JPH07509736A - 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 元服り３竺 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類本願は、代理人事案記録番号第４ ０８５−０６１−２７　ＣＩＰとして１９９４年４月２５日に提出された米国特 許出願第０８／号及び１９９３年５月７日で提出された米国特許出願第０８１０ ５７，９０３号の優先権を主張するものである。

二呵り背量 １呵の立野 本発明は、酵素により活性化されて分解し、分解する間に光を放出する化学発光 性１．２−ジオキセタン誘導体に関する０本ジオキセタン類は、ジオキセタンに 結合した芳香族環（フェニル又はナフチル）を有することを特に特徴とし、この 芳香族環は、メタ位に、酵素によって切断され得る、切断されると、ジオキセタ ンのフェノキシアニオン又はナフチルオキシアニオンを残す開裂性ないし分解性 置換基を有し、さらにフェニルの場合はその４位又は５位に、例えば電子供与又 は電子求引基を有する。４位又は５位の置換基（２残基）の種類を選択すること によって、ジオキセタンの化学発光特性、特に半減期、量子収率、Ｓ／Ｎ比など の特性を変更することができる。

Ｘ咀ム亙二 １．２−ジオキセタン酵素基質については、高効率の化学発光リポータ−分子と して、非常に広範囲の酵素免疫測定法及び核酸プローブ測定法における使用が確 立されている。これらの測定法は、放射性同位元素、蛍光発色団、複雑な色変化 、二次反応などに依存する従来の測定法に替わる、より望ましい方法を供するも のである。この目的のために開発されたジオキセタン類としては、米国特許４， ９７８，６１４号及び５，１１２．９６０号に開示されているものが挙げられる 。米国特許４，９７８，６１４号は、他の物質とともに、３−　（２’−スピロ アダマンクン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１ ，２−ジオキセタンを開示しており、この物質は世界的に注目され、ＡＭＰＰＤ の商品名で市販されている。米国特許５，１１２．９６０号は、アダマンチル安 定環がその橋頭位のいずれかにおいて、水素、ハロゲン等の各種置換基によって 置換されている化合物を開示しており、これらの置換基が、これらがなければ安 定又は非活性であるアダマンチル安定基を、ジオキセタン環の分解の動力学に関 連する活性基に変換しているのである。この種類の化合物もまた、多くの用途に おいてＡＭＰＰＤよりも速やかかつ強力な信号を発するため、同様に国際的に注 目された。Ｃ３ＰＤはアダマンチル基に塩素置換基を有するスピロアダマンチル −フェニルホスフェート−ジオキセタンであり、ＡＭＰＰＤと同様にマサチュー セッツ、ベトフォードのトロピックス社（Ｔｒｏｐｉｘ、　Ｉｎｃ、）により販 売されている。

この種類の化合物は、分析物が１０′□１２Ｍ又はそれ未満のような低濃度で存 在する場合の測定法のため、感受性の増大を特に目的として開発された。この種 類の化合物を、１０−”　Ｍ又はそれ未満の濃度の被検体を検出するために、増 強剤と併用して使用する場合もある。これらの増強剤は、天然及び合成水溶性巨 大分子を含むものであり、詳細には米国特許５，１４５，７７２号に開示されて いる。好ましい増強剤としては、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウム クロリド）（ＴＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド ）（ＴＢＱ）及びポリ（ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムクロリド ）（ＢＤＭＱ）などの水溶性重合性第四級アンモニウム塩が挙げられる。

これらの増強剤は、明らかにジオキセタンが封鎖される疎水性環境を供すること によって、ジオキセタンリポータ−分子による化学発光信号を改良する０体液を 使用するため、はとんどの測定法において避けることのできない要素である水は 、ジオキセタンの化学発光の天然の「消光剤」である、増強剤分子は明らかに、 ジオキセタン分子又は少なくとも励起状態の発光種が存在する微小環境から水を 除外して、化学発光の増強をもたらす、この増強剤とジオキセタンとの相互作用 に関連した他の作用も又、化学発光の増強をもたらす。

ナイロン膜及び処理済みニトロセルロースなど、膜に基づ（測定法において同様 の疎水表面をもたらす膜や、上述したような増強剤の種類のポリマーで被覆した 膜を選択使用することによっても、さらに有利な効果が得られる。

しかし、これらの安定化された化学発光性ジオキセタンリポータ−分子の性能を 向上し、ジオキセタン類によって放出される化学発光信号に依存した免疫測定法 におけろ機械の判読性、感度、及び性能を向上させることは１本業界にとっては いまだ一般的な目樟である。

背景技術において、及び上記で引用したいずれの特許においても開示されている ように、酵素により活性化されるジオキセタン類は、リポータ−分子として、ジ オキセタン環上の芳香族置換基に結合した、酵素に不安定な基を切断する酵素の 基質として使用される。従って、通常の抗原抗体リガンド結合測定法又は核酸測 定法における核酸プローブにおいては、酵素、例えばアルカリホスファターゼは 単独で存在するが、あるいは抗原又は抗体のいずれがと共有結合するか、そうで なければ複合体を形成する。酵素を有する抗原若しくは抗体、又は核酸プローブ を、抗原／抗体又はプローブ／核酸配列との間で複合体の形成又はハイブリダイ ゼーシジンを可能とする条件で、標的抗原を含んでいる疑いのある被検体又は核 酸配列と混合する。複合体又はハイブリッドを形成しなかったすべての物質を洗 い落とすか分離した後、ジオキセタン基質を加える。存在を疑われる被検体が存 在する場合、酵素は、ジオキセタン上の芳香族置換基、例えばフェニル又はナフ チル上の、酵素に不安定な基を切断して、フェノキシ又はナフチルオキシアニオ ン中間体を生じる。このアニオンが、芳香族環を介した電子伝達により分解し、 ジオキセタン環を切断して、２種類のカルボニル化合物を生じる。

この切断／分解の過程において、発光が得られる。

臨床的測定を自動化し、ある程度の処理能力を達成するには、半減期、すなわち ジオキセタンのＴＩ／□の連続的な短縮とリポータ−分子が光を最大放出するま でに要する時間の短縮が必要である。同時に、非常に低濃度、例えば約１０”” Ｍ以下の濃度の被検体を検出するには、ジオキセタンリポータ−分子の信号の強 度を向上させることが必要であり、同時に測定法の全体的な感度を向上させるに は酵素以外の物質に誘発される発光を原因とするバックグラウンドノイズの増大 を避けることも必要である。このため、化学発光性ジオキセタンリポータ−分子 のさらなる改良が望まれている。

発明の概要 上記目橿及びその他の目橿は、ジオキセタンに結合した芳香族環上の置換基と、 酵素に不安定なｍ位の置換基を特徴とする新しい種類のジオキセタン類によって 達成される。ここで、本発明の新規ジオキセタン類は、以下の一般式１、ＩＩ又 はＩＮの構造を有する。

式中、ＲはＣ１−１２アルキル、アラルキル又はアリールであり、好ましくはＣ １−４アルキルであり、Ｘは酵素に不安定な基を認識する特定の酵素によって切 断されてフェノキシ又はナフトキシアニオンとなる、酵素に不安定な基であり、 好ましくはホスフェート、ガラクトシド又はグルクロニドである。Ｙｌ及びＹ２ はそれぞれ独立して水素又は電子供与若しくは引基であり、好ましくは水素、メ トキシ、カルボキシ又はハロゲンであり、最も好ましくはＹｌ及びＹ２の一方が 水素であり、他方が塩素であり、そして２は電子活性基であり、最も好ましくは 塩素、アルコキシ、アルキル又はアミドである。Ｚがフェニル環上にある場合、 Ｚは４位又は５位に存在する。ＯＸ及び２がナフチル環上に置換基として存在す る場合、米国特許４，９５２，７０７号に開示されているように、ジオキセタン 環との結合部位と置換部位との間の環の原子の数の合計が、ジオキセタン環への 結合部位と置換部位も含めて奇数であるように、ＯＸは置換基として存在する。

置換基２は、ジオキセタン環との結合部位に隣接した部位以外であればナフチル 環上のいずれの部位に存在してもよい。

電子求引基又は電子供与基であるＺの特定の種類及び位置を選択することによっ て、ｔｌ／ｌすなわち化学発光半減期、最大発光に至るまでの時間、最大発光波 長及び化学発光信号強度など、ジオキセタンの化学発光様態の特定の特徴を変更 することができる。

はｌ二固車μ説囚 図１及び図２は、ジナトリウム　３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセ タン−３，２°−（５°−クロロ）トリシクロ［３，３，１，１”　］デカン］ −４−イル）−フェニルホスフェートのジオキセタン（Ｃ３ＰＤ）の性能を、本 発明の化合物であってフェニル残基が、４位に塩素置換基を有しているジナトリ ウム　２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２ ’　（５°−クロロ−）トリジクロー［３，３，１゜１３１〕−デカン］−４イ ル）−フェニルホスフェート（ＣＤＰ−３ｔａｒ）と比較したものである。図２ は、化学発光増強剤であるポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド の存在を反映している。

図３は、ビオチン化されたｐＢＲ３２２−３５ｍａｒのナイロン膜測定における Ｃ３ＰＤ及びＣＤＰ−３ｔａｒとを比較したものである。

図４及び図５は、Ｃ３ＰＤ及びＣＤＰ−３ｔａｒを比較したナイロン及びＰＶＤ Ｆ膜を用いて行われたウェスタンプロット法によるコダック（Ｋｏｄａｋ　）　 ＸＡＲ−５フイルムの露光の複写図である。

図６、図７及び図８は、酵母の遺伝子ＲＰＢ１に対して、ナイロン膜を用いて行 った測定においてそれぞれ１０分、７０分及び１９時間Ｃ３ＰＤ及びＣＤＰ−３ ｔａｒをインキュベートして比較した場合のＸ線フィルムの複写図である。

図９は、Ｃ３ＰＤ及びＣＤＰＳｔａｒを比較した、ナイロン膜を用いて行った梯 子型ＤＮＡ配列の化学発光検出を反映したＸ線フィルム露光の複写図である。

図１０及び図１１は、本発明で請求されているジオキセタンを使用して得られた ＤＮＡ配列のＸ線フィルムの映像の電子写真による複写図である。これらを、現 在市販されている標準品であるＣ３ＰＤと比較している。

図１２〜図２１は、本発明のジオキセタン類、本発明の範囲外のジオキセタン類 、及び市販されている欅準品であるＣ３ＰＤ及びＡＭＰＰＤを用い、記載した膜 を用いて行ったドツトプロット法による測定結果の電子写真による複写図である 。これらの測定を行った膜は、図中に記載しである。

尺且塁狂坦皇説朋 本発明のジオキセタン類は、ジオキセタンに結合した芳香族環上の置換基を、決 定的な特徴とし、この芳香族環が、アリールオキシアニオンにおける電子伝達を 決定し、分解と化学発光をもたらす。

従って、本発明のフェニルジオキセタン類は、以下の一般式（Ｉ）を有する。

従って、本発明のアダマンチル安定化ジオキセタン類は、ジオキセタンの結合部 位のほかフェニル環上に２種類の置換基を有し、さらにアダマンチル環上にもＯ ｌｌ又は２個の非水素置換基を有する。これらの置換基が、ジオキセタン、その オキシアニオン及びその分解挙動の電子的特徴を決定する。各置換基の種類は、 以下に述べるとおりである。

Ｒは、炭素数１−１２のアルキル、アラルキル、シクロアルキル又はアリールで あってよい。Ｒは好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルであり、より好ましくはＣ１− Ｃ３アルキルであり、最も好ましくはメチルである。Ｒの種類は、溶解性に関し ては、異常な被検体又は緩衝液が、特に問題を引き起こす場合に最適に選ばれる 。Ｙ’及びＹ２はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシ基、ハロゲン置換基、ヒド ロキシ低級アルキル基、へロ低級アルキル基、フェニル基、へロフェニル基、ア ルコキシフェニル基、アルコキシフェノキシ基、ヒドロキシアルコキシ基、シア ン基、アミド基、カルボキシル基若しくは置換されたカルボキシル基、アルコキ シ基及びその他の同様の電子活性種を示す。Ｙｌ及びＹ２の一方について好まし い種類は、他方が水素である場合、塩素、ヒドロキシ及びメトキシである。

Ｘは酵素によって切断される残基である。従って、適当な酵素に適宜接触させる ことによって、Ｘは分子から切断して、フェニル環に酸素を結合させたまま、従 ってフェノキシアニオンとして残す。

Ｘは理想的にはホスフェートガラクトシド、アセテート、１−ホスホ−２，３− ジアシルグリセリド、１−チオーＤ−グルコシド、アゾンシントリホスフェート 、アデノシンジホスフェート、アデノシンモノホスフェート、アデノシン、α− Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルクロニド、α−Ｄ−マンノ シド、β−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシド、β−グルコシドウロ ネート、ｐ−１−ルエンスルホニルーし−アルギニンエステル、及びｐ−＋−ル エンスルホニルーし一アルギニンアミドである。Ｘは好ましくはホスフェート、 ガラクトシド又はグルクロニドであり、最も好ましくはホスフェートである。フ ェニル環上に置換基を有する場合は、ＯＸはジオキセタン環との結合部位を基準 としてｍ位にある、つまり３位に存在することが重要である。

２は、４又は５位のいずれかを占める。Ｚは、電子活性種（電子供与又は電子求 引）の特徴である電子活性置換基であり、各種ジオキセタン残基を有効に利用す る。例えば、メトキシ基などの電子供与基は、芳香族環の〇−供与基からの遊離 電子のジオキセタン環への伝達を促進することによって、ジオキセタンフェノキ シアニオン分解の過程を促進させる。反対に、電子求引基は、遊離電子のジオキ セタンへの伝達能を低下させ又は阻害し、その結果、分解反応及び発光を遅れさ せるが、最終的には強度の大きい光信号を発する。

これは、塩素など、実質的に発光を促進し、ＴＩ／ヨを急激に短縮する。アダマ ンチル基上の電子活性置換基による効果とは対比的である。６位に置換基を有す ることが特に好ましくないという事実には、驚くべき意味がある。このように６ 位が置換されたフェニルジオキセタン類は、異常に早い分解の動力学を示し、は とんど発光を示さない。出願人はこの理論に限定することを望むわけではないが 、このような挙動は、立体的な面の考慮、つまりオルト位の置換基が、ジオキセ タン環を不安定化（電子伝達ではなく、立体的な力による不安定化）するように フェニル環を「回転」させるためであり、６位の置換基、例えばメトキシは、電 子伝達には関与しないと考えられている。以下に述べるように、６位置換フェニ ルジオキセタン類を用いた実験では、信号は実質的に得られない。

ジオキセタン環のフェニル置換基は、替わりになどのナフチル（式１１及びＩＩ Ｉ　）であってもよい。

ナフチルジオキセタンにおいても、Ｒ，Ｙ’、Ｙ”、Ｘ及び２の種類は、フェニ ルジオキセタンにおけるのと同じである。ＯＸは、「メタ」位に制限される替わ りに、ナフチル環における対応する位置、つまり非兵役位、又は米国特許４．９ ５２，７０７号に記載されているように、置換部位とジオキセタン環との結合部 位の間の炭素原子の数が、結合部位と置換部位の両方の炭素を含めて奇数である ような位置を占めてもよい。メタ位が置換されたフェニルジオキセタン類及び上 述したように置換されているナフチルジオキセタン類は一般的には、対応するバ ラ位に置換基を有する系や共役系におけるよりも高い量子収率を示すことが予想 されている。

上述したように、Ｚは、ジオキセタンの化学発光の挙動に干渉しないいかなる電 子活性置換基であってもよく、従って、非常に広い範囲から選択することができ る。好ましい電子活性置換基としては、クロロ、アルコキシ（−−ＯＲ）、アリ ールオキシ（−−ＯＡｒ）、トリアルキルアンモニウム（−−ＮＲ，”）、アル キルアミド（−−ＮＨＣＯＲｌ−−ＮＲＣＯＲ’　）、アリールアミド（−−Ｎ ＨＣＯＡｒ、−ＮＲＣＯＡｒ、−−ＮＡｒＣＯＡｒ）、アリールカルバモイル（ −−ＮＨＣＯＯＡｒ、−−ＮＲＣＯＯＡｒ）、アルキルカルバモイル（−−ＮＨ ＣＯＯＲｌ−−ＮＲＣＯＯＲ’　）、シアノ　（−−ＣＮ）、ニトロ（−−ＮＯ ｘ　）、エステル（−−ＣＯＯＲ１−−ＣＯＯＡｒ）、アルキル−若しくはアリ ールスルホナミド（−−ＮＨ３Ｏ，Ｒ１−ＮＨ３０ｉ　Ａｒ）、ｈリフルオロメ チル（−−ＣＦ、）、アリール（−−Ａｒ＞、アルキル（−−Ｒ）、ｈリアルキ ル−、トリアリール−若しくはアルキルアリールシリル（Ｓ　ｉＲｓ、Ｓ　１Ａ ｒｓ　、−−３１ＡｒＲ＊　）、アルキル−若しくはアリールアミドスルホニル （−−８０２ＮＨＣＯＲ１−−３ｏ２ＮＨＣＯＡｒ）、アルキル若しくはアリー ルスルホニル（−−９ｏ□Ｒ１５Ｏ２Ａｒ）、及びアルキル−若しくはアリール チオエーテル（−−３Ｒ，５Ａｒ）が挙げられる。Ｚ置換基の大きさは一般的に は、その溶解性によってのみ制限される。アルキル、つまりＲ１Ｒ゛などについ て述べる場合、アルキル残基は１〜１２の炭素原子を符すべきである。好適なア リール残基としては１代表的な残基としてフェニル及びナフチルが挙げられる。

特に好ましい種類は。

クロロ及びアルコキシを含む。

上述したような種類のジオキセタン類は、上述したようなＺ置換基を含まないが 、ここで一般的に挙げた特許に開示されている。Ｙ及び２置喚基を含まずにこの 種のジオキセタン類を示した特許としては、特許４，９６２，１９２号など、ウ ニイン州立大学（Ｗａｙｎｅ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に帰せられ る特許が挙げられる。ジオキセタン類のＺ置換基の置換により、新規トリ置換フ ェニル１．２−ジオキセタンホスフエートの名称を有し、以下に述べるトリ置換 フェニルホスホネートの合成法の開発が必要となった。同一の一般的な合成ルー トを、上記で論じたような所望置換パターンを考慮して、ここに含まれるナフチ ルジオキセタン類に用いることができる。以下に述べるルートによるこれらの化 合物の合成には、新規トリ置換ベンゼン類の製法が含まれる。

従って、以下に述べるように、この種類のジオキセタン類の合成に含まれる代表 的化合物としては、３−クロロ−５−メトキシ−ベンズアルデヒドが挙げられる 。これらのトリ置換化合物は、各種合成経路において、重要な中間体であり、こ の１，３．５置換パターンが、一般的に好ましく、広く適用可能なパターンであ る。これらの中間体はこれまでに製造されたことがないと出願人は信するもので あり、以下に述べる合成ルートにおいてアステリスクを付けて記載した。

新　トリ宥　フェニルｌ　２−ジオキセクンホスフエート賽含或 二股的説朋　市販の試薬をそのままさらに精製せずに用いた。

べ−カー（Ｂａｋｅｒ　）シリカゲル（グラムスケールで６０−２００メツシユ 、ミリグラムスケールで２３０−４００メツシユ）をフラッシュクロマトグラフ ィに用いた。”Ｐ　ＮＭＲスペクトルが、リン酸［４と比較して百万分の数位（ ｐｐｍ）であると報告された。

ジョンズホブキンス大学（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏ５ｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙ　）のＪ。

Ｌ　カチンスキ（Ｊ、Ｌ、　Ｋａｃｈｉｎｓｋｉ）によって高解像度質量スペク トルによる解析が行われた。ジオキセタン３及び４の合成は、それぞれジオキセ タン１及び２について以下に記載した過程により行われた。分離された中間体に 関して、その収量、融点（正確ではない）及びスペクトルのデータを要約する。

３−り四ロー５−メトキシー４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−ベンズ アルデヒド　５ ５ｏ２ＣＦ。

５−クロロ−バニリン’　（１３，０ｇ、７０ｍｍｏｌ）　、クロ。

ポルム（４ｍｌ）及びピリジン（１６ｍｌ）の１ｇ液を、０℃で攪拌した。無水 トリフルオロメタンスルホン酸（１２，４ｍｌ、７５ｍｍｏｌ）を０℃で３０分 間かけて加え、トリフラートを完全に生成させた。反応混合物をＥｔＯＡｃ及び ３ＮのＨＣＩに分配し、希ブラインで洗浄し、Ｎａｇ　ｓｏ、で乾燥させ、減圧 下で蒸発させた。得られた黄色の油をシリカゲルクロマトグラフィ（３０％Ｅｔ ＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、１８．５ｇ（８３％）のトリフラート５を黄色結 晶として得た。

ＩＲ（ＣＨＣｌ、、　ｃｍ−’）：　１７０５．　１５９０．　１４６１．　１ ４２５．　１２２５．　１２０５゜１１３２、１０４９．　ｌ１７５．６２４’ ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　３．９９　（３８，ｓ）、　７．４４　（ＩＨ，ｄ、　 Ｊ：１．６　Ｈｚ）、　７．５７（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１．７　Ｈｚ）、　９．９ ２　（ＩＨ，ｓｌ＊３−クロロ−５−メトキシ−ベンズアルデヒド　６トリフラ ート５（９ｇ、２８ｍｍｏｌ）　、酢酸パラジウム（ＩＩ）（１２０ｍｇ、０． ５ｍｍｏｌ）　、１．　１’−ビス（ジフェニルホスフィン）フェロセン（６２ ０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及びＨＰＬＣグレードのＣＨ，ＣＮ　（１０ｍ１）をテフ ロンで裏打ちしたステンレススチール製ボンベ中でよく混合した。調製したばか りの微粉プロトンスポンジホルマート”　（７，８４ｇ、３０開ｏｆ）を加え、 ボンベを密封し、９０℃で４時間加熱した。反応物を冷却後ろ過して、プロトン スポンジの結晶を除去し、ＥｔＯＡｃ及び３ＮのＭＣＩに分配し、それぞれを希 ブラインで１回ずつ洗浄し、Ｎ　ａ　ＨＣＯ３で希釈し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し 、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィ　（１５％、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン ）により精製し、融点４５°Ｃの４．２５ｇ　（８８，５％）のクロロメトキシ ベンズアルデヒド６を得た。

ＴＲ（ＣＨＣｌｉ、　ｃｌｌ−’）：　２８３５．　１７００　（Ｃ：０）、１ ５９０．　１５７６、１４６＋。

１４２５、１３８０．１３２０．１２８０．１２６５．１１４４．１０５０．８ ５０．６９５’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　３．８４　（３Ｈ，ｓｌ、　７．＋３　 （ＩＨ，ｍ）、　７．２６　（１）１．　ｍ）。

７．４１　（１ｔＬ　ｍｌ、　９．８９　（１１−１，ｓ）質量スペクトル（電 圧、７０ｅＶ）　：　Ｃａ　Ｈｔ　Ｃ１０ｆの正確な質量計算値１７０．０１３ ５、測定値１７０．０１３４゜３−クロロ−５−メトキシ−ベンズアルデヒドジ メチルアセターベンズアルデヒド６　（８，７６ｇ、５１　ｍｍｏｌ）のメタノ ール、各、夜（２０ｍｌ）をトリメチルオルトホルマート（５，６２ｍ１．５１ 　ｍｍｏｌ）及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸の存在下で、ジメチルアセタ ール７へ完全に変換させた。ｐ）１７のトリエチルアミンにより反応を停止させ 、蒸発させて少量としてからＥｔＯＡｃ及びＮＡＨＣＯ，に分配した。有機層を 乾燥し、減圧下で葱発させ、シリカゲルクロマトグラフィ（１０％ＥｔＯＡｃ／ ヘキサン）により精製して、１０．６８ｇ　（９６％）のアセタール７を淡黄色 の油として得た。

ＩＲｆｃｔｌｃｌ−９ｃｍ−’）＋　２９６０．　２９３８．　２ｇ３０．　１ ５９６．　１５７Ｌ　１４５８゜１２７０、１＋０４．１０５０゜ ９８９、　８７２．　８６５．８４０ ’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　３．３１　（６Ｈ，ｓ）、　３．７９　（３１（、ｓ ）、　５．３１　（ｌ）ｌ、　ｓ）、　６．８５（ｌｉｔ　ｓ）、６．８８　（ ＩＨ，ｓｌ、　７．０４　（ＩＨ，ｓ）。

ジエチル　ｌ−メトキシ−１−３−クロロ−５−メトキシーフ工アセタール７　 （４，０ｇ、１８．　５ｍｍｏｌ）　、ボロントリフルオリドエテラート（２， ３ｍｌ、１９ｍｍｏｌ）及びＣＨＩ　Ｃ１ｔ　（２０ｍｌ）の（容ｆ夜に、トリ エチＪレホスファイト’（３，２ｍｌ、１９ｍｍｏｌ）をＯ’Ｃで加えた。反応 物を室温まで徐々に温めたｆ＆（３０分）、溶液を希Ｎ　ａ　ＨＣＯｓに分配し 、Ｎａｇ　ｓｏ、で乾燥し、蒸発させ、シリカゲル（４０％−１００％ＥｔＯＡ ｃ／ヘキサン）で精製して、４．６ｇ　（７７，５％）のホスホネート８を淡黄 色の油として得た。

ＴＲ（ＣＨＣｌ３．　ａｍ−’）＋　２９９０．１５９１．１５７３．１４５８ ．１２５４　（Ｐ：０１．１０５０（Ｐ−０）、　１０２５　（Ｐ−Ｏｌ、　９ ６９．８７０．６８７’ＨＮＭＲ（ｐｐｍｌ：　１．２４　（３Ｎ、　ｔ、、　 Ｊ＝７　Ｈｚ）、１．２６　（３ｔ（、ｔ、　Ｊ＝７　Ｈｚ）。

３．３７　ｆ３Ｈ，ｓ）、　３．７８　（３Ｈ，ｓ）、　４．０１−４．０９　 （４Ｈ，ｍｌ、　４．４０　（ＩＨ，ｄ。

Ｊ＝１６　Ｈｚ）、　６．８３　（ＩＩＬ　ｔ、　Ｊ：２　Ｈｚ）、　６．８８ 　（ＩＨ，ｑｔ、　Ｊ＝２　Ｈｚ）、　６゜９８ｆｌＨ，ｑｔ、Ｊ＝２　Ｈｚｌ ３−クロロ−５−メトキシ−１−メトキシ−トリシクロ　３８３．１．１”　デ カ−２−イ１デンーメチル　−ベンゼン　９ホスホネート８　（４，６２ｇ、１ ４ｍｍｏｌ）及び２−アダマンタノン（２，５８ｇ、１７ｍｍｏｌ）をアルゴン 下で無水ＴＨＦ（３５ｍｌ）に溶解し、−６８℃に冷却した。無水ＴＨＦ　（２ ０ｍｌ）に？８解したリチウムジイソプロピルアミド（１８，６ｍｍｏｌ）を− ６８℃で滴下してイリドを生成し、その後、ケトンをオレフィン化した。反応物 を２時間かけて徐々に室温にまで温め、７５℃で１時間撹拌した。本溶液をＥｔ ＯＡｃ／ＮＨ４Ｃｌに分配し、Ｎａｇ　ｓｏ４で乾燥し、蒸発させ、シリカゲル クロマトグラフィ（２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により１ｌｌＩ製し、２．５ｇ 　（５５％）のエノールエーテル９を油として得た。

’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　１．５５−１．９５　（１２ｔＬ　ｍｌ、　２．６１ 　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、　３．２１　（ＩＨ。

ｂｒ　ｓｌ、　３．２８　ｆ３１（、ｓ）、　３．７８　（３Ｈ，ｓ）、　６． ７４　（ＩＨ，ｓ）、６．８０　（ＩＨ。

ｓｌ　、６．８７　ｆｌｌｔ　５） ３−クロロ−５−ヒドロキシ−１−メトキシ−トリシクロ　３゜３．１．１”　 デカ−２−イリデン−メチル　−ベンゼン」よ旦Ｌ エクンチオール酸ナトリウム（ｌ　ｌ　、７ｍｍｏｌ）の存在下で、エノールエ ーテル９　（２，５ｇ、７．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（１４ｍ１）中１５５℃で 加熱することによって、エノールエーテルフェノール１０への脱メチル化を完全 に進行させた。冷却後、混合物をＥｔＯＡｃ及びＮＨ，ＣＩに分配し、Ｎ　ａ　 ｍ　Ｓ　Ｏａにより乾燥し、高減圧下で蒸発させて残存しているＤＭＦを除去し た。クロマトグラフィによる事ｎ製（シリカゲル、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン ）により、２．３ｇ　（９６％）のフェノール１０を油として得、この油は放置 したところ結晶化した。この固体を５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにより粉末化した ところ、融点１３３℃の白色結晶が得られた。

ＩＲ（にＨ（Ｊ、、　ａｍ−’）：　３５８４　（ＯＨ）、　３３００　（ＯＨ ）、　２９に０．１５９０．１３１０゜１２ｇ５．１１６３．１［１９６，１０ ８０，１０１１，９００，８４０’ＨＮＭＲ（ｐｐｍｌ：　１．７３−１．９６ 　（１２ｔｌ、　ｍｌ、２．６２　（Ｉ）１．　ｂｒ　ｓ）、３．２０　（ＩＨ 。

ｂｒ　ｓ）、３．３２　（３Ｈ，ｓ）、　５．６５　（ＬｔＬ　ｂｒ　ｓ）、　 ６．７３　（ＩＨ，ｓ）、　６．７９（ｌｔｌｌｍ）、６．８５　（ＩＨ，ｓ） ピリジニウム　３−クロロ−５−メトキシ−トリシクロ　３゜３．１．１３７　 デカ−２−イリデン−メチル　−１−フェニルホムヱ玉二上ユユユＬ 無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）にン容解したエノールエーテル１０（７０９ｍｇ、２． ３ｍｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下でトリエチルアミン（４５０μｌ　、　３．　 ２ｍｍｏｌ）を加久た０本溶液を０℃に冷却し、二の時に２−クロロ−２−オキ ソ−１，３，２−ジオキサホスホレーン（フル力（Ｆｌｕｋａ　）　、２８５μ ｌ　、　３．０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を室温にまで温め、非活性雰囲気 下でアルゴンフラッシュカラム中を速やかに通過させて塩酸トリエチルアンモニ ウムの結晶を除去した。結晶ケーキをＴＨＦで１回１Ｍいた後、溶液を蒸発させ 、ポンプで※ｒｔＰＱさせて、１且ホスホレーンｌｌａを得た。

１１ａを圧水ＤＭＦ　（６ｍｌｊｍｌ塵中アルゴン下ＣＮ　（真空乾燥したもの 、ｊ７９ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）と反応させて、ホスホレーン環を開環し、所 望のβ−シアンエチルジエステルホスフェート１１ｂを得るとともに、エノール エーテルフェノール１０を再び生成した。フラスコを５５°Ｃにまで温めながら 、高真空下でＤ　Ｍ　Ｆを除去し、化合物１０及び１）ｂの混合物を黄椙色の浦 とじて得た。

上記混合物をメタノール（８ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＭｅ（１ｍｌの４．２５Ｍ のＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ１６，４ｍｍｏｌ）の存在下４０℃で攪拌して、シアノ エチル基のβ脱離を行い、エノールエーテルホスフェート１１をジナトリウム塩 として得た。メタノールを蒸発させた後、固体を水に溶解し、最装置のＥｔＯＡ ｃに分配して、フェノール１０　（３３３ｍｇ）を回収した。ＣＨ，ＣＮ／Ｈ， Ｏグラジェントを用い、ポリスチレンカラム（ＰＬＲＰ−５、ポリマーラボラト リーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）による分取ＨＰＬＣ により水屡を精製し、さらにピリジニウムトルエンスルホネート（アンバーリス トＩ　Ｒ−１２０（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−ＩＲ１２０）十樹脂）によるイオン交 換を行い、凍結乾燥を行って、４４８ｍｇ（３段階にわたって７８％、回収され たフェノールのため）のエノールエーテルホスフェ　）１１を、けば立ったオフ ホワイト色の粉末として得た。

ＩＲ（ＣＨＣＩｓ、　ｃｍ−’）：　２９１０．１５９０．１５６７、１２７８ ．１１６０．１０９５．９４５’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　１．７３−１．９６　 ｆ１２）１．　ｍ）、　２．６３　（ｌｉｔ　ｂｒ　ｓ）、　３．２０　（ＩＨ 。

ｂｒ　ｓ）、３．３２　（３ｔＬ　ｓｌ、　５．８９　（１８，ｓｌ、　６．７ ２　（１８，ｍｌ、　６．７９　（ｌ）ｌ。

ｔ、　、ＣＺ　Ｈｚｌ、　６．８５　（ｌ）１．　ｄ、　Ｊ：２　Ｈｚ）”Ｐ　 ＮＭＲ（ｐｐｍｌ：　５４　（ＩＰ）ジナトリウム　３−クロロ−５−メトキシ −スピロ　１２−ジオキセタン−３２°−トリシクロ　３．３．１．１’・テ　 −デカン　−４−イル　−１−フェニルホスフェート　１二ノールエーテルホス フェート】１及び５．１０．１５．２０−テトラフェニル−２１８，２３Ｈ−ポ ルフィン（ＴＰＰ、０．５ｍｌの２重量％ＣＨＣｌ、（容ｉ＋１７）のＣＨＣｌ 　ｓ　７Ｂ’ｔ＆　（８ｍｌ）を、ｌ容ン１ｕｉこ酸素流を通過させながら、２ ５０Ｗ’の高圧ナトリウムランプで１０°Ｃで照射した。ランプと反応混合物の 間に５ｍ１ｌのカプトン（Ｋａｐｔｏｎ）ポリイミドフィルム片（デュポン（Ｄ ｕＰｏｎｔ）社）を配置して、望ましくない紫外線照射を遮った。分取ＨＰＬＣ （２７０ｎｍ紫外線検出器）により、５分間の照射によりジオキセタンが完全に 生成したことが認められた。０°Ｃでクロロホルムを蒸発させた後、残渣をＮａ ｚ　ＣＯ３（２７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の存在下で氷水に溶解し、上述した ように分取ＨＰＬＣにより精製した。分画を凍結し、０℃で凍結乾燥して、６５ ．３ｍｇ（９０％）のジオキセタンｌをけば立った白色粉末として得た。ジオキ セタンのＴＬＣにより、加熱による熱分解により、青色の化学発光が示された。

ホスフェートの酵素による開裂によっても水？ｇ　ＩＩｌ中で化学発光性分解が 誘発された。

’ＨＮＭＲ（Ｄ２０．　ｐｐｍ１：　０．９３　（１）１．　ｄ、Ｊ＝１３　Ｈ ｚ）、１．２１　（ＩＨ，ｄ。

Ｊ＝１３　Ｈｚ）、１．４４−１．６９　（ＩＯＨ，ｍｌ、２．１６　（ＩＨ， ｂｒ　ｓ）、２．７８　（ＩＨ，ｂｒｓ）、３．１４　（３Ｈ，ｓ）、　７．２ ０　（２Ｈ，ｂｒ　ｓ）、　７．３０　（１８，ｓ）”Ｐ　ＮＭＲ（０，０，ｐ ｐｍ）：　２４　（ＩＰ）３−り四ロー５−ヒドロキシーベンズアルデヒドジメ チルアセ　−五」１旦Ｌ ＨＣ（ＯＭｅ１２ ５−クロロ−３−メトキシ−ベンズアルデヒドジメチルアセクール（７，３，２ １ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を、１５０℃で加熱しながら、ＤＭＦ（１４ｍｌ）中 でエタンチオール酸ナトリウム（１９ｍｍｏ　ｌ　）により脱メチル化した。得 られたフェノール１２を冷却し、ＥｔＯＡｃ及びＮＨ４Ｃｌに分配し、Ｎａｇ　 ＳＯ４で乾燥し、高真空でポンプにより蒸発乾固させて、残存していたＤＭＦを 除去した。クロマトグラフィｉこよる事前製（シリガゲル、２０％ＥｔＯＡｃ／ ヘキサン）により、２．７５ｇ　（９２％）のフェノール１２が黄色の油として 得られた。この油の分析サンプルは、さらに精製することによって、融点１５３ ℃の結晶となった。

ＩＲ（ＣＨＣｌｘ、　ｃｍ−’）：　３５８０　（０１１）、３３２５　（０８ １，２９４０，２８３０，１５９９゜１５８５、１４４９．１３５０．１１５５ ．１１０５．１０５５．８９４．８４５゜’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　３．３２　 （６Ｈ，ｓｌ、　５．３０　（ＩＩｌ、　ｓ）、　５．７３　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ ）。

６．８１　（２Ｈ，ｍｌ、　７．０１　（ＩＨ，５１３−クロロ−５−ピバロイ ルオキシーベンズアルデヒドジメチルア立Ｚ二止ユ上ユニ ＨＣＩＯＭｅ１２ ＋　＝　Ｃ（Ｃ）（３１３ フェノール１２　（２，７ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２， ８ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃ１！　（２０ｍｌ）中０℃で撹拌した。トリ メチルアセチルクロリド（１，６４ｍ１．１３．３ｍｍｏｌ）を加λたところ、 ピバロイルエステルが完全に生成した。悸準的な操作により、粗ピバロエート１ ３が油として得られ、これを精製せずに次の反応に供した。重量は測定しなかっ た。

少量のサンプルを、スペクトルによ゛る同定のために分取ＴＬＣにより精製した 。

ＩＲ（ＣＨＣ１＋、　ｃｍ−’）＋　２９８０．２９４０．１７４９　（Ｃ：０ ）、　１５ｇ５．１４４８．１３４９゜１２５０、１１５０．　１＋０９．１０ ５６．８９８’ＨＮ５ＩＲｆｐｐｍｌ：　１．３４　（９Ｈ，ｓ）、　３．３１ 　（６８，ｓ）、　５．３６　（ｌｔＬ　ｓ）、　７．０６（２ｔ１．　ｂｒ　 ｓ）、　７．３１　（ＩＨ，ｓ）ジエヂル　１−メトキシ−１−（３−クロロ− ５−ピバロイルオキシフェニル）メタンホスホネート　１４）アセタール１３、 ボロントリフルオリドエテラート（２，６ｍｌ、２１ｍｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃ１ ２（ｌ　０ｗ１）の溶液を一７８℃で撹拌した。トリエチルホスファイト（３， ０ｍｌ、１７．　５ｍｍｏｌ）を加えて、このアセタールをホスホネート１４に 変換させた。操作と精製（シリカゲル、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、 ２．４３ｇの油が得られた（２段階で４７％）。

ＩＲ（Ｃ）ｌｃ１３．　ｃｍ−’）＋　２９９５．２９８０．１７５０　（Ｃ＝ ｏ１．１６００．１５８１．１４４２゜１２４７　（Ｐ＝Ｏ１，１１１０，１０ ２８（Ｐ−０１，９７５，８９０’ＨＮＭＲ（ｐｐｍｌ：　１．２２−１．２６ 　（６Ｈ，ｄ　ｏｆ　ｔ、　Ｊ：２　Ｈｚ、　７　）１ｚ）、　１．３１（９Ｈ ，ｓ）、　３．３９　（３）１．　ｓ）、　４．０２−４．０８　（４ｔ（、ｍ ｌ、　４．４４　（ＬＨ，ｄ。

Ｊ＝１６　Ｈｚ）、　７．０４　（２Ｍ、　ｍｌ、　７．２７　（ＩＨ，ｂｒ　 ５）３−クロロ−５−ピバロイルオキシ−１−メトキシ−５−クロロ−トリシク ロ　３．３．１．１”　−デカ−２−イリデンメチル　ベンゼン　１５） ホスホネート１４　（２，４ｇ、６　、　１　ｍｍｏｌ）をアルゴン下、無水Ｔ ＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、−６８°Ｃに冷却した。無水ＴＨＦ（７ｍｌ）に忍 解したリチウムジイソプロピルアミド（６，６ｍｍｏｌ）を低温で滴下し、濃色 の発色によって証明されるイリドを生成させた。５分後、５−クロロ−２−アダ マンタノン（９４１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ蕩液を加え、反応物を４０分か けて室温にまで徐々に温め、次いで７５℃で１時間加熱して、完全にオレフィン 化を行った０本溶液をＥｔＯＡｃ／ＮＨ４Ｃｌに分配し、Ｎａｇ　ＳＯ４で乾燥 し、蒸発させて、エノールエーテルフェノ−ル１５及び対応するエノールエーテ ルフェノール１６の粗混合物を得た。粗油を、以降の加水分解には精製せずに用 いた。少量のサンプルを、スペクトルの定性用に分取ＴＬＣにより精製した。

ＩＲ（ＣＨＣＩ）、　ｃｍ−’）：２９３５．１７５０　（Ｃ；ｏｌ、　１５９ ５．　＋５７１．１４５０．１４２０゜１３９７、　１２７５．　１１ら０．　 １１１０．　１０２４．　９１８．　９０６．　１１８７．　８２９’ＨＮＭＲ （ｐｐｍ）：　１．３４　（９Ｈ，ｓ）、　１．６８−１．７８　（４Ｈ，ｍｌ 、　２．１４−２．２５（７ｆｔ　ｍ）、　２．７７　ｆＨＬ　ｂｒ　ｓ）、　 ３．３０　（３Ｈ，ｓ）、　３．４２　（１８，ｂｒ　ｓ）。

６．８８　ｉｌＨ，ｄ、　Ｊ＝１．５　ｔｌｚｌ、　７．０４　（ＩＨ，ｍ）、 　７．１１　（ＬＨ，ｄ、　Ｊ＝１．５　Ｈｚ）３−り四ロー５−ヒドロキシ− １−メトキシ−５−クロロ−トリシクロ　３．３．１．１’７−デカ−２−イリ デンメチル　ベン１且ビバロエートＩＳを、Ｋ２Ｃｏ、（１，４５ｇ、１０．５ ｍｍｏ　ｌ　）によりメタノール１０ｍ１中室温で加水分解した。メタノールの ア発１柔、標準的な操作と精製（シリカゲル、３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサジ）に より、微黄色の油１．０９５ｇ　（２段階にオ）たって６３％）を得た。この物 質は、放置すると固化した。この固形物を粉末化することによって融出１．３０ ℃の白色結晶のエノールエーテルフェノール１６が得られた。

ＩＲ（ＣＨ（：１．、　ｃｃａ−’Ｉ：　３５９０　（ＯＨ）、　３３００　（ ＯＨ）、　２９３５．１５９５．１１６３゜１１００、１０ｇ２．１０３０．９ １１’ＨＮＭＲ（ｐ９ｍ）：　１．６９−１．８３　（４）１．　ｍ）、　２． １４−２．２７　（７１４，ｍ）、　２．７７（ｌ）１．　ｂｒ　ｓｌ、　３． ３０　（３）１．　ｓ）、　３．４１　（ＬＨ，ｂｒ　ｓ）、　５．２１　（Ｉ Ｈ，ｂｒ　ｓ）。

６．６７　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１．５　Ｈｚ）、　６．８１　（ＩＨ，ｍ）、　６ ．８４　（ＩＨ，ｄ）ジナトリウム　３−クロロ−５−メトキシスピロ　１２− ジオキセタン−３２°−５−クロロ−ト１シクロ−３，３゜１１３７−デカン　 −４−イル）−１−フェニルホスフェート０−Ｎａ” 無水ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解したエノールエーテル１６（３５６ｍｇ、１　、０ ５ｍｍｏｌ）にアルゴン雰囲気下でトリエチルアミン（２３０ｕｌ　、１．６５ ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃に冷却し、この時に２−クロロ−２−オキソ− １，３，２−ジオキサホスホレーン（フル力（Ｆｌｕｋａ　）、１４３ｕｌ　、 １．５５ｍｍｏｉ）を滴下した。反応物を室温に温め、不活性雰囲気下でアルゴ ンフラッシュカラムに速やかに通過させて塩酸トリエチルアンモニウム結晶を除 去した。結晶ケーキをＴ　ＨＦで１回濯いだ後、溶液をポンプで矢発乾因させて 粗ホスホレーン１７ａを得た。

アルゴン下無水１）ＭＦ　（５ｍｌ）中ＮａＣＮ　（真空乾燥したもの、６９ｍ ｇ、１．４ｍｍｏｌ）により、ホスホレーン環を開環して所望のβ−シアノエチ ルジエステルホスフェート１７ｂを得た。フラスコを５５℃にまで、温めながら 高真空でＤＭＦを除去して、粗ジエステルホスフェートを橙色の油状物質として 得た。

シアンエチルホスフェート１７ｂ及び５．１０．１．５．２０−テトラフェニル −２１８，２３Ｈ−ポルフィン（ＴＰＰ、２重量％ＣＨＣｌ３７容１１ｍ１．５ ｍ１）のＣＨＣ１ｓ　２容’ｔＮ　（１０ｍ１）を、溶’ｔｒ＆に酸素流を通過 させながら、２５０Ｗの高圧ナトリウムランプで１０℃で叩射した。ランプと反 応混合物の間に５ｍ１１片のカプトン（Ｋａｐｔｏｎ）ポリイミドフィルム（デ ュポン（ＤｕＰｏｎｔＪ社）を配置して、望ましくない紫外線照射を遮った。分 取ＨＰＬＣ（２７０ｎｍ紫外線検出器）により、１５分間の照射によりジオキセ タンが完全に生成したことが認められた。０℃でクロロホルムを蒸発させた後、 残、蛍をメタノールに、容解し、ＮａＯＭｅ　（０，５ｍｌの４．２５ＭＮ　ａ 　ＯＭ　ｅ　／　Ｍ　ｅ　ＯＨ１２加ｍｏｌ）により保護基を脱離させてジナト リウムホスフェートジオキセタンとした。シアノエチル基のβ−説離に際し、溶 媒を０℃で蒸発させ、残渣を氷水に溶解した。上述したような分取用ＨＰＬＣに よる精製と、０℃での凍結乾燥の結果、２８９ｍｇ（４段階にわたって６０％） のジオキセタン２をけば立った白色粉末として得た。

１）（＼＠Ｒ（Ｃ２０，ｐｐｍ、シン−アンチ異性体の混合物）　：　０．８６ 　（ＩＨ。

ｄｌ、１．＋３　［ＩＨ、ｄ、　Ｊ＝１４１＋ｚ１．　１．３０　（ＩＨ，ｄｉ 、　１．３７　（ＩＨ，ｄｉ。

１．４５−２．０７　（１８８，ｍ）、２．２７　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、２．３ ２　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、２．９５（２Ｈ，ｂｒ　ｓ）、３．０９　（３Ｈ，ｓ ｌ、３．１１　（３Ｈ，ｓｌ、７゜Ｏ−７，３（４１ｔ　ｂｒ　ｓ）。

７．２５　（］ＩＨｓ）、７゜２Ｂ　（ＬＨ，Ｓ）３．５−ジメトキシ−ベンズ アルデヒドジメチルアセクールＩＲ（ＣＩ（Ｃ１ｓ、　Ｃｍ−’）：　２９５３ ．２９３５．１５９８．１４６０．１４２６．１３５７．１１９０゜１１５４、 １，１０１．１０５３．８４０’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　３．３２　ｆ６Ｈ，ｓ ）、　３．７８　（６Ｈ，ｓ）、　５．２８　（ｌ）Ｉ、　ｓ）、　６．４１（ ＩＨ，ｍｌ、　６．６０　（２Ｈ，ｍ）３−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンズ アルデヒドジメチルアセ久二止Ａ工旦Ｙ ＩＲ（ＣＨＣＩ３．　Ｃｍ−’）：　３５９０　（０）１）、　３３４５　（Ｏ Ｈ）、　２９４０．２８３０．１６［）Ｄ。

＋４６２．１４３２．１３５５．１，１９０．１１５０．１１１０．１０５５． ８４１’ｌｌ　ＮＭＲｆｐｐｍ）：　３．３２　（６ｔｌ、　ｓ）、　３．７７ 　（３Ｈ，ｓ）、　５．２８　ｆｉｌ−１，ｓｌ。

６．３７　（［１，ｄ、　Ｊ＝２　Ｈｚ）、　６．５３　ｆｌＨ，ｂｒ　ｓ）、 　６．５８　（Ｉｌｌ、　ｂｒ　ｓ）３−１）−諺之二辷≦盆但不乞１しニニ乙 没］１旦り乙ゴ五ヱ」づシュ匹バユユ、、ｌ（３段階かけて７３％、油）ＩＲ（ Ｃ１＋Ｃ１ｘ、　ｃｍ−’）＋　２９６０．２９３５．１７４１　（Ｃ”０１． １６０８．１５９７．１４６２゜１３５０．１２７３．１１９０．１１３９．１ １１５．１０５６．９９９．９０２．８４８’ＨＮＭＲ（ｐｐｍｌ：　１．３４ 　（９Ｈ，ｓ）、　３．３１　（６Ｈ，ｓ）、　３．８０　（３）１．　ｓ）、 　５．３５（ＩＨ，ｓ）、　６．５７　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝２　Ｈｚ）、　６． ７５　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、　６．８７　（１）１゜ｂｒ　ｓｌ ジエチル　ｌ−メトキシ−１−３−メトキシ−５−ビバロイルオＩＲｆｃｌ（Ｃ １，、ｃｍ−’ｌ：　２９９０．２９８０．１７４２　（Ｃ＝Ｏ）、　１６０６ ．１５９０．１４６３゜１２７２、１２４０．１１３６．１１１０．　＋１００ ．１０５５．１０２３．９７０’ｔｌ　ＮＭＲ（ｐｐｍ）＋　１．２１　（３） １．　ｔ、　Ｊ＝３　）１ｚ１．１．２３　（３１１ｔ）、　１．３２　（９） １゜ｓ）、　３．３９　（３Ｈ，ｓ）、　３．７８　（３）１．　ｓ）、　４． ０６　［４Ｈ，ｍｌ、　４．４４　（ｉｌｌ、　ｄ。

Ｊ＝１６　ｔｌｚ）、　６．５６　（ＬＨ，ｍ）、　６．７２　（ＩＨ，ｍｌ、 　６．８５　（ＩＨ，ｍ１３−メトキシ−５−ピバロイルオキシ−１−メトキシ ートｉシクロ　３．３．１．１”　デカ−２−イリデンメチル　−ベンゼン（２ ２ａｌ ＩＲ（ＣＨＣＩ、、　ｃｍ”）：　２９１０．１７４０　（Ｃ；０）、　１６０ ０．１５８０．１４６０．１３２５゜１２７２、１＋４０．１１１４．１０９７ ．１０７９．１０５５’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　１．３５　（９Ｈ，ｓ）、１． ５６−１．９６　（１２Ｍ、　ｍｌ、　２．６８　（ＩＨ。

ｂｒ　ｓＬ　３．２３　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、　３．３１　（３Ｈ，ｓ）、　３ ．８０　（３８，ｓ）、　６．５３（ＩＨ，ｔ、　Ｊ：２　Ｈｚ）、　６．６１ 　（ＩＨ，ｂｒ　ｓｌ　６．７２　（ＩＨ，ｍ）３−ヒドロキシ−５−メトキシ −１−メトキシ−トリシクロ３．３．１．１”７　デカ−２−イリデンメチル　 −ベンゼン」λ２）（６４％、融点１５９℃の白色結晶）ＩＲ（ＣＨＣ１＝、　 ｃｍ−’）：　３５９０　（ＯＨＩ、　３３２０　（ＯＨ）、　２９１０．１５ ９１．１３４２゜１１５０、　１０９８ ’ＨＮＭＲ（ｐｐｍｌ＋　１．７８−１．９７　（１２Ｈ，ｍ）、　２．６８　 （Ｉｔ（、ｂｒ　ｓ）、　３．２３　（ＩＨ。

ｂｒ　ｓ）、　３．３３　（３）１．　ｓ）、　３．７８　（３Ｈ，ｓｌ、　５ ．４９　（ＩＨ，ｓ）、　６．３７　（ＩＨ。

望）、６．４５　（２１（、ｍ） ピリジニウム　５−メトキシ−３−メトキシ−トリシクロ　３゜３．１．１”　 デカ−２−イリデンメチル　−１−フェニルボス２五二上１１旦Ｌ（６２％、オ フホワイト色のけば立った粉末）ＩＲ（ＣＨＣｌ、、　ｃｍ−’）：　２９１１ ．１５８４．　＋４４８．１４２５．１３２８．１１４９．１０９９゜９［１０ ，８７０ ’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　１．６８−１．９２　（１２Ｈ，ｍ）、　２．６３　 （ＩＨ，ｂｒ　ｓｌ、　３．１７　（ＩＨ。

ｂｒ　ｓ）、　３．２３　（３Ｈ，ｓ）、　３．６８　（３）１．ｓｌ、　６． ５５　（１８，ｂｒ　ｓ）、６７２（ＩＨ，ｂｒ　ｓｌ、　６．７６　（ＩＨ， ｂｒ　ｓ）、　６．９８　（ＬＨ，ｂｒ　ｓ）ジナトリウム　５−メトキシ−３ −メトキシスピロ　１２−ジオキセタン−３，２°　−トリシクロ　３．３．１ ．１”・７　デカン　−４−イル　−１−フェニルホスフェート　３　（８５％ 、白色のけば立った粉末） ’ＨＮＭＲ（Ｄ−０，ｐｐｍ）：　０．９８　（ＩＨ，ｂｒ　ｄｌ、　１．２２ 　（ＩＨ，ｂｒ　ｄ）、　１．４６−１．７６　（ＩＯＨ，ｍ）、　２．２０　 （ｌｉｔ　ｂｒ　ｓ）、　２．７８　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、　３．１４　（３Ｂ 。

ｓ）、　３．７４　（３）１．　ｓ）、　６．９１　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ’）、　 ６．６８−６．９７　（２）１．非常に幅広の信号） ”Ｐ　ＮＭＲ（Ｄ２０．　ｐｐｍ）：　４４．８　（ＩＰ）３−ヒドロキシ−５ −メトキシ−１−（メトキシ−５−クロロ−トリシクロ　３．３．１．”　−デ カ−２−イリデンメチル　ベンゼン（２４）（６３％、耐色、１３４℃の白色結 晶）ＴＲｆｃＨｃｌ、、　ｃｍ−’ｌ：　３５９０　（ＯＨ）、　３３３０　（ ＯＨ）、　２９３０．１６１０．１５９１゜１４５０．１４３０．１３４］、　 １１５０．１１００．１０８０．１０５６．１０２８．８２９’ＨＮＭＲ（ｐｐ ｍ）：　１．６８−２．４０　（ＩＩＨ，ｍｌ、　２Ｊ２　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ） 、　３．３１　（３Ｈ。

ｓ）、　３，４２　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、３．７８　（３１（、ｓｌ、　６．３ ７−６．４１　（３Ｎ、　ｍ）ジナトリウム　５−メトキシ−３−メトキシスピ ロ　ｌ　２−ジオキセタン−３２ニニ　５−クロロ−トリシクロ　３．３゜１、 ｖ７−デカン　−４−イル　−１−フェニルホスフェート−←Ｕ−（４段階かけ て５７％、白色のけば立った粉末）「 ０−Ｎａ” ’　ＩＩ　ＮＭＲ（Ｄｉｄ、　ｐｐｍ、シン−アンチ異性体の混合物）：　０． ９４　（ＩＩＩ、　ｂｒｄ）、　１．１９　（１）１．ｂｒ　ｄｉ、　１．４２ 　（ｌｉｔ　ｂｒ　ｄ）、　１．５０　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、　１．５８（ＩＨ ，ｂｒ　ｄ）、　１．６７−２．１６　（１７１（、ｍｌ、　２．３８　（ＩＨ ，ｂｒ　ｓ）、　２．４０　（ＩＨ。

ｂｒ　ｓ）、　３．００　（２Ｈ，ｂｒ　ｓｌ、　３．１５　（３１（、ｓ）、 　３．１６　（３）１．　ｓｌ、　３．７３（３Ｎ、　ｓ）、　３．７４　（３ Ｈ１ｓ）、　６．９０　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、　６．９３　（１）１．　ｂｒ　 ｓ）。

６．６５−７．００　（４８，非常に幅広の信号）”Ｐ　ＮＭＲ（ＤｚＯ，ｐｐ ｍ、シン−アンチ異性体の混合物）：　４４．８　（２Ｐ）参考 １　５−クロロバニリンは、ハン（ｌｌａｎｎ）及びスペンサー（Ｓｐｅｎｃｅ ｒ　）　（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１９２７．４９：　５３５ −５３７）が記敏しているように合成した。融出１６３℃。

２　プロトンスポンジホルマー１−　（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチル −１，８−ナフタレンジアンモニウムホルマート）：ギ酸（９８％、１．２ｍｌ 、３１　ｍｍｏｌ）を、プロトンスポンジ（６，８３，３２ｍｍｏｌ）及びＣＨ ，Ｃ１，（８ｍｌ）の溶液に０℃で加えた。

溶液を室温まで温めた後、溶媒を蒸発させ、最小限温めて高真空で乾燥しながら 、プロトンスポンジホルマートを結晶化させて白色結晶を得た。プロトンスポン ジホルマートの結晶（Ｍ点７９℃）は、調製俊速やかに使用しなければならない 、故！することによってギ酸が蒸発して、プロトンスポンジ（融点５０”Ｃ）と なってしまうからである。

３−メトキシ−５−ニトロ−４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドジメチルアセタ ール　２５ ５−ニトロバニリン（５、Ｏｇ、９７％、１８．４ｍｍｏｌ）のメタノール溶液 （３０ｍｌ）を、トリメチルオルトポルマート（２，８ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）及 び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸の存在下でジメチルアセタール２５に完全に 変換させた。ｐ］１８のトリエチルアミンにより反応を失活させ、蒸発させて少 鳳とし、ＥｔＯＡｃ及びＮ　ａ　ＨＣＯ３に分配さセた。水層をＥｔＯＡｃによ り１回洗浄し、有磯層をＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４ににり乾燥し、デカンテーション をｉテい、蒸発させて禮赤色の浦を得た。この油はポンプを用いて乾燥したとこ ろ結晶化した。５ｏ％Ｅ　ｔ　ＯＡ　Ｃ／ヘキサンにより再結晶して、５．５５ ｇ　（９３％）の融点５８〜・５９°Ｃのアセタール２５を、赤椙色の結晶とし て得た。

ＩＲ（ＣＨＣｌ、、　ｃｍ−’）、　３３００．３０１０．２９３０．２８２０ ．１６２０．１５４３．１４６０゜１４４５、１３９２．１３４１．１３２０． １２５４．１１３２．１１０１．、　＋０５８．９９０．８６５’ＨＮＭＲ（ｐ ｐｍｌ：　３．３１　（６）１．　ｓ）、　３．９４　（３Ｈ，ｓ）、　５．３ １　（１８，ｓ）、　７．２２（ＩＨ，ｄ、Ｊ二１．７　１４ｚ）、７．７８　 （１１−１，ｄ）３−メトキシ−５−ニトロ−４−トリフルオロメタンスルホニ ルオ＋’ｙ７ベンズアルデヒドジメチルアセタール皿ジメチルアセクール２５　 （５，０−ｇ、２０．６ｍ１ＴＬｏｌ）　、りｏロホルム（３ｍｌ）及びピリジ ン（８ｍｌ）の＞８６を、アルゴン下０″Ｃで撹拌した。Ｏ″Ｃで１０分間かけ て無水トリフルオロメタンスルホン酸（４，０ｍｌ、２３．　８ｍｍｏｌ）を加 え、室温で一晩撹拌して、トリフレートを完全に生成させた。油状物質を４５° Ｃにまで温めながら、高真空で、δ媒を広発させて、痕跡量のピリジンをトルエ ン４ｍｌで除去した。得られた油を高真空でよくポンプにより乾燥して、５ｏ％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンに溶かして５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンと共にすり消し、 微細なピリジニウムトリフラート結晶から所望のトリフラート（、δ液中）を９ 隨した。粉末化溶液をア発し、３ｏ％Ｅ　ｔ　ＯＩＸＣ／ヘキサンにより溶離を 行ってシリカゲルカラムにより曲を精’ｊａ、６．４３ｇ　（８４％）のトリフ ラート２Ｇを１．！：黄色の油として得た。

ＩＲ（ＣＨＣＩ−、ｃｍ−’） ’ＩＡ　ＮＭＲ（ｐｐｍ）：　３．３５　（６Ｈ，ｓ）、　４．００　（３Ｈ， ｓ）、　５．４２　（ＬＨ，ｓ）、　７．４２（１８，ｄ、　Ｊ＝１．６　Ｈｚ ｌ、　７．７３　（１Ｎ、　ｄ）玄」λユＬ ５−ニトロフェニルトリフラート２６　（７ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）、酢酸パラ ジウム（ＩＩ）　（８８ｍｇ、　０．３９ｍｍｏｌ）　、］、１’　−ビス（ジ フェニル−ホスフィノ−）フェロセン（４３０ｍｇ、０、７８ｍｍｏｌ）及びＨ ＰＬＣグレードのＣＨｘ　ＣＮ　（１０ｍ１）を、テフロンで裏打ちしたステン レススチール製ボンベ中でよく混合した。調製したしたばかりの微粉プロトンス ポンジホルマート（５１ｇ、１９．　６ｍｍｏｌ）を加え、ボンベを密封し、９ ０’Ｃで２時間加軌した。反応混合物をＥｔＯＡｃに溶がして、シリカゲルプラ グを通過させ、０−３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにより溶離をｉ：Ｔってシリカ ゲルカラムにより精製し、１．５ｇ　（３５％）のメトキシニトロベンズアルデ ヒドアセタール２７を得た。

ＩＲ（ＣＨＣ１＋、　ｃｍ−’ｌ：　３００５．２９６０．２９３５．２８３５ ．１５３２　（−ＮＯ，）、　１４６３゜１４５０、１３４３　ｋＮＯｘ）、　 １２８０．１１９０．１１５８．１１０４．１０５５．９９０．８７１’ＩＩＮ 〜ＩＲｆｐｐｍ）：　３．３３　（６Ｈ，ｓ）、　３．８９　（３Ｈ，ｓ）、　 ５．４１　（ｌｔｌ、　ｓ）、　７．３３（１）１．　ｓ）、　７．ｆ＋８　ｆ ｌ）Ｉ、　ｓ）、　７．９２　（ＩＨ，ｓ）ジエチル　１−メトキシ−１−３− メトキシ−５−二トロフェニル　メ　ンホスホネート　２８ トリエチルホスファイト（０，９８＋ｎ１．５．　７ｍｍｏｌ）を、ジメチルア セクール２７　（１，０８ｇ、４．　７ｍｍｏｌ）　、ボロントリフルオリドエ テラート（１，２ｍｌ、９．３ｍｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ。

（１０ｍｌ）の溶液にＯ′Ｃで滴下した０反応物を一晩かけて室温に温めた後、 ／３液を３ＮのＨＣＩに分配°し、水層をＣＨ＊Ｃ１ａで２回洗浄した。有機層 を、希ＮａＨＣＯ＝で洗浄し、Ｎａｇ　ＳＯ４で乾燥し、デカンテーションを行 って、蒸発させた。０−８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離を行って粗残渣をシ リカゲルカラムにより精製し、１．３６ｇ　（８６％）のホスホネート２８を淡 黄色のｌ由として得た。

ＩＲ（Ｃｔ＋Ｃｈ、　ｃｍ−’ｌ：　２９９５．　１５３２　（−Ｎｏ、）、＋ ３５０　（−Ｎｏ、）、１２８０゜１２５８、　＋２４３．１０９６．１０５３ ．１０２５．９７３．７２１’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）：　１．２８　（６１１，ｔ 、　Ｊ＝７．１　Ｈｚ）、　３．４４　（３１（、ｓ）、　３．９０ｉ３Ｈ，ｓ ）、　４．０８−４．１５　ｆ４Ｈ，ｍｌ、　４．５５　（ＩＨ，ｄ、　ＪＪ６ 　Ｈｚｌ、　７．３４　（ＩＨ。

ｄ）、　？、６９　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝２．１　Ｈｚ）、　７．８７　（ＩＨ， ｄ、　、ｂｌ、６　）１ｚ）ジエチル　１−メトキシ−１−３−アミノ−５−メ トキシフェニル　メタンホスホネート２９ ニトロホスホネート２８をメチレンクロリドに溶解し、これを、ｎ−Ｂｕ４ＮＢ ｒ及びヒドロ亜硫酸ナトリウムを含むＩＭ　ＮａＯＨ溶液に加＾ろ。２層性の／ ｓ液を、ニトロＩ換基のアニリン２９への還元反応が終了するまで、必要であれ ば加熱しながら激しく撹拌する。冷却した溶液をｃＨｔｃ１＊及び最小限の水に 分配し、水層を必要であればＣＨ＊Ｃ１＊で洗浄して、粗アニリンを得る。有機 層を集めて乾燥し、デカンテーションを行い、蒸発させる。残渣を短いシリカゲ ルプラグに通過させてアニリン２９を得る。

ＩＲ（Ｃ）ＩＣ１，、ａｍ−’） ’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ） （このほかの還元条件に関する参考文献は、合成法の要約に追加した。） ジエチル　１−メトキシ−１−３−メトキシ−５−ト１フルオロアセタミドフェ ニル　メタンホスホネート　３００ＣＦ３ ＣＨｚ　Ｃ１ｔ　１０　ｍｌに溶解した無水トリフルオロ酢酸（１ｅｑ）及びト リエチルアミン（ｔ、３ｅｑ）を０℃で加えることによって、ホスホネート２９ を定置的にアセチル化する０温媒な蒸発させ、シリカゲルカラムによる精製によ り、トリフルオロアセタミド３０を得る。

ＩＲ（ＣＨＣＩｓ、　Ｃｍ−’） ’ＨＮＭＲ（ｐｐｍ）： ３−メトキシ−５−トリフルオロアセタミド−１−メトキシド１シクロ　３．３ ．１．１”・７　デカ−２−イリデン−メチル　ベンホスホネート３０を無水Ｔ ＨＦに溶解し、アルゴン雰囲気下で＝６８℃に冷却する。同様に別のフラスコで ２−アダマンタノン（１，１ｅｑ）を無水ＴＨＦに溶解し、アルゴン下で一６８ ℃に冷却する。このホスホネート溶液に、イリドの赤色が持続するようになるま で、アルゴン下−６８℃で２．５Ｍのｎ−ＢｕＬｉを加える。

この時点で、１．２ｅｑのｎ−ＢｕＬｉを加えて、イリド生成を終了させ、得ら れる着色溶液を一６８℃で５分間撹拌する。低温を維持しながら、ＴＨＦに溶解 した２−アダマンタノンを１時間かけてイリドに徐々に加える。ケトンを最終的 に加えた後に、反応混合物を、室温に温めながら２時間撹拌する０反応物を１時 間還流しながら加熱し、冷却し、ＥｔＯＡｃ及び飽和Ｎ）１４ｃｌに分配するこ とによって、失活させた。有機層をＮａｇ　ＳＯ４により乾燥し、シリカゲルカ ラムを用いてＥｔＯＡｃ／ヘキサンによりクロマトグラフによる分離を行って、 エノールエーテル３１を得る。

ＩＲ（Ｃ）ＩＣＩｓ、　ａｍ−’ｌ： ’ＨＮ１１１Ｒ（ｐｐｍ）　： ３−アミノ−５−メトキシ−１−メトキシド１シクロ　３，３゜１．１”　デカ −２−イリデンメチル）ベンゼン　３２トリフルオロアセタミドエノールエーテ ル３１を、痕跡量の水を含有するλ４ｅＯＨ中、微細に粉砕したＫｔ　ｃｏｔ　 （３ｅｑ）により６０℃で加水２分解する。混合物を、ＥｔＯＡｃ／Ｈ＝　Ｏに 分配し、シリカゲルクロマトグラフィによる精製を行って、エノールエーテルア ニリン３２を得る。

ＩＲ（ＣＨＣＩｓ、　ａｍ”）： １ｏ　ＮＭＲ（ｐ１１１１１１＋ メチレンクロリドにｆ８解したエノールニーデルアニリントリエチルアミン（２ ．　Ｏｅｑ）の存在下０”Ｃで、４−メトギシフェニルクロロホルマ−１□　（ １．　ｌｅｑ）によりカルボキシル化１゛る。

反応混合物をｃＨ．　Ｃ　１　２　／Ｈ，ｔ　Ｏに分配し、希ＮａＨＣ帆により 洗浄し、Ｎａ　２　’ｓ　Ｏ　４により乾燥し、蒸発さセ、シリカゲルを用いて クロマトグラフィにょるｆｔｆｆＦｌを行って、エノールエーテルｐーメＩーキ シフェニル力ルバメ−１・３３を得る。

ＴＲ　（ＣＩＩＣｌ，、　ｃｍ−’） ’Ｈ　ｐ＋１１＋Ｒ（ｐｐｍ） とｔｅ二±−ニブーチノ１カッにノＳエヨイ２１７二ー５ニメーヒｊＬン二」二 ニーΩＫ」−矢２上丈乙芸ゴ１ニー支．１−１　、−Ｊプニ鼾づ塞１ヱリ］エユ 工 エノールエーテルアニリン３２、トリエチルアミン（１．５ｅｑ）及びＢＯＣ− ＯＮ　（１．３ｅｑ）のメチレンクロリド溶液を、固く栓をしたキマックス（Ｋ ｉｍａｘ　）管中５５°Ｃで撹拌して、ｔ−ブグルヵルバメートを生成させた． 溶液を冷却し、蒸発させて少量と腰残渣にＭ　ｅ．Ｏ　Ｈを加えて所望のカルバ メー刊・３４の沈殿物を得る。

ＩＲ　（ＣＪＩ（：ｉｓ．　ｃｍ−’）’Ｈ　ＮＭＲ　（ｐｐｍ） ３−Ｎ−ス西渉ー力’Ｅ．Ｈ＝ｆ５．Ｈ−浸−予乞霧博藤」１二づ史Ｈ　＄．． ．．Ｑ．−Ｎとー は−九２Ｖ１ヒンジ（匹２其ヲニー条−」ミー丁ーラニーメ上寺ーシεニー−１ −二−ＪＺＩ−Ａ＼ン−１−巳りとλＰー１旦ー夫ーニー、１”Ｊ　９≠．ニー １ニイ−９１ンメ孟四升ぺ２エノールエーテルアニリン３２のメチレンクロリド 溶液を，トリエチルアミン（２．　Ｏｅｑ）の存在下０℃でトシルクロリド（１ 。１ｅｑ）によりスルホニル化する．反応混合物をｃｏ’＊　Ｃ　１　ｍ　／Ｈ ．　０に分配し、希Ｎ　ａ　Ｈ　ＣＯ　ｓにより洗浄し、Ｎａオｓｏ４により乾 燥し、蒸発さセでシリカゲルを用いたクロマトグラフィにより精製してＮ−１− ルエンスルホナミドエノールエーテル３５、４得る。

ＩＲ　（Ｃ）ＩＣＩｓ．　ｃｍ−′） ’Ｈ　ＮＭＲ　（ｐｐ＋ｎ） メチル）−だ−乙すＺ」λ６’）　’ エノールエーテルアレニリン 採水１ーリフルオロメチルスルポン酸（１．　１　ｅｑ）によりスルホン化４− ル。’ｙ：Ｇ：Ｈ合物をｃＨｚ　Ｃ”ｊ２／Ｈ２　６に分配し、Ｎａａ　ｓｏ４ ：こより乾ｊＡ　ｌ＝、辺発させ、シリカゲルを用いたクロマトグラフィにｄ、 って情）ソし、Ｎ−１−リフルオロメチルスルホナミドエノール’Ｈ　Ｎ）１８ 　１ｐｐｍ） ３−アミド−５−メト１２Ｓ’３−ＮＨＣ以幻−一エノールエーテルアニリン３ ２のピリジン溶液な０℃でベンゾイルクロリド（　１　、、、１　ｅｑ）と反応 させる．溶媒を蒸発さセ、ポンプを用いて乾燥させ、粗油を得、これをＧＨ．、 Ｃｌｍ　／８．０に分配し、乾燥し、蒸発させる。シリカゲルを用いたクロマト グラフィによる精製を行って、ベンズアミドエノールエーテル３７を得る。

ＩＲ　（ＣＨＣｌａ．　ｃｍ−’）： ’Ｈ　ＮＭＲ．　（ｐｐｍ） ３−窒素置換フェニルエノールエーテル（化合物３３へ−３７）を、すトリウム エタンチオレート ボリル化し、ジオキセタン１及び２について記駐したように光酸素化して、ジオ キセタン類似物を得る。

式■の構造の範囲内の他の化合物中、特に好ましい化合物は、以下の横辺を有す る 本化合物の名称は、ジナトリウム　２−クロロ−５−（４−メトキシ−スピロ［ １，２−ジオキセタン−３，２“−（５°−クロロ−）トリシクロ［３，３，１ ，Ｍ・７］デカン］−４−イル−１−フェニルホスフェートである。

この化合物は、一般的にはＣＤＰ−３ｔａｒと呼ばれている。

本化合物は、以下の反応式において示されるように合成することができる。

４−クロロ−３−メトキシ−ベンズアルデヒドジメチルアセター五−ユ メタノール（２ｍｌ）、ＣＨ−ＣＩ−（３ｍｌ）、４−クロロ−３−メトキシベ ンズアルデヒド（２ｇ、１１　、７ｍｍｏｌ　；実質的にＲ，Ｍ。

Ｒｉｇｇｓら、Ｊ、１Ａｅｄ、　Ｇｈｅｍ、、３０１８３７．１９８７．に記載 されたように調整した）、トリメチルオルトホルマート（１，７ｍｌ、１５．　 ５ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸大結晶の不均質混合物を、室温で１ 時間撹拌した。次に、ＭｅＯＨ（１ｍｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸結晶を 添加し、その溶液を均一になるまで温めた。反応終了後、その溶液を過剰のＮａ ＨＣＯ＝固体とともに５分間撹拌し、回転蒸発させて溶媒を除去した。ペースト を、ＥｔＯＡｃ４０ｍｌに溶解させ、希Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　／８液に分配させ、 かつ蒸発させて明褐色の油状物を得た。この反応を、他の４−クロロ−３−メト キシベンズアルデヒド２ｇを用いて繰り返し、両方の生成油状物を併せてジメチ ルアセタール３を４．３７ｇ　（８６％）得た。

ＩＲ（ｎｅａｔ、　ｃｍ−’）：　２９３０．２８１０．１５８２．１５８０． １４８３．１４６０．１４０２゜１３４８、１２６ｇ、　１１００．　＋０５９ ．９８９，８６１．８２７．７９０’Ｉｆ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，ｐｐｍ１：　 ３．３０　（６１１，ｓ）、　３．９０　（３１！、　ｓ）、　５．３３　（Ｉ Ｈ。

ｓｌ、　６．９５　（ＩＨ，ｄ）、　７．０３　（ＩＨ，ｓｌ、　７．３２　（ ＩＩｌ、　ｄ）ジエチル　ｌ−メトキシ−１−４−クロロ−３−メトキシフェニ ル）メタンホスホネート　４ ジメチルアセタール　３　（４，３ｇ、２０ｍｍｏｌ）　、ふるい乾燥（ｓｉｅ ｖｅ−ｄｒｉｅｄｌ　ＣＨａ　Ｃ１２（２０ｍｌ）およびトリエチルホスファイ ト（４，１ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）の、８液をアルゴン下、−７８℃で撹拌した。

ボロントリフルオライドエテリエート（２，９５ｍ１．２４ｍｍｏｌ）を−７８ ℃で滴下し、その溶液を５分間攪拌し、−２０℃で一晩保存した。翌日、反応物 を室温まで温め、５時間撹拌してホスホネートの形成を完了させた。激しく撹拌 しながら、反応物をＮａＨＣＯ−固体で、次いでＮａ）（ＣＯ−飽和溶液によっ てクエンチした。ガスの発生がなくなった後、ＣＨｔ　Ｃ１ｔ　４０ｍ１および 水２０ｍ１を添加し、２層温合物を分配し、ＣＨ，Ｃ１ヨ眉を回収し、Ｎ　ａ　 ｘ　Ｓ　Ｏｓによって乾燥し、蒸発させた。真空で吸引した後、油状物をＣＨ， Ｃ１，で溶離を行いながらシリカゲルプラグで精製し、ホスホネート　４を淡黄 色の油状物（６，０１ｇ、９９％）として得た。

ＩＲ（ｎｅａｔ、　ｃｍ−’ｌ：　２９８０．２９３０．１５９０．１５８０． １４８０．１４６０．１４０８゜１２ｇ０．１２５０．１０９５．１０５５．１ ０２５．９６７、８７１．８０９．７９０．７５４．７２８４−クロロ−３−メ トキシ−１−メトキシ−５−クロロ−トリシクロ　３．３．１．１”７　デカ− ２−イリデンメチル　−ベンゼン　５ ホスホネート　４（３，２ｇ、１０ｍｍｏｌ）をアルゴン下乾燥ＴＨＦ３０ｍｌ に溶解し、−７８℃まで冷却した。ｎ−ＢｕＬｉ（２，３Ｍ、４．４ｍｌ、１０ ．　１ｍｍｏｌ）の滴下によって、黄色−橙色のホスホネートイリドが生成した 。得られたイリド溶液を１０分間撹拌した後、ＴＨＦ８ｍｌに溶解させたら一ク ロロー２−アダマンタノン（１，７５ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を−７８℃でイリド に滴下した。反応物を室温に４５分間かけてゆっくり温め、２時間還流させた。

冷却後、ＴＨＦを真空で除去し、生成物をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：　１）お よびＮ　ａ　ＨＣＯｓ希釈液との間に分配した。有機層をＮａＨＣＯ＝で乾燥さ せた。有機層をＮａｇ　ＳＯａで乾燥させ、溶媒を除去し、シリカゲル（２〜４ ％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製してエノールエーテル　５を３．３ｇ　（９ ６％）、無色粘性ゴム状物質として得た。

４−クロロ−３−ヒドロキシ−１−メトキシ−５−クロロート１シクロ　３．３ ．１．１”　デカ−２−イリデンメチル　−ベンゼン　６ エノールエーテルフェノール　６への脱メチル化を、エノールエーテル　５　（ ３，３ｇ、９．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ２２ｍｌ中、エタンチオール酸ナトリウム （１４ｉｍｏｌ）の存在下１３５℃で１．５時間加熱して、完全に進行させた０ 反応物を冷却し、ＥｔＯＡｃ５０ｍ１．１ＭのＮＨ４Ｃｌを１００ｍ１およびＮ ａＨＣＯｍ飽和溶液１０ｍ１の間に分配した。有機層を回収し、良く水洗する一 方、水性層をＥｔＯＡｃで一度洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を併せ、塩水で洗浄し、 Ｎａｇ　ＳＯ４で乾燥させ、真空下溶媒を除去した。５０％のＣＨ□Ｃ１□／ヘ キサンで溶離を行いながら、粗油状物をシリカゲルカラムで精製し、フェノール 　６を３．６ｇ、粗油状物として得た。冷却した１５％のＣＨ−Ｃ１ｇ／ヘキサ ン溶液から２回の結晶化によって更に精製してフェノール　６を固体（２，１８ ｇ、６８％）として得た。

ＩＲ（ＣＨＣｂ、　ｃｍ−’）：　３５３０　（Ｏ）Ｉ）、　３３００　ｆＯＨ ）、　２９２０．２８４５．１５６８゜１４７８、１３０８．１１９０．　＋１ ６６、１０９０．１０７９．１０４２．１０２０．８２１’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１ ，、ｐｐｍ）：　１．５７−２．２８　（ＩＩＨ，ｍｌ、　２．７５　（ＩＨ， ｂｒ　ｓ）。

３．２７　（３）１．　ｓ）、　３．４１　（ＩＨ，ｂｒ　ｓｌ、　５．５７　 （１８，ｓ）、　６．７９　（ＩＨ，ｄｄ。

Ｊ＝８　Ｈｚ、　２）１ｚ）、　６．９３　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ：２Ｈｚ）、　７ ．２８　（１）１．　ｄ、　Ｊ＝８１（ｚｌナトリウム　２−シアノエチル　２ −クロロ−５−メトキシ−５−クロロ　トリシクロ　３．３．１．１”・７　デ カ−２−イリデンメチル　−１−フェニルホスフェート　７フエノール　６　（ ０，７５ｇ、２．２關ｏ１）、ｈリエチルアミン（４００μｌ　、２．８６ｍｍ ｏｌ）および無水ＴＨＦ（８ｍｌ）の溶液に、２−クロロ−２−オキソ−１，３ ，２−ジオキサホスホラン（Ｆｌｕｋａ、２４０μｌ’、２．６ｍｍｏｌ）を室 温でアルゴン下添加した。塩酸トリエチルアンモニウムが析出するまでの間、反 応物を３時間撹拌した。反応溶液から、アルゴン強気流下、析出物を、先端に綿 をつけた注射器を用いてピペットで除去した。析出物をエーテルで数回すすぎ、 併せた溶液とすすぎ液を真空で蒸発させて、湿気への露出から保護された泡を得 た。

泡を無水ＤＭＦ　（４＋ｎｌ）に溶解し、乾燥ＮａＣＮ（１４０ｍｇ、２、８ｍ ｍｏｌ）と共に室温で２４時間撹拌してβ−シアノエチルホスフェートジエステ ルを形成させた。反応混合物を高減圧かつ５５℃で吸引してＤＭＦを除去し、ホ スフェートジエステル　７をゴム状物質として得た。粗ホスフェートジエステル を更に精製することな（光酸素化を行った。

シン　びアンチ−ジナトリウム　２−クロロ−５−４−メトキシスピロ　１．２ −ジオキセタン−３，２°　−５°　−クロロ−トリシクロ　３．３．１．１１ ７−デカン　−４−イル　−１−ホスフェートジエステル　７を、５．１ｏ、１ ５．２ｏ−テトラフェニル−２１Ｈ１２３Ｈ−ポルフィン（ＴＰＰ、２　ｍｇ／ ｍｌのＣＨＣｌ　ｍ　／８液０．８ｍ１）を添加した１　０　％　Ｍ　ｅ　ＯＨ ／　ＣＨＣｌ　ｚ２０ｍｌに溶解させた０反応混合物を酸素で飽和し、溶液に酸 素を通過させながら、カプトンフィルムで包んだ２５０Ｗ高圧ナトリウム蒸気ラ ンプを用いて照射した。逆相ＨＰＬＣ分析によれば、照射２０分後にジオキセタ ンの完全な形成が示された。溶媒を室温で真空下除去し、残渣を、高真空下で吸 引してゴム状物質とし、−２０℃で保存した。

ＭｅＯ８１１ｍｌに溶解させた粗シアノエチルホスフェートジエステルジオキセ タン　８を、ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨ中の２５重量％ＮａＯＭｅを０． ５ｍ１ｌを用いて室温で３０分間保護基を脱離させた。シアノエチル基のβ−除 去完了後、Ｎ　ａ　ＨＣＯａ飽和／８液２ｍｌを添加し、Ｍｅ　ＯＨを回転蒸発 させた。ＨＰＬＣグレード水（１５ｍｌ）を添加し、褐色溶液を０．４５μナイ ロンフイルターに通過させた。？８　？＆量をＨＰＬＣグレード水で４０ｍ１に 調整し、ポリスチレンカラム（Ｐ　Ｌ　ＲＰ　−Ｓ　、　ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を通したＣＨ，ＣＮ／Ｈ，Ｏ勾配液を用いて予備ＨＰＬＣ によって精製した。画分を凍結乾燥したところ、ジオキセタン１を０．８１ｇ（ フェノール　６から７４％）を得た。アセトニトリルと０．１％Ｎ　ａ　ＨＣＯ ３との勾配を用いたポリスチレンカラム逆相ＨＰＬＣおよび２７０ｎｍにおける Ｕ■検出によれば、シン及びアンチ異性体混合物を表す、前方に肩をもつ１個の ピークが示された。異性体混合物としての生成物試料を、０．１Ｍジェタノール アミン緩衝液（１ｍＭのＭｇＣ１諺）に、ｌ）＋１０で溶解させた。アルカリ性 ホスファターゼで処理した後、予期したように光が発せられた。このように、生 成物を表題の構造の１．２−ジオキセタンと確認した。

１施止 本発明の範囲内にある種々のジオキセタンを調製し、本質的な性質について試験 を行った。調製され試験されたジオキセタンとしては、Ｒがメチルであり、Ｘが ホスフェートであり、Ｙ２が塩素でありかつＺがフェニル環の４または５位にあ るジオキセタンが挙げられる。下記の試験においては、これらのジオキセタンを 市販されている櫟準Ｃ５ＰＤ■およびＡＭＰＰＤ”と比較した。

″　のアルカリ　ホスファターゼの　“アルカリ性ホスファターゼ（５，２５Ｘ 　１０−”モル）を、０．４ｍＭジオキセタンを含有する０、１Ｍジェタノール アミンおよび１ｍＭのＭｇＣ１ｚ　０．　５Ｉｌｌｌ　（ｐＨＩ　Ｏ）中で室温 にてインキュベートした。化学発光（５秒間の総和）をＢｅｒｔｈｏｌｄ　１Ｂ ９５２Ｔルミノメータで、５．１０．２０．３０．４４．５ｏおよび６０分に測 定した。図１および２では、Ｃ３ＰＤ■およびＣＤＰ−３ｔａｒ”の性能が比較 されている。図１には、相対光単位（ＲＬＵ）対時間としてプロットされたＣ３ ＰＤ＠およびＣＰＤ−３ｔａｒ？＋″の比較が示されている。３個を重ねた平均 がプロットされている。図２には、化学発光増強ポリマーであるポリビニルベン ジルトリブチルアンモニウムクロリド１　ｍｇ／ｍｌを含有する、別の試料から 得られた結果が示されている。

ナイロン　でのビオチン　ＢＲ３２２−３５ｍａｒの　“挟止 ビオチン化ｐＢＲ３２２３５−ｍｅｒ　（ＩμＬ中１３．１ｐｇ）を、陽電荷処 理されたナイロン膜（Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−Ｐｌｕｓ”　）の小片上に点在させた 。膜を完全に乾燥させ、ＤＮＡをＵＶ架橋（１２０ｍＪ／ｃが）によって膜に固 着させた。その膜をＰＢＳで湿らせ、次いで、ブロッキング緩ｔＩｉ液（０，２ ％１−Ｂｌｏｃｋ”　、　ＰＢＳ中０．５％５ＤＳ）中で１０分間、ストレプト アビジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Ａｖｉｄｘ−ＡＰ”、Ｔ ｒｏｐｉｘ　；ブロッキング緩衝液中１　：　５０００で希釈された）中で２０ 分間インキュベートし、ブロッキング緩衝液で５分間１回、洗浄緩衝液（ＰＢＳ 中０．５％５ＤＳ）で５分間３回洗浄した０次いで、膜を分析緩衝液（０，１Ｍ 　ＤＥＡ、１ｍＭＭｇＣ１５、ｐＨｌ０．Ｏ）で５分間２回洗浄した。最後に、 膜を調整し、ヒートシール可能なプラスチックの小片で０．２５ｍＭのＣ３ＰＤ またはＣＤＰ−３ｔａｒ　（分析緩衝液で希釈された）４０μｌを用いてシール した。膜のシールされた小片を管（２２℃で予備インキュベートされた）に即座 にテープで貼り例け、Ｔｕｒｎｅｒ　１Ａｏｄｅｌ　２０　ｅルミノメータ−（ Ｔｕｒｎｅｒ　Ｄｅｓｉｇｎｓ。

Ｉｎｃ、　）Ａｏｕｎｔａｉｎ　ｖｉｅｗ、　ＣＡ）中に置いた。光の放出を、 ２２℃で２４時間５分毎に記録した。図３は、Ｃ３ＰＤ及びＣＤＰ　５ｔａｒに ついての化学発光強度（ＲＬＵ）対時間のプロットである。

ウェスタンプロットヒトトランスフェリンの　−　゛精製されたヒトトランスフ ェリン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／ＭａｎｎｈｅｉＩＩＩｃａｔ＃１３１７４１５ 　）を、ＬＸ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液（０，０６Ｍトリス−ＭＣ１，ｐ） １６．８．２．２５％クリセロール、０．５％β−メルカプトエタノール、２％ ＳＤＳ、０．０５％ブロモフェノールブルー）を用いて順次希釈した。希釈液を ９５℃で５分間加熱し、希釈された試料５μｍをゲルレーン毎に負荷した。試料 を、Ｈｏｅｆｅｒ　５Ｅ２５０ミニゲル装置を用いて１０％ポリアクリルアミド ミニゲルによろ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動的に分離した。各プロットは 、トラ：／　スフ　ｚ　’Ｊ　”／を１０．３．３．１．１、ｏ、３７．０．１ ２および０．０４ｎｇ含有する。電気泳動に続いて、ゲルおよび膜を、移送緩衝 液（５ｍＭのＭＯＰＳ　ｐＨ７，５，２ｍＭの酢酸ナトリウム、２０％ＭｅＯＨ ）を用いて１５分間平衡化させた。蛋白を、Ｐ　Ｖ　Ｄ　Ｆ　（Ｔｒｏｐｉｆｌ ｕｏｒ”）および陽電荷処理されたナイロン（Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−Ｐｌｕｓ”　 ）膜に９０Ｖ、４℃で１時間移動させた。プロットを、ブロッキング緩衝液（Ｂ Ｂ−１ｒＰＢＳ中０゜２％１−Ｂｌｏｃｋ”、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０］をＰ ＶＤＦのために用い、ＢＢ−２ＩＰＢＳ中３％１−Ｂｌｏｃｋ”　、　０．　１ ％Ｔｗｅｅｎ−２０１をナイロンのために用いた）中で３０分間インキュベート した。次いで、プロットを、ウサギポリクローナル抗ヒトトランスフェリン（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ｃａｔ　ｔｔ６１５　Ｄｉｓ　；適切 なブロッキング緩衝液中ｌ：５０００に希釈された）で３０分間インキュベート し、次いで、５分間２回洗浄した（ＰＶＤＦをＢＢ−１で、及びナイロンを洗浄 緩ｉ１ｉ＋ＩＥＰＢｓ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０３で）６次に、プロットを、 ヤギ抗つサギＩｇＧアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ　 ；適切なブロッキング緩衝液中１：　１０，０００に希釈）で３０分間インキュ ベートし、次いで、上記のように５分間２回洗浄した。プロットを、分析緩衝液 （０、ＬＭ　ＤＥＡ、■畦のＭｇＣ１１、ｐＨ１ｏ、Ｏ）中５分間２回洗浄した 。最後に、プロットを０４２５ｍＭのＣ５ＰＤまたはＣＤＰ−３ｔａｒ　（分析 緩衝液中で希釈）で５分間インキュベートした。プロットから過剰の基質溶液を 奪い、プラスチックリポートカバー内に置き、これにＫｏｄａｋＸＡＲ−５フイ ルムを曝した。ナイロンおよびＰＶＤＦ膜について得られた結果を図４−５に示 す。

土ヱユ之腺　での　−コピー　゛　−一の　４、゛酵ｉｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのゲノムＤＮＡ全体を、ＥｃｏＲｌおよびＢｇ ｌ　１１制限酵素エンドヌクレアーゼで切断した。各ＤＮＡ断片物５．０．０． ５および０．０５Ｍｇを、水平な０．８％アガロース　ＩＸ　ＴＢＥゲルにおけ る電気泳動によって分離させた。電気泳動に続いて、そのゲルを１．５ＭのＮｎ ＣＬ、０．５ＭのＮ　ａ　ＯＨに４５分間漫してＤＮＡを変性し、次いで、中和 緩衝液（１Ｍトリス、１．５ＭのＮａＣ１、ｐ）１７．４）中で４Ｓ分間イ〉′ キュベートした。ＤＮＡを、２０ＸＳＳＣを用いて毛細管移動を一晩行うことに よって、陽電荷処理されたナイロン膜（Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−Ｐｌｕｓ”　）に移 動させた。その膜を空気乾燥させ、ＤＮＡをその膜に１２０ｍ、Ｊ／ｃがでＵＶ 架橋した。酵母遺伝子ＲＰＢ　１から切断された１　ｋｂ　Ｂｇｌ　１１フラグ メントをゲル精製し、ピオチン−１４−ｄＣＴＰを取り込ませるランダムブライ ミング反応によってビオチン化した。その膜を、ハイブリダイゼイション溶液（ ７％ＳＤＳ、０．２５ＭのＮａｇ　ＰＯ４，１，０ｍＡｌのＥＤＴＡ）中で６８ ℃３０分間予備バイブリド化し、変性したプローブ５　ｎｇ／ｍｌを含有する未 使用のハイブリダイゼイション忍液５ｍｌを用いて６８℃で一晩ハイブリド化し 、次いで、ハイブリダイゼイション溶液から除去し、以下の様に洗浄した。すな わち、室温で２Ｘ　ＳＳＣ，１％ＳＤＳで５分間２回；６８℃で０．１ＸＳＳＣ １１％ＳＤＳで１５分間２回；および室温で１ｘＳＳＣで５分間２回洗浄した６ 次いで、その膜を、ブロッキング緩衝液（０，２％カゼイン、０．５％ＳＤＳ、 ＰＢＳＪ中で１ｏ分間およびブロッキング緩衝液中１：５０００希釈ＡＶＩＤｘ −ＡＰＴ′を用いて２０分間インキュベートした。次いで、その膜を、ブロッキ ング緩ｌｊ液で５分間、洗浄緩衝液（０，５％ＳＤＳ、ＰＢＳ）で１０分間３回 および分析緩衝液（０，１Ｍジェタノールアミン、１．０ｍＭのＭｇＣ１＊　、 ｐＨ１０，ｏｌで２分間２回洗浄し、続いて、分析緩衝液中０．２５ｍＭジオキ セクンで５分間インキュベートした。過剰の基質溶液を奪った後、その膜をプラ スチックで包み、これにＸ線フィルムを曝した。基質インキュベーション後それ ぞれ１０分後、７０分後、および１９時間後に行われた６０分の露光が、以下の 露光に反映されている。Ｃ３ＤＰおよび（、ＤＰ−Ｓｔａｒの比較を、図６．７ および８に示す。

ＤＮＡ夕１　の・亡・ｌ ＤＮＡ配列決定反応を、ビオチン化（−２０）普遍的プライマーと一本鎖Ｍ１３ 　ｍｐ１８テンプレートＤＮＡを用いたＴｒｏｐｉｘＳＥＱ−１ｉｇｈｔＴ１″ キットを用いて行った。反応生成物を、６％ポリアクリルアミドの８Ｍ尿素ゲル で分離し、毛細管作用によってＴｒｏｐｉｌｏｎ−ＰｌｕｓＴ１′ナイロン膜に 移動させ、その膜にＵＶ架橋させた（全照射：　１２０ｍＪ／ｃｍ”）　＊化学 発光検出を、膜をブロッキング緩衝ｎ　（０，２％１−ＢｌｏｃｋＴｌ″、０． ５％ＳＤＳ、ＰＢＳ）中で１ｏ分間、コンジュゲート溶液（ブロッキング緩衝液 中のＡｖｉｄｘ−ＡＰ　ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼコンジュ ゲートの１１５０００希釈液）中で２０分間インキュベートし、次いで、ブロッ キング緩衝液で１回５分間、洗浄緩衝液（０，５％ＳＤＳ、ＰＢＳ）で３回５分 間、分析緩衝液（０，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ）ＭｇＣ１、、ｐ）１１ ０）で２回２分間洗浄した。各膜片を、分析緩衝液中０）０．２５ｍＭ（７）Ｃ ３ＰＤ＊たはＣＤＰ−３ｔａｒのいずれかで５分間インキュベートした。すべて の工程を、穏やかに震動（１４０−１７０ｒｐｍ　）させながら、ヒートシール した大きなプラスチックバッグ中で室温で行った。３ケ所の時間点でのＣ３ＰＤ 及びＣＤＰ−Ｓｔａｒの比較が与えられている。基質とのインキュベーション後 の時間とＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５Ｘ線フィルムへの露光時間を図９に示す。

別の試験は、量子収率（以下に掲げられた操作に従った独立の実験室によって達 成される）、ＴＩ／□および放出波長最大値等の値をもたらす。これらのジオキ セタンを数によって同定し、数の後に続く表には、アダマンチル環の置換基の同 定、もしあれば引き続いてＺｌ置換基同定が与えられる。試験された化合物にお いては、Ｘはホスフェートである。量子収率とＴ　Ｉ／！の値は、０．１モルＤ ＥＡ中でのジオキセタンのみ、及び増強剤、５ａｐｐｈｉｒｅ　ＩＩの存在下の 両方について得られる。

パ　のためのプロトコル ０．１ＭのＤＥＡ、ｐｏｌｏ、Ｏ中のジオキセタンの３．２×１０−’Ｍ溶液５ ００μＬを１２Ｘ７５ｍｍ管内に２０℃で入れた。

その溶液を冷却水浴内で１０分間２０℃で平衡化した。アルカリ性ホスファター ゼ懸濁液２μＬを、ジオキセタンを含有する管に添加し、即座に１秒問うずを起 こし、２０℃水浴内に置いた０次いで、管をＭＧＭ　Ｏｐｔｏｃｏｍｐ＠　Ｉル ミノメータ−内に置き、光信号を１秒総和時間で測定した。光信号を測定した後 、管を２０℃水浴内に戻し、測定を繰り返した。ジオキセタンについての全体の 総数を強度データから決定した。ジオキセタンの与えられた濃度について観察さ れた全体の総数は、ルミノメータ−の光子検出効率（ＰＤＥ）、ジオキセタンの 量子収率および光を放出可能な分子の数（脱リン酸化ジオキセタンの濃度）の結 果である＊　ＭＧＭ　Ｏｐｔｏｃｏｍｐ　Ｉルミノメータ−のＰＤＥを、Ｂｉｏ ｌｉｎｋ■絶対標準で測定し、ルミノメータ−のＰＭＴの既知のスペクトル応答 とジオキセタンの既知の放出スペクトルを利用して２．５６Ｘ１０−”と決定し た。量子収率は、測定された全総数をＰＤＥとジオキセタンの濃度によって割る ことによって計算される。

態にある゛　にお番る、　またはハーフタイムの肚！ ターナ−ルミノメータ−の読み取りから、最大信号を測定した。

最大信号から、３０．１５０．３００または６００秒間隔でのターナ−光ユニッ ト読み取り値を引いたものを計算し、対時間でグラフ化した。グラフから、半減 期を決定するために指数式を計算した。

ジオキセタンの半減期はまた、ターナ−ルミノメータ−印字出力から直接的に決 定された。

放工晟人１ ０．４ｍＭのジオキセタン、０．１Ｍのジェタノールアミンおよび１ｍＭのＭ　 ｇ　Ｃ１＊のｐＨ１０の溶液２ｍｌに、９．９Ｘ１０−”　Ｍのアルカリ性ホス ファターゼを添加した。その溶液を５ｐｅｘ　ＦｌｕｏｒｏｌｏｇＦｌｕｏｒｉ ｍｅｔｅｒ中で５分間平衡化させ、次いで、化学発光放出について、０　、　５ 　ｓｅｃ／ｎｍで５回走査した。化学発光放出波長最大値を記録した。

−によるＤＮＡ　１・ 化学発光検出によるＤＮＡの配列決定を、Ｔｒｏｐｉｘ　ＳＥＱ−ＬｉｇｈｔＴ １″プロトコルに記載されているように行った。簡単には、ＤＮＡ配列決定反応 を、Ｍ１３一本鎖ファージＤＮＡをテンプレートとして用いるビオチニル化プラ イマーを用いて始めた。反応物を、８Ｍ尿素変性ＰＡＧＥによって分離し、毛細 管作用によってＴｒｏｐｉｌｏｎ−Ｐｌｕｓナイロン膜に水平に移動させ、５ｐ ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　５ｐｅｃｔｏＬｉｎｋｅｒＸＬ−１５００を用いて２００ ｍＪ／ｃがでＵｖ光を露光させることによって膜に架橋させた。その膜をブロッ キング緩衝液（リン酸塩緩衝食塩水／ＰＢＳ［２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７，２，１５０ＩＩＩＭのＮａＣ１］中の０．２％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ”　、　０． 　５％ドデシル硫酸ナトリウム／５ＤＳ）で１０分間インキュベートし、ブロッ キング緩衝液中Ａｖｉｄｘ−ＡＰストレプトアビジン−アルカリ性ホスファター ゼの１１５０００希釈液で２０分間インキュベートし、ブロッキング緩衝液で５ 分間、洗浄緩衝液（０，５％ＳＤＳ、ＰＢＳ）で３回５分間、分析緩衝液（０， １Ｍジェタノールアミン、１ａ＋ＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　２、ｐ）Ｉ　１０　）で２ 回５分間洗浄し、次いで、ジオキセタン溶液（分析緩衝液中で０．２５ｍＭに希 釈されたＣ３ＰＤ、１４０−１７またはＬ２８−８７のいずれか）を用いて５分 間インキュベートした。その膜の水気をきり、プラスチックホルダーでシールし 、　Ｋｏｄａｃｋ　ＸＡＲ−５Ｘ線フィルムに露光させた。ジオキセタン１２８ −８７については、露光時間は７０分であり、１４０−１７については８０分で あり、両方とも基質溶液添加後６５分に行った。ジオキセタン１２Ｂ−８７対Ｃ ５ＰＤの比較については、膜露光時間は、基質との２４時間インキュベーション 後５分であった。図１０および１１．このタイプのプロトコルの詳細は、トロビ ックス　インコーホレーテッドから商業上入手可能なＴｒｏｐｉｘ　ＳＥＱ−Ｌ ｉｇｈｔ”Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定システムに示されている。

０．１ＭのＤＥＡ、ｐＨ１０，２５℃ ジオキセタン？震度　３．　７Ｘ　１０−’Ｍ　〜６Ｘ　１０−’Ｍ０．０９Ｍ のＤＥＡ＋０．１％５ａｐｐｈｉｒｅＩ工、ｐＨ９，９５，２５℃ ジオキセクン１度　１．８ｘｌＯ−’ＩＡ〜６．１．ｘｌｏ−’Ｍジオキセタン に関連する使用について知られているタイプの増強剤と共に、ジオキセタンまた は少なくとも励起状態の発光種との相互作用を積極的に示すために、放出最大値 についての波長を、いがなる増強剤も存在しない条件下、ＢＤＭＱの存在下、及 びナイロン膜上で検出した。データを以下の表に示す。

二二Σヱ旦ユ上旦所 上記から分かるように、本発明のジオキセタンは、ドツトプロット分析の使用に 適切である。上記合成経路に従って合成されたジオキセタンを、ドツトプロット 分析に用いた。６位に２置換基をもつジオキセタンの化学発光がないことを確認 するに当たって、化合物１４０−６２が、首尾一貫した信号を与えないかまたは 最適条件下でわずかに検出可能な信号を与えることに留意すべきである。同様に 、アダマンチル頂上の塩素置換基と共に、６位にメトキシ置換基を有するジオキ セタン１４０−７３は、ドツトプロット分析では信号を与えず、６位置換メタホ スフェートフェニルジオキセタンの化学発光活性の欠如を確認した。図１２〜２ １゜ニトロセルロースおよびナイロン膜に、ビオチン化３５塩基　オリゴヌクレ オチドプローブを点在させた。そのプローブをｌＸ５ＳＣで希釈して出発希釈液 ２１０ｐｇを得た。出発希釈液の連続１；２希釈液を、膜に全体でＸ２スポット 点在させた。その膜な乾燥させ、最ＺＵ、Ｖ、架ｆＪＩ　（１２０ｍＪ／ｃｍ” ）を行い、ブロッキング緩徨ｊ（夜にトロセルロース−０，２％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ 、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｉｘ　ＰＢＳ；ナイロン・０．２％Ｉ−Ｂｌｏｃ ｋ、　０．５％ＳＤＳ、ＩＸ　ＰＢＳ）で３０分間ブロックし、ブロッキング緩 衝液中で希釈されたストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲ ートの１１５０００希釈液中で２０分間インキュベートし、以下のように洗浄し た。ブロッキング緩衝液で１回５分間、ＩＸＰＢＳ、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０ にトロセルロース）で３回５分間またはＬＸ　ＰＢＳ、０．５％ＳＤＳ　（ナイ ロン）で３回５分間；基質緩衝液（０，１Ｍジェタノールアミン、０．１＋ｎＭ のＭ　ｇ　Ｃ１ｇ、ｐＨ１０）で２回５分間；基質緩衝液にトロセルロース実験 のみ）中で希釈されたＮ１ｔｒｏ−Ｂｌｏｃｋ　（トロビツクス社、ベッドフォ ード、ＭＡ）の１／２０希釈液中で１回５分間；および基質緩衝液にトロセルロ ース実験のみ）で２回５分間洗浄した。その膜を基質緩衝液中で希釈された０、 ２５ｍＭのジオキセタンを用いて５分間インキュベートした。ニトロセルロース およびナイロン実験の両方における数枚の膜を、０．２５ｍｇ／ｍｌ　Ｃａ１ｆ ａｘ　ＤＢ−４５、Ｃａ１ｆａｘ　１０　Ｌ−４５またはＣａ１ｓｏｆｔ　Ｔ− ６０（Ｐｉｌｏｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ロサンゼルス、ＣＡ） 　、　Ｔｗｅｅｎ−２０を１　、０ｍｇ／ｍｌ　、　Ｎ１ｔｒｏ−ＢＬｏｃｋを １　、０ｍｇ／ｍｌ　、および基質溶液中で希釈された０、２５ｍＭのジオキセ タンを用いて５分間インキュベートした。これらの膜は、Ｎ１ｔｒｏ−Ｂｌｏｃ ｋの１／２０希釈を受けなかった。次いで、その膜をＸ線フィルムに露光させ、 現像した。

このように、上記結果から分かるように、ジオキセタンの芳香環に加えられた電 子吸引基は、化学発光信号を増加させる傾向がある一方、光放出の動力学を改め る。これに反し、電子供与基は、酸素から芳香族基を介してジオキセタンへの電 子の移動を促進させることによって明らかにＴ、７．を短縮する。このように、 所望の場合には、電子供与または電子吸引Ｚ置換基の性質および性能の適切な選 択および同時にアダマンチル環のための適切な置換基の選択によって、最適信号 強度、最適速度、特定の放出波長等を含む特性を有するジオキセタンを得ること ができる。

これらのジオキセタンは、ジオキセタンを切断可能な酵素が単独で存在する、ま たはもし被検体が存在するならば形成するであろう最終錯体の一部に付着され得 るすべてのタイプの分析に用いることができる。従来の分析形態は、当業者に知 られており、また、発明の背景で述べられている特許に記載されている。適切な 分析法の具体的な開示は、米国特許５，１１２，９６０号に見られ、同一の開示 が文献によって本明細書に包含されている。その分析形態自体は１本発明のジオ キセタンによって向上された性能を除けば本発明の概要を構成しない。

したがって、中間体と共に本発明のジオキセタンは、一般的な記載および特定の 態様の両方を参照することによって開示されている。加えて、ジオキセタンの性 質は一般的に記載され、かつ例証されている。本実施例は、本発明を限定するも のとして意図されておらず、そのまま解釈されるべきではない。開示と一致して いる置換基パターンの変形、同−性等は、当業者にとって起こるものである。こ のような変形および変化は、以下の請求項に述べられる限定によって除外される 場合を除いては本発明の範囲内にある。

ん 時間（分） １’ｌＧ−７ 時間（分） ０ＬＩＲ 時間（ｈ） ＦＩＧ、　３ Ｃ９ＰＤ＠ＣＤＰ−８ｔａＰ ＦｊＧ、　４Ａ　ＦＩＧ、　４８ Ｃ５ＰＤ＠Ｃ０Ｐ−５ｔａｒ”’ ＦＩＧ、　４ＣＦＩＧ、　４Ｄ ｃｓｐｏ■　Ｃ０Ｐ−８ｔａｒ”’ ＦＩＧ、　５Ａ　ＦＩＧ、　５８ Ｃ３ＰＤ■　ＣＤＰ−５ｔａＰ ＦＩＧ、　５ＣＦＩＧ、　５Ｄ １０分間インキュベーション　１０分間インキュベーション６０分間露光　６０ 分間露光 ５．０　０．５　０，０５　５．０　０．５　０．０５　ｕｌｌＩａ引ＤＮＡＦ ＩＧ、　６４　ＦＩＧ、　６Ｂ ７ｏ分間イアキ、−、−シ３ン　７ｏ分間イ′キ゛６−シヨ′６ｏ分間露光　６ ０分間露光 ５．０　０．５　０，０５　５．０　０．５　０．０５　１ｕＱＹｅＭＳＩＤＮ ＡＣ９ＰＤ”　ＣＤＰ−５ｔａｒＴＭ ｓ、ｏ　ｏ、ｓ　ｏ、ｏｓ　ｓ、ｏ　ｏ、ｓ　ｏ、ｏｓ　μＱ　酵母０ＮＡＦＩ Ｇ、　８Ａ　ＦＩＧ、　８Ｂ 特表千７−５０９７３６　（２３） １４０−１７　１２８−８７　ＡＭＰＰＤ　Ｃ３ＰＤ３０分間ｎ光 １４０−１７　１２８−８７　ＡＭＰＰＤ　Ｃ５ＰＤ６０分間露光 １４０−１７　１２８−８７　ＡＭＰＰＤニトロセルロース ３０分間露光 ０分間インキュベーション ＦＩＧ、　１６Ａ ・　・　も １４０−１７　１２８−８７　ＡＭＰＰＤニトロセルロース ６０分間露光 ・　・　・ １４０−１７　１２８−８７　ＡＭＰＰＤニトロセルロース １２０分間露光 ６０分間インキュベーション ・　・　・ ・　・　・ ・　・　・ １４０−１７　１２８−８７　ＡＭＰＰＤニトロセルロース １５、５時間露光 ２時間インキュベーション ＦＩＧ、１８Ａ Ｆ［Ｇ、２１Ａ ＦＩＧ、２１８　ＦＩＧ、２１ＣＦＩＧ、２１Ｄフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，も　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｃ６９／８４ ２３３／７５　９５４７−４Ｈ ２７１１５８９４５１−４Ｈ ３０９／７５　７４１９−４Ｈ ３１１１０４７４１９−４Ｈ ３１１１０８７４１９−４Ｈ ３１１／１６　７４１９−４Ｈ ＣＯ７Ｆ　７１０８　Ｓ　８８２９−４Ｈ７／１８　Ｆ　８８２９−４Ｈ Ｌ　８８２９−４Ｈ ９／６５５　９１５５−４Ｈ ＣＯ７Ｈ１５／２０３　８６１５−４ＣＣ１２Ｑ　１／３４　６８０７−４８ １／４２　６８０７−４Ｂ １／６８　Ａ　９４５３−４８ ＧＯＩＮ　２１／７８　Ｃ８３１０−２Ｊ３３１５３２　Ｂ　７０５５−２Ｊ ３３１５３５　７０５５−２Ｊ ３３１５８　Ａ　７０５５−２Ｊ Ｉ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＮ、ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＧＥ、ＨＵ、ＪＰ、 ＫＧ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＤ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、 Ｎｏ。

ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＩ、　ＳＫ、ＴＪ 、ＴＴ、ＵＡ、ＵＺ、ＶＮ （７２）発明者　スパータス、アリソンアメリカ合衆国、マサチューセッツ ０１８４５、ノース・アンド−バー、ジョンソン・ストリート　３２５

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、Ｙ１及びＹ２は、独立して、 Ｈ、水酸基、ハロゲン、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキル基、ハ ロ低級アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、アル コキシフェノキシ基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、アミド基、アルコキ シ基またはカルボキシル基であり、Ｒは、Ｃ１−１２アルキル、アリールまたは アラルキルであり、Ｘは、ホスフェート、ガラクトシド、アセテート、１−ホス ホ−２、３−ジアシルグリセリド、１−チオ−Ｄ−グルコシド、アデノシントリ ホスフェート、アデノシンジホスフェート、アデノシンモノホスフェート、アデ ノシン、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルクロニド、α −Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシド、β−グ ルコシドウロネート、ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル及びｐ −トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミドからなる群より選ばれた酵素によ る作用を受けやすい基であり、Ｚは、電子吸引基及び電子供与基からなる群から 選ばれた電子活性基であり、かつフェニル環の４位または５位を占有している） で示されることを特徴とするジオキセタン。
2. ２．Ｚが、Ｃ１、ＯＭ、ＯＡｒ、ＮＭ２＋、ＮＨＣＯＭ、ＮＭＣＯＭ１、ＮＨＣ ＯＡｒ、ＮＨＣＯＯＡｒ、ＮＨＣＯＯＭ、ＮＭＣＯＯＭ１、ＣＭ３、ＮＯ２、Ｃ ＯＯＭ、ＣＯＯＡｒ、ＮＨＳＯ２ＯＭ、ＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＦ３、Ａｒ、Ｍ、Ｓ ｉＭ３、Ｓ１Ａｒ２、ＳｉＡｒＭ２、ＳＯ２ＮＨＣＯＭ、ＳＯ２ＮＨＣＯＡｒ、 ＳＯ２Ｍ、ＳＯ２Ａｒ、ＳＭ及びＳＡｒからなる群より選ばれ、ここでＭ及びＭ １は独立してＣ１−６アルキルであり、Ａｒはフェニルまたはナフチルである請 求項１記載のジオキセタン。
3. ３．Ｚが、５位にあるクロロ、メトキシまたはアミド置換基である請求項２記載 のジオキセタン。
4. ４．Ｚが塩素である請求項３記載のジオキセタン。
5. ５．Ｙ２が水素であり、Ｙ１が塩素である請求項４記載のジオキセタン。
6. ６．Ｚがエトキシまたは塩素であり、かつ４位にある請求項２記載のジオキセタ ン。
7. ７．Ｚが塩素であり、Ｙ２が水素であり、かつＹ１が塩素である請求項６記載の ジオキセタン。
8. ８．Ｚが５位にあるメトキシであり、Ｙ２が水素であり、かつＹ１が塩素である 請求項２記載のジオキセタン。
9. ９．Ｘがホスフェート基である請求項５、７または８記載のジオキセタン。
10. １０．ＲがＣ１−４アルキルである請求項９記載のジオキセタン。
11. １１．Ｙ２が水素であり、Ｙ１が塩素であり、Ｚが５位にある−ＯＣＨ３であり 、Ｒがメチルであり、かつＸがホスフェートである請求項１記載のジオキセタン 。
12. １２．Ｙ２が水素であり、Ｙ１が塩素であり、Ｚが５位にある塩素であり、Ｒが メチルであり、かつＸがホスフェートである請求項１記載のジオキセタン。
13. １３．Ｙ２が水素であり、Ｙ１が塩素であり、Ｚが４位にある塩素であり、Ｒが メチルであり、かつＸがホスフェートである請求項１記載のジオキセタン。
14. １４．式ＩＩまたはＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ＩＩＩ）（式中、Ｙ１及びＹ２は、独立して、Ｈ、水酸基、ハロゲン、非置換 低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキル基、ハロ低級アルキル基、フェニル基 、ハロフェニル基、アルコキシフェノキシ基、アルコキシフェニル基、ヒドロキ シアルコキシ基、シアノ基、アミド基、アルコキシ基またはカルボキシル基であ り、ＲがＣ１−１２アルキル、アリールまたはアラルキルであり、Ｘは、ホスフ ェート、ガラクトシド、アセテート、１−ホスホ−２、３−ジアシルクリセリド 、１−チオ−Ｄ−クルコシド、アデノシントリホスフェート、アデノシンジホス フェート、アデノシンモノホスフェート、アデノシン、α−Ｄ−クルコシド、β −Ｄ−クルコシド、β−Ｄ−グルクロニド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マン ノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシド、β−グルコシドウロネート、ｐ−トルエ ンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル及びｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アル ギニンアミドからなる群より選ばれた酵素によって作用を受けやすい基であり、 Ｚは、電子吸引基及び電子供与基からなる群より選ばれた電子活性基であり、Ｏ Ｘは、ジオキセタンへのナフチル環の置換部位と、ＯＸの置換部位との間の環員 炭素の数（置換部位の炭素を含む）が、奇数であるようにナフチル環に置換され ており、Ｚは、ジオキセタン環の置換部位に隣接した炭素を除いて、いかなる環 員炭素上にあってもよい置換基である）で示されることを特徴とするジオキセタ ン。
15. １５．Ｚが、Ｃｌ、ＯＭ、ＯＡｒ、ＮＭ２＋、ＮＨＣＯＭ、ＮＭＣＯＭ１、ＮＨ ＣＯＡｒ、ＮＨＣＯＯＡｒ、ＮＨＣＯＯＭ、ＮＭＣＯＯＭ１、ＣＭ３、ＮＯ２、 ＣＯＯＭ、ＣＯＯＡｒ、ＮＨＳＯ２ＯＭ、ＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＦ３、Ａｒ、Ｍ、 ＳｉＭ２、ＳｉＡｒ３、ＳｉＡｒＭ２、ＳＯ２ＮＨＣＯＭ、ＳＯ２ＮＨＣＯＡｒ 、ＳＯ２Ｍ、ＳＯ３Ａｒ、ＳＭ及びＳＡｒからなる群より選ばれここでＭ及びＭ １は独立してＣ１−６アルキルであり、Ａｒはフェニルまたはナフチルである請 求項１記載のジオキセタン。
16. １６．Ｚが、４位、５位または７位にあるクロロ、メトキシまたはアミド置換基 である請求項１４記載のジオキセタン。
17. １７．請求項１または１４記載のジオキセタンおよび水溶液中で前記ジオキセタ ンの基Ｘを切断することができる酸素を含むことを特徴とする化学発光ジオキセ タンリポータ−分子を用いて検定を行うためのキット。
18. １８．水溶液中での前記Ｘ基の切断に際し、前記ジオキセタンから得られる化学 発光信号を増加させるための増強物質を更に含有する請求項１７記載のキット。
19. １９．前記検定が、免疫検定であり、前記酵素が、被検体に結合可能な試薬と複 合体を形成し、その存在の有無または濃度を検出するために前記検定が行われる 請求項１７記載のキット。
20. ２０．前記検定が、ＤＮＡプローブ検定であり、前記キットが前記検定が行われ る膜を更に含有する請求項１７記載のキット。
21. ２１．水溶液中での前記Ｘ基の切断の際に前記ジオキセタンから得られた化学発 光信号を増加させるための増強物質を更に含有する請求項１７記載のキット。
22. ２２．前記酵素が、試料中に存在する被検体と順次複合体を形成し得る試薬と複 合体を形成し、検定が前記被検体の存在または濃度のために行われる請求項２０ 記載のキット。
23. ２３．前記検定が、ＤＮＡ配列分析検定であり、前記キットが、前記配列分析検 定が行われる膜を更に含有する請求項１７記載のキット。
24. ２４．前記キットが、水溶液中でのＸ基の切断に際し、前記ジオキセタンから得 られる化学発光信号を増加させるための増強物質を更に含有する請求項２３記載 のキット。
25. ２５．前記酵素が、前記検定において配列決定されるべきＤＮＡへの酵素の付着 を可能にする試薬と複合体を形成する請求項２３記載のキット。
26. ２６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ１は、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＣＨ３）２またはＣＯＯＭであり、Ｑ２は、 ＯＨ、ＯＭ、（ＣＨ２〕３ＣＣＯＯ−またはＯＳｉＭ３であり、Ｑ３は、Ｃ１、 Ｂｒ、Ｆ、ＮＯ２またはＮＨ２であり、ここで、Ｍは、炭素数１−６のアルキル またはアラルキルである） で示されることを特徴とする化合物。
27. ２７．試料中の酵素の存在を検出する方法であって、該試料を請求項１または１ ４のジオキセタンと接触させ、かつそれによって生じた光の放出を検出する工程 を含み、ここで前記酵素が、前記酵素によって作用を受けやすい基Ｘを切断し、 かつ放出された光の検出が、試料中の前記酵素の存在を示すことを特徴とする検 出方法。
28. ２８．前記Ｘ基が、ホスフェートであり、前記酵素が、アルカリ性ホスファター ゼである請求項２７記載の方法。
29. ２９．第１及び第２の部位をもつ特定の結合対のうち第１の部位を検出する方法 であって、請求項１または１４のジオキセタンと、前記ジオキセタンの前記酵素 によって作用を受けやすい基Ｘを切断する酵素との反応によって生じた化学発光 を、光学的に検出し、ここで前記酵素が前記特定の結合対の第２の部位と複合体 を形成することを特徴とする検出方法。
30. ３０．前記方法が、免疫検定を含む請求項２９記載の方法。
31. ３１．前記方法が、核酸プローブ検定を含む請求項２９記載の方法。