JP4668418B2 - 多種酵素アッセイ - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、細胞のサンプル又は集団の一つのアリコート中の少なくとも１種の内在性酵素及びサンプルの１つのアリコート中の多種の酵素（ただし、酵素の少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を計測する多酵素アッセイを開示する。本発明はまた、多種の酵素の活性を検出する方法及びキットを開示する。
【０００２】
従来技術の背景
多様なレポーター遺伝子アッセイが、生体医学的及び薬学的研究で、遺伝子調節及び細胞因子の同定ならびに遺伝子発現に影響する化合物の研究のために使用されている。Alam and Cook, Anal Biochem, 1990; 188:245-54; Bronstein, et al., Anal Biochem., 1994; 219:169-81。レポーター遺伝子活性、すなわちレポータータンパク質の産生は遺伝子の調節要素の転写活性に正比例するため、レポーター遺伝子アッセイは遺伝子調節要素の研究に有用である。これらのアッセイで使用するためのレポーター遺伝子構築物は、重要な１種以上の遺伝子調節要素、機能的ｍＲＮＡの転写のための最小シーケンス要件及びレポータータンパク質のためのコード化シーケンスを含む。Alam, et al., Anal. Biochem., 188:245-254, 1990。調節領域内に種々の欠失を含む構築物の分析は、転写及び細胞特異的発現に必要な調節シーケンスのマッピングを可能にする。
【０００３】
レポーター遺伝子構築物を細胞に導入したのち、発現したタンパク質又はその活性を定量すると、遺伝子発現の間接的な計測が得られる。たとえば、レポーター遺伝子産物の高感度な定量は、遺伝子発現、信号伝達経路、タンパク質相互作用の同定及び薬物発見に重要である。さらには、レポーター遺伝子の定量は、遺伝子プロモーター及びエンハンサー領域のマッピング、遺伝子発現機構の分析ならびに遺伝子発現のエファクタを求めての化学物質及び天然物質ライブラリのスクリーニングを可能にする。
【０００４】
化学発光レポーター遺伝子アッセイは、高い感度を、一般には６〜７のオーダーの大きさの広いダイナミックレンジと組み合わせる。化学発光１，２−ジオキセタン基質が、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、β−グルクロニダーゼ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含むいくつかのレポーター酵素のための、高感度アッセイに使用されている。これらの化学発光アッセイは、従来の比色的、蛍光的及びアジオアイソトープ的検出方法に対する優れた代替を提供する。１，２−ジオキセタン化学発光基質はまた、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼレポーター酵素のための二重アッセイで使用されてきた。各化学発光基質の酵素的開裂が、不安定化したジオキセタンアニオンを作り出し、それが断片化し、光を放出する。
【０００５】
ジオキセタン基質を使用する、レポーター遺伝子アッセイに限定されない高感度化学発光アッセイが記載されている。引用例として本明細書に取り込むBronsteinの米国特許第４，９７８，６１４号。これらのジオキセタン基質は、酵素誘発分解ののち、可視光を放出する。疎水性領域を有する特定の水溶性分子、たとえば球状タンパク質又は合成ポリマーを含むエンハンサー基質による、１，２−ジオキセタン類の化学発光分解の増強が記載されている。引用例として本明細書に取り込むVoytaらの米国特許第５，１４５，７７２号。これらのジオキセタン基質はまた、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼのレポーター遺伝子アッセイに使用される。たとえばBronstein et al., Anal. Biochem., 219:169-181, 1994及びその中で引用されている文献を参照。レポーター遺伝子アッセイにおけるジオキセタン基質及びエンハンサーの使用は、引用例として本明細書に取り込む米国特許出願第０８／５７９，７８７号に記載されている。米国特許出願第０８／５７９，７８７号は、同じ細胞抽出物アリコート中で多種のレポーター遺伝子の産物が順次に定量されるアッセイを記載している。一般に使用されるレポーター遺伝子を検出する、ラジオアイソトープを使用せず、外部光源を要しない簡単で高速で高感度な組み合わせ多レポーター遺伝子アッセイが記載されている。これらのアッセイは、増強されたレベルの光を発生させ、したがって、アッセイのダイナミックレンジ及び感度を増し、多様な計器の使用を可能にする。
【０００６】
１，２−ジオキセタン基質は、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素活性の定量のために、Tropix社から市販されているGALACTO-LIGHT（商標）、GALACTO-LIGHT PLUS（商標）及びGALACTO-STAR（商標）アッセイ系に組み込まれ、哺乳動物細胞培養物、組織抽出物、マイクロインジェクションしたカエル胚、寄生原生動物、酵母及びバクテリアで使用されている。Jain et al., Anal Biochem., 1991, 199:199-24、Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamental and Applied Aspects, (Campbell et al., ed) Chichester: Wiley, 1994, 20-3、Martin et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, (Hastings et al., eds.) Chichester: Wiley, 1997, 525-8、Bronstein et al., Clin. Chem., 1996, 42:1542-6。GUS-LIGHT（商標）系は、β−グルクロニダーゼレポーター検出に使用される。Bronstein et al., BioTechniques., 1994, 17:172-7。ＣＳＰＤ（登録商標）基質は、分泌形態又は非分泌形態のヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）レポーター酵素の定量のためにPHOSPHA-LIGHT（商標）アッセイ系で使用される。Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamental and Applied Aspects (Campbell et al., eds.) Chichester: Wiley, 1994, 20-3、Bronstein et al., et al., Clin. Chem., 1996, 42:1542-6、Bronstein et al., BioTechniques, 1994, 17:172-7。Tropix社によるDUAL-LIGHT（登録商標）系は、β−Ｇａｌ及びルシフェラーゼレポーター酵素の単管アッセイで、１，２−ジオキセタンをルシフェリンと組み合わせている。Martin et al., BioTechniques, 1996, 21:520-4、Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons (Hastings et al., eds.) Chichester: Wiley, 1997, 451-7。
【０００７】
現在、多レポーター遺伝子アッセイは一般に、トランスフェクションの効率を制御するために使用されている。このようなアッセイでは、細胞は、それぞれが異なるレポーター遺伝子を有する２種の別々のプラスミドの混合物でトランスフェクトされる。一方のレポーター遺伝子の発現が、研究される種々の調節領域によって制御され、対照として働く他方のレポーター遺伝子は一般に、標準のプロモーター又はエンハンサーによって構造的に発現される。試験用レポーター酵素の活性は、対照レポーター酵素の活性に対して正規化される。
【０００８】
単一アッセイにおける多種の酵素活性の計測は、いくつかの能力を提供する。トランスフェクション正規化は、試験用レポーター酵素及び対照レポーター酵素の定量によって実施することができる。薬学的スクリーニング法は、特異的転写因子に対する化合物の効果を遺伝子発現に対する非特異的効果から区別するのに、すなわち、いくつかの薬物標的の多重スクリーニングのために、多種のレポーターから恩恵を受ける。これらの利点は、１９９５年１２月２８日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／５７９，７８７号に記載されている。
【０００９】
レポーター遺伝子発現は遺伝子調節を計測するのに有用であるが、また、細胞数、細胞接着、細胞毒性及び細胞増殖を計測するための機構を有することが望ましい。そのようなレポーター遺伝子を制御するための使用される促進物質は、遺伝子発現を試験するために細胞に加えられる外来性化合物から独立して作用することが好ましいため、レポーター酵素は、これらの計測を実施するには有用性が限られるかもしれない。当業者は、試験細胞に何が加えられるかにかかわらず、細胞によって一定レベルで発現される遺伝子構築物を要するであろう。たとえば、試験化合物によって影響されない強力な促進物質に結合したレポーター酵素を使用しなければならないであろう。
【００１０】
レポーター酵素及び内在性細胞酵素の活性の計測は、レポーター酵素活性を細胞タンパク質に対して正規化する、すなわち、レポーター活性と、細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性との同時定量を潜在的に可能にするためのアッセイを提供する。細胞数、細胞増殖、細胞接着及び細胞健全性を計測するための、そのような計測を実施するのにレポーター酵素の使用を要しない方法を有することが望ましい。
【００１１】
細胞増殖、成長阻害、細胞接着又は細胞毒性効果を正規化又は計測するために細胞数を定量するための技術は現在公知であり、細胞酵素活性、生体染色及び細胞代謝を計測するための種々の方法を含む。レポーター酵素活性の計測及び細胞数の計測のためにサンプルの別個の部分を試験する必要性は、アッセイの精度を下げ、実験誤差を結果に招き入れるおそれがある。したがって、同じ細胞抽出物アリコートに対して順次に実施される多酵素アッセイは、アッセイ手順を簡素化し、実験誤差を最小限に抑えるであろう。多種の酵素の使用は、薬物発見のための高処理能力スクリーニングの効率及び情報内容を改善することができる。したがって、二つ以上の単一サンプルアリコートの試験を要することなく、これらの要因を計測する方法を有することが有用であろう。
【００１２】
Sherfらへの米国特許第５，７４４，３２０号は、２種の異なるレポーター酵素を同時に発現するように遺伝子操作された細胞によって産生される２種の個別のレポーター酵素を計測する二酵素レポーター系を記載している。Sherfらは、２種のルシフェラーゼレポーター酵素の使用及びそれらの酵素の活性を計測するための消光活性化試薬の使用を記載している。しかし、Sherfらは、内在性酵素（endogenous enzyme）を計測する方法を記載していない。
【００１３】
したがって、アッセイにおいてたとえば細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性を計測するために多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）を計測する方法を開発することは依然として当業者にとって目的である。当業者にとってのさらなる目的は、サンプルの１つのアリコート中の少なくとも１種のレポーター酵素及び少なくとも１種の内在性酵素を計測する方法を開発することである。
【００１４】
発明の概要
本発明の目的は、一つのアリコート中の少なくとも１種の内在性酵素の活性を計測し、それにより、一つのサンプル中の細胞数の内部正規化を提供する多酵素アッセイを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、多種の酵素の活性を計測するための、多種の酵素が少なくとも１種の酵素及び少なくとも１種の内在性酵素であり、少なくとも１種のレポーター酵素がジオキセタン類と反応することができる酵素であるアッセイを提供することである。１，２−ジオキセタン基質の使用は、内在性細胞酵素の定量のための高感度で融通性で容易な化学発光アッセイ系を提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、サンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種の酵素は内在性酵素である）の活性を計測する方法を提供することである。方法は、第一の酵素による第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第一の酵素の活性を定量することと、次いで、第二の酵素による第二の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第二の酵素の活性を定量することなどを含む。すべての定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して実施される。
【００１７】
単一アッセイにおける多種の酵素の活性の計測は利点を提供する。レポーター酵素及び内在性細胞酵素の活性の計測は、レポーター酵素活性を細胞タンパク質に対して正規化するための、すなわち、レポーター活性と、細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性との同時定量を潜在的に可能にするためのアッセイを提供するため、有利である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、サンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を検出するためのキットを提供することである。キットは、各酵素を定量するための試薬と、各酵素のための基質（基質の少なくとも１種はジオキセタン類である）と、場合によっては、水溶性ポリマーエンハンサー分子を含む促進物質溶液とを含む。
【００１９】
多種の酵素の活性は、使用する計器又は検出装置に依存して、順次に検出することもできるし、同時に検出することもできる。
【００２０】
発明の詳細な説明
上記目的は、１，２−ジオキセタン類の高い感度に頼る化学発光アッセイによって満たされる。本発明の譲受人であるTropix社によって開発されたこれらのジオキセタン類は、多様な米国特許の主題である。一般に、ジオキセタン類とは、４個の構成員を有し、それらの２個が隣接する酸素原子である環を有する分子である。ジオキセタン類は、熱的、化学的又は光化学的に分解されてカルボニル生成物、たとえばエステル、ケトン又はアルデヒドを形成することができる。この分解がエネルギーを光の形態で放出（すなわち発光）する。具体的には、ジオキセタン基質はそれぞれ、対応する酵素によって開裂させることができる酵素開裂性基を含む。開裂すると、負の電荷を帯びた基（たとえば酸素アニオン）がジオキセタンに結合したまま残る。このジオキセタンアニオンがジオキセタンを不安定化し、するとジオキセタンは分解して発光性物質を形成し、これが光を発生させる。この光信号が酵素の存在及び量の指標として検出される。したがって、過剰な基質の存在における発光信号の強さを計測することにより、対応する酵素の濃度を測定することができる。
【００２１】
レポーター酵素の高感度化学発光検出は、研究規模及び自動化可能な高処理能力薬学的スクリーニングプラットフォームの両方で使いやすいアッセイフォーマットで、１，２−ジオキセタン基質を用いて達成されている。１．２−ジオキセタン基質の使用は、多レポーター酵素及びレポーター／内因性酵素アッセイをはじめとする二重検出アッセイのために、ルシフェラーゼ反応試薬と組み合わされている。たとえば米国特許出願第０８／５７９，７８７号を参照。以前に開発されたDUAL-LIGHT（登録商標）アッセイ系は、ルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼレポーター活性の二重検出に広く使用されている。
【００２２】
本発明は、多種の酵素、たとえばレポーター酵素活性及び内在性酵素活性、たとえばルシフェラーゼ／ＡＰ、β−ガラクトシダーゼ／ＡＰ及びルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼ／ＡＰの検出を可能にする多酵素検出アッセイに関する。これらの多酵素アッセイは、両方の酵素素活性の検出感度を最適化し、アッセイ実行をさらに簡素化する。内在性酵素の活性は、レポーター酵素活性に影響するために操作されるか、細胞に加えられる要因に依存しない。その結果、内因性酵素の活性は、レポーター酵素に関連しない細胞数のマーカを提供する。この多重検出能力が、少なくとも１種の促進物質の活性と、レポーター酵素の転写活性に依存しない細胞数、細胞成長もしくは増殖、細胞接着又は細胞毒性の細胞定量読み出し正規化との同時計測を提供する。このような計測は、基本的な細胞機能の実験室研究から薬物スクリーニングに使用される複雑なアッセイに至るまで、レポーター酵素を使用するいかなるタイプのアッセイにも有用である。
【００２３】
本発明のアッセイは、サンプルの単一アリコート中の多種の酵素の検出を可能にする（本明細書で使用する「サンプル」は、ホールセル又は細胞抽出物を含むことができ、細胞は、哺乳動物、酵母又はバクテリアからの細胞であってもよい）。多種の酵素は、少なくとも１種の酵素が内因性酵素である限り、レポーター酵素と内在性酵素とのいかなる組み合わせからでも選択することができる。たとえば、本発明の一つの実施態様では、第一の酵素がレポーター酵素であり、第二の酵素が内在性酵素である。もう一つの実施態様では、すべての酵素が内在性酵素である。さらに別の実施態様では、第一及び第二の酵素がレポーター酵素であり、第三の酵素が内在性酵素である。さらなる実施態様では、第一の酵素が内在性酵素であり、第二の酵素がレポーター酵素である。当業者にとって自明である他の組み合わせを、本明細書の教示に準じるアッセイ及び方法で使用することができる。
【００２４】
本発明に有用である酵素は、酵素活性を示し、基質を分解させて光信号を発生させる、遺伝子から産生されるタンパク質を含む。そのような酵素の例は、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及び他の酵素を含む。好ましい実施態様では、酵素の少なくとも１種は加水分解酵素である。２種以上のレポーター酵素を使用する実施態様では、第二のレポーター酵素が加水分解酵素であることが好ましい。他の実施態様では、酵素のすべてが加水分解酵素である。加水分解酵素の例は、アルカリ及び酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ及びトリプシンを含む。
【００２５】
アルカリホスファターゼが使用される場合、基質は、ホスフェート含有ジオキセタン、たとえば３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩又は二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン〕−４−イル〕フェニルホスフェート又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１．２−ジオキセタン−３,２′−（５′−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１．２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、CDP-Star（登録商標）及びADP-Star（商標））を含むことが好ましい。
【００２６】
β−ガラクトシダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、ガラクトシダーゼ開裂性基又はガラクトピラノシド基を含有するジオキセタン類を含むことが好ましい。アッセイにおける発光は、ジオキセタン基質からの糖基の酵素的開裂の結果として生じる。そのような基質の例は、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕−デカン〕−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton（登録商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ〔１．２−ジオキセタン−３,２′−（５′−クロロ）トリシクロ｛３．３．１3.7〕デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））及び２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン〕−４−イル）フェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Star（登録商標））及びＡＭＰＧＤを含む。
【００２７】
β−グルクロニダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、β−グルクロニダーゼ開裂性基、たとえばグルクロニド含むジオキセタン、たとえばナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンのエステル基を開裂させる。プロテアーゼ及びホスホリパーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンに結合した適当な酵素開裂性基を開裂させる。
【００２８】
β−グルコシダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、β−グルコシダーゼ開裂性基、たとえばグルコシダーゼを含むジオキセタン、たとえばナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンのエステル基を開裂させる。プロテアーゼ及びホスホリパーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンに結合した適当な酵素開裂性基を開裂させる。
【００２９】
レポーター酵素が使用されるとき、それは、好ましくは、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエステラーゼ、酸ホスファターゼ及びグルコシダーゼからなる群より選択される。より好ましいアッセイでは、レポーター酵素はルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼである。
【００３０】
好ましくは、検出される内在性酵素は、細胞により、使用される特定の化学発光系及び計器によって検出可能な量で産生される。当業者は、適切な内在性酵素を容易に選択することができる。有用な内在性酵素の例は、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼを含む。好ましい内在性酵素は、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ及びガラクトシダーゼである。もっとも好ましい内在性酵素はグルコシダーゼである。
【００３１】
サンプルの単一のアリコート中の２種以上の内在性酵素の活性を計測することが望ましいかもしれない。本発明は、そのような計測を実施するために容易に使用することができる。計測される酵素のすべてが内在性酵素であるアッセイの例は、アルカリホスファターゼ及びエステラーゼ、酸ホスファターゼ及びアルカリホスファターゼ、プロテアーゼ及びアルカリホスファターゼならびにホスホリパーゼ及びアルカリホスファターゼを含む。
【００３２】
本発明において、酵素、すなわちレポーター酵素及び内在性酵素の基質は、光信号を発することができる発光基質を含む。好ましくは、酵素ごとに基質は異なり、少なくとも１種の基質は、置換又は非置換のアダマンチル基、置換されていてもよいし非置換であってもよいＹ基及び酵素開裂性基を含むジオキセタン類である。好ましいジオキセタン類の例は、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕−デカン〕−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton（登録商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１3.7〕デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））、二ナトリウム６−（４−メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン〕−４−イル）−２−フェニルベンゾチアゾリル−４−ホスフェート、二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（CDP-Star（登録商標））、ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glucon（商標））、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン）−４−イル）フェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Star）、二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン）−４−イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）、二ナトリウム３−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン）−４−イル）−１−フェニルホスフェート（ＣＤＰ）、二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート（ＡＭＰＰＤ）、CDP-Star（登録商標）及び二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（ADP-Star）を含む。これらの基質は、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００３３】
好ましくは、ジオキセタン含有基質は、式Ｉ
【００３４】
【化３】
【００３５】
（式中、
Ｔは、炭素原子６〜１２個を環中に有する置換又は非置換のシクロアルキル環又は２個以上の縮合環を有し、各環が、独立して、炭素原子５〜１２個を有するポリシクロアルキル基であり、Ｔは、スピロ結合（たとえばクロロアダマンチル又はアダマンチル基）によって４員ジオキセタン環に結合しており、
Ｙは、蛍光クロモフォアであり、
Ｘは、水素、炭素原子１〜７個を有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキルもしくはヘテロアルキル基（たとえばメトキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシエチル、トリフルオロエトキシ又はヒドロキシプロピル）、少なくとも１個の環を有するアリール基（たとえばフェニル）、少なくとも１個の環を有するヘテロアリール基（たとえばピロリル又はピラゾリル）、炭素原子２〜７個を環中に有するヘテロアルキル基（たとえばジオキセタン）、少なくとも１個の環を有するアラルキル基（たとえばベンジル）、少なくとも１個の環を有するアルカリール基（たとえばトリル）又は酵素開裂性基（すなわち、酵素によって開裂されると、ジオキセタンに結合した電子リッチな基を生じることができる部分を有する基、たとえば、リン−酸素結合を酵素、たとえば酸ホスファターゼもしくはアルカリホスファターゼによって開裂させて、ジオキセタン又はＯＲに結合した負の電荷を帯びた酸素を生じることができるホスフェート）であり、
Ｚは、水素、ヒドロキシル又は酵素開裂性基（上記のとおり）である。
ただし、Ｘ又はＺの少なくとも一方が酵素開裂性基でなければならず、負の電荷を帯びた基が基Ｙを含む）
を有する。発光信号は、対応する酵素の活性の指標として検出される。発光の強さを計測することにより、対応する酵素の活性を測定することができる。
【００３６】
ＸがＯＲであるとき、基Ｒは、炭素原子１〜２０個の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル、アリール、シクロアルキル又はアリールアルキルである。Ｒは、Ｐ、Ｎ、Ｓ又はＯであることができる１又は２個のヘテロ原子を含むことができる。置換基Ｒはハロゲン化されている。ハロゲン化の程度は、アダマンチル基、アリール基上の置換基の選択及び想定される特定の用途に望まれる酵素反応速度に応じて異なる。もっとも好ましくは、Ｒはトリハロアルキル基である。好ましい基は、トリハロ低級アルキル基、たとえばトリフルオロエチル、トリフルオロプロピル、ヘプタフルオロブチロール、ヘキサフルオロ−２−プロピル、α−トリフルオロメチルベンジル、α−トリフルオロメチルエチル及びジフルオロクロロブチル基を含む。置換基Ｒの炭素原子は、ハロゲンによって部分的又は完全に置換されていてもよい。Ｒがアリールであるとき、好ましい基は、１個以上のクロロ、フルオロ又はトリフルオロメチル基によって置換されているフェニル環、たとえば２，５−ジクロロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，３，５−トリフルオロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニル又は３−トリフルオロメチルフェニルを含む。フッ素及び塩素が特に好ましい置換基であるが、特殊な状況では臭素及びヨウ素を用いてもよい。
【００３７】
基Ｙは、酵素開裂性基Ｚに結合した蛍光クロモフォア又はフルオロフォアである。Ｙは、基Ｚの酵素開裂によって生じるジオキセタン分解によって発光する。Ｚが開裂すると、電子リッチな基が形成し、それがジオキセタンを不安定化して、その分解を招く。この分解は、２種の別個のカルボニル化合物を生じさせ、その一方が基Ｔを含み、その他方が基Ｘ及びＹを含む。分解から放出されるエネルギーが、Ｘ及びＹ基を含む化合物をして発光させる（基Ｘが水素であるならば、アルデヒドが生成される）。Ｙは、好ましくはフェニル又はアリールである。アリール基は、式Ｉにおけるように基Ｚを有し、さらに、米国特許第５，５８２，９８０号に記載のように１〜３個の電子活性基、たとえば塩素又はメトキシを有する。
【００３８】
いかなるクロモフォアをＹとして使用してもよい。一般に、感度を増すため、量子収率を最大限にするクロモフォアを使用することが望ましい。したがって、Ｙは普通、芳香族基を含む。適当なクロモフォアの例は、米国特許第４，９７８，６１４号でさらに記載されている。
【００３９】
結合した基Ｚは、酵素開裂性基である。酵素との接触すると、基Ｚは開裂し、それにより、クロモフォアＹに結合した電子リッチな基を生じさせる。この電子リッチな基が、ジオキセタンを２種の別個のカルボニル含有化合物、たとえば、基Ｘが水素である場合には、ケトン又はエステルとアルデヒドとに分解させる。電子リッチな基の例は、酸素、硫黄及びアミンもしくはアミノアニオンを含む。もっとも好ましい基は酸素アニオンである。適当なＺ基の例及びそれらの基に特異的な酵素は、引用例として本明細書に取り込む米国特許第４，９７８，６１４号の表１に掲載されている。このような酵素は、アルカリ及び酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼ、Ｄ，β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ及びトリプシンを含む。
【００４０】
本発明のジオキセタン類はまた、基Ｔ、Ｙ及びＸのいずれかに付いた１個以上の可溶化置換基を含むことができる。可溶化置換基とは、水溶液へのジオキセタンの溶解性を高める置換基である。可溶化置換基の例は、カルボン酸、たとえば酢酸、スルホン酸、たとえばメタンスルホン酸及び第四級アミノ塩、たとえば臭化アンモニウムを含む。もっとも好ましい可溶化置換基は、メタン又はエタンスルホン酸である。
【００４１】
本発明の実施で有用である他のジオキセタン類は、すべて引用例として本明細書の取り込む米国特許第５，０８９，６３０号、米国特許第５，１１２，９６０号、米国特許第５，５３８，８４７号及び米国特許第５，５８２，９８０号に記載され、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００４２】
本発明のアッセイの基質を加える順序は、使用される酵素に依存して異なる。特定の実施態様では、第一のレポーター酵素基質と内在性酵素の基質とを同時に加える。他の実施態様では、第一のレポーター基質ののち、内在性酵素の基質を加える。
【００４３】
好ましくは、計測される第二の酵素の活性を定量する前に、計測される第一の酵素の活性を低下させる。第一の酵素の活性を低下させることは、第一の酵素を実質的に不活性化するか、第一の酵素基質の量を減らすことを含む。
【００４４】
正確なアッセイを得るためには、第一の酵素基質の分解によって生じる光信号が、第二の酵素による第二の酵素基質の分解によって生じる光信号の定量を妨害してはならない。これは、第一の基質の分解によって生じる光信号を計測したのち、第二の酵素の活性を定量する前に、第一の酵素の基質によって生じる信号を減らすことによって達成される。
【００４５】
他の実施態様では、第一の酵素の活性を低下させることにより、たとえば第一の酵素とその基質の反応を、第一の酵素の基質が実質的に分解するまで進行させることにより、第一の酵素の基質から生じる信号を減らす。すなわち、第二の酵素、たとえば内在性酵素の活性化又は増強の前に、第一の基質の分解によって生じる光信号を減衰させる。
【００４６】
他の実施態様では、第一の基質の量を減らすことによって第一の酵素の基質によって生じる信号を減らす。適切な方法は、当業者が、使用される具体的な酵素及び基質に基づいて選択することができる。しかし、一つのそのような実施態様では、好ましくは、第一のレポーター酵素の定量後に残留する第一の基質を分解させるの十分な量の第一の酵素をさらに加えることにより、基質濃度を低下させる。たとえば、第一の酵素、たとえばアルカリホスファターゼによる第一の基質の分解から生じる光信号を計測したのち、残留する基質を分解させ、潜在的に妨害性の光信号を防ぐのに十分な量のアルカリホスファターゼをアリコートに加える。第二の基質は第二の酵素に対して特異的であるため、過剰な第一の酵素の存在が第二の光信号の検出を妨害することはない。すべての酵素のためにジオキセタン基質が使用されるとき、これは有用である。
【００４７】
異なる実施態様では、第一の基質の量を減らすことは、アリコートを加熱して第一の基質を分解させることを含む。熱不活性化は、第一の基質の不活性化に続いて第二の基質を加える実施態様で使用することが好ましい。
【００４８】
さらに好ましい実施態様では、適切な計器、たとえば、米国特許出願第６０／１４４，８９１号に開示されている、本譲受人のNorthStar（商標）計器を使用して信号の同時計測を実施することができる。同出願を引用例として本明細書に取り込む。
【００４９】
レポーター酵素、たとえばルシフェラーゼ及び内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼを計測する本発明の一つの実施態様では、基質ルシフェリン（Dual-Light（登録商標）試薬）の添加ののち、まずルシフェラーゼ信号を計測する。ルシフェラーゼ信号の減衰ののち、内在性酵素（ＡＰ）の基質及び適切なエンハンサーを含む内在性酵素（ＡＰ）検出バッファ（CDP-Star（登録商標）基質／Sapphire-II（商標）エンハンサー溶液）を加え、内在性ＡＰ触媒光放出を計測する。試薬添加から１５分以内にＡＰ反応からの光放出が最大値に達する。このアッセイの結果を図１に示す。あるいはまた、望むならば、ルシフェラーゼ信号を減らすため、ＡＰ検出バッファを早めに、たとえばルシフェラーゼを計測した直後に加えることもできる（図示せず）。
【００５０】
レポーター酵素、たとえばβ−ガラクトシダーゼ及び内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼを計測する本発明のもう一つの好ましい実施態様では、レポーター酵素の基質（Galacton（登録商標）基質）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートする。次に、エンハンサー（Sapphire-II（商標））含有促進物質を各ウェルに注入し、β−ガラクトシダーゼ触媒光放出を計測する。β−ガラクトシダーゼ信号の減衰ののち、ＡＰの基質（CDP-Star（登録商標））を加え、内在性ＡＰ触媒光放出を計測する。このアッセイの結果を図２に示す。
【００５１】
２種以上のレポーター酵素、たとえば２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する発明のアッセイの特定の実施態様では、第一のレポーター酵素の活性の定量の間に第一及び第二のレポーター基質がいずれもアリコート中に存在する。これらの実施態様では、第二のレポーター酵素及びその基質の存在が、第一のレポーター酵素の活性又は第一のレポーター酵素による第一の基質の分解によって生じる光信号の計測を妨害することはない。一つの好ましい実施態様では、第一の基質の分解によって生じる光は、第二の基質の分解の産物が光を生じさせないpHで起こる。このような実施態様では、アリコートの環境がこの第二の酵素反応の産物による発光を阻害するため、第一の定量の間に第二の基質との酵素反応の産物が計測可能な信号を発することはない。たとえば、第一の基質の分解による発光の計測は、中性pHで起こることが好ましい。第一のレポーター酵素がその基質に作用する間に、第二のレポーター酵素はその基質に作用する。しかし、このpHでは、第二のレポーター酵素とその基質との反応から有意な発光は起こらない。pHを上げ、第二の酵素反応の発光を計測する前に所定の期間を経過させて、その反応の産物を蓄積させ、それにより、さらに強い光信号を生じさせることが好ましい。
【００５２】
他の実施態様では、第二の酵素の存在が、第一の酵素反応からの光信号の計測を妨害しない。理由は、第二の酵素の基質がこの計測中にアリコート中に存在しないからである。そのような実施態様では、第二の酵素は活性であるが、それが作用することができる基質が存在しない。一つの好ましい実施態様では、第一のレポーター酵素の活性を低下させたのち又は第一の酵素反応によって生じる信号を減少させたのち、第二の基質を加えることにより、第二の酵素の活性を誘発する。たとえば、β−ガラクトシダーゼを第一の酵素として使用し、アルカリホスファターゼを第二の酵素として使用するアッセイでは、β−ガラクトシダーゼ反応の結果として起こる発光は、中性よりも高いpHで最適化される。上げられたpHは、第二の酵素、アルカリホスファターゼを同時に活性化し、それが光を生じさせ、その光が第一の酵素の活性の定量を妨害することになる。したがって、そのようなアッセイでは、第一の定量に続いて第二の基質を加える、もっとも好ましくは、光信号が減衰した後で第二の基質を加えることが好ましい。この添加は容易に達成され、当該技術で一般に知られる検出装置を使用する場合、特に簡単である。
【００５３】
２種以上のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する好ましい実施態様では、第二のレポーター酵素基質からの光放出の減衰ののち、内在性酵素の基質を加える。好ましくは、内在性酵素の基質が光放出を開始させる。あるいはまた、第二のレポーター酵素の計測の前の時点で内在性酵素の基質を加え、先に述べた方法、たとえばpHを変化させることによって内在性酵素の活性を高める。
【００５４】
本発明の特定の好ましい実施態様では、水溶性ポリマー性エンハンサー分子を、基質の酵素的分解によって生じる光信号に加える。好ましいポリマーエンハンサーは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン及びポリマー第四級オニウム塩を含む。好ましいポリマー第四級オニウム塩の例は、ポリビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire-I（商標））、ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド及びポリビニルトリブチルスルホニウムクロリドを含む。他のポリマーエンハンサーは、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald（登録商標））、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald II（登録商標））を含む。これらのエンハンサーは、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００５５】
他の実施態様では、第二の酵素の活性を定量する前に促進物質溶液を加える。好ましい促進物質溶液は、酵素による基質の分解からの信号発生を活性化することができる、約８〜約１４のpHの水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む。１種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素しか使用しない実施態様では、促進物質溶液が、内在性酵素による内在性基質の分解によって生じる信号を活性化し、第一のレポーター酵素を不活性化する。２種以上のレポーター酵素を有する実施態様では、第二のレポーター酵素の定量の前に促進物質溶液を加えると、それが、第二のレポーター酵素基質の分解によって生じる信号を活性化し、第一のレポーター酵素を不活性化する。
【００５６】
特定の内在性酵素を計測するとき、細胞をさらに処理することが必要になるかもしれない。たとえば、細胞又は血清中に多量に存在する内在性酵素を計測するとき、バックグラウンドレベルが高すぎて正確な読みを出すことができないおそれがある。そのような場合、アッセイの前に細胞を洗浄することが好ましい。当業者は、どの内在性酵素が洗浄を要するのかを容易に決定することができ、適切な洗浄溶液、たとえばＰＢＳを決定することができるであろう。たとえば、ＡＰを計測するアッセイでは、アッセイの直前に細胞をＰＢＳで一度洗浄する。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、第一の基質の存在が、第二のレポーター酵素又は内在性酵素の基質の分解によって生じる光信号を増強する。この増強した信号が、より高感度なアッセイを提供する。本発明者は理論によって拘束されることを意図しないが、第二の基質の分解によって生じるエネルギーが残りの第一の基質に伝達され、それにより、生じる光信号の強さを増強すると考えられる。この方法の一つの好ましい実施態様では、第一の基質はルシフェリンである。この実施態様では、第二の酵素の基質は、好ましくはジオキセタン基質である。ルシフェリンは非常に効率的なエネルギー受容体であり、ジオキセタン分解から発生する励起状態からのエネルギー伝達の結果として光信号を放出すると考えられる。これが、より大きな信号強さを生じさせる。
【００５８】
本発明の特定の好ましい実施態様はさらに、レポーター酵素又は内在性酵素によるジオキセタン基質の酵素的分解から生じる光信号を増強する水溶性エンハンサー分子を加えることを含む。
【００５９】
一般に高分子性である特定の水溶性天然及び合成物質が、一部には疎水性環境を提供することにより、化学発光信号の強さを増強する。これらの物質、たとえば、疎水性領域を含む水溶性球状タンパク質、哺乳動物血清アルブミン、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は水溶性ポリマー性第四級オニウム塩、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire-I（商標））ならびにポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドは、水溶液中の酵素的に開裂可能な１，２−ジオキセタン類の分解によって生じる化学発光信号の強さを増大させる。コポリマー、たとえば水溶性第四級アンモニウム−ホスホニウム、アンモニウム−スルホニウム及びスルホニウム−ホスホニウムポリマーがエンハンサー分子として有用である。他の好ましいエンハンサーは、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド、フルオレセインナトリウム（Emerald（登録商標））、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びフルオレセインナトリウム（Emerald II（商標））を含む。
【００６０】
有効量のエンハンサー物質の存在のおかげで、水性媒体中で放出される光の強さは、そのようなエンハンサーの不在で放出される光の強さに比べて有意に増大する。これらの化合物は、１，２−ジオキセタン類からの化学発光信号の強さを少なくとも１０％、普通は少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１０〜１，０００倍に増強する。
【００６１】
そのようなエンハンサー物質に含まれるものは、疎水性領域を含む高分子球状タンパク質、一般には、ＳＤＳゲル電気泳動による測定で約１０００〜約６００，０００ダルトンの範囲の分子量を有するものである。そのような物質は、哺乳動物血清アルブミン、たとえばＢＳＡ、ＨＳＡなど、球状タンパク質、たとえば哺乳動物ＩｇＧ、ＩｇＥ、タンパク質Ａ、アビジンなど及び血清リポタンパク質、アポリポタンパク質などを含む。
【００６２】
本発明を実施する際に使用することができる合成オリゴマー又はポリマーエンハンサー物質は、一般式II
【００６３】
【化４】
【００６４】
（式中、Ｅ＋は、Ｐ、Ｎ又はＳであることができる）
を有する水溶性ポリビニルアリール第四級オニウム塩、たとえばポリビニルベンジル第四級アンモニウム、スルホニウム及びホスホニウム塩を含む。
【００６５】
この式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3それぞれは、炭素原子１〜２０個を有する直鎖状又は分岐鎖状の非置換アルキル基、たとえばベンジル、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、セチルなど、１個以上のヒドロキシ、アルコキシ、たとえばメトキシ、エトキシ、ベンジルオキシもしくはポリオキシエチルエトキシ、アリールオキシ、たとえばフェノキシで置換されている、炭素原子１〜２０個を有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、アミノもしくは置換アミノ、たとえばメチルアミノ、アミノ、たとえばアセトアミドもしくはコレステリルオキシカルボニルアミド、又はフルオロアルカンもしくはフルオロアリール、たとえばヘプタフルオロブチル基、環炭素原子３〜１２個を有する非置換モノシクロアルキル基、たとえばシクロヘキシルもしくはシクロオクチル、１個以上のアルキル、アルコキシ又は縮合ベンゾ基で置換されている、環炭素原子３〜１２個を有する置換モノシクロアルキル基、たとえばメトキシシクロヘキシルもしくは１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アルコキシ又はアリール基で置換されている、それぞれが炭素原子５〜１２個を有する２個以上の縮合環を有するポリシクロアルキル基、たとえば１−アダマンチルもしくは３−フェニル−１−アダマンチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アリール、又はフルオロアルカンもしくはフルオロアリール基で置換されている、少なくとも１個の環及び全部で６〜２０個の炭素原子を有するアリール、アルカリールもしくはアラルキル基、たとえばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジルもしくはデヒドロアビエチルであり、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の少なくとも二つが、それらが結合する第四級原子といっしょになって、炭素原子３〜５個及びヘテロ原子１〜３個を有し、ベンゾアニル化されていてもよい、飽和又は不飽和の、非置換又は置換されている窒素含有環、窒素及び酸素含有環又は窒素及び硫黄含有環、たとえば１−ピリジル、１−（３アルキルもしくはアラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、ピペリジノもしくはアシルピペリジノ、ベンゾオキサゾール、ベンズチアゾール又はベンゾアミダゾールを形成することができる。
【００６６】
記号Ｘ-は、ハライド、すなわちフルオリド、クロリド、ブロミドもしくはヨージド、スルフェート、アルキルスルホネート、たとえばメチルスルホネート、アリールスルホネート、たとえばｐ−トルエンスルホネート、置換アリールスルホネート、たとえばアニリノナフチレンスルホネート（種々の異性体）、ルシファーイエローＣＨ及びジフェニルアントラセンスルホネート、ペルクロレート、アルカノエート、たとえばアセテート、アリールカルボキシレート、たとえばフルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、ベンゾ複素環式アリールカルボキシレート、たとえば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボキシレートもしくは置換モノアリールオキシホスフェート、たとえば３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンジアニオンもしくは上記式Ｉで示す他のジアニオンのような基を単独で又は組み合わせて含むことができる対イオンを表す。
【００６７】
記号ｎは、そのようなポリビニルベンジル第四級オニウム塩の分子量が、固有粘度又はＬＡＬＬＳ技術による測定で、約８００〜約２００，０００、好ましくは約２０，０００〜約７０，０００の範囲になるような数を表す。
【００６８】
そのような水溶性ポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）の代表例は、ＴＭＱ、ＢＤＭＱなどである。
【００６９】
Bronstein-Bonteらの米国特許第４，１２４，３８８号に開示され、特許請求されている、式III
【００７０】
【化５】
【００７１】
（式中、Ｅ＋は、Ｐ、Ｎ又はＳであることができ、各Ｒ4は、同じ又は異なる脂環式置換基であり、Ｘ-は、アニオンである）
を有する、ポリビニルアセタールとホルミルベンジル第四級オニウム塩との水溶性アセタール。また、上記式IIのポリビニルベンジル第四級オニウム塩を調製するために使用される個々のビニルベンジル第四級オニウム塩モノマーを、ポリマーが式IIIに示されている他のビニルベンジル第四級オニウム塩モノマー又は第四級オニウム官能基を有しない他のエチレン性不飽和モノマーとで共重合させて、Landらの米国特許第４，３２２，４８９号、Bronstein-Bonteらの米国特許第４，３４０，５２２号、Landらの米国特許第４，４２４，３２６号、Bronstein-Bonteらの米国特許第４，５０３，１３８号及びBronstein-Bonteの米国特許第４，５６３，４１１号に開示され、特許請求されているポリマーを得ることもできる。これらのポリマーすべては、本発明を実施する際にエンハンサー物質として使用することもできる。好ましくは、これらの第四級化ポリマーは、式IIIのポリビニルベンジル第四級アンモニウム塩に関して上記した範囲内の分子量を有する。
【００７２】
他の水溶性オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマー物質は、前記ポリマーに加えて、又はその代わりにエンハンサー物質として使用することができ、米国特許第５，１４５，７７２号にさらに記載され、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００７３】
使用されるエンハンサー物質の量は、選択される特定のエンハンサー物質ならびに存在する化学発光化合物の量及びタイプに応じて異なる。必要な量は、当業者が本教示に基づいて容易に決定することができる。さらには、米国特許第５，１４５，７７２号に含まれる開示が、本発明を実施する際に当業者を支援するであろう。
【００７４】
エンハンサー分子は、本発明のいかなる時点で加えることもできる。第二の基質ではなく第一の基質がジオキセタン類であるならば、エンハンサーは、第一の酵素の定量の前又はそれと同時に加えることが好ましい。第一の基質ではなく第二の基質がジオキセタン類であるならば、エンハンサーは、いつ加えてもよいが、好ましくは、第一の酵素の定量ののち、第二の酵素の定量の前又はそれと同時に加える。第一及び第二の基質がいずれもジオキセタン類であるならば、エンハンサー分子は、定量の前又は第一の定量と同時に加えることが好ましい。この最後の実施態様では、一つのエンハンサーを使用して、両方の酵素基質の分解によって生じる光信号を増強することができる。あるいはまた、酵素基質ごとに異なるエンハンサーが使用される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施態様では、第一の酵素の基質によって生じる光信号の定量ののち、一部には、第一の基質によって生じる光信号を減衰させるためのインキュベーション期間がある。インキュベーション期間の長さは、第一のレポーター酵素の濃度及び基質によって生じる光信号の半減期に依存して異なる。第一の酵素が高濃度で存在するならば、それが、後続の低レベルの酵素の定量を妨害するおそれがある。長めのインキュベーション期間は、第一のレポーター酵素の基質から残留する光信号を低下させる。本発明の教示を考慮すると、適切なインキュベーション期間の長さは、当業者が容易に決定することができる。
【００７６】
本発明の方法は、一つのサンプルアリコート中の多種の酵素の活性を順次に検出するための高速で高感度の非アイソトープ的方法を提供する。具体的には、本発明はまた、一つのサンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を計測する方法に関する。この方法は、第一の酵素による第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第一の酵素の活性を定量することと、次いで、内在性酵素による第二の基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第二の酵素の活性を定量することとを含み、両定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して実施される。基質から生じる発光信号の強さは、酵素の活性、すなわち、その基質を分解させる能力に換算した酵素の有効性及び／又は存在する酵素の量の関数である。
【００７７】
好ましい実施態様では、サンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素は、少なくとも１種のレポーター遺伝子産物及び少なくとも１種の内在性酵素である）の活性を計測する方法は、第一のレポーター酵素の基質である第一基質及び内在性酵素の基質である第二の基質を細胞抽出物アリコートに加えることを含む。この好ましい実施態様では、第一の基質はルシフェリンであり、第二の基質はジオキセタン類を含み、内在性酵素は加水分解酵素である。まず、第一のレポーター酵素の活性を計測する。次に、エンハンサー分子を含む促進物質溶液を加える。促進物質溶液は、第一のレポーター酵素を実質的に不活性化し、同時に、内在性酵素の基質の化学発光信号を増大させる。次に、内在性酵素の基質を加え、内在性酵素の活性を計測する。好ましくは、第一のレポーター酵素はルシフェラーゼであり、内在性酵素は、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼからなる群より選択される。より好ましい内在性酵素はアルカリホスファターゼである。
【００７８】
本発明の方法は、少なくとも１種のレポーター遺伝子でトランスフェクトされた細胞の転写活性を計測し、細胞にとって内在性の少なくとも１種の酵素を計測することによって細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性の計測を可能にするのに特に有用である。
【００７９】
細胞のトランスフェクションは、当該技術で公知の方法によって達成される。たとえば、Alam, J. and Cook, J. K., Anal. Bioch. 188:245-254(1990)を参照。少なくとも３種の酵素、すなわち少なくとも２種のレポーター酵素及び内在性酵素を計測する本発明の実施態様では、細胞を、それぞれが異なるレポーター遺伝子を有する２種の別々のプラスミドのＤＮＡ混合物で同時にトランスフェクトする。一方のプラスミドは、既知の制御プロモーターによって調節されるレポーター遺伝子を有する。このレポーター遺伝子が対照として働く。第二のプラスミドは、研究される調節領域によって制御される第二のレポーター遺伝子を有する。各レポーター遺伝子のトランスフェクションは、その産物、すなわち「レポーター酵素」の活性を計測することによって分析される。第二のレポーター酵素の活性は通常、第一のレポーター酵素の活性に対して正規化される。同上２４９を参照。
【００８０】
本発明の特定の方法では、第二の酵素の活性を、その基質の分解によって生じる光信号を計測する前に変調させる。第二の酵素の活性は、内在性酵素の基質を加えるか、内在性酵素を活性化することによって変調させる。特定の実施態様では、第二の酵素の活性は、上記で論じたように、アリコートのpHを上げることによって変調させる。
【００８１】
特定の好ましい実施態様では、多種の酵素の活性を計測する方法は、第一のレポーター酵素の定量ののち、酵素検出バッファを添加することをさらに含む。好ましくは、酵素検出バッファは、第二の酵素の基質及びエンハンサーを含む。酵素検出バッファはまた、以下さらに記載するように、促進物質溶液、すなわち高pHバッファ中のエンハンサーを含むことができる。
【００８２】
加えて、本発明は、同じサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素は、３種以上のレポーター遺伝子産物及び内在性酵素を含む）の活性を計測する方法を提供する。多数の要因、たとえばサンプルの入手性、計器及び試薬の入手性が、使用される細胞抽出物のアリコートの量を決定する。好ましくは、細胞抽出物アリコートの量は、抽出物を保持するために使用される装置又はプレートの大きさ、信号を測定するための装置、環境条件ならびに当業者には周知である他のパラメータに基づいて決定される。
【００８３】
本発明の方法は、いかなるルミノメータで実施することもできるが、自動インジェクタを有するルミノメータ又は光放出の計測を可能にする他の計器で実施することが好ましい。本方法はまた、一つのインジェクタを備えたルミノメータで実施することもできる。試薬をサンプルに添加したのちほぼ同じ時間間隔をおいた後で各サンプルの光信号を計測するならば、本方法は、手動注入を使用して実施することもできる。前記のように、酵素の活性は、使用される計器に依存して、順次に検出することもできるし、同時に検出することもできる。
【００８４】
一つの好ましい実施態様では、本方法は、まず、第一の基質の分解によって生じる光信号を計測することによって細胞抽出物アリコート中の第一のレポーター酵素の活性を定量することと、次いで、第一のレポーター酵素の活性を低下させることとを含む。次に、第二の基質の分解によって生じる光信号を計測することにより、細胞抽出物アリコート中の第二のレポーター酵素の活性を定量する。好ましくは、第二の酵素は、ジオキセタン類と反応することができる加水分解酵素である。第二の酵素は、いかなる酵素であることもできるが、好ましくは、以下の酵素、すなわち、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ及びカルボキシルエステラーゼから選択される。もっとも好ましい実施態様は、第二の酵素がβ−ガラクトシダーゼを含む実施態様である。そして、内在性酵素の基質の分解によって生じる光信号を計測することにより、同じ細胞抽出物アリコート中の内在性酵素の活性を定量する。すべての定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して順次に実施される。
【００８５】
もう一つの実施態様で、第一及び第二のレポーター基質及び内在性酵素基質は異なり、基質の少なくとも１種がジオキセタン類である。本発明は、第二のレポーター酵素による第二のレポーター基質の分解によって生じる信号を誘発することと、次いで、内在性酵素の活性を誘発することとをさらに含む方法を含む。
【００８６】
２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する方法の一つの実施態様では、第一のレポーター酵素の基質及び第二のレポーター酵素の基質である第二の基質を細胞抽出物アリコートに加える。好ましい実施態様では、第一の酵素はルシフェラーゼであり、第二の酵素は加水分解酵素であり、第一の基質はルシフェリンであり、第二の基質はジオキセタン類である。レポーター酵素は、好ましくは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエステラーゼ及びルシフェラーゼから選択される。より好ましいレポーター酵素はルシフェラーゼである。
【００８７】
この好ましい実施態様では、第一の酵素の基質を第二の酵素の基質と同時に加え、第二の酵素の基質を同時に加える間にルシフェラーゼ−ルシフェリン反応から生じる光信号を計測することにより、第一のレポーター酵素の基質によって生じる化学発光信号を計測する。次いで、アリコートのpHを上げることによって第一のレポーター酵素を実質的に不活性化する促進物質溶液を加える。すると、アリコートのpHの上昇が、第二のレポーター酵素−第二の基質反応の蓄積生成物からの発光を活性化する。促進物質溶液は、上述したように第二のレポーター酵素のジオキセタン基質の分解によって生じる光信号を増強するエンハンサー、たとえばポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドを含む。そして、同じ細胞抽出物アリコート中で化学発光信号の強さを読むことにより、第二のレポーター酵素の活性を計測する。ルシフェリンが第一の基質として使用される実施態様では、この基質の存在が、第二の基質によって生じる光信号をさらに増強する。好ましい実施態様では、第二のレポーター酵素からの光放出の減衰ののち、１，２−ジオキセタン基質を加えて内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼからの光放出を開始させる。この例では、基質はCDP-Star（登録商標）１，２−ジオキセタンである。この順次検出プロトコルは、一つの細胞抽出物サンプルの単管／ウェルアッセイで、２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素を含む３種の酵素の活性の検出を可能にする。
【００８８】
図３は、ルシフェリン、Galacton（登録商標）及びCDP-Star（登録商標）をそれぞれ用いるルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼの活性の順次検出を示す。アッセイは、以下、例３で記載するように、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素及び内在性アルカリホスファターゼ活性を含み、精製ルシフェラーゼを添加されているΨ２ＢＡＧα及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞抽出物の混合物を用いて実施した。抽出物混合物及びルシフェラーゼ添加量を調節して、酵素ごとに類似した光の強さを生成した。まず、ルシフェリン基質及びGalacton（商標）基質の添加ののち、ルシフェラーゼ触媒光放出を計測した。ルシフェラーゼ信号の減衰中にGalacton（登録商標）基質のβ−ガラクトシダーゼ触媒開裂が進行し、促進物質、エンハンサーを含有する高pH溶液の添加によってGalacton（登録商標）アニオン中間体の分解からの光放出を誘発した。β−ガラクトシダーゼ信号の十分な減衰ののち、CDP-Star（登録商標）を加えると、それが、アルカリホスファターゼによって触媒されるグロー光放出反応を誘発する。また、内在性アルカリホスファターゼの直前にルシフェラーゼの検出を実行した（図１）。
【００８９】
２種以上のレポーター酵素、たとえば２種のレポーター酵素を使用する本発明の実施態様では、アリコート中の第二のレポーター酵素の存在が第一のレポーター酵素の活性又はその第一の酵素によって生じる光信号の計測を妨害してはならない。これらの実施態様では、本方法はさらに、第一の酵素の活性を定量したのち第二のレポーター酵素の酵素活性を高めることを含む。これは、酵素活性を活性化する当該技術で公知の方法によって達成することができる。特に好ましい実施態様では、アリコートのpHを調節して、第二の定量の前に第二の酵素が活性になる環境を創り出す。たとえば、アルカリホスファターゼを第二のレポーター酵素として使用する実施態様では、アルカリホスファターゼの活性はアルカリ性pHで高まるため、アリコートのpHを上げる。
【００９０】
いくつかの好ましい実施態様では、第一のレポーター酵素を実質的に不活性化することにより、第一の酵素の基質から生じる信号を減らす。第一の酵素を実質的に不活性化する方法は当該技術で公知である。しかし、これらの方法は、第二の酵素の活性の計測を妨害してはならない。たとえば、一つの実施態様では、アリコートのpHを変化させることにより、第一の酵素を実質的に不活性化する。酵素に依存して酸又は塩基をアリコートに加えることによってpHを変化させて、第一の酵素にとって厳しい環境を提供することができる。好ましくは、アリコートのpHを上げる。この上げられたpHが第一の酵素を不活性化し、それにより、第一の酵素がその基質をさらに分解し、光信号を発することを防ぐ。もう一つの実施態様では、アリコートを加熱して第一の酵素を分解させる。あるいはまた、特定の阻害剤を加えて第一の酵素を不活性化することもできる。阻害剤の例は、アルコール、たとえばイソプロパノールもしくはエタノール、界面活性剤、たとえばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）又は酵素に結合し、酵素を不活性化する基質類似物を含む。
【００９１】
上述したように、本発明の方法は、内在性酵素の活性を計測する。本方法は、サンプル中に存在するレポーター酵素の活性から独立して細胞数の計測を提供することにより、アッセイにおける細胞の正規化を可能にする。本方法はまた、同じくレポーター酵素の活性から独立して、試験条件によって影響されるおそれのある細胞増殖の観察を可能にする。たとえば、非特異的効果を生じさせる特定の化合物、たとえば成長因子を細胞に加える場合、レポーター構築物を制御する機能とは違って、正常な細胞機能が生じることを確認することが望ましい。本発明の方法はこの確認を可能にする。
【００９２】
最後に、試験条件、すなわち潜在的薬物、温度又はpHの変化などの細胞毒性効果を本発明の方法によって評価することができる。細胞毒性の一つの測定は、細胞から培地の中に解放される内在性酵素の活性の量又は変化を計測することによって得ることができる。加えて、存在する生きた細胞の指標として酵素活性を計測することにより、細胞毒性を潜在的に測定することができる。これは、細胞毒性の一つの計測値である細胞溶菌の測定を提供する。そのようなアッセイは、培地中に存在する細胞とで本発明の方法を使用して実施することができる。
【００９３】
本発明はまた、一つのサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素の少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を検出するためのキットを提供する。このようなキットは、各酵素を定量するための試薬と、各酵素の基質（基質の少なくとも１種はジオキセタン類である）とを含む。キットはまた、水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む促進物質溶液を含むことができる。場合によっては、促進物質溶液は、pHを上げ、第一の酵素の活性を低下させ、第二の酵素による第二の基質の酵素的分解から生じる信号を増大させるか（たとえば三酵素アッセイの場合）、第一のレポーター酵素の活性を低下させ、内在性酵素の基質の分解によって生じる信号を増大させる（たとえばレポーター／内在性酵素アッセイの場合）ため、約８〜約１４のpHの水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む。
【００９４】
ポリマー性エンハンサーは、好ましくは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン又はポリマー第四級オニウム塩を含む。ポリマー第四級オニウム塩は、ポリビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire（商標））もしくはポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald（登録商標））ならびにポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald II（登録商標））を含む。好ましいポリマーエンハンサーは、ポリビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire（商標））又はポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドを含む。
【００９５】
以下の例は、本発明を例示するために提供するが、本発明の範囲をいかなるふうにも限定することを意図しない。
【００９６】
例
試薬、セルライン及び計器
溶菌溶液、CDP-Star（登録商標）、Galacton（登録商標）及びSapphire-II（商標）及びポリマー性エンハンサー、Phospha-Light（商標）アッセイバッファ、Dual LightバッファＡ及びＢならびにプラスミドｐＣＭＶ／β−Ｇａｌを含むアッセイ試薬がTropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００９７】
セルラインは、Ψ２ＢＡＧα（CRL-9560、ATCC、Rockville, MD）、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養された安定に挿入されたレトロウイルス構築物からバクテリアβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＮＩＨ／３Ｔ３誘導体及びＡＰ３Ｔ３ｂ（O' Connor, K. L., et al., Biotechniques, 1994; 17: 502-9）、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養されたＮＩＨ／３Ｔ３（CRL-1658、ATCC）マウス胚繊維芽細胞、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養された非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢａｌｂｃ／３Ｔ３誘導体を含む。すべての培地及び血清は、Sigma（St. Louis, MO）から得た。プラスミドｐＧＬ３は、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーターを構成的に発現する。SuperFect（商標）トランスフェクション試薬は、QIAGEN（Valencia, CA）から得た。供給されたプロトコルにしたがってトランスフェクションを実施した。
【００９８】
組織培養処理した、底が透明で不透明白色の９６ウェル型マイクロプレート（カタログ番号３６１０、Corning Costar社 Action, MA）でアッセイを実施した。TR717（商標）マイクロプレートルミノメータ（Tropix）又はTurnerモデル２０ｅ単管ルミノメータ（Turner Designs, Mountain View, CA）のいずれかで光放出を計測した。
【００９９】
例１：ルシフェラーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル
ｐＧＬ−３でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェル型マイクロタイタプレートに播種し、アッセイの前にＰＢＳで一度洗浄した。まず、Dual-Light（登録商標）試薬を使用してルシフェラーゼ信号を計測した。次に、０．１％Triton X-100を含有するDual-Light（登録商標）バッファＡ２５μlを各ウェルに加え、Dual-Light（登録商標）バッファＢ７５μl／ウェルを注入した。そして、TR717ルミノメータで光放出を計測した。ルシフェラーゼ信号の減衰ののち、CDP-Star（登録商標）基質／Sapphire-II（商標）エンハンサー溶液１００μlを加え、内在性ＡＰで触媒された光放出を計測した。試薬の添加から１５分以内にＡＰ反応からの光放出が最大値に達した。アッセイの結果を図１に示す。ＡＰ検出バッファを早め（たとえばルシフェラーゼを計測した直後）に添加すると、ルシフェラーゼ信号が減少することが注目された（この効果は図示せず）。
【０１００】
例２：β−ガラクトシダーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル
ｐＣＭＶ／β−ＧａｌでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェル型マイクプレートに２×１０4個／ウェルで播種し、アッセイの前にＰＢＳで一度洗浄した。次に、ＨＥＰＥＳ、ＭｇＣｌ2、Triton X-100及びGalacton基質を含む反応バッファ１００μlを各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。そして、Sapphire-II（商標）エンハンサー含有促進物質５０μlを各ウェルに注入し、β−ガラクトシダーゼで触媒された光放出をTR717ルミノメータで計測した。β−ガラクトシダーゼ信号の減衰ののち、希釈CDP-Star（登録商標）基質５０μlを加え、内在性ＡＰで触媒された光放出を計測した。アッセイの結果を図２に示す。
【０１０１】
例３：三酵素アッセイ：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−ガラクトシダーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル
Dual-Light（登録商標）バッファＡ２５μlを溶解物１０μlに加え、３０秒間インキュベートした。次に、１：１００Galacton（登録商標）を含むDual-Light（登録商標）バッファＢ１００μlを加えた。４．５分後、０．３mol/Lジエタノールアミン／２０％エンハンサーを含むバッファＣの１００μlを加えた。最後に、１０分で、バッファＣ中１．２mmol/L CDP-Star（登録商標）１００μlを加えた。アッセイを通じてTurnerモデル２０ｅルミノメータで光放出を連続的に計測した。
【０１０２】
抽出物を、ルシフェラーゼレポーター、β−Ｇａｌレポーター及び最後に内在性アルカリホスファターゼ酵素の活性に関して順次に試験した。β−ＧａｌのGalacton（登録商標）１，２−ジオキセタン基質を改質促進物質製剤とともに使用して、改質Dual-Light（登録商標）アッセイ試薬でルシフェラーゼ及びβ−Ｇａｌ活性を計測した。エンハンサー含有促進物質の添加が、Galacton（登録商標）基質とのβ−Ｇａｌ触媒分解反応からの光放出を開始させ、ルシフェラーゼ触媒光放出を消光した。Galacton（登録商標）基質からの光放出の減衰ののち、CDP-Star（登録商標）１，２−ジオキセタン基質を加えてアルカリホスファターゼからの光放出を開始させた。この連続検出プロトコルは、一つの細胞抽出物サンプルの単管／ウェルアッセイで、２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素を含む３種の酵素の活性の検出を可能にする。
【０１０３】
例４：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの反応速度
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーター酵素を構成的に発現する、ｐＧＬ３−コントロールでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３マウス胚繊維芽細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（５×１０4個／ウェル）中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイの前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。Triton X-100及びGlucon（商標）基質を含む改質ルシフェラーゼ反応バッファを加え（２５μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。このインキュベーション中、Gluconのβ−グルコシダーゼ触媒脱グリコシル化が、蓄積する中間体を生成することがわかった。このpHでは、認められるβ−グルコシダーゼ活性はなかった。次に、プレートをTR717マイクロプレートルミノメータに配置し、ルシフェリンを含有するバッファ７５μl／ウェルを注入した。注入の直後、ルシフェラーゼ触媒光放出を１秒間計測した。ルシフェラーゼ信号は「閃光」として現れ、急速に減衰した。約１５分後、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液を注入し（１００μl／ウェル）、光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。高pH促進物質溶液が、蓄積したGlucon（商標）反応生成物の分解からの光放出を誘発した。アッセイの結果を図４に示す。促進物質の添加が残留ルシフェラーゼ信号の消光を生じさせ（図示せず）、したがって、ルシフェラーゼ信号が完全に減衰するのを待つ必要はないことがわかった。
【０１０４】
例５：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの検出範囲
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーター酵素を構成的に発現する、ｐＧＬ３−コントロールでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３マウス胚繊維芽細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイの前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。Triton X-100及びGlucon（商標）基質を含む改質ルシフェラーゼ反応バッファを加え（２５μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、プレートをTR717マイクロプレートルミノメータに配置し、ルシフェリンを含むバッファ７５μl／ウェルを注入した。注入の直後、光放出を１秒間計測した。約１５分後、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液を注入し（１００μl／ウェル）、光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。ルシフェラーゼレポーター酵素及び内在性β−グルコシダーゼ活性の定量を、トランスフェクトされた細胞１００個未満から５０，０００個までの細胞数の大きさの３のオーダーに及ぶダイナミックレンジで達成した。このアッセイの結果を図５に示す。
【０１０５】
例６：ＰＬＡＰ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの反応速度
ＡＰ３Ｔ３ｂ細胞、非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／３Ｔ３誘導体を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（１．２×１０4個／ウェル）中、底が透明で側壁が白い、組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイを実施する前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのインキュベーションを室温で実施した。リン酸ナトリウム、pH５．５、ＭｇＳＯ4、Ｌ−ホモアルギニン、Triton X-100及びGlucon（商標）を含むβグルコシダーゼ反応バッファを加え（５０μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含有する促進物質溶液（１００μl／ウェル）に注入した直後、光放出を１秒／ウェルでTR717マイクロプレートルミノメータで計測した。約１５分の遅延ののち、CDP-Star（登録商標）を加え（５０μl／ウェル）、ＰＬＡＰ触媒光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。まず、内在性β−グルコシダーゼ触媒反応からの光信号を計測した。この反応では、１，２−ジオキセタン基質の酵素的脱グリコシル化が、最初１５分のインキュベーション中に蓄積するアニオン中間体を生成することがわかった。促進物質溶液の添加がアニオンの分解からの光放出を誘発し、β−グルコシダーゼ酵素活性を不活性化した。β−グルコシダーゼ触媒光放出は数分以内に減衰した。CDP-Star（登録商標）なしの反応で見られるように、促進物質の添加後４０分で光信号はほぼ完全に減衰した。最後に、CDP-Star（登録商標）を加えて胎盤アルカリホスファターゼ触媒光放出を開始させた。基質添加後約２０分で最大強さのグロー光放出反応速度を得た。アッセイの結果を図６に示す。
【０１０６】
例７：ＰＬＡＰ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの検出範囲
ＡＰ３Ｔ３ｂ細胞、非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／３Ｔ３誘導体を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイを実施する前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。リン酸ナトリウム、pH５．５、ＭｇＳＯ4、Ｌ−ホモアルギニン、Triton X-100及びGlucon（登録商標）基質を含むβグルコシダーゼ反応バッファを加え（５０μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液（１００μl／ウェル）を注入し、ただちに、光放出を１秒／ウェルでTR717マイクロプレートルミノメータで計測した。約１５分の遅延ののち、CDP-Star（登録商標）基質の希釈物を加え（５０μl／ウェル）、ＰＬＡＰ触媒光放出を計測した（１秒／ウェル）。ＰＬＡＰレポーター酵素及び内在性β−グルコシダーゼ活性の定量を、２倍の大きさの線形範囲で、すなわち約３００〜５０，０００個／ウェルの範囲で達成した。アッセイの結果を図７に示す。二重プロトコルで得られた各酵素の検出感度は、それぞれを単独で計測した場合（アッセイプロトコルに１種の基質しか含めないことによる）に得られる感度と同一であった。したがって、ＰＬＡＰ検出の感度は、Glucon（商標）からの残留信号によって影響されなかった。
【０１０７】
本明細書で言及するすべての引用例を全体として取り込む。
【０１０８】
本発明を一般的に、また、その好ましい実施態様及び具体例を参照して詳細に説明した。しかし、本開示を考慮すると、本発明の本質及び範囲に該当する変形及び改良を当業者が加えうることが理解されよう。請求の範囲の詳説によって除外されない限り、これらの変形は本発明の範囲に入る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びＡＰ（内在性酵素）の二酵素アッセイのグラフ表示を提供する。
【図２】 β−Ｇａｌ（レポーター酵素）及びＡＰ（内在性酵素）の二酵素アッセイのグラフ表示を提供する。
【図３】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）、β−ガラクトシダーゼ（レポーター）及びアルカリホスファターゼ（内在性酵素）の多酵素アッセイのグラフ表示を提供する。
【図４】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの反応速度のグラフ表示を提供する。
【図５】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの検出範囲のグラフ表示を提供する。
【図６】 ＰＬＡＰ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの反応速度のグラフ表示を提供する。
【図７】 ＰＬＡＰ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの検出範囲のグラフ表示を提供する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、細胞のサンプル又は集団の一つのアリコート中の少なくとも１種の内在性酵素及びサンプルの１つのアリコート中の多種の酵素（ただし、酵素の少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を計測する多酵素アッセイを開示する。本発明はまた、多種の酵素の活性を検出する方法及びキットを開示する。
【０００２】
従来技術の背景
多様なレポーター遺伝子アッセイが、生体医学的及び薬学的研究で、遺伝子調節及び細胞因子の同定ならびに遺伝子発現に影響する化合物の研究のために使用されている。Alam and Cook, Anal Biochem, 1990; 188:245-54; Bronstein, et al., Anal Biochem., 1994; 219:169-81。レポーター遺伝子活性、すなわちレポータータンパク質の産生は遺伝子の調節要素の転写活性に正比例するため、レポーター遺伝子アッセイは遺伝子調節要素の研究に有用である。これらのアッセイで使用するためのレポーター遺伝子構築物は、重要な１種以上の遺伝子調節要素、機能的ｍＲＮＡの転写のための最小シーケンス要件及びレポータータンパク質のためのコード化シーケンスを含む。Alam, et al., Anal. Biochem., 188:245-254, 1990。調節領域内に種々の欠失を含む構築物の分析は、転写及び細胞特異的発現に必要な調節シーケンスのマッピングを可能にする。
【０００３】
レポーター遺伝子構築物を細胞に導入したのち、発現したタンパク質又はその活性を定量すると、遺伝子発現の間接的な計測が得られる。たとえば、レポーター遺伝子産物の高感度な定量は、遺伝子発現、信号伝達経路、タンパク質相互作用の同定及び薬物発見に重要である。さらには、レポーター遺伝子の定量は、遺伝子プロモーター及びエンハンサー領域のマッピング、遺伝子発現機構の分析ならびに遺伝子発現のエファクタを求めての化学物質及び天然物質ライブラリのスクリーニングを可能にする。
【０００４】
化学発光レポーター遺伝子アッセイは、高い感度を、一般には６〜７のオーダーの大きさの広いダイナミックレンジと組み合わせる。化学発光１，２−ジオキセタン基質が、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、β−グルクロニダーゼ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含むいくつかのレポーター酵素のための、高感度アッセイに使用されている。これらの化学発光アッセイは、従来の比色的、蛍光的及びアジオアイソトープ的検出方法に対する優れた代替を提供する。１，２−ジオキセタン化学発光基質はまた、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼレポーター酵素のための二重アッセイで使用されてきた。各化学発光基質の酵素的開裂が、不安定化したジオキセタンアニオンを作り出し、それが断片化し、光を放出する。
【０００５】
ジオキセタン基質を使用する、レポーター遺伝子アッセイに限定されない高感度化学発光アッセイが記載されている。引用例として本明細書に取り込むBronsteinの米国特許第４，９７８，６１４号。これらのジオキセタン基質は、酵素誘発分解ののち、可視光を放出する。疎水性領域を有する特定の水溶性分子、たとえば球状タンパク質又は合成ポリマーを含むエンハンサー基質による、１，２−ジオキセタン類の化学発光分解の増強が記載されている。引用例として本明細書に取り込むVoytaらの米国特許第５，１４５，７７２号。これらのジオキセタン基質はまた、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼのレポーター遺伝子アッセイに使用される。たとえばBronstein et al., Anal. Biochem., 219:169-181, 1994及びその中で引用されている文献を参照。レポーター遺伝子アッセイにおけるジオキセタン基質及びエンハンサーの使用は、引用例として本明細書に取り込む米国特許出願第０８／５７９，７８７号に記載されている。米国特許出願第０８／５７９，７８７号は、同じ細胞抽出物アリコート中で多種のレポーター遺伝子の産物が順次に定量されるアッセイを記載している。一般に使用されるレポーター遺伝子を検出する、ラジオアイソトープを使用せず、外部光源を要しない簡単で高速で高感度な組み合わせ多レポーター遺伝子アッセイが記載されている。これらのアッセイは、増強されたレベルの光を発生させ、したがって、アッセイのダイナミックレンジ及び感度を増し、多様な計器の使用を可能にする。
【０００６】
１，２−ジオキセタン基質は、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素活性の定量のために、Tropix社から市販されているGALACTO-LIGHT（商標）、GALACTO-LIGHT PLUS（商標）及びGALACTO-STAR（商標）アッセイ系に組み込まれ、哺乳動物細胞培養物、組織抽出物、マイクロインジェクションしたカエル胚、寄生原生動物、酵母及びバクテリアで使用されている。Jain et al., Anal Biochem., 1991, 199:199-24、Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamental and Applied Aspects, (Campbell et al., ed) Chichester: Wiley, 1994, 20-3、Martin et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, (Hastings et al., eds.) Chichester: Wiley, 1997, 525-8、Bronstein et al., Clin. Chem., 1996, 42:1542-6。GUS-LIGHT（商標）系は、β−グルクロニダーゼレポーター検出に使用される。Bronstein et al., BioTechniques., 1994, 17:172-7。ＣＳＰＤ（登録商標）基質は、分泌形態又は非分泌形態のヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）レポーター酵素の定量のためにPHOSPHA-LIGHT（商標）アッセイ系で使用される。Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamental and Applied Aspects (Campbell et al., eds.) Chichester: Wiley, 1994, 20-3、Bronstein et al., et al., Clin. Chem., 1996, 42:1542-6、Bronstein et al., BioTechniques, 1994, 17:172-7。Tropix社によるDUAL-LIGHT（登録商標）系は、β−Ｇａｌ及びルシフェラーゼレポーター酵素の単管アッセイで、１，２−ジオキセタンをルシフェリンと組み合わせている。Martin et al., BioTechniques, 1996, 21:520-4、Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons (Hastings et al., eds.) Chichester: Wiley, 1997, 451-7。
【０００７】
現在、多レポーター遺伝子アッセイは一般に、トランスフェクションの効率を制御するために使用されている。このようなアッセイでは、細胞は、それぞれが異なるレポーター遺伝子を有する２種の別々のプラスミドの混合物でトランスフェクトされる。一方のレポーター遺伝子の発現が、研究される種々の調節領域によって制御され、対照として働く他方のレポーター遺伝子は一般に、標準のプロモーター又はエンハンサーによって構造的に発現される。試験用レポーター酵素の活性は、対照レポーター酵素の活性に対して正規化される。
【０００８】
単一アッセイにおける多種の酵素活性の計測は、いくつかの能力を提供する。トランスフェクション正規化は、試験用レポーター酵素及び対照レポーター酵素の定量によって実施することができる。薬学的スクリーニング法は、特異的転写因子に対する化合物の効果を遺伝子発現に対する非特異的効果から区別するのに、すなわち、いくつかの薬物標的の多重スクリーニングのために、多種のレポーターから恩恵を受ける。これらの利点は、１９９５年１２月２８日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／５７９，７８７号に記載されている。
【０００９】
レポーター遺伝子発現は遺伝子調節を計測するのに有用であるが、また、細胞数、細胞接着、細胞毒性及び細胞増殖を計測するための機構を有することが望ましい。そのようなレポーター遺伝子を制御するための使用される促進物質は、遺伝子発現を試験するために細胞に加えられる外来性化合物から独立して作用することが好ましいため、レポーター酵素は、これらの計測を実施するには有用性が限られるかもしれない。当業者は、試験細胞に何が加えられるかにかかわらず、細胞によって一定レベルで発現される遺伝子構築物を要するであろう。たとえば、試験化合物によって影響されない強力な促進物質に結合したレポーター酵素を使用しなければならないであろう。
【００１０】
レポーター酵素及び内在性細胞酵素の活性の計測は、レポーター酵素活性を細胞タンパク質に対して正規化する、すなわち、レポーター活性と、細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性との同時定量を潜在的に可能にするためのアッセイを提供する。細胞数、細胞増殖、細胞接着及び細胞健全性を計測するための、そのような計測を実施するのにレポーター酵素の使用を要しない方法を有することが望ましい。
【００１１】
細胞増殖、成長阻害、細胞接着又は細胞毒性効果を正規化又は計測するために細胞数を定量するための技術は現在公知であり、細胞酵素活性、生体染色及び細胞代謝を計測するための種々の方法を含む。レポーター酵素活性の計測及び細胞数の計測のためにサンプルの別個の部分を試験する必要性は、アッセイの精度を下げ、実験誤差を結果に招き入れるおそれがある。したがって、同じ細胞抽出物アリコートに対して順次に実施される多酵素アッセイは、アッセイ手順を簡素化し、実験誤差を最小限に抑えるであろう。多種の酵素の使用は、薬物発見のための高処理能力スクリーニングの効率及び情報内容を改善することができる。したがって、二つ以上の単一サンプルアリコートの試験を要することなく、これらの要因を計測する方法を有することが有用であろう。
【００１２】
Sherfらへの米国特許第５，７４４，３２０号は、２種の異なるレポーター酵素を同時に発現するように遺伝子操作された細胞によって産生される２種の個別のレポーター酵素を計測する二酵素レポーター系を記載している。Sherfらは、２種のルシフェラーゼレポーター酵素の使用及びそれらの酵素の活性を計測するための消光活性化試薬の使用を記載している。しかし、Sherfらは、内在性酵素（endogenous enzyme）を計測する方法を記載していない。
【００１３】
したがって、アッセイにおいてたとえば細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性を計測するために多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）を計測する方法を開発することは依然として当業者にとって目的である。当業者にとってのさらなる目的は、サンプルの１つのアリコート中の少なくとも１種のレポーター酵素及び少なくとも１種の内在性酵素を計測する方法を開発することである。
【００１４】
発明の概要
本発明の目的は、一つのアリコート中の少なくとも１種の内在性酵素の活性を計測し、それにより、一つのサンプル中の細胞数の内部正規化を提供する多酵素アッセイを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、多種の酵素の活性を計測するための、多種の酵素が少なくとも１種の酵素及び少なくとも１種の内在性酵素であり、少なくとも１種のレポーター酵素がジオキセタン類と反応することができる酵素であるアッセイを提供することである。１，２−ジオキセタン基質の使用は、内在性細胞酵素の定量のための高感度で融通性で容易な化学発光アッセイ系を提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、サンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種の酵素は内在性酵素である）の活性を計測する方法を提供することである。方法は、第一の酵素による第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第一の酵素の活性を定量することと、次いで、第二の酵素による第二の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第二の酵素の活性を定量することなどを含む。すべての定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して実施される。
【００１７】
単一アッセイにおける多種の酵素の活性の計測は利点を提供する。レポーター酵素及び内在性細胞酵素の活性の計測は、レポーター酵素活性を細胞タンパク質に対して正規化するための、すなわち、レポーター活性と、細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性との同時定量を潜在的に可能にするためのアッセイを提供するため、有利である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、サンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を検出するためのキットを提供することである。キットは、各酵素を定量するための試薬と、各酵素のための基質（基質の少なくとも１種はジオキセタン類である）と、場合によっては、水溶性ポリマーエンハンサー分子を含む促進物質溶液とを含む。
【００１９】
多種の酵素の活性は、使用する計器又は検出装置に依存して、順次に検出することもできるし、同時に検出することもできる。
【００２０】
発明の詳細な説明
上記目的は、１，２−ジオキセタン類の高い感度に頼る化学発光アッセイによって満たされる。本発明の譲受人であるTropix社によって開発されたこれらのジオキセタン類は、多様な米国特許の主題である。一般に、ジオキセタン類とは、４個の構成員を有し、それらの２個が隣接する酸素原子である環を有する分子である。ジオキセタン類は、熱的、化学的又は光化学的に分解されてカルボニル生成物、たとえばエステル、ケトン又はアルデヒドを形成することができる。この分解がエネルギーを光の形態で放出（すなわち発光）する。具体的には、ジオキセタン基質はそれぞれ、対応する酵素によって開裂させることができる酵素開裂性基を含む。開裂すると、負の電荷を帯びた基（たとえば酸素アニオン）がジオキセタンに結合したまま残る。このジオキセタンアニオンがジオキセタンを不安定化し、するとジオキセタンは分解して発光性物質を形成し、これが光を発生させる。この光信号が酵素の存在及び量の指標として検出される。したがって、過剰な基質の存在における発光信号の強さを計測することにより、対応する酵素の濃度を測定することができる。
【００２１】
レポーター酵素の高感度化学発光検出は、研究規模及び自動化可能な高処理能力薬学的スクリーニングプラットフォームの両方で使いやすいアッセイフォーマットで、１，２−ジオキセタン基質を用いて達成されている。１．２−ジオキセタン基質の使用は、多レポーター酵素及びレポーター／内因性酵素アッセイをはじめとする二重検出アッセイのために、ルシフェラーゼ反応試薬と組み合わされている。たとえば米国特許出願第０８／５７９，７８７号を参照。以前に開発されたDUAL-LIGHT（登録商標）アッセイ系は、ルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼレポーター活性の二重検出に広く使用されている。
【００２２】
本発明は、多種の酵素、たとえばレポーター酵素活性及び内在性酵素活性、たとえばルシフェラーゼ／ＡＰ、β−ガラクトシダーゼ／ＡＰ及びルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼ／ＡＰの検出を可能にする多酵素検出アッセイに関する。これらの多酵素アッセイは、両方の酵素素活性の検出感度を最適化し、アッセイ実行をさらに簡素化する。内在性酵素の活性は、レポーター酵素活性に影響するために操作されるか、細胞に加えられる要因に依存しない。その結果、内因性酵素の活性は、レポーター酵素に関連しない細胞数のマーカを提供する。この多重検出能力が、少なくとも１種の促進物質の活性と、レポーター酵素の転写活性に依存しない細胞数、細胞成長もしくは増殖、細胞接着又は細胞毒性の細胞定量読み出し正規化との同時計測を提供する。このような計測は、基本的な細胞機能の実験室研究から薬物スクリーニングに使用される複雑なアッセイに至るまで、レポーター酵素を使用するいかなるタイプのアッセイにも有用である。
【００２３】
本発明のアッセイは、サンプルの単一アリコート中の多種の酵素の検出を可能にする（本明細書で使用する「サンプル」は、ホールセル又は細胞抽出物を含むことができ、細胞は、哺乳動物、酵母又はバクテリアからの細胞であってもよい）。多種の酵素は、少なくとも１種の酵素が内因性酵素である限り、レポーター酵素と内在性酵素とのいかなる組み合わせからでも選択することができる。たとえば、本発明の一つの実施態様では、第一の酵素がレポーター酵素であり、第二の酵素が内在性酵素である。もう一つの実施態様では、すべての酵素が内在性酵素である。さらに別の実施態様では、第一及び第二の酵素がレポーター酵素であり、第三の酵素が内在性酵素である。さらなる実施態様では、第一の酵素が内在性酵素であり、第二の酵素がレポーター酵素である。当業者にとって自明である他の組み合わせを、本明細書の教示に準じるアッセイ及び方法で使用することができる。
【００２４】
本発明に有用である酵素は、酵素活性を示し、基質を分解させて光信号を発生させる、遺伝子から産生されるタンパク質を含む。そのような酵素の例は、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及び他の酵素を含む。好ましい実施態様では、酵素の少なくとも１種は加水分解酵素である。２種以上のレポーター酵素を使用する実施態様では、第二のレポーター酵素が加水分解酵素であることが好ましい。他の実施態様では、酵素のすべてが加水分解酵素である。加水分解酵素の例は、アルカリ及び酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ及びトリプシンを含む。
【００２５】
アルカリホスファターゼが使用される場合、基質は、ホスフェート含有ジオキセタン、たとえば３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩又は二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン〕−４−イル〕フェニルホスフェート又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１．２−ジオキセタン−３,２′−（５′−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１．２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、CDP-Star（登録商標）及びADP-Star（商標））を含むことが好ましい。
【００２６】
β−ガラクトシダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、ガラクトシダーゼ開裂性基又はガラクトピラノシド基を含有するジオキセタン類を含むことが好ましい。アッセイにおける発光は、ジオキセタン基質からの糖基の酵素的開裂の結果として生じる。そのような基質の例は、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕−デカン〕−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton（登録商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ〔１．２−ジオキセタン−３,２′−（５′−クロロ）トリシクロ｛３．３．１3.7〕デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））及び２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン〕−４−イル）フェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Star（登録商標））及びＡＭＰＧＤを含む。
【００２７】
β−グルクロニダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、β−グルクロニダーゼ開裂性基、たとえばグルクロニド含むジオキセタン、たとえばナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンのエステル基を開裂させる。プロテアーゼ及びホスホリパーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンに結合した適当な酵素開裂性基を開裂させる。
【００２８】
β−グルコシダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、β−グルコシダーゼ開裂性基、たとえばグルコシダーゼを含むジオキセタン、たとえばナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンのエステル基を開裂させる。プロテアーゼ及びホスホリパーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンに結合した適当な酵素開裂性基を開裂させる。
【００２９】
レポーター酵素が使用されるとき、それは、好ましくは、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエステラーゼ、酸ホスファターゼ及びグルコシダーゼからなる群より選択される。より好ましいアッセイでは、レポーター酵素はルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼである。
【００３０】
好ましくは、検出される内在性酵素は、細胞により、使用される特定の化学発光系及び計器によって検出可能な量で産生される。当業者は、適切な内在性酵素を容易に選択することができる。有用な内在性酵素の例は、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼを含む。好ましい内在性酵素は、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ及びガラクトシダーゼである。もっとも好ましい内在性酵素はグルコシダーゼである。
【００３１】
サンプルの単一のアリコート中の２種以上の内在性酵素の活性を計測することが望ましいかもしれない。本発明は、そのような計測を実施するために容易に使用することができる。計測される酵素のすべてが内在性酵素であるアッセイの例は、アルカリホスファターゼ及びエステラーゼ、酸ホスファターゼ及びアルカリホスファターゼ、プロテアーゼ及びアルカリホスファターゼならびにホスホリパーゼ及びアルカリホスファターゼを含む。
【００３２】
本発明において、酵素、すなわちレポーター酵素及び内在性酵素の基質は、光信号を発することができる発光基質を含む。好ましくは、酵素ごとに基質は異なり、少なくとも１種の基質は、置換又は非置換のアダマンチル基、置換されていてもよいし非置換であってもよいＹ基及び酵素開裂性基を含むジオキセタン類である。好ましいジオキセタン類の例は、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕−デカン〕−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton（登録商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１3.7〕デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））、二ナトリウム６−（４−メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン〕−４−イル）−２−フェニルベンゾチアゾリル−４−ホスフェート、二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（CDP-Star（登録商標））、ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glucon（商標））、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン）−４−イル）フェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Star）、二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン）−４−イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）、二ナトリウム３−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１3.7〕デカン）−４−イル）−１−フェニルホスフェート（ＣＤＰ）、二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート（ＡＭＰＰＤ）、CDP-Star（登録商標）及び二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（ADP-Star）を含む。これらの基質は、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００３３】
好ましくは、ジオキセタン含有基質は、式Ｉ
【００３４】
【化３】
（式中、
Ｔは、炭素原子６〜１２個を環中に有する置換又は非置換のシクロアルキル環又は２個以上の縮合環を有し、各環が、独立して、炭素原子５〜１２個を有するポリシクロアルキル基であり、Ｔは、スピロ結合（たとえばクロロアダマンチル又はアダマンチル基）によって４員ジオキセタン環に結合しており、
Ｙは、蛍光クロモフォアであり、
Ｘは、水素、炭素原子１〜７個を有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキルもしくはヘテロアルキル基（たとえばメトキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシエチル、トリフルオロエトキシ又はヒドロキシプロピル）、少なくとも１個の環を有するアリール基（たとえばフェニル）、少なくとも１個の環を有するヘテロアリール基（たとえばピロリル又はピラゾリル）、炭素原子２〜７個を環中に有するヘテロアルキル基（たとえばジオキセタン）、少なくとも１個の環を有するアラルキル基（たとえばベンジル）、少なくとも１個の環を有するアルカリール基（たとえばトリル）又は酵素開裂性基（すなわち、酵素によって開裂されると、ジオキセタンに結合した電子リッチな基を生じることができる部分を有する基、たとえば、リン−酸素結合を酵素、たとえば酸ホスファターゼもしくはアルカリホスファターゼによって開裂させて、ジオキセタン又はＯＲに結合した負の電荷を帯びた酸素を生じることができるホスフェート）であり、
Ｚは、水素、ヒドロキシル又は酵素開裂性基（上記のとおり）である。
ただし、Ｘ又はＺの少なくとも一方が酵素開裂性基でなければならず、負の電荷を帯びた基が基Ｙを含む）
を有する。発光信号は、対応する酵素の活性の指標として検出される。発光の強さを計測することにより、対応する酵素の活性を測定することができる。
【００３６】
ＸがＯＲであるとき、基Ｒは、炭素原子１〜２０個の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル、アリール、シクロアルキル又はアリールアルキルである。Ｒは、Ｐ、Ｎ、Ｓ又はＯであることができる１又は２個のヘテロ原子を含むことができる。置換基Ｒはハロゲン化されている。ハロゲン化の程度は、アダマンチル基、アリール基上の置換基の選択及び想定される特定の用途に望まれる酵素反応速度に応じて異なる。もっとも好ましくは、Ｒはトリハロアルキル基である。好ましい基は、トリハロ低級アルキル基、たとえばトリフルオロエチル、トリフルオロプロピル、ヘプタフルオロブチロール、ヘキサフルオロ−２−プロピル、α−トリフルオロメチルベンジル、α−トリフルオロメチルエチル及びジフルオロクロロブチル基を含む。置換基Ｒの炭素原子は、ハロゲンによって部分的又は完全に置換されていてもよい。Ｒがアリールであるとき、好ましい基は、１個以上のクロロ、フルオロ又はトリフルオロメチル基によって置換されているフェニル環、たとえば２，５−ジクロロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，３，５−トリフルオロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニル又は３−トリフルオロメチルフェニルを含む。フッ素及び塩素が特に好ましい置換基であるが、特殊な状況では臭素及びヨウ素を用いてもよい。
【００３７】
基Ｙは、酵素開裂性基Ｚに結合した蛍光クロモフォア又はフルオロフォアである。Ｙは、基Ｚの酵素開裂によって生じるジオキセタン分解によって発光する。Ｚが開裂すると、電子リッチな基が形成し、それがジオキセタンを不安定化して、その分解を招く。この分解は、２種の別個のカルボニル化合物を生じさせ、その一方が基Ｔを含み、その他方が基Ｘ及びＹを含む。分解から放出されるエネルギーが、Ｘ及びＹ基を含む化合物をして発光させる（基Ｘが水素であるならば、アルデヒドが生成される）。Ｙは、好ましくはフェニル又はアリールである。アリール基は、式Ｉにおけるように基Ｚを有し、さらに、米国特許第５，５８２，９８０号に記載のように１〜３個の電子活性基、たとえば塩素又はメトキシを有する。
【００３８】
いかなるクロモフォアをＹとして使用してもよい。一般に、感度を増すため、量子収率を最大限にするクロモフォアを使用することが望ましい。したがって、Ｙは普通、芳香族基を含む。適当なクロモフォアの例は、米国特許第４，９７８，６１４号でさらに記載されている。
【００３９】
結合した基Ｚは、酵素開裂性基である。酵素との接触すると、基Ｚは開裂し、それにより、クロモフォアＹに結合した電子リッチな基を生じさせる。この電子リッチな基が、ジオキセタンを２種の別個のカルボニル含有化合物、たとえば、基Ｘが水素である場合には、ケトン又はエステルとアルデヒドとに分解させる。電子リッチな基の例は、酸素、硫黄及びアミンもしくはアミノアニオンを含む。もっとも好ましい基は酸素アニオンである。適当なＺ基の例及びそれらの基に特異的な酵素は、引用例として本明細書に取り込む米国特許第４，９７８，６１４号の表１に掲載されている。このような酵素は、アルカリ及び酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼ、Ｄ，β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ及びトリプシンを含む。
【００４０】
本発明のジオキセタン類はまた、基Ｔ、Ｙ及びＸのいずれかに付いた１個以上の可溶化置換基を含むことができる。可溶化置換基とは、水溶液へのジオキセタンの溶解性を高める置換基である。可溶化置換基の例は、カルボン酸、たとえば酢酸、スルホン酸、たとえばメタンスルホン酸及び第四級アミノ塩、たとえば臭化アンモニウムを含む。もっとも好ましい可溶化置換基は、メタン又はエタンスルホン酸である。
【００４１】
本発明の実施で有用である他のジオキセタン類は、すべて引用例として本明細書の取り込む米国特許第５，０８９，６３０号、米国特許第５，１１２，９６０号、米国特許第５，５３８，８４７号及び米国特許第５，５８２，９８０号に記載され、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００４２】
本発明のアッセイの基質を加える順序は、使用される酵素に依存して異なる。特定の実施態様では、第一のレポーター酵素基質と内在性酵素の基質とを同時に加える。他の実施態様では、第一のレポーター基質ののち、内在性酵素の基質を加える。
【００４３】
好ましくは、計測される第二の酵素の活性を定量する前に、計測される第一の酵素の活性を低下させる。第一の酵素の活性を低下させることは、第一の酵素を実質的に不活性化するか、第一の酵素基質の量を減らすことを含む。
【００４４】
正確なアッセイを得るためには、第一の酵素基質の分解によって生じる光信号が、第二の酵素による第二の酵素基質の分解によって生じる光信号の定量を妨害してはならない。これは、第一の基質の分解によって生じる光信号を計測したのち、第二の酵素の活性を定量する前に、第一の酵素の基質によって生じる信号を減らすことによって達成される。
【００４５】
他の実施態様では、第一の酵素の活性を低下させることにより、たとえば第一の酵素とその基質の反応を、第一の酵素の基質が実質的に分解するまで進行させることにより、第一の酵素の基質から生じる信号を減らす。すなわち、第二の酵素、たとえば内在性酵素の活性化又は増強の前に、第一の基質の分解によって生じる光信号を減衰させる。
【００４６】
他の実施態様では、第一の基質の量を減らすことによって第一の酵素の基質によって生じる信号を減らす。適切な方法は、当業者が、使用される具体的な酵素及び基質に基づいて選択することができる。しかし、一つのそのような実施態様では、好ましくは、第一のレポーター酵素の定量後に残留する第一の基質を分解させるの十分な量の第一の酵素をさらに加えることにより、基質濃度を低下させる。たとえば、第一の酵素、たとえばアルカリホスファターゼによる第一の基質の分解から生じる光信号を計測したのち、残留する基質を分解させ、潜在的に妨害性の光信号を防ぐのに十分な量のアルカリホスファターゼをアリコートに加える。第二の基質は第二の酵素に対して特異的であるため、過剰な第一の酵素の存在が第二の光信号の検出を妨害することはない。すべての酵素のためにジオキセタン基質が使用されるとき、これは有用である。
【００４７】
異なる実施態様では、第一の基質の量を減らすことは、アリコートを加熱して第一の基質を分解させることを含む。熱不活性化は、第一の基質の不活性化に続いて第二の基質を加える実施態様で使用することが好ましい。
【００４８】
さらに好ましい実施態様では、適切な計器、たとえば、米国特許出願第６０／１４４，８９１号に開示されている、本譲受人のNorthStar（商標）計器を使用して信号の同時計測を実施することができる。同出願を引用例として本明細書に取り込む。
【００４９】
レポーター酵素、たとえばルシフェラーゼ及び内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼを計測する本発明の一つの実施態様では、基質ルシフェリン（Dual-Light（登録商標）試薬）の添加ののち、まずルシフェラーゼ信号を計測する。ルシフェラーゼ信号の減衰ののち、内在性酵素（ＡＰ）の基質及び適切なエンハンサーを含む内在性酵素（ＡＰ）検出バッファ（CDP-Star（登録商標）基質／Sapphire-II（商標）エンハンサー溶液）を加え、内在性ＡＰ触媒光放出を計測する。試薬添加から１５分以内にＡＰ反応からの光放出が最大値に達する。このアッセイの結果を図１に示す。あるいはまた、望むならば、ルシフェラーゼ信号を減らすため、ＡＰ検出バッファを早めに、たとえばルシフェラーゼを計測した直後に加えることもできる（図示せず）。
【００５０】
レポーター酵素、たとえばβ−ガラクトシダーゼ及び内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼを計測する本発明のもう一つの好ましい実施態様では、レポーター酵素の基質（Galacton（登録商標）基質）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートする。次に、エンハンサー（Sapphire-II（商標））含有促進物質を各ウェルに注入し、β−ガラクトシダーゼ触媒光放出を計測する。β−ガラクトシダーゼ信号の減衰ののち、ＡＰの基質（CDP-Star（登録商標））を加え、内在性ＡＰ触媒光放出を計測する。このアッセイの結果を図２に示す。
【００５１】
２種以上のレポーター酵素、たとえば２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する発明のアッセイの特定の実施態様では、第一のレポーター酵素の活性の定量の間に第一及び第二のレポーター基質がいずれもアリコート中に存在する。これらの実施態様では、第二のレポーター酵素及びその基質の存在が、第一のレポーター酵素の活性又は第一のレポーター酵素による第一の基質の分解によって生じる光信号の計測を妨害することはない。一つの好ましい実施態様では、第一の基質の分解によって生じる光は、第二の基質の分解の産物が光を生じさせないpHで起こる。このような実施態様では、アリコートの環境がこの第二の酵素反応の産物による発光を阻害するため、第一の定量の間に第二の基質との酵素反応の産物が計測可能な信号を発することはない。たとえば、第一の基質の分解による発光の計測は、中性pHで起こることが好ましい。第一のレポーター酵素がその基質に作用する間に、第二のレポーター酵素はその基質に作用する。しかし、このpHでは、第二のレポーター酵素とその基質との反応から有意な発光は起こらない。pHを上げ、第二の酵素反応の発光を計測する前に所定の期間を経過させて、その反応の産物を蓄積させ、それにより、さらに強い光信号を生じさせることが好ましい。
【００５２】
他の実施態様では、第二の酵素の存在が、第一の酵素反応からの光信号の計測を妨害しない。理由は、第二の酵素の基質がこの計測中にアリコート中に存在しないからである。そのような実施態様では、第二の酵素は活性であるが、それが作用することができる基質が存在しない。一つの好ましい実施態様では、第一のレポーター酵素の活性を低下させたのち又は第一の酵素反応によって生じる信号を減少させたのち、第二の基質を加えることにより、第二の酵素の活性を誘発する。たとえば、β−ガラクトシダーゼを第一の酵素として使用し、アルカリホスファターゼを第二の酵素として使用するアッセイでは、β−ガラクトシダーゼ反応の結果として起こる発光は、中性よりも高いpHで最適化される。上げられたpHは、第二の酵素、アルカリホスファターゼを同時に活性化し、それが光を生じさせ、その光が第一の酵素の活性の定量を妨害することになる。したがって、そのようなアッセイでは、第一の定量に続いて第二の基質を加える、もっとも好ましくは、光信号が減衰した後で第二の基質を加えることが好ましい。この添加は容易に達成され、当該技術で一般に知られる検出装置を使用する場合、特に簡単である。
【００５３】
２種以上のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する好ましい実施態様では、第二のレポーター酵素基質からの光放出の減衰ののち、内在性酵素の基質を加える。好ましくは、内在性酵素の基質が光放出を開始させる。あるいはまた、第二のレポーター酵素の計測の前の時点で内在性酵素の基質を加え、先に述べた方法、たとえばpHを変化させることによって内在性酵素の活性を高める。
【００５４】
本発明の特定の好ましい実施態様では、水溶性ポリマー性エンハンサー分子を、基質の酵素的分解によって生じる光信号に加える。好ましいポリマーエンハンサーは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン及びポリマー第四級オニウム塩を含む。好ましいポリマー第四級オニウム塩の例は、ポリビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire-I（商標））、ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド及びポリビニルトリブチルスルホニウムクロリドを含む。他のポリマーエンハンサーは、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald（登録商標））、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald II（登録商標））を含む。これらのエンハンサーは、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００５５】
他の実施態様では、第二の酵素の活性を定量する前に促進物質溶液を加える。好ましい促進物質溶液は、酵素による基質の分解からの信号発生を活性化することができる、約８〜約１４のpHの水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む。１種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素しか使用しない実施態様では、促進物質溶液が、内在性酵素による内在性基質の分解によって生じる信号を活性化し、第一のレポーター酵素を不活性化する。２種以上のレポーター酵素を有する実施態様では、第二のレポーター酵素の定量の前に促進物質溶液を加えると、それが、第二のレポーター酵素基質の分解によって生じる信号を活性化し、第一のレポーター酵素を不活性化する。
【００５６】
特定の内在性酵素を計測するとき、細胞をさらに処理することが必要になるかもしれない。たとえば、細胞又は血清中に多量に存在する内在性酵素を計測するとき、バックグラウンドレベルが高すぎて正確な読みを出すことができないおそれがある。そのような場合、アッセイの前に細胞を洗浄することが好ましい。当業者は、どの内在性酵素が洗浄を要するのかを容易に決定することができ、適切な洗浄溶液、たとえばＰＢＳを決定することができるであろう。たとえば、ＡＰを計測するアッセイでは、アッセイの直前に細胞をＰＢＳで一度洗浄する。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、第一の基質の存在が、第二のレポーター酵素又は内在性酵素の基質の分解によって生じる光信号を増強する。この増強した信号が、より高感度なアッセイを提供する。本発明者は理論によって拘束されることを意図しないが、第二の基質の分解によって生じるエネルギーが残りの第一の基質に伝達され、それにより、生じる光信号の強さを増強すると考えられる。この方法の一つの好ましい実施態様では、第一の基質はルシフェリンである。この実施態様では、第二の酵素の基質は、好ましくはジオキセタン基質である。ルシフェリンは非常に効率的なエネルギー受容体であり、ジオキセタン分解から発生する励起状態からのエネルギー伝達の結果として光信号を放出すると考えられる。これが、より大きな信号強さを生じさせる。
【００５８】
本発明の特定の好ましい実施態様はさらに、レポーター酵素又は内在性酵素によるジオキセタン基質の酵素的分解から生じる光信号を増強する水溶性エンハンサー分子を加えることを含む。
【００５９】
一般に高分子性である特定の水溶性天然及び合成物質が、一部には疎水性環境を提供することにより、化学発光信号の強さを増強する。これらの物質、たとえば、疎水性領域を含む水溶性球状タンパク質、哺乳動物血清アルブミン、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は水溶性ポリマー性第四級オニウム塩、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire-I（商標））ならびにポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドは、水溶液中の酵素的に開裂可能な１，２−ジオキセタン類の分解によって生じる化学発光信号の強さを増大させる。コポリマー、たとえば水溶性第四級アンモニウム−ホスホニウム、アンモニウム−スルホニウム及びスルホニウム−ホスホニウムポリマーがエンハンサー分子として有用である。他の好ましいエンハンサーは、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド、フルオレセインナトリウム（Emerald（登録商標））、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びフルオレセインナトリウム（Emerald II（商標））を含む。
【００６０】
有効量のエンハンサー物質の存在のおかげで、水性媒体中で放出される光の強さは、そのようなエンハンサーの不在で放出される光の強さに比べて有意に増大する。これらの化合物は、１，２−ジオキセタン類からの化学発光信号の強さを少なくとも１０％、普通は少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１０〜１，０００倍に増強する。
【００６１】
そのようなエンハンサー物質に含まれるものは、疎水性領域を含む高分子球状タンパク質、一般には、ＳＤＳゲル電気泳動による測定で約１０００〜約６００，０００ダルトンの範囲の分子量を有するものである。そのような物質は、哺乳動物血清アルブミン、たとえばＢＳＡ、ＨＳＡなど、球状タンパク質、たとえば哺乳動物ＩｇＧ、ＩｇＥ、タンパク質Ａ、アビジンなど及び血清リポタンパク質、アポリポタンパク質などを含む。
【００６２】
本発明を実施する際に使用することができる合成オリゴマー又はポリマーエンハンサー物質は、一般式II
【００６３】
【化４】
（式中、Ｅ＋は、Ｐ、Ｎ又はＳであることができる）
を有する水溶性ポリビニルアリール第四級オニウム塩、たとえばポリビニルベンジル第四級アンモニウム、スルホニウム及びホスホニウム塩を含む。
【００６５】
この式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3それぞれは、炭素原子１〜２０個を有する直鎖状又は分岐鎖状の非置換アルキル基、たとえばベンジル、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、セチルなど、１個以上のヒドロキシ、アルコキシ、たとえばメトキシ、エトキシ、ベンジルオキシもしくはポリオキシエチルエトキシ、アリールオキシ、たとえばフェノキシで置換されている、炭素原子１〜２０個を有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、アミノもしくは置換アミノ、たとえばメチルアミノ、アミノ、たとえばアセトアミドもしくはコレステリルオキシカルボニルアミド、又はフルオロアルカンもしくはフルオロアリール、たとえばヘプタフルオロブチル基、環炭素原子３〜１２個を有する非置換モノシクロアルキル基、たとえばシクロヘキシルもしくはシクロオクチル、１個以上のアルキル、アルコキシ又は縮合ベンゾ基で置換されている、環炭素原子３〜１２個を有する置換モノシクロアルキル基、たとえばメトキシシクロヘキシルもしくは１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アルコキシ又はアリール基で置換されている、それぞれが炭素原子５〜１２個を有する２個以上の縮合環を有するポリシクロアルキル基、たとえば１−アダマンチルもしくは３−フェニル−１−アダマンチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アリール、又はフルオロアルカンもしくはフルオロアリール基で置換されている、少なくとも１個の環及び全部で６〜２０個の炭素原子を有するアリール、アルカリールもしくはアラルキル基、たとえばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジルもしくはデヒドロアビエチルであり、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の少なくとも二つが、それらが結合する第四級原子といっしょになって、炭素原子３〜５個及びヘテロ原子１〜３個を有し、ベンゾアニル化されていてもよい、飽和又は不飽和の、非置換又は置換されている窒素含有環、窒素及び酸素含有環又は窒素及び硫黄含有環、たとえば１−ピリジル、１−（３アルキルもしくはアラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、ピペリジノもしくはアシルピペリジノ、ベンゾオキサゾール、ベンズチアゾール又はベンゾアミダゾールを形成することができる。
【００６６】
記号Ｘ-は、ハライド、すなわちフルオリド、クロリド、ブロミドもしくはヨージド、スルフェート、アルキルスルホネート、たとえばメチルスルホネート、アリールスルホネート、たとえばｐ−トルエンスルホネート、置換アリールスルホネート、たとえばアニリノナフチレンスルホネート（種々の異性体）、ルシファーイエローＣＨ及びジフェニルアントラセンスルホネート、ペルクロレート、アルカノエート、たとえばアセテート、アリールカルボキシレート、たとえばフルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、ベンゾ複素環式アリールカルボキシレート、たとえば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボキシレートもしくは置換モノアリールオキシホスフェート、たとえば３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンジアニオンもしくは上記式Ｉで示す他のジアニオンのような基を単独で又は組み合わせて含むことができる対イオンを表す。
【００６７】
記号ｎは、そのようなポリビニルベンジル第四級オニウム塩の分子量が、固有粘度又はＬＡＬＬＳ技術による測定で、約８００〜約２００，０００、好ましくは約２０，０００〜約７０，０００の範囲になるような数を表す。
【００６８】
そのような水溶性ポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）の代表例は、ＴＭＱ、ＢＤＭＱなどである。
【００６９】
Bronstein-Bonteらの米国特許第４，１２４，３８８号に開示され、特許請求されている、式III
【００７０】
【化５】
（式中、Ｅ＋は、Ｐ、Ｎ又はＳであることができ、各Ｒ4は、同じ又は異なる脂環式置換基であり、Ｘ-は、アニオンである）
を有する、ポリビニルアセタールとホルミルベンジル第四級オニウム塩との水溶性アセタール。また、上記式IIのポリビニルベンジル第四級オニウム塩を調製するために使用される個々のビニルベンジル第四級オニウム塩モノマーを、ポリマーが式IIIに示されている他のビニルベンジル第四級オニウム塩モノマー又は第四級オニウム官能基を有しない他のエチレン性不飽和モノマーとで共重合させて、Landらの米国特許第４，３２２，４８９号、Bronstein-Bonteらの米国特許第４，３４０，５２２号、Landらの米国特許第４，４２４，３２６号、Bronstein-Bonteらの米国特許第４，５０３，１３８号及びBronstein-Bonteの米国特許第４，５６３，４１１号に開示され、特許請求されているポリマーを得ることもできる。これらのポリマーすべては、本発明を実施する際にエンハンサー物質として使用することもできる。好ましくは、これらの第四級化ポリマーは、式IIIのポリビニルベンジル第四級アンモニウム塩に関して上記した範囲内の分子量を有する。
【００７２】
他の水溶性オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマー物質は、前記ポリマーに加えて、又はその代わりにエンハンサー物質として使用することができ、米国特許第５，１４５，７７２号にさらに記載され、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００７３】
使用されるエンハンサー物質の量は、選択される特定のエンハンサー物質ならびに存在する化学発光化合物の量及びタイプに応じて異なる。必要な量は、当業者が本教示に基づいて容易に決定することができる。さらには、米国特許第５，１４５，７７２号に含まれる開示が、本発明を実施する際に当業者を支援するであろう。
【００７４】
エンハンサー分子は、本発明のいかなる時点で加えることもできる。第二の基質ではなく第一の基質がジオキセタン類であるならば、エンハンサーは、第一の酵素の定量の前又はそれと同時に加えることが好ましい。第一の基質ではなく第二の基質がジオキセタン類であるならば、エンハンサーは、いつ加えてもよいが、好ましくは、第一の酵素の定量ののち、第二の酵素の定量の前又はそれと同時に加える。第一及び第二の基質がいずれもジオキセタン類であるならば、エンハンサー分子は、定量の前又は第一の定量と同時に加えることが好ましい。この最後の実施態様では、一つのエンハンサーを使用して、両方の酵素基質の分解によって生じる光信号を増強することができる。あるいはまた、酵素基質ごとに異なるエンハンサーが使用される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施態様では、第一の酵素の基質によって生じる光信号の定量ののち、一部には、第一の基質によって生じる光信号を減衰させるためのインキュベーション期間がある。インキュベーション期間の長さは、第一のレポーター酵素の濃度及び基質によって生じる光信号の半減期に依存して異なる。第一の酵素が高濃度で存在するならば、それが、後続の低レベルの酵素の定量を妨害するおそれがある。長めのインキュベーション期間は、第一のレポーター酵素の基質から残留する光信号を低下させる。本発明の教示を考慮すると、適切なインキュベーション期間の長さは、当業者が容易に決定することができる。
【００７６】
本発明の方法は、一つのサンプルアリコート中の多種の酵素の活性を順次に検出するための高速で高感度の非アイソトープ的方法を提供する。具体的には、本発明はまた、一つのサンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を計測する方法に関する。この方法は、第一の酵素による第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第一の酵素の活性を定量することと、次いで、内在性酵素による第二の基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第二の酵素の活性を定量することとを含み、両定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して実施される。基質から生じる発光信号の強さは、酵素の活性、すなわち、その基質を分解させる能力に換算した酵素の有効性及び／又は存在する酵素の量の関数である。
【００７７】
好ましい実施態様では、サンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素は、少なくとも１種のレポーター遺伝子産物及び少なくとも１種の内在性酵素である）の活性を計測する方法は、第一のレポーター酵素の基質である第一基質及び内在性酵素の基質である第二の基質を細胞抽出物アリコートに加えることを含む。この好ましい実施態様では、第一の基質はルシフェリンであり、第二の基質はジオキセタン類を含み、内在性酵素は加水分解酵素である。まず、第一のレポーター酵素の活性を計測する。次に、エンハンサー分子を含む促進物質溶液を加える。促進物質溶液は、第一のレポーター酵素を実質的に不活性化し、同時に、内在性酵素の基質の化学発光信号を増大させる。次に、内在性酵素の基質を加え、内在性酵素の活性を計測する。好ましくは、第一のレポーター酵素はルシフェラーゼであり、内在性酵素は、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼからなる群より選択される。より好ましい内在性酵素はアルカリホスファターゼである。
【００７８】
本発明の方法は、少なくとも１種のレポーター遺伝子でトランスフェクトされた細胞の転写活性を計測し、細胞にとって内在性の少なくとも１種の酵素を計測することによって細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性の計測を可能にするのに特に有用である。
【００７９】
細胞のトランスフェクションは、当該技術で公知の方法によって達成される。たとえば、Alam, J. and Cook, J. K., Anal. Bioch. 188:245-254(1990)を参照。少なくとも３種の酵素、すなわち少なくとも２種のレポーター酵素及び内在性酵素を計測する本発明の実施態様では、細胞を、それぞれが異なるレポーター遺伝子を有する２種の別々のプラスミドのＤＮＡ混合物で同時にトランスフェクトする。一方のプラスミドは、既知の制御プロモーターによって調節されるレポーター遺伝子を有する。このレポーター遺伝子が対照として働く。第二のプラスミドは、研究される調節領域によって制御される第二のレポーター遺伝子を有する。各レポーター遺伝子のトランスフェクションは、その産物、すなわち「レポーター酵素」の活性を計測することによって分析される。第二のレポーター酵素の活性は通常、第一のレポーター酵素の活性に対して正規化される。同上２４９を参照。
【００８０】
本発明の特定の方法では、第二の酵素の活性を、その基質の分解によって生じる光信号を計測する前に変調させる。第二の酵素の活性は、内在性酵素の基質を加えるか、内在性酵素を活性化することによって変調させる。特定の実施態様では、第二の酵素の活性は、上記で論じたように、アリコートのpHを上げることによって変調させる。
【００８１】
特定の好ましい実施態様では、多種の酵素の活性を計測する方法は、第一のレポーター酵素の定量ののち、酵素検出バッファを添加することをさらに含む。好ましくは、酵素検出バッファは、第二の酵素の基質及びエンハンサーを含む。酵素検出バッファはまた、以下さらに記載するように、促進物質溶液、すなわち高pHバッファ中のエンハンサーを含むことができる。
【００８２】
加えて、本発明は、同じサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素は、３種以上のレポーター遺伝子産物及び内在性酵素を含む）の活性を計測する方法を提供する。多数の要因、たとえばサンプルの入手性、計器及び試薬の入手性が、使用される細胞抽出物のアリコートの量を決定する。好ましくは、細胞抽出物アリコートの量は、抽出物を保持するために使用される装置又はプレートの大きさ、信号を測定するための装置、環境条件ならびに当業者には周知である他のパラメータに基づいて決定される。
【００８３】
本発明の方法は、いかなるルミノメータで実施することもできるが、自動インジェクタを有するルミノメータ又は光放出の計測を可能にする他の計器で実施することが好ましい。本方法はまた、一つのインジェクタを備えたルミノメータで実施することもできる。試薬をサンプルに添加したのちほぼ同じ時間間隔をおいた後で各サンプルの光信号を計測するならば、本方法は、手動注入を使用して実施することもできる。前記のように、酵素の活性は、使用される計器に依存して、順次に検出することもできるし、同時に検出することもできる。
【００８４】
一つの好ましい実施態様では、本方法は、まず、第一の基質の分解によって生じる光信号を計測することによって細胞抽出物アリコート中の第一のレポーター酵素の活性を定量することと、次いで、第一のレポーター酵素の活性を低下させることとを含む。次に、第二の基質の分解によって生じる光信号を計測することにより、細胞抽出物アリコート中の第二のレポーター酵素の活性を定量する。好ましくは、第二の酵素は、ジオキセタン類と反応することができる加水分解酵素である。第二の酵素は、いかなる酵素であることもできるが、好ましくは、以下の酵素、すなわち、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ及びカルボキシルエステラーゼから選択される。もっとも好ましい実施態様は、第二の酵素がβ−ガラクトシダーゼを含む実施態様である。そして、内在性酵素の基質の分解によって生じる光信号を計測することにより、同じ細胞抽出物アリコート中の内在性酵素の活性を定量する。すべての定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して順次に実施される。
【００８５】
もう一つの実施態様で、第一及び第二のレポーター基質及び内在性酵素基質は異なり、基質の少なくとも１種がジオキセタン類である。本発明は、第二のレポーター酵素による第二のレポーター基質の分解によって生じる信号を誘発することと、次いで、内在性酵素の活性を誘発することとをさらに含む方法を含む。
【００８６】
２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する方法の一つの実施態様では、第一のレポーター酵素の基質及び第二のレポーター酵素の基質である第二の基質を細胞抽出物アリコートに加える。好ましい実施態様では、第一の酵素はルシフェラーゼであり、第二の酵素は加水分解酵素であり、第一の基質はルシフェリンであり、第二の基質はジオキセタン類である。レポーター酵素は、好ましくは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエステラーゼ及びルシフェラーゼから選択される。より好ましいレポーター酵素はルシフェラーゼである。
【００８７】
この好ましい実施態様では、第一の酵素の基質を第二の酵素の基質と同時に加え、第二の酵素の基質を同時に加える間にルシフェラーゼ−ルシフェリン反応から生じる光信号を計測することにより、第一のレポーター酵素の基質によって生じる化学発光信号を計測する。次いで、アリコートのpHを上げることによって第一のレポーター酵素を実質的に不活性化する促進物質溶液を加える。すると、アリコートのpHの上昇が、第二のレポーター酵素−第二の基質反応の蓄積生成物からの発光を活性化する。促進物質溶液は、上述したように第二のレポーター酵素のジオキセタン基質の分解によって生じる光信号を増強するエンハンサー、たとえばポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドを含む。そして、同じ細胞抽出物アリコート中で化学発光信号の強さを読むことにより、第二のレポーター酵素の活性を計測する。ルシフェリンが第一の基質として使用される実施態様では、この基質の存在が、第二の基質によって生じる光信号をさらに増強する。好ましい実施態様では、第二のレポーター酵素からの光放出の減衰ののち、１，２−ジオキセタン基質を加えて内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼからの光放出を開始させる。この例では、基質はCDP-Star（登録商標）１，２−ジオキセタンである。この順次検出プロトコルは、一つの細胞抽出物サンプルの単管／ウェルアッセイで、２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素を含む３種の酵素の活性の検出を可能にする。
【００８８】
図３は、ルシフェリン、Galacton（登録商標）及びCDP-Star（登録商標）をそれぞれ用いるルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼの活性の順次検出を示す。アッセイは、以下、例３で記載するように、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素及び内在性アルカリホスファターゼ活性を含み、精製ルシフェラーゼを添加されているΨ２ＢＡＧα及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞抽出物の混合物を用いて実施した。抽出物混合物及びルシフェラーゼ添加量を調節して、酵素ごとに類似した光の強さを生成した。まず、ルシフェリン基質及びGalacton（商標）基質の添加ののち、ルシフェラーゼ触媒光放出を計測した。ルシフェラーゼ信号の減衰中にGalacton（登録商標）基質のβ−ガラクトシダーゼ触媒開裂が進行し、促進物質、エンハンサーを含有する高pH溶液の添加によってGalacton（登録商標）アニオン中間体の分解からの光放出を誘発した。β−ガラクトシダーゼ信号の十分な減衰ののち、CDP-Star（登録商標）を加えると、それが、アルカリホスファターゼによって触媒されるグロー光放出反応を誘発する。また、内在性アルカリホスファターゼの直前にルシフェラーゼの検出を実行した（図１）。
【００８９】
２種以上のレポーター酵素、たとえば２種のレポーター酵素を使用する本発明の実施態様では、アリコート中の第二のレポーター酵素の存在が第一のレポーター酵素の活性又はその第一の酵素によって生じる光信号の計測を妨害してはならない。これらの実施態様では、本方法はさらに、第一の酵素の活性を定量したのち第二のレポーター酵素の酵素活性を高めることを含む。これは、酵素活性を活性化する当該技術で公知の方法によって達成することができる。特に好ましい実施態様では、アリコートのpHを調節して、第二の定量の前に第二の酵素が活性になる環境を創り出す。たとえば、アルカリホスファターゼを第二のレポーター酵素として使用する実施態様では、アルカリホスファターゼの活性はアルカリ性pHで高まるため、アリコートのpHを上げる。
【００９０】
いくつかの好ましい実施態様では、第一のレポーター酵素を実質的に不活性化することにより、第一の酵素の基質から生じる信号を減らす。第一の酵素を実質的に不活性化する方法は当該技術で公知である。しかし、これらの方法は、第二の酵素の活性の計測を妨害してはならない。たとえば、一つの実施態様では、アリコートのpHを変化させることにより、第一の酵素を実質的に不活性化する。酵素に依存して酸又は塩基をアリコートに加えることによってpHを変化させて、第一の酵素にとって厳しい環境を提供することができる。好ましくは、アリコートのpHを上げる。この上げられたpHが第一の酵素を不活性化し、それにより、第一の酵素がその基質をさらに分解し、光信号を発することを防ぐ。もう一つの実施態様では、アリコートを加熱して第一の酵素を分解させる。あるいはまた、特定の阻害剤を加えて第一の酵素を不活性化することもできる。阻害剤の例は、アルコール、たとえばイソプロパノールもしくはエタノール、界面活性剤、たとえばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）又は酵素に結合し、酵素を不活性化する基質類似物を含む。
【００９１】
上述したように、本発明の方法は、内在性酵素の活性を計測する。本方法は、サンプル中に存在するレポーター酵素の活性から独立して細胞数の計測を提供することにより、アッセイにおける細胞の正規化を可能にする。本方法はまた、同じくレポーター酵素の活性から独立して、試験条件によって影響されるおそれのある細胞増殖の観察を可能にする。たとえば、非特異的効果を生じさせる特定の化合物、たとえば成長因子を細胞に加える場合、レポーター構築物を制御する機能とは違って、正常な細胞機能が生じることを確認することが望ましい。本発明の方法はこの確認を可能にする。
【００９２】
最後に、試験条件、すなわち潜在的薬物、温度又はpHの変化などの細胞毒性効果を本発明の方法によって評価することができる。細胞毒性の一つの測定は、細胞から培地の中に解放される内在性酵素の活性の量又は変化を計測することによって得ることができる。加えて、存在する生きた細胞の指標として酵素活性を計測することにより、細胞毒性を潜在的に測定することができる。これは、細胞毒性の一つの計測値である細胞溶菌の測定を提供する。そのようなアッセイは、培地中に存在する細胞とで本発明の方法を使用して実施することができる。
【００９３】
本発明はまた、一つのサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素の少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を検出するためのキットを提供する。このようなキットは、各酵素を定量するための試薬と、各酵素の基質（基質の少なくとも１種はジオキセタン類である）とを含む。キットはまた、水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む促進物質溶液を含むことができる。場合によっては、促進物質溶液は、pHを上げ、第一の酵素の活性を低下させ、第二の酵素による第二の基質の酵素的分解から生じる信号を増大させるか（たとえば三酵素アッセイの場合）、第一のレポーター酵素の活性を低下させ、内在性酵素の基質の分解によって生じる信号を増大させる（たとえばレポーター／内在性酵素アッセイの場合）ため、約８〜約１４のpHの水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む。
【００９４】
ポリマー性エンハンサーは、好ましくは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン又はポリマー第四級オニウム塩を含む。ポリマー第四級オニウム塩は、ポリビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire（商標））もしくはポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald（登録商標））ならびにポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald II（登録商標））を含む。好ましいポリマーエンハンサーは、ポリビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire（商標））又はポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドを含む。
【００９５】
以下の例は、本発明を例示するために提供するが、本発明の範囲をいかなるふうにも限定することを意図しない。
【００９６】
例
試薬、セルライン及び計器
溶菌溶液、CDP-Star（登録商標）、Galacton（登録商標）及びSapphire-II（商標）及びポリマー性エンハンサー、Phospha-Light（商標）アッセイバッファ、Dual LightバッファＡ及びＢならびにプラスミドｐＣＭＶ／β−Ｇａｌを含むアッセイ試薬がTropix社（Bedford, MA）から市販されている。
【００９７】
セルラインは、Ψ２ＢＡＧα（CRL-9560、ATCC、Rockville, MD）、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養された安定に挿入されたレトロウイルス構築物からバクテリアβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＮＩＨ／３Ｔ３誘導体及びＡＰ３Ｔ３ｂ（O' Connor, K. L., et al., Biotechniques, 1994; 17: 502-9）、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養されたＮＩＨ／３Ｔ３（CRL-1658、ATCC）マウス胚繊維芽細胞、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養された非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢａｌｂｃ／３Ｔ３誘導体を含む。すべての培地及び血清は、Sigma（St. Louis, MO）から得た。プラスミドｐＧＬ３は、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーターを構成的に発現する。SuperFect（商標）トランスフェクション試薬は、QIAGEN（Valencia, CA）から得た。供給されたプロトコルにしたがってトランスフェクションを実施した。
【００９８】
組織培養処理した、底が透明で不透明白色の９６ウェル型マイクロプレート（カタログ番号３６１０、Corning Costar社 Action, MA）でアッセイを実施した。TR717（商標）マイクロプレートルミノメータ（Tropix）又はTurnerモデル２０ｅ単管ルミノメータ（Turner Designs, Mountain View, CA）のいずれかで光放出を計測した。
【００９９】
例１：ルシフェラーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル
ｐＧＬ−３でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェル型マイクロタイタプレートに播種し、アッセイの前にＰＢＳで一度洗浄した。まず、Dual-Light（登録商標）試薬を使用してルシフェラーゼ信号を計測した。次に、０．１％Triton X-100を含有するDual-Light（登録商標）バッファＡ２５μlを各ウェルに加え、Dual-Light（登録商標）バッファＢ７５μl／ウェルを注入した。そして、TR717ルミノメータで光放出を計測した。ルシフェラーゼ信号の減衰ののち、CDP-Star（登録商標）基質／Sapphire-II（商標）エンハンサー溶液１００μlを加え、内在性ＡＰで触媒された光放出を計測した。試薬の添加から１５分以内にＡＰ反応からの光放出が最大値に達した。アッセイの結果を図１に示す。ＡＰ検出バッファを早め（たとえばルシフェラーゼを計測した直後）に添加すると、ルシフェラーゼ信号が減少することが注目された（この効果は図示せず）。
【０１００】
例２：β−ガラクトシダーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル
ｐＣＭＶ／β−ＧａｌでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェル型マイクプレートに２×１０4個／ウェルで播種し、アッセイの前にＰＢＳで一度洗浄した。次に、ＨＥＰＥＳ、ＭｇＣｌ2、Triton X-100及びGalacton基質を含む反応バッファ１００μlを各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。そして、Sapphire-II（商標）エンハンサー含有促進物質５０μlを各ウェルに注入し、β−ガラクトシダーゼで触媒された光放出をTR717ルミノメータで計測した。β−ガラクトシダーゼ信号の減衰ののち、希釈CDP-Star（登録商標）基質５０μlを加え、内在性ＡＰで触媒された光放出を計測した。アッセイの結果を図２に示す。
【０１０１】
例３：三酵素アッセイ：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−ガラクトシダーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル
Dual-Light（登録商標）バッファＡ２５μlを溶解物１０μlに加え、３０秒間インキュベートした。次に、１：１００Galacton（登録商標）を含むDual-Light（登録商標）バッファＢ１００μlを加えた。４．５分後、０．３mol/Lジエタノールアミン／２０％エンハンサーを含むバッファＣの１００μlを加えた。最後に、１０分で、バッファＣ中１．２mmol/L CDP-Star（登録商標）１００μlを加えた。アッセイを通じてTurnerモデル２０ｅルミノメータで光放出を連続的に計測した。
【０１０２】
抽出物を、ルシフェラーゼレポーター、β−Ｇａｌレポーター及び最後に内在性アルカリホスファターゼ酵素の活性に関して順次に試験した。β−ＧａｌのGalacton（登録商標）１，２−ジオキセタン基質を改質促進物質製剤とともに使用して、改質Dual-Light（登録商標）アッセイ試薬でルシフェラーゼ及びβ−Ｇａｌ活性を計測した。エンハンサー含有促進物質の添加が、Galacton（登録商標）基質とのβ−Ｇａｌ触媒分解反応からの光放出を開始させ、ルシフェラーゼ触媒光放出を消光した。Galacton（登録商標）基質からの光放出の減衰ののち、CDP-Star（登録商標）１，２−ジオキセタン基質を加えてアルカリホスファターゼからの光放出を開始させた。この連続検出プロトコルは、一つの細胞抽出物サンプルの単管／ウェルアッセイで、２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素を含む３種の酵素の活性の検出を可能にする。
【０１０３】
例４：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの反応速度
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーター酵素を構成的に発現する、ｐＧＬ３−コントロールでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３マウス胚繊維芽細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（５×１０4個／ウェル）中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイの前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。Triton X-100及びGlucon（商標）基質を含む改質ルシフェラーゼ反応バッファを加え（２５μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。このインキュベーション中、Gluconのβ−グルコシダーゼ触媒脱グリコシル化が、蓄積する中間体を生成することがわかった。このpHでは、認められるβ−グルコシダーゼ活性はなかった。次に、プレートをTR717マイクロプレートルミノメータに配置し、ルシフェリンを含有するバッファ７５μl／ウェルを注入した。注入の直後、ルシフェラーゼ触媒光放出を１秒間計測した。ルシフェラーゼ信号は「閃光」として現れ、急速に減衰した。約１５分後、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液を注入し（１００μl／ウェル）、光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。高pH促進物質溶液が、蓄積したGlucon（商標）反応生成物の分解からの光放出を誘発した。アッセイの結果を図４に示す。促進物質の添加が残留ルシフェラーゼ信号の消光を生じさせ（図示せず）、したがって、ルシフェラーゼ信号が完全に減衰するのを待つ必要はないことがわかった。
【０１０４】
例５：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの検出範囲
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーター酵素を構成的に発現する、ｐＧＬ３−コントロールでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３マウス胚繊維芽細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイの前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。Triton X-100及びGlucon（商標）基質を含む改質ルシフェラーゼ反応バッファを加え（２５μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、プレートをTR717マイクロプレートルミノメータに配置し、ルシフェリンを含むバッファ７５μl／ウェルを注入した。注入の直後、光放出を１秒間計測した。約１５分後、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液を注入し（１００μl／ウェル）、光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。ルシフェラーゼレポーター酵素及び内在性β−グルコシダーゼ活性の定量を、トランスフェクトされた細胞１００個未満から５０，０００個までの細胞数の大きさの３のオーダーに及ぶダイナミックレンジで達成した。このアッセイの結果を図５に示す。
【０１０５】
例６：ＰＬＡＰ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの反応速度
ＡＰ３Ｔ３ｂ細胞、非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／３Ｔ３誘導体を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（１．２×１０4個／ウェル）中、底が透明で側壁が白い、組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイを実施する前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのインキュベーションを室温で実施した。リン酸ナトリウム、pH５．５、ＭｇＳＯ4、Ｌ−ホモアルギニン、Triton X-100及びGlucon（商標）を含むβグルコシダーゼ反応バッファを加え（５０μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含有する促進物質溶液（１００μl／ウェル）に注入した直後、光放出を１秒／ウェルでTR717マイクロプレートルミノメータで計測した。約１５分の遅延ののち、CDP-Star（登録商標）を加え（５０μl／ウェル）、ＰＬＡＰ触媒光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。まず、内在性β−グルコシダーゼ触媒反応からの光信号を計測した。この反応では、１，２−ジオキセタン基質の酵素的脱グリコシル化が、最初１５分のインキュベーション中に蓄積するアニオン中間体を生成することがわかった。促進物質溶液の添加がアニオンの分解からの光放出を誘発し、β−グルコシダーゼ酵素活性を不活性化した。β−グルコシダーゼ触媒光放出は数分以内に減衰した。CDP-Star（登録商標）なしの反応で見られるように、促進物質の添加後４０分で光信号はほぼ完全に減衰した。最後に、CDP-Star（登録商標）を加えて胎盤アルカリホスファターゼ触媒光放出を開始させた。基質添加後約２０分で最大強さのグロー光放出反応速度を得た。アッセイの結果を図６に示す。
【０１０６】
例７：ＰＬＡＰ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの検出範囲
ＡＰ３Ｔ３ｂ細胞、非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／３Ｔ３誘導体を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイを実施する前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。リン酸ナトリウム、pH５．５、ＭｇＳＯ4、Ｌ−ホモアルギニン、Triton X-100及びGlucon（登録商標）基質を含むβグルコシダーゼ反応バッファを加え（５０μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液（１００μl／ウェル）を注入し、ただちに、光放出を１秒／ウェルでTR717マイクロプレートルミノメータで計測した。約１５分の遅延ののち、CDP-Star（登録商標）基質の希釈物を加え（５０μl／ウェル）、ＰＬＡＰ触媒光放出を計測した（１秒／ウェル）。ＰＬＡＰレポーター酵素及び内在性β−グルコシダーゼ活性の定量を、２倍の大きさの線形範囲で、すなわち約３００〜５０，０００個／ウェルの範囲で達成した。アッセイの結果を図７に示す。二重プロトコルで得られた各酵素の検出感度は、それぞれを単独で計測した場合（アッセイプロトコルに１種の基質しか含めないことによる）に得られる感度と同一であった。したがって、ＰＬＡＰ検出の感度は、Glucon（商標）からの残留信号によって影響されなかった。
【０１０７】
本明細書で言及するすべての引用例を全体として取り込む。
【０１０８】
本発明を一般的に、また、その好ましい実施態様及び具体例を参照して詳細に説明した。しかし、本開示を考慮すると、本発明の本質及び範囲に該当する変形及び改良を当業者が加えうることが理解されよう。請求の範囲の詳説によって除外されない限り、これらの変形は本発明の範囲に入る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びＡＰ（内在性酵素）の二酵素アッセイのグラフ表示を提供する。
【図２】 β−Ｇａｌ（レポーター酵素）及びＡＰ（内在性酵素）の二酵素アッセイのグラフ表示を提供する。
【図３】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）、β−ガラクトシダーゼ（レポーター）及びアルカリホスファターゼ（内在性酵素）の多酵素アッセイのグラフ表示を提供する。
【図４】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの反応速度のグラフ表示を提供する。
【図５】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの検出範囲のグラフ表示を提供する。
【図６】 ＰＬＡＰ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの反応速度のグラフ表示を提供する。
【図７】 ＰＬＡＰ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵素アッセイの検出範囲のグラフ表示を提供する。
Claims (32)
- 哺乳動物、バクテリア又は酵母、又は該細胞の細胞抽出物を含む一つのサンプルアリコート中の多種のレポータ酵素及び内在性酵素の活性を計測するためのアッセイ方法であって、該アッセイ方法は、
（ａ）ある酵素に対して特異的な酵素基質の、該酵素による分解によって生じる光信号を計測することによって酵素の活性を定量する工程と、
（ｂ）計測される該アリコート中に存在する酵素ごとに工程（ａ）を繰り返す工程とを含み、
該酵素が、レポータ酵素及び内在性酵素からなる群より選択され、
該酵素の少なくとも１種が内在性酵素であり、そして該酵素の少なくとも１種がレポータ酵素であり、第二の酵素の活性を定量する前に第一の酵素の活性を低下させる、アッセイ方法。 - 少なくとも１種の酵素基質がジオキセタン類である、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該ジオキセタン類が、式Ｉ
Ｔは、炭素原子６〜１２個を有する置換又は非置換のシクロアルキル環又はスピロ結合によって４員ジオキセタン環に結合されたポリシクロアルキル基であり、
Ｙは、蛍光クロモフォアであり、
Ｘは、水素、直鎖状又は分岐鎖状のアルキルもしくはヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロアルキル基、アラルキル基、アルカリール基又は酵素開裂性基であり、
Ｚは、水素、ヒドロキシル又は酵素開裂性基である。
ただし、Ｘ又はＺの少なくとも一方が酵素開裂性基でなければならず、
該酵素開裂性基が、酵素によって開裂されると、ジオキセタンに結合した負の電荷を帯びた基を形成し、それが分解して発光物質を形成し、
該負の電荷を帯びた基が基Ｙを含む）
を有する、請求項２記載のアッセイ方法。 - 少なくとも１種の酵素が加水分解酵素である、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該アリコートのｐＨを変化させることによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項４記載のアッセイ方法。
- 該アリコートを加熱することによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項４記載のアッセイ方法。
- 阻害剤を加えることによって該第一の酵素を不活性化することによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項４記載のアッセイ方法。
- 該第一の酵素と第一の酵素基質の反応を、該第一の酵素基質が分解するまで進行させることによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項４記載のアッセイ方法。
- 第一の酵素基質の量を減らすことによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項４記載のアッセイ方法。
- 促進物質溶液を加えることによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項４記載のアッセイ方法。
- 内在性酵素が、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼからなる群より選択される、請求項１記載のアッセイ方法。
- レポータ酵素が存在し、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエステラーゼ、酸ホスファターゼ及びグルコシダーゼからなる群より選択される、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該レポータ酵素がβ−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼである、請求項１２記載のアッセイ方法。
- エンハンサを加えて該光信号を増強する、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該エンハンサが、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン及びポリマー第四級オニウム塩からなる群より選択される、請求項１４記載のアッセイ方法。
- 該ポリマー第四級オニウム塩が、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド、ポリビニルトリブチルスルホニウムクロリド、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド、ナトリウムフルオレセイン、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド、ナトリウムフルオレセイン、第四級アンモニウム−ホスホニウムポリマー、アンモニウム−スルホニウムポリマー及びスルホニウム−ホスホニウムポリマーからなる群より選択される、請求項１５記載のアッセイ方法。
- レポータ酵素及び内在性酵素のみが、測定される酵素である、請求項１記載のアッセイ方法。
- レポータ酵素基質及び内在性酵素基質を同時に該アリコートに加える、請求項１７記載のアッセイ方法。
- レポータ酵素基質の前に内在性酵素基質を該アリコートに加える、請求項１７記載のアッセイ方法。
- レポータ酵素の定量ののち、内在性酵素基質及びエンハンサを含む酵素検出バッファを該アリコートに加える、請求項１７記載のアッセイ方法。
- 第一のレポータ酵素、第二のレポータ酵素及び内在性酵素が、測定される唯一の酵素であり、該第一のレポータ酵素の定量の間、第一のレポータ酵素基質及び第二のレポータ酵素基質が該アリコート中に存在する、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該第一のレポータ酵素の活性の定量ののち、該第二のレポータ酵素の酵素活性を高める、請求項２１記載のアッセイ方法。
- 該第一のレポータ酵素基質の分解によって生じる光信号が、該第二のレポータ酵素基質の分解の産物が光信号を生じさせないｐＨで起こる、請求項２１記載のアッセイ方法。
- 第一のレポータ酵素、第二のレポータ酵素及び内在性酵素が、測定される唯一の酵素であり、該第一のレポータ酵素の定量の間、第二のレポータ酵素基質が該アリコートに存在せず、第二のレポータ酵素基質の添加によって該第二のレポータ酵素の活性を誘発する、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該第二のレポータ酵素の定量ののち、内在性酵素基質を加える、請求項２４記載のアッセイ方法。
- 該サンプルが細胞溶解物の標本である、請求項１記載のアッセイ方法。
- 該サンプルが培地中の全細胞を含む、請求項１記載のアッセイ方法。
- アッセイの前に該全細胞を洗浄する、請求項２７記載のアッセイ方法。
- 該サンプルが培地なしの全細胞を含む、請求項１記載のアッセイ方法。
- アッセイの前に該サンプルを洗浄する、請求項２９記載のアッセイ方法。
- 計測される各酵素の活性を同時に定量する、請求項１記載のアッセイ方法。
- 計測される各酵素の活性を定量する工程を、計測される酵素ごとに順次に実施する、請求項１記載のアッセイ方法。
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