃ、、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ｄ％入手）　％’用イ
テー）ｌ（７）ＴＳ）１欅準試料について、ＴＳＨに関
するイムノアッセイケ行った。

Ｑ、１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭＱ化マグネシウム
、０．０２％ナトリウムアジド＋ｐＨ１０，の中にそれ
ぞれ、ジナトリウム３−　（２’−スピロアダマンタン
）−４−メト千シー４−（５“−ホスホリルオ千シ〕フ
ェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、ジナト
リウム６−（４−メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセ
タン−３，２’　−（５’−ヒドロ千シトリシクロＣ３
，３，１，１３・７〕デカン〕−４−イル）フェニルホ
スフェートＣＡイソマー：Ａ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ）、対
応するジナトリウムＢ−イソマー（Ｂ−ＯＨ−ＡＭＰＰ
Ｄ）、及びジナトリウム６−（４−メトキシスピロ−［
１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ〕ト
リシクロ［＆３．１゜１３・７〕デカン）−４−４ル）
フェニルホスフェ−）　（ｃ）−ＡＭＰＰＤ）％−含む
０．６７ｍＭ緩衝液６００μｔ１に′、ヒーズを含む管
に加えることによって、ビーズの表面に結合した抗ＴＳ
Ｈアルカリ性ホスファターゼ複合体からり化学発光信号
ヶ励起させた５発光の強度を、室温で５秒積分値としテ
、　Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　ＬＢ９５２Ｔ　Ｌｕｍｉｎｏｍ
ｅｔｅｒｒＢｅｒ　−ｔｈｏｌｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔ、　ＷｉＬｄｂａｃｉ、　　西ド４７ＪＱ入手〕Ｙ用
いて、基質の添加後７．１３．１９．２５゜３１．４０
．５０及び６０分後に引き続き記録した。

ＡＭＰＰＤ、Ｂｒ−ＡＭｆ’ＰＤ、Ｂ−ＯＨ−ＡＭＰＰ
Ｄ。

Ａ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ＆びＣｚ−ＡＭＰＰＤのそれぞれ
ＫＩＮｆ６Ｔｆ（Ｓ、ＲＬＵｖ、ＴＳＨｋ、そ４ぞれ。

第１．２．３．４及び５図に示す。

実施Ｎ　　１３ ＡＭＰＰＤ、韮びに、そのアダマント−２Ｉ−イリデン
基ｔ、ヒドロ千シ（Ａ及びＢイソマー〕。

クロロ及びブロモ基で単置換した対応する１、２−ジオ
牟七タン急からの全発光の比較？、これらの化合物のそ
れぞれについて全デホスポリル化実験ケ行５゛ことＫよ
りて行りたつ １ｍＭ塩化マグネシウム？含む０．０５　Ｍ炭酸ナトリ
ウム／重炭酸ナトリウム中の１．２−ジオ牟セタ７（４
，ＱｍＭ）ｃｔ）水溶液？調製し、３０”Ｃで平衝化さ
せた５次に、アルカリ性ホスファターゼｃコウシｔ）腸
：　Ｂｉｏｚｙｍｅ）　ｃｔ、＞　７．６４　ｘ　１０
　Ｍ水溶液１０μｔｙ加え、得ら４た溶液からのｆヒ学
発光ｌｋ、　Ｔｕｒｎｅｒ　　Ｍｏｄｅｌ　　２Ｑ　Ｅ
発ＫＫ度薯牡（ＴｕｒｎｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　
　；　　５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　　Ｃａ１ｉ　ｆ’ｏｒ
ｎｉａ　）ｋｌ＠いて記録した。

対象の五つの化合物のそれそｔｌに−する化学発光崩壊
速１１％’、１分あたりの相対光重［ｒＦｉＬＵ’　Ｓ
）で表し、下表に示すっ 表　　１ １．２−ジオキセタン　　崩壊速度ＩＲＬＵ’Ｓ）　　
全崩壊時間１　　　２　　６　　　　（分〕 ＡＭ）’ＦＤ　　　　　　　Ｏ，１０，３０，８６００
Ｈ−アダマント−２′− イリデンｒＡイソマー） １．３ ０Ｈ−アダマント−２′− イリデン（Ｂイソマー） １．５ ０Ｈ−アダマント−２′− イリデン ５．５ Ｂｒ−アダマント−２７− イリデン １．２ ０．８ これらの全化学発光ヶ。

それぞれ。

＠６゜ ７゜ ８．９及び１０因に図式的に示したつ 実施例　１４ 中性＋７）ＢＩＯＤＹＮＥ　Ａナイｏ　：ｙｉｇＩ！ｔ
　Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ、　Ｇｌｅｎ　
Ｃｏｖｅ、　Ｎ、Ｙ、　）　ｃｖ片％’、ＬＪ下９）濃
度のビオチニルｆヒｐＢｒ　３２２　３５ｍｅｒ　　オ
リゴヌクレオチドプローブ（５ｙｓｔｒｉｅｔｉｃ　Ｇ
ｅｎｅｔｔｃｓ。

Ｓａｎ　ＤｉｅｇＯ）　で２回（並行処理〕ドツト処理
し嶋 ｉｏｏ、ｏｏ。

ｓｏ、ｏｏ。

２５．０００ １２．５００ ６．２５０ ３．１２５ １．５６３ Ｌｌ、　７８１ ０．５９１ ブランク１ １＊−の標準非標１＠ＤＮＡ。

　　ｎｇ 次に、ホスフェートａｍ食塩水＃、液（ＰＢＳ）１’Ｐ
　Ｑ）　０．２％カゼイ：／１０．１％Ｔｗｅｅｎ　２
０Ｉ５ｖ：浄剤中で１時間膜？ブロッ千ングし、その後
、ＰＢＳ中０、２％カゼイン中の１１５０００希釈アビ
ジン／アル力リ性ホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ、
　Ｉｎｃ、　。

Ｓｔ、　ＬＯｕｉＳ、　ＭＯ）　％’加えた５次に、Ｉ
Ｉｖ３０分イン千ユペートし、ＰＢＳ中０．２％カゼイ
ン１０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０洗浄剤中で２回（それぞ
れ５分間）。

１　ｍＭの塩化マグネシウム？含む水性０．１Ｍジェタ
ノールアミンｃｐＨ１０，の中で２回Ｃそれぞれ５分間
〕洗降した。

次に、膜？中央で切り裂き、それぞれが１セツトのドラ
）％−有する二つの片？得た。片の一方ｔＡＭＰＰＤ水
溶液（１ｍＭの塩化マグネシウムＶ含む０．１Ｍジェタ
ノールアミン（ｐＨ１の中に０．２５ｍＭ）ｃＰで５分
間イｙｘｑ＞ヘ−）ｔ、、もう−万會、対応するクロロ
アダマント−２′−イリデン化合物（同一りバッファー
中０．２５ｍＭＪ中で５分間インキエベートした。次に
、二つの片ｔカメラ発光光度計内に配置し、ｐｏｌａｒ
ｏｉｄ　’ｒｙｐｅ６１２インスタント白黒フィルム上
ｖｃ＠露した。

単１１区においてカラム２　（ＣＬ−ＡＭＰ）’Ｄ）％
”カラム１１ＡＭＰＰＤ）［対して比軟することＫよっ
て、ＡＭｆ’ＰＤ自身と比較して、クロロ化合物Ｙ用い
て得られた改良された化学発光強度が分かる。

５）ｌ施例　１５ ｐＢｒ　３２２プラスミド（４７００はｐ）％’。

Ｔｒａｎｓ−Ｌｉｇｈｔ−ｒ　　ｙ　　ト　（ＴｒＯｐ
ｉｘ、　Ｉｎｃ、、　　Ｂｅｄｆｏｒｄ。

ＭａｓｓＪＹ用いてニックトランスレージーン（ｎ　ｉ
　ｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）　　１根にかけ、灸
さ２００−２０００ｂｐＳのビオチニル北本−標準ポリ
ヌクレオチドの混合物？生成させた。

こり混合物？、Ｎ下の濃度のドツトの五つのパラレルな
カラふとして、乾燥ＢＩＯＤＹＮＥ　Ａ１１ｌｌ上にド
ツト処理しに。

２０．００ｉＪ ｉｏ、ｏｏｕ ５．０００ ２．５００ １．２５０ ０．６２） Ｑ、５１３ ０．１５６ ０．０７８ ０、Ｑ６９ ａ’ｒ紫外線放射（ＵＶＰ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｌｉｇｈ
ｔ　：ＵＶＰ、　Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、　Ｃａ１ｉ
ｆ、３　Ｋ　５分間かけて。

膜の表面ＫＤＮＡ？固定した後、空気乾燥した。

次に、膜をＰＢＳ中０．２％カゼイン７０．１％ＴＷ８
８ｎ２０洗浄剤中において１時間ブロッキングシ、ソの
後、ＰＢＳ中０．２％カゼイン中の１７５０００　希釈
アビジン／アルカリ性ホスファターゼ複合−ケ加えた。

次に、款な６０分間インキュベートし、ＰＢＳ中０．２
％カセイン１０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０洗＃酌中ｒ３回
１そｔｌそ１１５０間）。

１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．０２％ナトリウムアジ
ドＹ含む０゜１Ｍジェタノールアミン水溶液。

ｐ）１１０．０（基質＆＆＃　）中で５分間（１回）洗
浄した。

次に、ドｙ）列１〜５の五つのカラムＹ映から−々に切
断し１片１〜５）、同様にドツト列６〜１０の五つのカ
ラムＹ＠から切断した（片６〜１の０片１〜５Ｖ、基質
緩衝液で６０分間洗浄した。片６〜１０１基貴緩衝基中
緩衝液中０．１Ｑ中で３０分間ブロッ呼ングした５次に
１両方の片の組？、基質緩衝液中で５分間イン牟ユベー
トした後、以下に示す１．２−ジオキセタン類の水溶液
（０，２５ｍＭ）中で５分間インキ、ベートシニ。

１　　　　ＡＭＦＰｌ） ２　　　ｏＨ−アダマント−２′−イリデン（Ａインマ
ー〕６　０日−アダマント−２′−イリデンｌイソマー
）４　　　ＧＡ−アダマント−２′−イリデン５　　　
Ｓｒ−アダマント−２′−イリデン（５ＡＭＰＥ’Ｄ ７　０Ｈ−アダマント−２′−イリデン（Ａイソマー）
８　０Ｈ−アクマント−２′−イリデンＩＢイソマー）
９　　　Ｃｔ−アダマント−２′−イリテン次に、全て
の片Ｙカメラ発光光度ｒ内に配置し。

Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　Ｔｙｐｅ　６１２インスタント白黒
フイルム上Ｋ１１寓した。下表２に示す結果から、ＡＭ
ＰＰＤ自身と比較して、５−（ａｔ換アダマント−２′
−イリデン）−１，２−ジオキセタンｅＡを用いて得ら
れた改良された化学発光強度が分かる。

夾Ｓ例　１６ 中性のＢＩＯＤＹＮ１！；　Ａナイロン膜の片會、ビオ
デ＝”化ｐＢｒ３２２３５ｍａｒオリゴヌクレオチドプ
ローブｃ　Ｂｉｏｇｅｎ、　Ｉｎｃ、　、　Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓ、　）１２．５ピコグラムで２回
（Ｍ行処理）ドツト処理り、　ｉＥ燥り、　ＵＶＰ　Ｍ
ｉｎｅｒａｌ　Ｌｉｇｈｔランプカラの紫外線放射に５
分間かけて、膜の表面にＤＮＡケ固定させた。次に、艮
％−５ＸＳＳＣ（０，０ｉ　５Ｍクエン酸ナトリウム／
９．１５Ｍ１４化ナトリウム）で湿潤させ、ＰＢＳ中０
．２％カゼイン、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０洗浄中でブ
ロー１キングしｔつ次に、プロヴ千ングさｔ”＋た腋％
’、０．２％カゼイン中に１／ＩＧ、０００希釈したア
ビジン／アルカリ註ホスファターゼ複合Ｋ　（ＡＶｉｄ
Ｘ複合Ｋ　：　Ｔｒｏｐｉｘ、　Ｉｎｃ）で３０分間イ
ン−？エベートした。

次に、膜ｗ、ＰＢＳｃＰ性０．２％カゼイン／　０．１
％Ｔｗｅｅｎ　２０洗浄剤で２回（それぞれ５分間）。

次に，ＰＢＳ中水性０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　ｅＬ浄
剤テ２回（それぞれ５分間）、最後に、１ｍＭの塩化マ
グネシウム？含む３１Ｍジェタノールアミン水溶液、ｐ
Ｈ１０（アッセイ酸伽液〕中で２回（それぞれ５分間）
洗浄した。

洗浄した膜シ半分に切断して、それぞれが一つのドツト
Ｖ有する二つの片？得た５片ゲ、それぞｆｉ、ＡＭＰＰ
Ｄ（７）Ｑ、２５ｍＭ水溶液、及び、１ｍＭの一化マグ
ネシウムケ含む０．１Ｍジェタノールアミン（ｐＨ１の
中の対りするクロロアダマント−２′−イリデン化合物
中で５分間イン−？、ベートし、排水してプラスチック
バック中で缶封し、こｔ′ｌ？　Ｔｕｒｎｅｒ　Ｍｏｄ
ｅｌ　２０　Ｅ発光光度計のウィンドウに貼り付けた。

それぞれの片からの化学発光Ｖ２０時間積分した。得ら
ｊた発光の千ネテイヴクスＶ第１２図に示す。

実施例　１７ 相当するヒドロキクアダマント−２′−イリデン（Ａ及
びＢ異性−）及びクロロアダマン）−２’−イリデン化
合物（更（全ての場合下記に列挙したエンハンサ−ポリ
マーの存在において）によって与えられる化学発光の増
強（ＡＭＰＰＤからの発光に比較して）は下記の方法で
示された。

各々６本ずつから成る４組のテエーブであって。

各組の各デ島−ブシ；４撞のジオキセタンのうちの１つ
のＱ、４ｍＭ水溶液４５０μｔＹ含有しており。

これら４ｓ［のジオキセタンは１ｍＭ＠化マグネシウム
、０．０２％ナトリウムアジド及び０．１％のエンハン
サ−ポリマー？含有する０、ＩＭジェタノールアミンｔ
ｐＨＩＱ、Ｑ基質最伽液）中で比較されるものである。

チューブケミ４製し、各チューブからのバックグラウン
ド信号ケベルンールド（Ｂｅｒ−ｔｆｉＯｌｄ　）　Ｌ
Ｂ　９５２Ｔルミノメータ−Ｃベルソールドインストル
ーメ７７　（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｉｎｓｔｒｕ−ｍ６ｎ
ｔＳ　）　；　Ｗｉｌｄｂａｄ、　　ドイツ連邦共和国
〕を用いて測定したり 次に、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．０２％のナトリ
ウムアジドＶ含有するＱ、１Ｍジェタノールアミン中Ｋ
　２．８３　ｘ　１０−１２Ｍのアルカリ性ホスファタ
ーゼ水溶液、ｐＨ１０，０（＊ｉ酵素濃度＝２．８３ｘ
１０　　Ｍ）５．ｕｚｖ各チューブに添加し。

化学発光信号１５分及び２０分後にルミノメータ−で測
定した。エンハンサ−ポリマーの存在における４種の１
．２−ジオキセタンのそｊぞわについて得られに化学発
ｙｔ、信号及び信号対バックグラウンド比を丁下記表Ｉ
Ｖｃ示す。

＆　用すｔｉ　ｒ；エンハンサ−ポリマー、及び表鑞に
おいて用いられにそれらポリマーリｄピ号Ｙ以下に下す
。

記　号　　　　　　エンハンサ−ポリマー５ＡＰｆ’Ｈ
Ｉｆ（Ｅ　　　　　　　　ＢＤＭ　ＱＴＭＱ　　　　　
　　ポリＣビニルベンジルトリメデルアンモニウムクロ
ライド） Ｓ／ＴＭＱ　　　　　スチレン／ＴＭＱ共１合陣のＤＡ
／ＴＭＱ　　　ジアセトンアクリルアミド／ＴＭＱ共１
会体 ＤＭＱ／ＴＥＱ　　　ポリ（ビニルベンジルドデシルジ
メデルアンモニウムクロライド）／ＴＥＱ 共東合体 ＴＥＱ　　　　　　　ポリＣビニルベンジルトリメデル
アンモニウムクロライド〕 ＴＢＱ　　　　　　　ポリＣビニルベンジルトリブチル
アンモニウムクロライド） ＭＰＢ　　　　　　　ポリ（ビニルベンジル−Ｎ−メチ
ルピペリジニウムクロライド） ＢＡＥＩ）Ｍ ポリ〔ビニルベンジル（２−ペンソイ ルアミノ〕エデルジメチルアンモニウ ムクロライド〕 Ｚ ペンザルモーダント ＩＭＥＥＳ がり（ビニルベンジルシメテルエチル アンモニウムクロライド〕 ＤＭｈ：ｔＯＨ）Ｂ ポリ〔ビニルペンジルジメチル（２− ヒドロ千シ〕エテルアンモニウムクロ ライド〕 ＭＩＡＬＤ サファイア及びフルオレセイン 実ｍ例　１８ ２８１の異なる緩衝液中で下記列挙した置換アメマント
−２′−イリテン化合物について得たバックグランド信
号及びｔ？２パラメーター（ＡＭＰＰＤとの比軟で〕１
次の方法で５１１」定した。

ｉｍＭ塩化マグネシウムヶ含有する０、　０５　Ｍ炭散
ナトリウム／Ｉｋ炭酸ナトリウムから作られた緩衝液、
は）ｉ９．５．中の４ｘｌＯ−’Ｍ１，２−ジオキセタ
ン水浴液ケ調製した。同様に、１ｍＭ塩イヒマグネシウ
ム及び０．０２％ナトリウムアジド會含有する０、１ν
ジエタノールアミンから作られた緩衝液（ｐＨＩＱ、Ｑ
中１７）！　Ｘ　１０−’Ｍ１．２−−＃＃セタ７水溶
ｆＦｉ、’に’ｍ製した。これらの溶液のそれぞれケチ
、−１１本当り１１ずつ入し、ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ
　）　Ｍｏｄｅｔ２　ＱＥｋミ／メーター中に入れ、バ
ックグランド信号？釧定した。

次に、各サンプルについて下記の方法で′ｔ、＋１２値
ｋ　＃ｉ」定した。

上記載＆浴溶液１つの９ＣＪＯｐｌｃＰＫ１００ｐｔの
サンプルジオキセタンケビペヴトで１本のチューブに入
ｔ’＋＋６終ジオ千セタン濃度：４Ｘ１０　　Ｍノロ０
℃で平衝ｆｌｆ。ｆｉＱ　−の　ａｌ　ｋ液中テ１−１
．０００柳釈の子午腸アルカリ性ホスファターゼ１０μ
ｔ（酵素嬢度ニア、６ｘｌＯＭ）ケ添加し、得ろねた化
学発′ｊｔ強度ケ、ターナ−ＭＯＱ８１２０Ｅルミノメ
ータ−Ｙ用いて６０分間にわたって記録したう次いで減
良曲巌からＬ？２厘を訂算した。

これらの伸］定の結果は下記表＾に示す。

表　＾ １、　０．０５Ｍ炭酸ナトリウム／東炭酸ナトリウム。

１ｍＭ塩化マグネシウム、　ｐ）１９．５ＭＰＰＤ Ａ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ Ｂ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ Ｏ６−ＡＭＰＰＤ Ｂｒ−ＡＭＰＰＤ １．９６ １．２０ １．７２ ０．９３ １．３５ ２．４２ １．４９ １．０Ｂ ０．９９ ２゜ ０．１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ塩化マグネシウム
、０．０２％ナトリウムアジド、ｐＨ１０，０ ジオそセタン バックグランド ０．４ｍＭ（ＴＬＩＪ） 陰イオンの 半減Ｍ（分〕 ＡＭＰＰＤ　　　　　　　　　　２．０９　　　　　　
　２．２６Ａ−ＯＨ−ＡｂＡＰＰＤ　　　　　　Ｏ，９
５１，Ｕ　ｂＢ−ＯＨ−ＡＭＰｋｌＤ　　　　　　１．
５２　　　　　　　１．３１Ｃｔ−ＡＭＰＰＤ　　　　
　　　　Ｏ，７７０，８６Ｂｒ−ＡＭＰＰＤ　　　　　
　　　１．１３　　　　　　　０．５６実施例　１９ アルカリ性ホスファターゼ（子牛腸；Ｂ１０ＺｙＩｎ８
）を１−１．０００．０００　Ｋ前駅し、保存溶液を作
った。

濃度、　２．５４　Ｘ　１０　”Ｍ、　　一連のチュー
ブ２２本ずつ８１１１！！シた。こｒらデユープは１ｍ
Ｍの塩化マグネシウム及び０．０２％のナトリウムアジ
ドＶ含有する０、１Ｍジェタノールアミン水溶液、ｐＨ
１ｏ、ｖ４ｓｏμｔ、及び０．１％の下記のエンハンサ
−ポリマーと４．４Ｘ１０−’Ｍの１．２−ジオキセタ
ン：　ＡＭＰＰＤ又は相当するクロロアダマント−２′
−イリデン化合物ヶ含有するものであった。

次いで、５０μｔのアルカリ性ホス７オター（保存溶液
？ｒ−添加して、下記の酵素ｓ度ケ含むサンプルケ得た
。

２．５１ｘ１０　　　Ｍ ８．４９ＸＩＬＩ　　　Ｍ ２．８３ｘ　　１０　　　Ｍ ９．４５　　Ｘ　　Ｉ　Ｑ”　Ｍ ３．１５Ｘ１０　　　Ｍ １．０５ｘ１０　　　Ｍ ６．４９Ｘ１０　　　Ｍ １．１６Ｘ１０　　　Ｍ ３．８８Ｘ１０　　　Ｍ ｔ２９　ｘ　１０　　　Ｍ ４．３１ｘ１０Ｍ 各デユープの１，２−ジオ千セタン最終濃度は４Ｘ１０
−’Ｍで＆す、エンハンサ−ポリマーの最終濃度はｃＬ
０９％であった。５秒間の積分會１．２−ジオキセタン
添加後５分及び２０分に記録したヮ第１６図及び単１４
図は、ジオキセタンの添加仮、５分及び２０分における
クロロアダマント−２１−イリデン１．２−ジオキセタ
ンとＢＤＭＱとによるアルカリ性ホスファターゼ稀釈度
についての用量反応曲線であり、　ＡＭｆ’ＦＤ及びＢ
ＤＭＱ［関する用量反応ＦｆＢ蘇と比較している。

第１５１及び第１６図シ；、クロロアダマントー２７−
イリデン１，２−ジオキセタン＋ＢＤＭＱ−フルオレセ
インＣエメラルド）及びポリ（ビニルベンジルトリブチ
ルアンモニウムクロライド）（ＴＢＱ）−フルオレセイ
ンにより、基質添加ｆｌｋ５分及び２０分におけるアル
カリ性ホスファターゼ稀釈の検出Ｙ示す。ＡＭＰＰＤ及
び−じエンハンサ−ポリマーについて比較した。

実ｍ例２０ ＴＰＡ配列挿入ｓｉｎ’含むｐＢＲプラスミド（Ｂｉｏ
ｇｅｎ　Ｉｎｃ、、ケンブリｙ　Ｖ　＊　１　”ｊ　ｆ
　ｚ　−＊　ｙツ州）ｒＭｓｉ’１制限酵素で切断した
。ＭａＸａｍ等、ＰＮＡＳ　７４５６０（１９７７３に
＆：述されているように化学的切断１行い、Ｇ、ＡＧ、
ＡＣ，ＴＯ及びＣ−及びその他、　Ｔ、　’％’Ｈｕｂ
ｉｎ等、ＮｕＣ１６ｉＣＡＣｉＣ１８Ｒｅ５ｅａｃｈ　
、　８．４６１３（１９８のＫ記述さｔ１″′Ｃいるよ
うに得たつ各反応チューブの内容物の１７７ケ０．４．
０ＴＢＥ−勾配シーフェンシングゲル（６０α長）Ｋ疾
加した。４時間の電気泳動後、ＤＮＡ１に一バイオダイ
ンＡ　ｔＢＩＯＤＹＮＥ　Ａ）ナイロンＭＩＤ、４５μ
ｍ）Ｋ電気移動し、紫外光で処理して膜表面にそのＤＮ
Ａｌ−固定した。

次いで、膜Ｙ乾燥し、１％Ｂ、ＳＡ、Ｑ、５Ｍリン酸ナ
トリウム及び７％ＳＤＳケ含有する緩衝水溶液（’ＰＨ
７，２）中、４５℃で６０分間予備ハイブリダイズし１
次いで上記σＪＢＳＡｌｉ衝ぞ液４０１中で１０μｔの
ＮＮＢスナップ直接アルカリ性ホス７オターゼ接合プロ
ーブ（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ１０−８３／Ｓｔ８ｍＳ
Ｉｎｃ、サンジエゴ、カリホルニア州〕と４５℃、２時
間ハイブリダイズした。

次いで、膜％’４５℃で５ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ水溶液
で２回Ｃ各５分ずつ）洗浄し；４５℃で１×ＳＳＣ／１
％ＳＤＳ水溶液で２回（各５分ずっ）洗浄し；１２５ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ）すｘ（ＴｒｉＳ）及び１
％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００界＋１！ｌ
ｌａ性剤ｔｐＨ，８，０３で１回洗浄し、Ｍｉ［０，１
Ｍのジェタノールアミン、１ｍＭ塩化マグネシウム及び
０．０２％ナトリクムアジドの水浴ｇ（ｐＨ１０，ので
２回洗浄した。

次いで膜４ＡＭＰＰＤ水酊液（０，２５Ｍ）で湿らせ、
サランラップで包み、４０分間コダックＸ／ＲＸ−線７
４　ＡＩ　Ａ　ｉ対しＣ％元り、、ｅ。ＡＭＰＰＤ添加
σ〕添加２仮１ ンス画＠ｖ＠１７（は図に示す。

相当するクロロアダマント−２１−イリデン１．２−ジ
オ千セタン化合物Ｙ使用して．上記の全工程ケ総返し．
第１７＋２１図の７−ケンス画像？得ｅ＊本発明の上記
検討は好しい態様及びその実施に主として向けられてい
る。この明細書に記述された着想の実際の具体化に対す
る更なる変更及び修飾が，特許請求の範囲で特定された
精神及び範囲から逸脱することなく容易に行うことがで
きることヲ；轟業者にとって自明であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図は，そ１それ前記の実施例１２に記載の
ように得られた．各々ＡＭＰＰＤおＪびそのブロモ−　
８−ヒドロ干シー、Ａ−ヒドロ千シーおよびクロロアダ
マント−２′−イリデン類似体ｗついてのＴｓＨ，ＴＳ
ＨＫＮＴ６ＲＬＶｖ示す。 第６図〜第１０図では．それぞれ前記の実施例１３に記
載のように得らｔ″したＡＭＰＰＤおよびそのＡ−ヒド
ロキシ−１Ｂ−ヒドロキシ−、クロロ−およびブロモア
ダマント−２１−イリデン類似体から得られた全ての発
光ケ比較しているっｗ４１１図は．核酸検定法でのリポ
ータ−分子としてのＡＭＰＰＤそれ自体と比較した場合
の。 ＡＭｉ’ＰＤのクロロアダマント−２′−イリデン類似
本ヲ用いて得らｔ′ｌた，改良された化学発光強度を示
す（前記の実施例１４％’参照されたい）。 １１［１２図は，ＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２′
−イリデン類似体およびＡＭＰＰＤそれ自＃會。 核酸検定法でのリポータ−分子として用いて得られた発
光の速度皇ケ示す（前記の実施例１６ケ参照さｔｌない
〕つ 第１３ｔｚｋ！、ポリ〔ビニルＣベンジルジメチルアン
モ二つムクロリド）］　（ＩＢＤＭＱＪ　Ｊ％＝加えｒ
、：　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄのクロロアダマント−２′−
イリデン類似捧Ｙ有゛するアルカリ性ホスファターゼｍ
釈度についての５分間での用飯−反応曲に＝！ｙ、ＢＤ
ＭＱ％＝加えたＡＭＰＰＤそｔｌ自（４）についての５
分間での用量−反応曲線と比較したものである（＠記の
実施例１９ケ−照されたい）。 第１４１は、與１６図に用量−反応曲線を示している同
じ物質についての２０分間での用量−反応曲線である。 ８１５図は、ＢＤＭＱ−フルオレセイン（「エメラルド
」〕Ｖ加えｒ、−Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄのクロロアダマン
ト−２′−イリデン類似体Ｙ有するアルカリ性ホスファ
ターセ稀釈度についての５分間での用量−反応曲線ケ、
エメラルドケ加えたＡＭＰＰＤそれ自Ｋ［ついての５分
間での用童−反応島線と比較したものである（再度前記
の実施ｆ＋３１９を参照されない〕っ 単１６区は、皐１５図に用蓋−反応曲巌ケ手している同
じＴｈ１ｉｉｉ［ついての２０分間での用■−反応曲緑
であろう Ｉ！１７図）２．１１ＩＡ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　ＤおＪひ（２
）ＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２１−イリテン類似
に％’用いて前記の実施例２０に記載のように傅らｔ′
ＦたＴＰＡ配タリ潅ケ示す。 代理人　弁理士　湯　浅　恭　三　　′（外４名） ２分 第 凹 アＩＩＪり作ホス７７７−ぞｏ１と掌た犬′遵檜出ナイ
ロ；職上のアビヅシ岸＃、ＢＩＤ−ｐＢＲｉｚｚ寸すコ
゛Ｘ７しす斗ド吋 閏、今 Ｆｌｇ。 ２、発明の名称 化学発光性３−（置換アダマント−２−イリデン）１，
２ジオキセタン化合物、検定法およびキット３゜ 補ＩＦをする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　トロピソクス・インク ポレ チット ４、代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号 新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　　平成　２年１．　ＩＪ−１２７
日　（発送＋３）６、補正の対象 出願人の代表音名を記載した願書 委任状及訳文 タイプ印書により浄書した明細書 平成３年− １、事件の表示 平成２年特許願第２３９７６４号 ２、発明の名称 化学発光性３−（置換アダマント−２”−イリデン）１
．２−ジオキセタン化合物、検定Ｘ法およびキット３、
補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分解されると光エネルギーを発生することができ、
   その酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に
   開裂される部位の結合が行われる前は室温において実質
   的に安定であり、次式で表わされる、酵素によって開裂
   し得る化学発光性１，２−ジオキセタン化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＸおよびＸ＾１は各々、水素、ヒドロキシ基ハロ
   ゲン基、未置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基またはアミド基であるが、ＸおよびＸ
   ＾１の少くとも一方は水素以外であり；そして、Ｒ＿１
   およびＲ＿２は、独立してあるいはいっしょになって、
   上記ジオキセタン化合物が酵素によって開裂されるとき
   発光するのを妨げず且つ該ジオキセタン化合物の４位の
   炭素原子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；た
   だし、Ｒ＿１およびＲ＿２が独立した置換基を表わすと
   きは、Ｒ＿２は芳香族基、複素環芳香族基または芳香族
   環と結合した不飽和置換基であり、またＲ＿１およびＲ
   ＿２の少くとも一方は、あるいはＲ＿１とＲ＿２はいっ
   しょになって、該ジオキセタン化合物の酵素によって開
   裂し得る不安定な置換基が酵素によって脱離されると発
   光性物質を生成させる、酵素によって開裂し得る不安定
   な基で置換された発螢光団基である。） ２、ＸはヒドロキシでＸ＾１は水素である請求項１の化
   合物。 ３、ＸはクロルでＸ＾１は水素である請求項１の化合物
   。 ４、ＸはブロムでＸ＾１は水素である請求項１の化合物
   。 ５、Ｒ＿１がメトキシである請求項１ないし４のいずれ
   か１つの化合物。 ６、Ｒ＿２がメタホスフェート置換フェノキシである請
   求項５の化合物。 ７、上記ホスフェート置換基が二ナトリウム塩として存
   在する請求項６の化合物。 ８、Ｒ＿２がメタβ−Ｄ−ガラクトシド置換フェノキシ
   である請求項５の化合物。 ９、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン
   −３，２′−（５′−ヒドロキシ）トリシクロ〔３，３
   ，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フェニル
   リン酸二ナトリウムである請求項１の化合物。 １０、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタ
   ン−３，２′−（５′−クロル）トリシクロ〔３，３，
   １，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フェニルリ
   ン酸二ナトリウムである請求項１の化合物。 １１、５−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタ
   ン−３，２′−（５′−ブロム）トリシクロ〔３，３，
   １，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フェニルリ
   ン酸二ナトリウムである請求項１の化合物。 １２、シン−３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオ
   キセタン−３，２′−（５′−ヒドロキシ）トリシクロ
   〔３，３，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）
   フェニルリン酸二ナトリウムである請求項１の化合物を
   １３、シン−３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオ
   キセタン−３，２′−（５′−クロル〕トリシクロ〔３
   ，３，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フェ
   ニルリン酸二ナトリウムである請求項１の化合物。 １４、シン−３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオ
   キセタン−３，２′−（５′−ブロム）トリシクロ〔３
   ，３，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フェ
   ニルリン酸二ナトリウムである請求項１の化合物を１５
   、アンチ−３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキ
   セタン−３，２′−（５′−ヒドロキシ）トリシクロ〔
   ３，３，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フ
   ェニルリン酸二ナトリウムである請求の範囲１の化合物
   。 １６、アンチ−３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジ
   オキセタン−３，２′−（５′クロル）トリシクロ〔３
   ，３，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フェ
   ニルリン酸二ナトリウムである請求の範囲１の化合物。 １７、アンチ−３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジ
   オキセタン−３，２′−（５′−グロム）トリシクロ〔
   ３，３，１，１＾３＾．＾７〕デカン〕−４−イル）フ
   ェニルリン酸二ナトリウムである請求の範囲１の化合物
   。 １８、次式のエノール化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＸおよびＸ＾１は各々、水素、ヒドロキシ基ハロ
   ゲン基、未置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基またはアミド基であるが、ＸおよびＸ
   ′の少くとも一方は水素以外であり； Ｙは低級アルキル基であり；そして Ｙ′は水素、低級アルキル基、低級アルキル基、炭素数
   ２０以下のアラルキル基、アルカリ金属陽イオン、炭素
   数２ないし約１４のアシル基、▲数式、化学式、表等が
   あります▼，▲数式、化学式、表等があります▼または
   ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｍは各々独立して、プロトン、アルカリ金属陽イ
   オン、アンモニウム、置換アンモニウム、四級アンモニ
   ウムあるいはＨ＾＋ピリジニウム陽イオンである） である。） １９、ＸがヒドロキシでＸ＾１が水素である請求項１８
   の化合物。 ２０、ＸがクロルでＸ＾１が水素である請求項１８の化
   合物。 ２１、ＸがブロムでＸ＾１が水素である請求項１８の化
   合物。 ２２、Ｙがメチルである請求項１９〜２１のいずれかの
   化合物。 ２６、Ｙ′が▲数式、化学式、表等があります▼である
   請求項２２の 化合物。 ２４、各Ｍがナトリウムである請求項２３の化合物。 ２５、ジナトリウム３−（メトキシ−５−ヒドロキシト
   リシクロ〔３，３，１，１＾３＾．＾７〕デク−２−イ
   リデンメチル）フェニルホスフェートである請求項１８
   の化合物。 ２６、３−（メトキシ−５−クロルトリシクロ〔３，３
   ，１，１＾３＾．＾７〕デク−２−イリデンメチル）フ
   ェニルリン酸二ナトリウムである請求項１８の化合物。 ２７、３−（メトキシ−５−ブロムトリシクロ〔３，３
   ，１，１＾３＾．＾７〕デク−２−イリデンメチル）フ
   ェニルリン酸二ナトリウムである請求項１８の化合物。 ２８、光学的に検出し得る反応によって特異的結合対の
   一方を検出する検定方法であって： 上記光学的に検出し得る反応が、酵素と； 分解されると光エネルギーを発生することができ、その
   酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開裂
   される部位の結合が行われる前は室温において実質的に
   安定であり、次式で表わされる、酵素によって開裂し得
   る化学発光性１，２−ジオキセタン化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＸおよびＸ＾１は各々、水素、ヒドロキシ基ハロ
   ゲン基、未置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基またはアミド基であるが、ＸおよびＸ
   ＾１の少くとも一方は水素以外であり；そして、Ｒ＿１
   およびＲ＿２は、独立してあるいはいっしよになって、
   上記ジオキセタン化合物が酵素によって開裂されるとき
   発光するのを妨げず且つ該ジオキセタン化合物の４位の
   炭素原子の原子価を満足させる有機置換基を表わすが、
   ただし、Ｒ＿１およびＲ＿２が独立した置換基を表わす
   ときは、Ｒ＿２は芳香族基、複素環芳香族基、または芳
   香族環と結合した不飽和置換基であり、またＲ＿１およ
   びＲ＿２の少くとも一方は、あるいはＲ＿１とＲ＿２は
   いっしょになって、該ジオキセタン化合物の酵素によっ
   て開裂し得る不安定な置換基が酵素によって脱離される
   と発光性物質を生成させる酵素によって開裂し得る不安
   定な基で置換された発螢光団基である。）との反応から
   なる方法。 ２９、ＸがヒドロキシでＸ＾１が水素である請求項２８
   の検定方法。 ３０、ＸがクロルでＸ＾１が水素である請求項２８の検
   定方法。 ３１、ＸがブロムでＸ＾１が水素である請求項２８の検
   定方法。 ３２、Ｒ＿１がメトキシである請求項２９−３１のいず
   れか１つの検定方法。 ３３、Ｒ＿２はメタホスフェート置換フェノキシである
   請求項３２の検定方法。 ３４、リン酸塩置換基が二ナトリウム塩の形で存在する
   請求項３３の検定方法。 ３５、Ｒ＿２がメタβ−Ｄ−ガラクトシド置換フェノキ
   シである請求項３２の検定方法。 ３６、１，２−ジオキセタン化合物が３−（４−メトキ
   シスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−
   ヒドロキシ）トリシクロ〔３，３，１，１＾３＾．＾７
   〕デカン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウムで
   ある請求項２８の検定方法。 ３７、１，２−ジオキセタン化合物が３−（４−メトキ
   シスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−
   クロル）トリシクロ〔３，３，１，１＾３＾．＾７〕デ
   カン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウムである
   請求項２８の検定方法。 ３８、１，２−ジオキセタン化合物が３−（４−メトキ
   シスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−
   プロム）トリシクロ〔３，３，１，１＾３＾．＾７〕デ
   カン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウムである
   請求項２８の検定方法。 ３９、特異的結合対が抗原及び抗体からなる請求項２８
   の検定方法。 ４０、特異的結合対が核酸とこの核酸の全体あるいは一
   部分と結合し得るプローブからなる請求項２８の検定方
   法。 ４１、特異的結合対が酵素とこの酵素によって開裂し得
   る基を含む１，２−ジオキセタン化合物からなる請求項
   ２８の検定方法。 ４２、酵素によって開裂し得る基がガラクトピラノシド
   であり、酵素がガラクトシダーゼである請求項４１の検
   定方法。 ４３、核酸がＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片である請求
   項４０の検定方法。 ４４、プローブが上記核酸に対して相補性である標識さ
   れたオリゴヌクレオチドである請求項４０の検定方法。 ４５、オリゴヌクレオチドプローブがビオチニル化され
   ている請求項４４の検定方法。 ４６、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片が塩基配列決定プ
   ロトコールによって製造される請求項４４の検定方法。 ４７、さらに下記段階（ａ）〜（ｄ）を含む請求項４６
   の検定方法： （ａ）ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片を標識された相補
   性オリゴヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダ
   イズする対を形成し；（ｂ）ハイブリダイズした対を、
   酵素によって開裂し得る１，２−ジオキセタン化合物を
   開裂して光エネルギーを放出し得る酵素と共有結合され
   たオリゴヌクレオチドの標識に強く結合し得る分子と接
   触させ；（ｃ）そのような１，２−ジオキセタン基質を
   加え；そして（ｄ）発光を検出する。 ４８、オリゴヌクレオチドの標識がビオチンまたはビオ
   チン誘導体である請求項４７の検定方法。 ４９、オリゴヌクレオチドの標識と強い結合を行える分
   子がアビジンまたはストレプトアビジンである請求項４
   ７の検定方法。 ５０、酵素が酸性またはアルカリ性ホスファターゼであ
   り、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタホスフェー
   ト置換フェノキシである請求項４７の検定方法。 ５１、酵素がガラクトシダーゼで、Ｒ＿１がメトキシで
   、Ｒ＿２がメタβ−Ｄ−ガラクトシド置換フェノキシで
   ある請求項４７の検定方法。 ５２、光エネルギーが感光性フィルムで検出される請求
   項４７の検定方法。 ５３、光エネルギーが光電セルによって検出される請求
   項４７の検定方法。 ５４、上記オリゴヌクレオチドプローブが、１，２−ジ
   オキセタンを分解して光エネルギーを放出し得る酵素で
   共有結合によって標識されている請求項４４の検定方法
   。 ５５、オリゴヌクレオチドプローブの標識が抗体−酵素
   結合物に免疫化学的に結合した共有結合抗原からなり、
   上記抗体は上記抗原に結合され、上記酵素は上記１，２
   −ジオキセタン化合物を分解して光エネルギーを放出す
   ることができる請求項４４の検定方法。 ５６、上記酵素が酸性またはアルカリ性ホスファターゼ
   であり、Ｒ＿１はメトキシであり、Ｒ＿２はメタホスフ
   ェート置換フェノキシである請求項５４または５５のい
   ずれかの検定方法。 ５７、酵素がガラクトシダーゼであり、Ｒ＿１がメトキ
   シであり、Ｒ＿２がメタβ−Ｄ−ガラクトシド置換フェ
   ノキシである請求項５４または５５のいずれかの検定方
   法。 ５８、上記核酸へのプローブの結合がナイロン膜上で行
   なわれる請求項４０，４４，５４または５５のいずれか
   １つの検定方法。 ５９、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片と上記標識された
   オリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼー
   ションがナイロン膜上で行なわれる請求項４７−５３の
   いずれかの検定方法。 ６０、上記マトリックスに対する非特異的結合が上記マ
   トリックスを重音性四級アンモニウム塩で前処理するこ
   とによって阻止される、固体マトリックスを使用して行
   なわれる、請求項２８の検定方法。 ６１、その不存在下に発生される特異的光エネルギーを
   それ以上に上昇させる水溶性エンハンサーをさらに存在
   させて行なわれる請求項２８の検定方法。 ６２、水溶性エンハンサーが血清アルブミンである請求
   項６１の検定方法。 ６３、上記エンハンサーが重合性四級アンモニウム塩で
   ある請求項６１の検定方法。 ６４、上記重合性四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベ
   ンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ〔ビニ
   ルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）
   〕またはポリ〔ビニル（ベンジルトリブチルアンモニウ
   ムクロリド）〕である請求項６３の検定方法。 ６５、エンハンサーが正に荷電した重合性四級アンモニ
   ウム塩、および上記１，２−ジオキセタン化合物の酵素
   触媒分解によって生成した１，２−ジオキセタン化合物
   の負に荷電した生成物との三元複合体を形成し得るフル
   オレセインからなり、それによってエネルギーが該負に
   荷電した生成物とフルオレセインとの間で移行し、光エ
   ネルギーがフルオレセインによって放出される請求項６
   １の検定方法。 ６６、重合性四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベンジ
   ルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ〔ビニルベ
   ンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）〕ま
   たはポリ〔ビニル（ベンジルトリブチルアンモニウムク
   ロリド）〕である請求項６５の検定方法。 ６７、分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物、及び該１，２−ジオキセタ
   ン化合物の酵素によって開裂し得る不安定な基を開裂す
   ることができる酵素を含む、試料中の第一物質を検出す
   るためのキット：ただし、上記の式において Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシル基、ハロ
   ゲン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基又はアミド基を表わし、ここでＸ及び
   Ｘ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり；そして Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位の炭素原
   子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただし、
   Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換基Ｒ
   ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合して
   いる不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の少な
   くとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって該ジ
   オキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安定な
   置換基が酵素によって脱離させると発光性物質を生成さ
   せる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置換された
   発螢光団基を表わす。 ６８、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−ホスフ
   ェート置換フェノキシ基であり、そして酵素が酸性又は
   アルカリ性のホスファターゼである、請求項６７に記載
   のキット、 ６９、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がβ−Ｄ−ガラ
   クトシド置換フェノキシ基であり、そして酵素がガラク
   トシダーゼである、請求項６７に記載のキット。 ７０、光エネルギーを検出する画像再現手段を更に含む
   、請求項６７〜６９のいずれかに記載のキット。 ７１、画像再現手段が写真フィルムである、請求項７０
   に記載のキット。 ７２、分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物、酵素により共有結合で標識
   されたオリゴヌクレオチドプローブ、及び膜の上で核酸
   −オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーショ
   ンが行われるそのナイロン膜を含む、試料中の核酸又は
   その断片を該核酸又はその断片の相補性標識付きオリゴ
   ヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーション
   により検出するためのキット：ただし、上記の式におい
   て、 Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシル基、ハロ
   ゲン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基又はアミド基を表わし、ここでＸ及び
   Ｘ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり；そして Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位の炭素原
   子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただし、
   Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換基Ｒ
   ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合して
   いる不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の少な
   くとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって該ジ
   オキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安定な
   置換基が酵素によって脱離させると発光性物質を生成さ
   せる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置換された
   発螢光団基を表わす。 ７３、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−ホスフ
   ェート置換フェノキシ基であり、そして酵素が酸性又は
   アルカリ性のホスファターゼである、請求項７２に記載
   のキット。 ７４、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−β−Ｄ
   −ガラクトシド置換フェノキシ基であり、そして酵素が
   ガラクトシダーゼである、請求項７２に記載のキット。 ７５、光エネルギーを検出する画像再現手段を更に含む
   、請求項７２〜７４のいずれかに記載のキット。 ７６、画像再現手段が写真フィルムである、請求項７５
   に記載のキット。 ７７、分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物；ビオチン又はビオチン誘導
   体により共有結合で標識された相補性オリゴヌクレオチ
   ドプローブ；光エネルギーを発生せしめるために該１，
   ２−ジオキセタン化合物を分解することができる酵素に
   共有結合されたアビジン又はストレプトアビジン；及び
   膜の上で核酸又はその断片が該オリゴヌクレオチドプロ
   ーブにハイブリダイズされるそのナイロン膜を含む、試
   料中の核酸又はその断片を該核酸又はその断片の相補性
   標識付きオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリ
   ダイゼーションにより検出するためのキット：ただし、
   上記の式において Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシル基、ハロ
   ゲン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基又はアミド基を表わし、ここでＸ及び
   Ｘ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり；そして Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位の炭素原
   子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただし、
   Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換基Ｒ
   ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合して
   いる不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の少な
   くとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって該ジ
   オキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安定な
   置換基が酵素によって脱離されると発光性物質を生成さ
   せる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置換された
   発螢光団基を表わす。 ７８、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−ホスフ
   ェート置換フェノキシ基であり、そして酵素が酸性又は
   アルカリ性のホスファターゼである、請求項７７に記載
   のキット。 ７９、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−β−Ｄ
   −ガラクトシド置換フェノキシ基であり、そして酵素が
   ガラクトシダーゼである、請求項７７に記載のキット。 ８０、光エネルギーを検出する画像再現手段を更に含む
   、請求項７７〜７９のいずれかに記載のキット。 ８１、画像再現手段が写真フィルムである、請求項８０
   に記載のキット。 ８２、分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物；抗原により共有結合で標識
   された相補性オリゴヌクレオチドプローブ；光エネルギ
   ーを発生せしめるために該１，２−ジオキセタン化合物
   を分解することができる酵素に共有結合された、該抗原
   に向けられる抗体；及び膜の上で核酸又はその断片が該
   オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされるそ
   のナイロン膜を含む、試料中の核酸又はその断片を該核
   酸又はその断片の相補性標識付きオリゴヌクレオチドプ
   ローブに対するハイブリダイゼーションにより検出する
   ためのキット：ただし、上記の式において Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシル基、ハロ
   ゲン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシ基、シアノ基又はアミド基を表わし、ここでＸ及び
   Ｘ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり；そして Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位の炭素原
   子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただし、
   Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換基Ｒ
   ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合して
   いる不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の少な
   くとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって該ジ
   オキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安定な
   置換基が酵素によって脱離されると発光性物質を生成さ
   せる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置換された
   発螢党団基を表わす。 ８３、酵素が酸性又はアルカリ性のホスファターゼであ
   り、Ｒ＿１がメトキシであり、そしてＲ＿２がメタ−ホ
   スフェート置換フェノキシ基である、請求項８２に記載
   のキット。 ８４、酵素がガラクトシダーゼであり、Ｒ＿１がメトキ
   シであり、そしてＲ＿２がメタ−β−Ｄ−ガラクトシド
   置換フェノキシ基である、請求項８２に記載のキット。 ８５、光エネルギーを検出する画像再現手段を更に含む
   、請求項８２〜８４のいずれかに記載のキット。 ８６、画像再現手段が写真フィルムである、請求項８５
   に記載のキット。 ８７、分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される配位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物；光エネルギーを発生せしめ
   るために該１，２−ジオキセタン化合物を分解すること
   ができる酵素に共有結合された、蛋白質に向けられる抗
   体；及び膜上で蛋白質−抗体の結合が行われるその膜を
   含む、試料中の蛋白質を検出するためのキット：ただし
   、上記の式において Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシ基、ハロゲ
   ン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アル
   キル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフ
   ェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキ
   シ基、シアノ基又はエアミド基を表わし、ここでＸ及び
   Ｘ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり；そして Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位の炭素原
   子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただし、
   Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換基Ｒ
   ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合して
   いる不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の少な
   くとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって該ジ
   オキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安定な
   置換基が酵素によって脱離されると発光性物質を生成さ
   せる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置換された
   発螢光団基を表わす。 ８８、膜がナイロン又はニトロセルロースの膜である、
   請求項８７に記載のキット。 ８９、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−ホスフ
   ェート置換フェノキシ基であり、そして酵素が酸性又は
   アルカリ性のホスファターゼである、請求項８７に記載
   のキット。 ９０、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−β−Ｄ
   −ガラクトシド置換フェノキシ基であり、そして酵素が
   ガラクトシダーゼである、請求項８７に記載のキット。 ９１、光エネルギーを検出する画像再現手段を更に含む
   、請求項８７〜９０のいずれかに記載のキット。 ９２、画像再現手段が写真フィルムである、請求項９１
   に記載のキット。 ９３、分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によつて開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物；蛋白質に向けられる第一の
   抗体；及び該１，２−オキセタン化合物を分解すること
   ができる酵素に共有結合された該第一抗体に向けられる
   第二の抗体を含む、試料中の蛋白質を検出するためのキ
   ット：ただし、上記の式において Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシル基、ハロ
   ゲン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）ア
   ルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロ
   フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコ
   キシフェニル基、シアノ基又はアミド基を表わし、ここ
   でＸ及びＸ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり
   ；そしてＲ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって
   、該ジオキセタン化合物が酵素によって開裂されるとき
   光の発生を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位
   の炭素原子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；
   ただし、Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合
   置換基Ｒ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に
   結合している不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿
   ２の少なくとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒にな
   って該ジオキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る
   不安定な置換基が酵素によって脱離されると発光性物質
   を生成させる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置
   換された発螢光団基を表わす。 ９４、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−ホスフ
   ェート置換フェノキシ基であり、そして酵素が酸性又は
   アルカリ性のホスファターゼである、請求項９３に記載
   のキット。 ９５、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−β−Ｄ
   −ガラクトシド置換フェノキシ基であり、そして酵素が
   ガラクトシダーゼである、請求項９３に記載のキット。 ９６、水溶性のエンハンサーを更に含み、該エンハンサ
   ーはそれが存在しないときに発生するよりも多量の特定
   の光エネルギーを発生させるものである、請求項６７，
   ７２，７７，８２，８７又は９３に記載のキット。 ９７、水溶性のエンハンサーが血清アルブミンでである
   、請求項９６に記載のキット。 ９８、エンハンサーが高分子四級アンモニウム塩である
   、請求項９６に記載のキット。 ９９、高分子四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベンジ
   ルトリメチルアンモニウムクロライド）又はポリ〔ビニ
   ルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライド
   ）〕である、請求項９７に記載のキット。 １００、エンハンサーが正に帯電した高分子四級アンモ
   ニウム塩、及び１，２−ジオキセタン化合物の酵素触媒
   分解の結果生成した該１，２−ジオキセタン化合物の負
   に帯電した生成物と三成分系錯体を形成することができ
   るフルオレセインを含み、それによって該負帯電生成物
   とフルオレセインとの間でエネルギーの移動が起り、フ
   ルオレセインによって光エネルギーが発せられる、請求
   項９６に記載のキット。 １０１、高分子四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベン
   ジルトリメチルアンモニウムクロライド）又はポリ〔ビ
   ハルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライ
   ド）〕である、請求項１００にに記載のキット。 １０２、試料中の酵素を検出する方法であって、該方法
   は次の （ａ）分解されると光エネルギーを発生することができ
   、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に開
   裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安定
   な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｘ及びＸ＾１は各々個別に水素、ヒドロキシ基、ハロゲ
   ン基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アル
   キル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフ
   ェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキ
   シ基、シアノ基又はアミド基を表わし、ここでＸ及びＸ
   ＾１の少なくとも一方は水素以外の基であり；そして Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該式のジオキセタン化合物の４位の炭
   素原子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただ
   し、Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換
   基Ｒ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合
   している不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の
   少なくとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって
   該ジオキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安
   定な置換基が酵素によって脱離されると発光性物質を生
   成させる、酵素によって開裂し得る不安定な基で置換さ
   れた発螢光団基を表わす。〕 で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物を用意し；（ｂ）該１，２−
   ジオキセタン化合物を該酵素含有試料と接触させ、その
   結果該酵素は該１，２−ジオキセタン化合物からその酵
   素開裂性の不安定な置換基を開裂させて該１，２−ジオ
   キセタン化合物に結合された負に帯電した置換基を形成
   し、ここで該負帯電置換基は該１，２−ジオキセタン化
   合物を分解させて該発螢光団基を含む発色性物質を形成
   するものであり；そして （ｃ）該酵素の存在を示すものとしての該発光性物質を
   検出する 工程を含む前記検出方法。 １０３、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−ホス
   ホホネート置換フェノキシ基であり、そして酵素が酸性
   又はアルカリ性のホスファターゼである、請求項１０２
   に記載のキット。 １０４、Ｒ＿１がメトキシであり、Ｒ＿２がメタ−β−
   Ｄ−ガラクトシド置換フェノキシ基であり、そして酵素
   がガラクトシダーゼである、請求項１０２に記載のキッ
   ト。 １０５、分解されると光エネルギーを発生することがで
   き、酵素によって開裂し得る不安定な置換基が意図的に
   開裂される部位の結合が行われる前は室温で実質的に安
   定な、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性の１
   ，２−ジオキセタン化合物：ただし、上記の式において Ｒ＿１及びＲ＿２は、個別に又は一緒になって、該ジオ
   キセタン化合物が酵素によって開裂されるとき光の発生
   を妨害せず、かつ該ジオキセタン化合物の４位の炭素原
   子の原子価を満足させる有機置換基を表わす；ただし、
   Ｒ＿１及びＲ＿２が個々の置換基を表わす場合置換基Ｒ
   ＿２は芳香族基、複素芳香族基又は芳香族環に結合して
   いる不飽和置換基であり、またＲ＿１及びＲ＿２の少な
   くとも一方は、又はＲ＿１とＲ＿２は一緒になって該ジ
   オキセタン化合物の、酵素によって開裂し得る不安定な
   置換基が酵素によって脱離されると発光性となる、酵素
   によって開裂し得る不安定な基で置換された発螢光団基
   を表わす。