JP4365026B2 - ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファートを使用した化学発光反応 - Google Patents
ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファートを使用した化学発光反応 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4365026B2 JP4365026B2 JP2000530578A JP2000530578A JP4365026B2 JP 4365026 B2 JP4365026 B2 JP 4365026B2 JP 2000530578 A JP2000530578 A JP 2000530578A JP 2000530578 A JP2000530578 A JP 2000530578A JP 4365026 B2 JP4365026 B2 JP 4365026B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- substituted
- compound
- aryl
- alkyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K3/00—Materials not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
- C09K11/07—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials having chemically interreactive components, e.g. reactive chemiluminescent compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光を産出するための化学発光方法と組成物に関する。特に、本発明は、酸素存在下でジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物とを反応させることを含む、化学発光を産出する方法に関する。また、本発明は、加水分解酵素の作用により、化学発光を産出するための化学発光方法と組成物に関する。化学発光を産出する方法は、加水分解酵素を、ヒドロキシ基の一つが酵素切断可能基で保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と反応させてジヒドロキシ芳香族化合物を遊離させ、これを複素環式エノールフォスファート化合物と反応させて化学発光を産出することを含む。本発明は、さらに、イムノアッセイ、核酸プローブアッセイなどを含む特異結合対アッセイにおいて、加水分解酵素と酵素標識化特異結合パートナーとを含む被検体を検出するためのアッセイにおける本発明の化学発光方法の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１．加水分解酵素の化学発光検出。
アルカリホスファターゼとβ−ガラクトシダーゼなどの加水分解酵素は、しばしば、酵素結合アッセイにおいて、生物学的分子およびその他の興味のある被検体、例えば薬剤、ホルモン、ステロイドおよび腫瘍マーカーなどに対するマーカーもしくは標識（ｌａｂｅｌ）として用いられる。さらに、ホスファターゼ酵素、例えばアルカリホスファターゼ（AP）と酸性ホスファターゼ（AcP）は、医者と獣医の診断において臨床的に重要である。これらの酵素の化学発光の検出には、試料中における酵素量、または酵素標識化被検体もしくは被検体に対する標識化特異結合パートナーの量を、定量的に測定するための、安全で、使いやすく、かつ感度の高い手段が、要求される。特定の加水分解酵素の標識を定量するための多くの化学発光反応の概要が、当該分野において公知である。これらの概要の多くが、複雑かつ高価であり、多数の酵素もしくは複数の試薬を必要とする。大量試験用にそのような方法を商業的に採用することは、遅れている。
【０００３】
ａ．アクリダン（Ａｃｒｉｄａｎ）化合物とアルカリホスファターゼとの化学発光反応。
１９９７年１月１５日に出願されたＰＣＴ出願ＵＳ９７／０００１５号に、ホスファターゼ酵素と、複素環式基およびエノールホスファート基を含む化合物との化学発光反応について記載されている。また、ホスファターゼと複素環式エノールホスファート化合物との化学発光反応において、カチオン性芳香族化合物を組み込むことによって、より改善されることが記載されている。本発明の方法に対して、これらの出願において開示された方法では、ホスファート基を切断するための、ホスファターゼ酵素と複素環式エノールホスファート化合物との反応に依存している。本発明では、ホスファート基を切断するために酵素を用いない。
【０００４】
ｂ．還元剤の生成を含む反応。
アルカリホスファターゼによって触媒作用を及ぼされたホスファートエステルから、還元剤を生成する化学発光方法が報告されている。（M.Maeda, A.Tsuji, K.H.Yang, S.Kamada, Biolum. and Chemilum. Current Status, 119-22(1991); M.Kitamura, M.Maeda, A.Tsuji, J. Biolumin. Chemilumin., 10, 1-7(1995); H.Sasamoto, M,Maeda, A.Tsuji, Anal. Chim. Acta, 306, 161-6(1995))。還元剤を、酸素およびルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）と反応させ、光を産出する。代表的な還元剤は、アスコルビン酸、グリセリン、ＮＡＤＨ、ジヒドロキシアセトン、コルチゾール、およびフェナシルアルコールを含む。また、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０４４００号と文献（H.Arakawa, M.Maeda, A.Tsuji, Anal. Biochem., 199, 238-242(1991)）に、インドキシルホスファート化合物と、脱リン酸化において還元種を生成するその他の関連ホスファート化合物を用いた、アルカリホスファターゼの化学発光アッセイ法が記載されている。化学発光は、ルシゲニンもしくはその他の発光増幅剤の存在下で、Ｈ2Ｏ2またはスーパーオキシドイオンとの反応によって産出する。
【０００５】
Ｍａｈａｎｔに対する米国特許第５５８９３２８号に、化学発光反応について開示されており、それによれば、インドキシルエステル、チオインドキシルエステル、およびベンゾフランエステルが、酵素によって加水分解され、それによって、スーパーオキシドが産出する。この発光は、ルシゲニンなどの化学発光産出剤を添加することによって、増幅される。ルシゲニンは、スーパーオキシドと反応することによって、化学発光を産出する。
【０００６】
ｃ．酵素学的にトリガー可能なジオキシエタン。
保護化フェノールトリガー基を有する安定１，２−ジオキシエタンから、保護基が除去されると、化学発光分解が生じる[A.P.Schaap, T.S.Chen, R.S.Handley, R.DeSilva,およびB.P.Giri, Tetrahedron Lett., 1155(1987);A.P.Schaap, R.S.Handley,およびB.P.Giri, Tetrahedron Lett., 935(1987);A.P.Schaap, M.D.Sandison,およびR.S.Handley, Tetrahedron Lett., 1159(1987);A.P.Schaap, Photochem. Photobiol.,47S, 50S (1988)]。そのような酵素学的トリガー可能なジオキシエタンは、加水分解酵素との反応によってトリガーされ、それによって、次数規模でジオキシエタンの化学発光分解効率が増大する。そのようなトリガー可能なジオキシエタンの数多くの実施例が、当該分野において公知である。しかしながら、ほとんどのトリガー可能なジオキシエタンが有する不都合は、酵素不在下で、除々に熱分解することによって、または、非酵素学的加水分解によって、バックグラウンドの化学発光を生じる傾向にあることである。
【０００７】
ｄ．ルシフェリン誘導体。
ホタルルシフェリンのホスファートとガラクトシド誘導体が、公知である（N.Ugarova, Y.Vosny, G.Kutuzova, I.Dementieva, Biolum. and Chemilum. New Perspectives, P.StanleyおよびL.J.Kricka,版、Wiley, Chichester, 511-4(1981);W.Miska, R.Geiger, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 119-28(1989)）。ホタルルシフェリン誘導体を、適切な酵素で処理することにより、ホタルルシフェリンが遊離し、これが第２工程で、ルシフェラーゼおよびＡＴＰと反応して光を産出する。
【０００８】
ｅ．ルミノール誘導体。
ルミノールのホスファート誘導体とＮＡＧ誘導体が、公知である（K.Sasamoto, Y.Ohkura, Chem. Pharm. Bull., 38,1323-5(1991);M.Nakazono, H.Nohta, K.Sasamoto, Y.Ohkura, Anal. Sci.,8,779-83(1992)）。ルミノール誘導体を、適切な酵素で処理することにより、ルミノールが遊離し、これが続く工程で、 ヘキサシアノ鉄（III）酸塩と反応して光を発する。
【０００９】
ｆ．酵素結合法。
ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０７９１１号において、加水分解酵素を用い、保護化フェノール化合物からフェノール増強剤を酵素学的に生成させることが開示されている。フェノール化合物は、ペルオキシダーゼ酵素と共に、アクリダンカルボン酸誘導体の化学発光酸化を増強する。米国特許第５３０６６２１号は、同様の酵素結合反応について開示しており、ジヒドロフタルアジンイオンが、ペルオキシダーゼの化学発光基質として用いられている。これらの方法では、ジヒドロキシ芳香族化合物がペルオキシダーゼ増強剤でないため、ヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基で保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を使用できない。ホスファターゼ酵素などの加水分解酵素を、酵素結合反応を介して測定するためのその他多くの化学発光方法とアッセイが、公知である。そのような方法が、A.Tsuji, M.Maeda, H.Arakawa, Anal. Sci.,5,497-506(1989)において、一覧に編集されている。全ての酵素結合反応では、２種以上の酵素を要し、化学発光種としてルミノールもしくはルミノール類似体、ルシゲニンもしくは細菌のルシフェリンのいずれかの使用が必要である。
【００１０】
上記方法の多くには、発光シグナルを産出するために、複数の剤や酵素が必要であるという欠点がある。検出感度に優れていることが証明されたにも関わらず、付加された費用、もしくは操作の煩雑性が妨げとなって、これらの方法は商業的に受容されていない。これらの感度レベルに達するが、酵素基質に加えてさらなる酵素や剤を必要としない、加水分解酵素を検出および定量するための化学発光方法が有益である。本発明は、そのような方法と化合物を提供する。
【００１１】
２．電子転移剤（ＥＴＡ）の酵素遊離。
ａ．比色および蛍光検出。
米国特許第４９５２４９５号には、検出可能な種を産出する電子転移反応を仲介することができる基質の酵素学的形成によって加水分解酵素を測定するための方法について開示および請求している。ＥＴＡは、一実施態様において、置換化ヒドロキノン化合物などの還元基質を含むことができる。検出される種は、着色性もしくは蛍光性の生成物を形成する。さらに、検出可能な種が、発色性、蛍光性もしくは化学発光性の種と連結基を介して連結したキノンを含むシフト可能な検出可能種であることができることが示されている。そのようなシフト可能な化合物以外、化学発光で検出可能ないかなる種についても示されていないし、提案されていない。本発明に記載した複素環式エノールホスファート化合物について、全く提案されていないし、示されていない。
【００１２】
ｂ．アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の電流測定検出。
ＡＰによるモノホスファートからのヒドロキノンの酵素学的産出、ベンゾキノンを産出するための電極表面におけるヒドロキノンの酸化、電子を基質のグルコースから転移する第２の酵素のグルコースオキシダーゼによるヒドロキノンの再生を含むアルカリホスファターゼの電流測定検出法が知られている。ＡＰ量は、電流の増加として検出される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明の目的は、ジヒドロキシ芳香族化合物を、ヘテロ環式基およびエノールホスファート基を含む第２の化合物と反応させることによって、化学発光を産出する方法であって、反応を酸素存在下で行わせて、化学発光を産出する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、
ａ）ジヒドロキシ芳香族化合物を産出するために、加水分解酵素を、ヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基によって保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と反応させること、および
ｂ）化学発光を産出するために、ジヒドロキシ芳香族化合物を、複素環式エノールホスファート化合物と反応させること、
を含む、加水分解酵素の作用によって化学発光を産出する方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明の目的は、ジヒドロキシ芳香族化合物と、複素環式エノールホスファート化合物を含む化学発光組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、加水分解酵素との反応時に化学発光を産出する組成物であって、ヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基で保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と、複素環式エノールホスファート化合物とを含む組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を反応させることを含む被検体のアッセイを行う方法を提供することである。
【００１７】
更なる目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を反応させることを含む被検体のアッセイを行う方法であって、複素環式エノールホスファート化合物が特異結合対員の標識として提供される方法を提供することである。
【００１８】
更なる目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を反応させることを含む被検体のアッセイを行う方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、化学発光を産出し、化学発光をサンプル中の加水分解酵素量に関係づけるために、加水分解酵素を含む、もしくは含むと推測される試料を、ヒドロキシ基の一つが酵素切断可能な基で保護された保護化ジヒロキシ芳香族化合物と、複素環式エノールホスファート化合物の存在下で反応させることを含む、試料中の加水分解酵素を検出する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の更なる目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物とを反応させることを含む被検体の測定を行う方法であって、加水分解酵素が、特異結合対員の標識として提供される方法を提供することである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
定義：
アルキル−１から２０炭素を含む、分枝鎖状、直鎖状、もしくは環状の炭化水素基。ここに用いられる低級アルキルは、８炭素までを含むアルキル基を指す。
【００２２】
アルケニル−少なくとも一つのＣ−Ｃ二重結合を含み、２から２０炭素を含む分枝鎖状、直鎖状、もしくは環状の炭化水素基。ここに用いられる低級アルケニルは、８炭素までを含むアルケニル基を指す。
【００２３】
アルキニル−少なくとも一つのＣ−Ｃ三重結合を含み、２から２０炭素を含む分枝状鎖もしくは直鎖の炭化水素基。ここに用いられる低級アルキニルは、８炭素までを含むアルキニル基を指す。
【００２４】
被検体−アッセイによって、試料中における存在または量が測定される基質。被検体は、有機的かつ生物学的分子を含み、特異的結合親和性を有する特異的結合対が存在する。典型的な被検体は、限定されないが、一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンを含む。また、その他の典型的な被検体は、加水分解酵素、加水分解酵素阻害剤、およびジヒドロキシ芳香族化合物を含む。
【００２５】
アリール−１から５炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であって、Ｈ以外の１以上の置換基で置換することができる。
【００２６】
生体臨床学的分析−興味のある被検体としての生物学的由来試料を分析すること。該分析は、イムノアッセイ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡシークエンスアッセイ、コロニーハイブリダイゼーション、遺伝子発現分析、ハイスループット薬剤スクリーニング、感染物質もしくは病原菌の検出などであることができる。
【００２７】
ジヒドロキシ芳香族化合物−芳香環式系を含む芳香環化合物であって、同様に一つ以上五つ以下の炭素環を含み、偶数の環の炭素原子によって隔てられた二つのヒドロキシ基で置換されている芳香環化合物。この置換のパターンは、ベンゼン環のオルト−とパラ−置換のパターン、および例えば、ナフタレン環の１，２−、１，４−、もしくは２，６−置換のパターンによって例示される。ビフェニルおよびビナフチルなどのジヒドロキシ置換化ビアリール環式系は、二つのヒドロキシ基を隔てる偶数の環の炭素原子があるものに限定する定義の範囲内であるとみなされる。ジヒドロキシ芳香族化合物は、さらにヒドロキシ基、すなわちトリヒドロキシ、テトラヒドロキシなどで置換することができ、さらに、少なくとも一対のヒドロキシ基が、偶数の環の炭素原子によって隔てられていることを規定する定義の範囲内である。
【００２８】
ハロゲン−フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子。
【００２９】
試料−アッセイされる一つ以上の被検体を含む、もしくは含むと推測される液体。化学発光反応法によって分析される典型的な試料は、体液を含む生体試料、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞溶解液、組織抽出液等である。他のタイプの試料は、食物試料と環境試料、例えば土壌、水などを含む。
【００３０】
特異的結合対−相互に結合親和性を示す二つの基質。実施例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体もしくは抗体−抗体対、相補のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭化水素、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合タンパク質、および核酸−抗核酸抗体を含む。
【００３１】
「複素環式エノールホスファート化合物」、もしくは「ジヒドロキシ芳香族化合物」、もしくは「保護化ジヒドロキシ芳香族化合物」に関して、唯一の事例であることを明示しない限りは、記載された種の一つ以上を含むことを企図することを注記する。
【００３２】
偶数の環の炭素原子によって隔てられた少なくとも二つのヒドロキシ基で置換された芳香環式系を含むある種のジヒドロキシ芳香族化合物が、複素環式基とエノールホスファート基を含む複素環式エノールホスファート化合物である第２の化合物と、酸素存在下で反応し、容易に検出可能な化学発光を産出することを、予期せず見出した。本発明のジヒドロキシ芳香族化合物の範囲内にまとめられる典型的な芳香環式系は、ベンゼン、ビフェニル、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、ベンゾピレンおよびナフタセン環式系を含む。
【００３３】
ジヒドロキシ芳香族化合物の好ましい基は、式Iを有する。
【化３８】
式中、Ｒ1とＲ3の少なくとも一方はＯＨ基であり、Ｒ1もしくはＲ3の他方と、Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5は、各々独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、カルボキシルエステル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ6、ホルミル−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、アルキルカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ6、アリールカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ9およびハロゲン基から選択され、式中、隣接する基の対が一緒になって５もしくは６員脂肪環もしくは芳香環を完結することができ、式中Ｒ6は低級アルキル基、Ｒ7とＲ8は各々Ｈもしくは低級アルキル基であり、Ｒ9はアリール環式基である。
【００３４】
式Iのより好ましい化合物は、式中、Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5が、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される化合物である。より好ましくは、各Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5が、水素であり、Ｒ1が、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される。
【００３５】
二つのヒドロキシ基を有するジヒドロキシ芳香族化合物に加えて、同じ６員環に置換されたその他のジヒドロキシ芳香族化合物も、ジヒドロキシ芳香族化合物の範囲内であり、本発明の方法に有効であることが認識される。ヒドロキシ基が異なる６員環にある二芳香環式系を含むジヒドロキシ芳香族化合物が、代表的である。本発明の方法に有用であるジヒドロキシ芳香族化合物のいくつかの特別な実施例を、本発明の範囲を限定するためではなく、例示するために、表１に列挙する。
【００３６】
表１．ジヒドロキシ芳香族化合物
ＤＨＡ−１ ２−クロロヒドロキノン
ＤＨＡ−２ ヒドロキノン
ＤＨＡ−３ ２−フェニルヒドロキノン
ＤＨＡ−４ ３，３，３’，３’−テトラメチル−１，１’−スピロビスイン
ダン−５，５’，６，６’−テトロール，
ＤＨＡ−５ ２，３，５，６−テトラフルオロヒドロキノン
ＤＨＡ−６ ２−メチルヒドロキノン
ＤＨＡ−７ ２−メトキシヒドロキノン
ＤＨＡ−８ カテコール
ＤＨＡ−９ １，２−ジヒドロキシアントラセン
ＤＨＡ−１０ ７，８−ジヒドロキシ−６−メトキシクマリン
ＤＨＡ−１１ １−メチル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−
テトラヒドロイソキノリン
ＤＨＡ−１２ ４−アミノレソルシノール
ＤＨＡ−１３ １，４−ジヒドロキシナフタレン
ＤＨＡ−１４ １，２，４−トリヒドロキシベンゼン
ＤＨＡ−１５ ９，１０−ビス（４−ヒドロキシフェニル）アントラセン
ＤＨＡ−１６ ４−ブロモレソルシノール
ＤＨＡ−１７ ２，３−ジヒドロ−９，１０−ジヒドロキシ−１，４−
アントラキノン
ＤＨＡ−１８ エラグ酸
ＤＨＡ−１９ ２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド
ＤＨＡ−２０ ２，３−ジクロロ−５，８−ジヒドロキシ−１，４−
ナフトキノン
【化３９】
【００３７】
本発明の方法に有用である複素環式エノールホスファート化合物と、化学発光を産出するための組成物は、式：
【化４０】
（式中、Ｒ10は、光の産出を許容する有機基であり、各Ｒ11−Ｒ18は独立して選択され、式中、隣接する基の対がベンゼン−融合環を完結することができ、Ｒ19はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される５０原子までを含む有機基であり、ＺはＯとＳ原子から選択され、各Ｍは独立してＨとカチオン性中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である）
を有する。二重結合異性体が可能である式IIIの化合物において、該二重結合異性体の混合物を用いることができる。
【００３８】
前記式IIIに関して、典型的な環の構造は、アスタリスクで環外二重結合部位を表示した以下の構造を含む。全ての潜在的な置換パターンを明示しておらず、各環の位置で水素以外の置換基を含むことができると理解される。
【化４１】
【００３９】
基Ｒ19は、好ましくは、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、アラルキルおよび置換化アラルキル基から選択されることが好ましい。より好ましい基Ｒ19は、置換化および非置換化低級アルキル基と置換化および非置換化ベンゼン基を含む。
【００４０】
上記化合物の全てにおいて、基Ｒ11−Ｒ18は、各々独立して、Ｈもしくは光を産出するための置換基であり、通常、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含む。本発明の代表的な置換基は、限定されないが、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換化アミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノおよびスルホナート基を含む。隣接する基の対、例えばＲ11−Ｒ12は、互いに結合し、ベンゼン融合環を形成することができる。特別の置換とその効果を、以下の特別の実施例に例示するが、如何なる点においても、本発明の範囲を限定しないものとみなされる。
【００４１】
各基Ｍは、独立して、水素原子もしくはカチオン性中心である。カチオン性中心は、ナトリウムイオンＮａ+、アンモニウムイオンＮＨ4 +などの原子基、または１以上の陽性荷電部位を有する分子の一部など、陽性に荷電された原子を意味する。後者の実施例は、米国特許出願第５４５１３４７号に記載されたジカチオン性化合物と、米国特許出願第５３９３４６９号に記載された多重カチオン性基を有するポリマー性化合物を含む。カチオン性中心の陽性電荷は、あらゆる単位値、すなわち１、２、３などを取ることができる。典型的なカチオン性中心は、限定されないが、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第四級アンモニウムイオン、第四級ホスホニウムイオンを含み、原子価で要求される数で存在する。電気的中性のために、二つの基が式Iの化合物中に存在することが要求される場合、それらは同じものであっても異なるものであっても良い。好ましい対イオンは、アルカリ金属イオンである。より好ましいものは、ナトリウムおよびカリウムイオンである。
【００４２】
有機基Ｒ10は、光の産出を許容するあらゆる基であることができる。これは、基Ｒ10としてのいかなる基の存在によっても、最終的に化学発光を産出する式IIIの化合物の性能を妨げないことを意味する。後者によって、式IIIの化合物が、酸素存在下で、ジヒドロキシ芳香族化合物と反応した時に、速やかに化学発光が産出され、１以上の化学発光中間体の産出を伴うことを意味する。
【００４３】
基Ｒ10は、好ましくは、基における原子の原子価を満足するために要求されるＨ原子の必要数を除き、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含む。基Ｒ10として機能できる基は、限定されないが、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、アラルキルおよび置換化アラルキル基を含む。例えばイオン性基または極性基など、Ｈ原子以外の置換基は、化合物の特性を修飾するため、もしくは最終のホスファート化合物の合成を好都合にするために、様々な数で、Ｒ10の炭素鎖もしくは環上の選択された部位に組み込ませることができる。そのような特性は、例えば、産出される化学発光量、酵素との反応効率、放射光の最大強度、放射光の持続時間、放射光の波長、反応培地中での可溶性等を含む。特定の置換およびそれらの効果を、以下の特定の実施例において例示するが、これらは、如何なる点においても、本発明の範囲を限定しないものと見なされる。
【００４４】
化合物の好ましいクラスは、以下の式IIIaを有し、式中、ＺはＯまたはＳ原子であり、Ｒ19は低級アルキル基であり、Ａｒは少なくとも一つの炭素環式芳香環を含むアリール環式基であり、さらに置換されることができる。
【化４２】
基Ｒ11からＲ18は、同一であっても異なっていても良く、各々、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含み、光の産出を許容する置換基であり、限定されないが、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、ベンジルなどのアラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換化アミノ基、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノおよびスルホナート基を含むことができる。好ましい化合物の一セットは、水素と低級アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどから選択された基Ｒ11からＲ18を有する。その他の好ましい化合物は、式IIIbを有し、式中、ＺはＯまたはＳであり、Ａｒはフェニル基、置換化フェニル基、もしくはナフチル基から選択される。
【化４３】
【００４５】
複素環式エノールホスファート化合物のその他の好ましいセットは、化合物が標識として使用されることを許容する基−Ａ−Ｑを含む。好ましい標識化合物は、Ｒ10もしくはＲ18もしくはＲ11からＲ18部位のいずれか一つにおける置換基として、基−Ａ−Ｑを含む。化合物を標識する複素環式エノールホスファートの標識化合物の実施例は、式IIIc、dもしくはeを有する。
【化４４】
【００４６】
基−Ａ−Ｑにおいて、Ａは、Ｃ1−Ｃ10アルキレン、およびＣ2−Ｃ10オキシアルキレン基から選択されたスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）基であり、Ｑは、被検体もしくは特異結合パートナー等に、抱合される分子と共有結合を形成し得る連結基である。連結基Ｑは、ハロゲン、ジアゾ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＣＨＯ、酸無水物、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、スクシンイミドオキシカルボニル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、マレイミド、シアノ、トリアゾールおよびテトラゾール基、および当該分野において一般的に公知である類似体などの求電子部分であることができる。あるいは、連結基Ｑは、ヒドロキシル、−ＣＯＯＨ、チオール、第一級アミノ、第二級アミノ基などの求核部分であることができる。式IIIeの化合物において、基Ａ−Ｑが二つのベンゼン環のどちらか一方に存在できることが企図される。
【００４７】
以下の特定の化合物は、本発明に記載された新規な化学発光法における使用のために、特に好ましいものである：
【化４５】
【００４８】
緩衝水溶液中における式IIIの化合物と、ジヒドロキシ芳香族化合物との反応により、室温で速やかに最大強度に到達する明るい化学発光を産出した。
【化４６】
【００４９】
この点で、この発見の特別のメカニズムの説明を前置きすることは望ましくないのだが、化学発光は、形式的に、複素環式エノールホスファート化合物の二重結合の酸化から得られたケトン化合物IVの電気的励起状態から放射されると考えられる。化学発光を産出するための必要な条件は、反応によりIVの励起状態を形成し、IVが蛍光を放つのに十分なエネルギーが産出されることである。活性酸化剤は、酸素、酸素の還元化型、例えばスーパーオキシドイオン、過酸化イオンもしくは過酸化ラジカルなど、またはジヒドロキシ芳香族化合物の酸化生成物、例えばキノンもしくはセミキノン型などである。
【００５０】
本発明の反応および方法から放射される化学発光は、典型的には、１００−２００ｎｍ幅の放射帯域として産出され、電磁スペクトルの近紫外から可視領域における波長で最大強度を示す。典型的な最大強度の波長、λmaxは、３５０−５００ｎｍの範囲にある。共有結合した発蛍光団を担持している式IIIのホスファート化合物は、分子内エネルギーを伝達し、結果として、発蛍光団の励起状態から長波長で放射されることが企図される。
【００５１】
本発明の方法によって放射された化学発光の光は、可視的に、もしくはルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンターもしくは化学光量計等を用いたその他の好適な公知手段によって、検出することができる。各検出手段は、異なるスペクトル感度を有する。人間の眼は緑色光に対して最適であり、ＣＣＤカメラは赤色光に対して最大の感度を示し、ＵＶ、青色光、もしくは緑色光に対して最大の感応を有するＸ線フィルムが利用できる。検出機器は、適応性、価格、利便性、および恒久的な記録の作製が要求されるかを考慮して、選択される。
【００５２】
酸素存在下における式Iと式IIIの化合物の反応を含む本発明の化学発光反応は、例えば、公知の光スティックおよび関連する新規なアイテム、もしくは非常灯など、化学光源としての使用を見い出せる。他は、生体臨床分析、食物分析もしくは汚染物質の環境分析において、試料中における式Iの化合物の検出方法において、使用できる。
【００５３】
また、本発明の化学発光反応は、検出可能な標識化特異結合対によって、試料中の被検体のアッセイを行う方法においても用いることができる。そのようなアッセイ方法の一実地態様において、化合物Iもしくは化合物IIIが、標識化合物として提供される。標識化合物は、反応性標識基を担持する置換基を含み、それによって、反応性基が、特異結合対の一員と共有結合を形成し、検出可能な標識化特異結合対員を形成することができる。さらに、該分析方法は、標識された特異結合対を形成するための、標識された特異結合対員と被検体を検出するためのパートナーとの反応、および、必要に応じて、被検体を検出するための化学発光を産出するための、標識された特異結合対と化合物Iもしくは化合物IIIとの反応を含む。好ましくは、複素環式エノールホスファートは標識として提供される。
【００５４】
アッセイ方法のその他の実施態様において、化合物Iもしくは化合物IIIは、特異結合対員に抱合されたリポソーム中に内包された検出可能な種として提供される。検出可能な種を含むリポソームの調製方法、および化学発光アッセイにおける検出可能な標識としてのそれらの使用は、ここに参照として組み込まれる米国特許第５５９５８７５号に記載されている。
【００５５】
アッセイ方法のその他の実施態様において、化合物Iおよび化合物IIIは、相補する特異結合対員に付着するように、各々、別々のラテックス粒子物質に内包されて提供される。検出可能な種を含むラテックス粒子物資の調製方法と化学発光分析において検出可能な標識としての使用が、ここに参照として組み込まれる米国特許第５５７８４９８号に記載されている。
【００５６】
アッセイ工程における化学発光測定時に、測定は、光強度を、アッセイ工程における結果に応じた時間の固定点で測定すること、もしくは一連の時間点で測定すること、または瞬間最大強度を測定すること、または特定した光強度に到達するまでの光の総量もしくは時間を測定することを含む。
【００５７】
本発明の実施方法において、酸素は、典型的には、反応溶液中、外気と平衡状態で溶解されて供給される。溶液上の外気は、溶解酸素濃度を高めるために、酸素に富み、または酸素と置換させることができる。また、溶液を、加圧可能な密閉容器中に入れ、容器中の気体の空間を酸素で加圧することができる。その他の酸素の送達方法、例えば、空気もしくは酸素を散布すること、または化学反応によって酸素を産出することは、ここに記載および請求した方法の範囲内であると見なされる。
【００５８】
その他の態様で、本発明は、ｐＨ７−１０．５の範囲の水溶液、濃度０．００１−２０ｍＭの範囲の式Iの化合物、および濃度０．００１−２０ｍＭの式IIIの化合物を含む、化学発光を産出するための試薬組成物に関する。好ましくはｐＨが８−１０の範囲であり、より好ましくはｐＨが９−１０の範囲である。
【００５９】
好ましい実施態様において、組成物は、さらに、アニオン性界面活性剤を、最終濃度が好ましくは０．００１から５ｍｇ／ｍＬの範囲となるように、より好ましくは０．０１から２．５ｍｇ／ｍＬの範囲となるように含む。
【００６０】
化学発光を産出するための好ましい試薬組成物は、ｐＨが８−１０の範囲である水性緩衝液と、濃度約０．０５−５ｍＭの式Iのジヒドロキシ芳香族化合物と、濃度約０．０５−５ｍＭの式IIIcのアクリダンホスファートと、任意で、好ましくは濃度０．０１から２．５ｍｇ／ｍＬの間のアニオン性界面活性剤を含む。より好ましい組成物において、式Iのジヒドロキシ芳香族化合物は、ヒドロキノン、２−クロロヒドロキノン、２−フェニルヒドロキノン、および２，３，５，６−テトラフルオロヒドロキノンから選択される。
【００６１】
加水分解酵素の化学発光の検出
本発明の化学発光反応は、酵素学的化学発光反応の基礎として役立つことができ、これにおいて、加水分解酵素と、ヒドロキシ基の一つが酵素切断可能基で保護された保護化ジヒドロキシ芳香族化合物との反応によって、酵素切断可能基が除去され、ジヒドロキシ芳香族化合物が産出される。ジヒドロキシ芳香族化合物は、酸素存在下で、複素環式エノールホスファートと反応し、化学発光を産出する。好ましい保護化ジヒドロキシ芳香族化合物は、式IIを有し、式中、ジヒドロキシ芳香族化合物Iのヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基で保護されている。これらの方法において有用である保護化ジヒドロキシ芳香族化合物は、式IIの化合物を含む：
【化４７】
（式中、Ｒ1もしくはＲ3のうちの一方はＯＸ基であり、Ｘは加水分解酵素によって除去できる基であり、Ｒ1もしくはＲ3の他方と、Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5は、各々独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、カルボキシルエステル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ6、ホルミル−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、アルキルカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ6、アリールカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ9およびハロゲン基から選択され、式中、隣接する基が一緒になって５もしくは６員脂肪環もしくは芳香環を完結することができ、Ｒ6は低級アルキル基、Ｒ7とＲ8は各々Ｈもしくは低級アルキル基であり、Ｒ9はアリール環式基である）。
【００６２】
本発明のジヒドロキシ芳香族化合物において、Ｘ基は、加水分解酵素によって切断できるあらゆる基であることができる。加水分解酵素は、酵素分類系のクラスＥ．Ｃ．３．１もしくは３．２に分類されるそれらの酵素であり、概して、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼおよびエステラーゼ酵素を含む。特別の実施例は、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラクターゼ、カルボキシルエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。可能なＯ−Ｘ基は、使用条件下で安定であり、酵素との反応により切断することができるあらゆる化学脱離基を含み、限定されないが、アルキルもしくはアリールカルボキシルエステル、リン酸塩と硫酸塩を含む無機オキソ酸塩、およびα−Ｄ−ガラクトシドとβ−Ｄ−ガラクトシド、α−グルクロニドとβ−グルクロニド、およびα−グルコシドとβ−クルコシド基を含む酸素−ピラノシド基、および当該分野において通常の技術を有するものにとって明らかである類似体を含む。好ましい加水分解酵素は、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼである。
【００６３】
式IIの化合物と加水分解酵素との反応により、複素環式エノールホスファート化合物（III）の存在もしくは不在下で、ジヒドロキシ芳香族化合物が形成されることができ、それによって、Iの形成と化学発光の産出が、併発してもしくは連続して進行することができる。
【００６４】
化学発光を産出する一つの方法において、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を、緩衝液中の複素環式エノールホスファート化合物の存在下で、適切な加水分解酵素と反応させる。ｐＨは、酵素活性と化学発光反応を促す値、通常は、約ｐＨ８から１０の間に、好ましくは約ｐＨ９から１０の間に維持する。この方法で反応を行うことにより、持続的な化学発光シグナルを得る。
【００６５】
本発明の化学発光を行う代替方法において、保護化ジヒドロキシ化合物を、加水分解酵素と、緩衝液中もしくは固体表面上で、第１のｐＨを好ましくは５．０−９．５の範囲とし、第１の時間を好ましくは数秒から数分までの範囲として反応させる。次いで、この溶液、もしくは該溶液の測定した一部を、複素環式エノールホスファート化合物および任意でアニオン界面活性持を含む第２の溶液と反応させ、光をピーク強度で測定する、または固定した時間もしくは放射光が消光するまでの時間で光を積算することにより測定する。第２の溶液のｐＨは、８以上、好ましくは９から１０の間であり、典型的には緩衝溶液である。
【００６６】
化学発光を産出するこの方法は、大量の試料を同時に処理してまとめて測定するアッセイにおいて有利である。また、この２ステップ方法は、β−ガラクドシダーゼもしくは酸性ホスファターゼなど、酸性から中性のｐＨ（５−８）において、最適の活性を有する加水分解酵素を測定するために有用である。また、そのような化学発光反応もしくはアッセイに組み込ませることができる任意のステップは、全てのさらなる酵素反応を停止させるために、第１の時間後に酵素阻害剤を反応系に添加することである。
【００６７】
これら二つの反応方法は、様々な因子と特定の使用もしくは適用によって、選択されることが望ましい。それにも関わらず、両方法は有効である。酸性ｐＨが最適である酵素の場合は、二つの独立したステップにおける反応を、各々、最適のｐＨ、温度、イオン強度、緩衝塩などで行うことが望ましい。
【００６８】
複素環式エノールホスファート存在下における加水分解酵素と化合物IIとの反応により化学発光を産出する場合、反応は、通常、温度５℃から５０℃、好ましくは２０℃から４０℃で、ｐＨ７から１０．５、好ましくは８．５から１０の水性緩衝溶液中で行わせる。化合物IIIは、濃度１μＭから２０ｍＭ、好ましくは５０μＭから５ｍＭの間で用いられる。化合物IIは、濃度１μＭから２０ｍＭ、好ましくは５０μＭから５ｍＭの間で用いられる。
【００６９】
また、アニオン性界面活性剤は、本発明の化学発光反応において用いられる。アニオン性界面活性剤は、ジヒドロキシ芳香族化合物不在下における複素環式エノールホスファートからの化学発光のバックグラウンドを低減する。使用時に、アニオン性界面活性剤は、最終反応溶液中に、０．０１から５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１から２．５ｍｇ／ｍＬの間の量で用いられる。アニオン性界面活性剤増強剤は、アルキルサルファートとアルキルスルホナートを含む。界面活性剤の各カテゴリーの代表的な構造のより詳細な一覧を、界面活性剤におけるあらゆる標準的な専門書において見出すことができる。好ましい界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳなどのＣ10−Ｃ20のアルキルスルホナートである。
【００７０】
酵素学的化学発光方法の重要な使用は、被検体の存在もしくは被検体量を、化学発光反応によるアッセイ工程において検出するためである。方法は、被検体を含むと推測される試料を本発明の化学発光化合物と加水分解酵素と接触させるステップと、産出した光を質的方法で検出するステップと、定量が所望される場合には産出した光量を被検体量と関係づけるステップを含む。光強度と被検体量との関係は、被検体の既知濃度で検量曲線を構築することによって、容易に識別することができる。化学発光化合物は、典型的には、濃度約１０-5Ｍから約１０-2Ｍ、好ましくは約１０-4Ｍから１０-3Ｍで用いられる。加水分解酵素は、溶液中で検出する場合、好ましくは約１０-9Ｍ以下である。
【００７１】
本発明の方法によってアッセイできる被検体の複数のカテゴリーがある。これらは、さらなる加水分解酵素の添加が不必要である場合に、加水分解酵素を含む。例えば、加水分解酵素がアルカリホスファターゼである場合、そのような測定は、例えば、患者の肝機能状態の指標として、もしくはある病状のインデックスとして、血清中のアルカリホスファターゼのレベルを測定する場合に使用される。また、前立腺の酸性ホスファターゼの測定も、前立腺腫瘍の臨床的診断のインデックスとして有用である。
【００７２】
本発明の化学発光アッセイによる酵素活性の検出および測定は、遺伝子発現アッセイにおいても使用される。β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびアルカリホスファターゼ、特に排出された胎盤において産出されたアイソザイムが、レポーター遺伝子として有用である（J.Alam, J.Cook, Anal.Biochem.188, 245-54(1990)）。この種のアッセイにおいて、レポーター酵素を発現する責任遺伝子を、生物の遺伝物質中にプラスミドを介して、プロモーターもしくはエンハンサー配列の近傍にクローニングする。転写活性におけるプロモーターもしくはエンハンサー配列の効果を、レポーター酵素の産出レベルを測定することによって評価する。
【００７３】
また、この場合に用いられる被検体は、加水分解酵素阻害剤を含む。阻害剤は、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物などの第２の基質と競合することによって可逆的に作用する化合物、並びに酵素を不活化することにより不可逆的に作用する阻害剤を含む。例えば、アルカリホスファターゼ阻害剤は、無機ホスファート、レバミソール、テトラミソールと他のイミダゾ[１，２−ｂ]チアゾール、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−ホモアルギニンを含み、R.B. McComb, G.N.Bowers, S.Posen , Alkaline Phosphatase, Plenum Press, New York 1979, pp.268-275, 332-334, 394-397, 410-413において同定されている。その他の加水分解酵素阻害剤は、通常、酵素アッセイの分野における当業者に公知である。酵素阻害剤を検出するために本発明の化学発光反応を用いる場合、好適な加水分解酵素を、式IIの化合物と反応させてジヒドロキシ芳香族化合物Iを形成させ、阻害剤基質の存在および不在下で、これを複素環式エノールホスファートIIIと反応させ、結果より阻害剤の存在もしくは量を比較測定する。放射された化学発光の差により、阻害剤の存在が示される。
【００７４】
さらに、この場合に使用される被検体は、加水分解酵素で標識できる、もしくは酵素標識特異結合対を介して特異的に検出できる、様々なクラスの生物と生物学的分子を含む。酵素は、直接、標識として、被検体と結合した化合物に取り込まれることができる。あるいは、被検体結合化合物に対する少なくとも一つの酵素標識特異結合基質に、被検体結合化合物を結合させることができる。この形態の典型例は、オリゴヌクレオチドの酵素標識化検出を用いた核酸ハイブリダイゼーションアッセイである。あるいは、被検体結合化合物を、ビオチンなどの少なくとも一つの第２の特異結合基質で標識し、次いで、これをアビジンなど、第２の特異結合基質に対する酵素標識結合対に結合させることができる。
【００７５】
１以上の加水分解酵素に抱合できる生物学的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンを含む。また、生物学的分子と接着するための機能を有する、リポソーム、ミセル、小胞、ポリマーなど、加水分解酵素を含む、もしくは取り込む複合体を、本発明の方法において使用することができる。
【００７６】
酵素アッセイを行う技術は、公知である。ここに解説として実施例に提示されるガイダンスとともに、試料を調製するための様々な手順、試薬の適切な量と割合、反応時間の設定、検量曲線の構築などは、実験手順の一つとして工夫するために当業者が行う技術範囲内である。
【００７７】
反応は、加水分解酵素によって触媒されるので、検出可能な光量を産出するためには、非常に少量の酵素で十分である。 １ａｍｏｌ（１ｘ１０-18モル）以下の感度が達成されている。そのような少量の加水分解酵素を検出する性能により、本発明の化学発光技術は、酵素結合アッセイを用いた多くのタイプの被検体の分析に適している。 そのような分析およびアッセイでは、分析する試料中における被検体の含有量が少ない、もしくは試料量が限られていることにより、少量の加水分解酵素を検出する性能が要求される。このタイプのアッセイにおいて、アルカリホスファターゼは、特異結合対の一員に抱合される。実施例は、化学発光酵素結合イムノアッセイ、いわゆる酵素免疫結合アッセイもしくはＥＬＩＳＡなどである。そのようなアッセイは、一般的に手動型、並びに自動化多重試験イムノアッセイ系で用いられる。典型的なイムノアッセイにおいて、被検体のハプテン、抗原、もしくは抗体を、被検体に対する酵素標識特異結合対もしくは被検体の酵素標識類似体の存在または量を検出することによってアッセイする。様々なアッセイ型と免疫化学ステップを行うためのプロトコールが、当該分野において公知である。これらのアッセイは、概して二つのカテゴリーに属する。競合的アッセイでは、被検体および被検体の類似体、例えば検出可能な標識化被検体分子などとの特異抗体の免疫学的結合が特徴である。サンドウィッチアッセイでは、連続して、もしくは同時に、被検体と二つの抗体（一つは検出可能に標識化）とが結合する。そのように形成された検出可能な酵素標識化結合対は、本発明の化合物と方法によりアッセイすることができる。測定は、当該分野において通常に使用されるビーズ、チューブ、マイクロウェル、マグネット粒子、テスト用細片、膜、およびフィルターなどを含む個体表面もしくは支持物に付着させた酵素標識化種で行うことができる。また、検出可能な酵素標識化種は、溶液中に遊離している、もしくはリポソームなどの構造体に内包されて存在することができ、後者の場合には、リポソームを溶解して検出可能な酵素を遊離するために溶解剤が用いられる。
【００７８】
その他の代表的な使用は、ウェスタンブロッティング技術によるタンパク質の検出である。被検体として興味のあるタンパク質を含む試料を、電気泳動して分離する。分離したタンパク質を、毛管現象により、もしくは電場を使って、ブロッティング膜に写す。そのように写したタンパク質を、典型的には、第１の特異抗体と、第１の抗体を認識して結合する第２の酵素標識化抗体とを用いて、検出する。マーカー酵素活性の可視化は、被検体タンパク質の存在を反映する。本発明の方法をウェスタンブロッティングに適用するために、アルカリホスファターゼもしくはβ−ガラクトシダーゼなどの加水分解酵素に抱合させた第２の抗体を用いることができ、酵素基質として式IIの化合物と、化学発光剤として式IIIの化合物を使用した化学発光により、酵素活性を測定することができる。ビオチン化抗体とアビジン−酵素抱合体の使用などのこの技術の変形は、本発明の方法を用いて行うことができるアッセイの範囲内であると見なされる。
【００７９】
また、前述の抗原−抗体、ハプテン−抗体もしくは抗体−抗体対に加えて、特異結合対は、相補的なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン受容体、レクチン−炭化水素、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合タンパク質および核酸−抗核酸抗体を含むことができる。
【００８０】
本発明の検出方法の特に有用な適用は、酵素標識化核酸プローブの使用による核酸の検出である。酵素標識を使用した核酸の分析および化学発光検出の方法、例えば、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ検出、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリンティング、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークリフトが、十分に確立された技術である。酵素標識（例えば、ＡＰもしくはβ−ｇａｌ）は、オリゴヌクレオチドプローブとの直接的な抱合体として、もしくはオリゴヌクレオチドの捕捉体として存在することができ、もしくは当該分野の公知手段を使用した間接的な結合手段を介して取り込まれることができる。間接的な結合手段の実施例として、ハプテン−標識化オリゴヌクレオチドと抗ハプテン抗体−酵素抱合体、またはビオチン化オリゴヌクレオチドとアビジン−酵素抱合体の使用を含む。そのような核酸アッセイは、ブロッティング膜上、または当該分野において公知であるビーズ、チューブ、マイクロウェル、マグネット粒子、テスト用細片などを含む固体表面に付着させたオリゴヌクレオチドを使用した溶液中で行うことができる。
【００８１】
他の面において、本発明は、加水分解酵素との反応により化学発光を産出する試薬組成物であって、式IIIの化合物と酸素の存在下において、化学発光を産出する式Iのジヒドロキシ芳香族化合物を産出する式IIの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を含む試薬組成物に関する。試薬組成物は、ｐＨ７−１０．５の範囲である水性緩衝液、濃度０．００１−２０ｍＭの式IIの化合物、および濃度０．００１−２０ｍＭの式IIIの化合物を含む。加水分解酵素との化学発光反応のための製剤は、さらに、酵素活性を増強するもしくは維持するために、マグネシウムもしくは亜鉛などの金属塩を、濃度０．０１−１０ｍＭで含むことができる。
【００８２】
好ましい実施態様において、組成物は、さらにアニオン性界面活性剤を、最終反応溶液中、好ましくは濃度０．０１から５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１から２．５ｍｇ／ｍＬの間で含むことができる。
【００８３】
加水分解酵素との反応により、１ステップ方法で化学発光を産出するための好ましい試薬組成物は、ｐＨ８−１０の範囲である水性緩衝液、濃度約０．０５−５ｍＭの式IIの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物、濃度約０．０５−５ｍＭの式IIIcのアクリダンホスファート、および任意で、好ましくは濃度０．１から２．５ｍｇ／ｍＬのアニオン性界面活性剤を含む。より好ましい組成物において、式IIの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物は、式：
【化４８】
（式中、Ｘは、加水分解酵素によって除去できる基である）
を有する。
【００８４】
本発明の様々な局面をより十分に記載するために、化合物、調製方法、使用の組成と方法を記載した以下の実施例を提示する。実施例は、例示するものと見なされ、本発明の範囲を限定しない。
【００８５】
（実施例）
１．アクリダン誘導体１の合成
【化４９】
【００８６】
ａ．フェニルアクリジン−９−カルボキシラート。
アクリジン−９−カルボン酸（１ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、塩化チオニル（５ｍＬ）に懸濁し、反応混合物を３時間還流させた。溶媒を減圧下で除去して得た黄色固体を、アルゴン下で、ＣＨ2Ｃｌ2とピリジン（３５０μＬ）に溶解した。この溶液を氷槽で冷却し、ＣＨ2Ｃｌ2中のフェノール溶液（０．７８ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を、室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物を酢酸エチルに再度溶解し、水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、粗生成物を得て、これをシリカゲル（３０％酢酸エチル／ヘキサン）上、クロマトグラフで分離し、黄色固体として純生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．３５−７．５７（ｍ、５Ｈ）、７．６３−８．３７（ｍ、８Ｈ）。
【００８７】
ｂ．フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシラート・トリフルオロメタンスルホナート。
フェニルアクリジン−９−カルボキシラート（５３０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を、アルゴン下、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、メチルトリフルオロメタンスルホナート（１ｍＬ、８．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩攪拌し、厚い黄色沈殿物を得た。この沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥させて、黄色結晶を得た。1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ５．２２（ｓ、３Ｈ）、７．４７−７．７１（ｍ、５Ｈ）、８．２３−９．０７（ｍ、８Ｈ）。
【００８８】
ｃ．フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート。
フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシラート・トリフルオロメタンスルホナート（１０ｍｇ、０．０２１６ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（１０ｍＬ）に懸濁し、この混合物を１５分間還流し、透明な溶液を得た。塩化アンモニウム（８８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を溶液の一部に加え、次いで亜鉛（１０８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。亜鉛の添加により、直ちに溶液の黄色が消えた。無色の溶液を２時間還流した。反応混合液のＴＬＣにより、完全に無極性物質に転化していることが示された。溶液を濾過し、沈殿物をエタノール（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。濾過物を濃縮し、オフホワイトの固体を得て、これをＣＨ2Ｃｌ2中に再度溶解し、水（２ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、粗生成物を得て、（３０％酢酸エチル：ヘキサン）を使用した分取ＴＬＣによって精製した。純生成物を、オフホワイトの固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．３８（ｓ、３Ｈ）、５．１６（ｓ、１Ｈ）、６．８９−７．３７（ｍ、１３Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３３．２９、４９．７２、１１２．９３、１２０．１９、１２１．３６、１２５．７３、１２８．６７、１２９．１６、１２９．２６、１４２．３７、１５１．０４、１７０．２２。
【００８９】
ｄ．９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
三口フラスコを、アルゴンで浄化し、５ｍＬの無水ＴＨＦとジイソプロピルアミン（０．０４ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を注入した。フラスコを、ドライアイス−アセトン槽中で冷却した。この溶液に、ｎ−ブチルリチウム（０．１１６ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を加えた。２０分後、５ｍＬＴＨＦ中、ステップ（ｃ）からアクリダンエステル溶液（７０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、この溶液に加え、−７８℃で３０分間、攪拌を続けた。最終的に、３ｍＬＴＨＦ中、ＰＯＣｌ3溶液（０．０２７ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）とピリジン（０．０２３ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を加え、ドライアイス槽を取り去った。４５分後、ピリジン（０．０３９ｍＬ、０．５８ｍｍｏｌ）と３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．０９４ｍＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、一晩攪拌を続けた。次いで、それを濾過し、溶剤を濾過物から除去した。残留物を、分取ＴＬＣ（８０％酢酸エチル／ヘキサン）にかけ、純生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３５−２．５４（ｍ、４Ｈ）、３．４７（ｓ、３Ｈ）、３．７９−３．９０（ｍ、２Ｈ）、３．９８−４．０８（ｍ、２Ｈ）、６．８２５−７．４５（ｍ、１２Ｈ）、７．８０−７．８３（ｄｄ、１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１９．１２、１９．２４、３３．６３、６２．１９、６２．４９、８８．７２、９２．８２、１１２．４０、１１２．５２、１１５．８３、１１６．０７、１１９．６８、１２０．４４、１２０．７１、１２３．８１、１２６．６９、１２８．０３、１２８．２７、１２８．５８、１３０．０９、１４２．３９、１４３．０６、１６５．７３、２０２．０９。
【００９０】
ｅ．９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（１）。
５０ｍＬアセトン中、ビス（シアノエチル）ホスファート化合物溶液（２．８９７ｇ、５．７７ｍｍｏｌ）を、３０分間、アルゴンで浄化（ｐｕｒｇｅ）した。７．５ｍＬ水中、４７９ｍｇ（１２ｍｍｏｌ）ＮａＯＨのアルゴン浄化溶液を滴下し、溶液を一晩攪拌した。形成した沈殿物を濾過し、５０ｍＬのアルゴン浄化アセトンで洗浄し、風乾させた。３．４７３ｇの（１）を、水分を含んだ白色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．３２６（ｓ、３Ｈ）、６．８２５−７．４５（ｍ、１３Ｈ）、７．８０−７．８３（ｄ、１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３２．９５、１０２．８６、１０２．９２、１１２．３０、１１５．８５、１２０．６８、１２１．０１、１２２．３５、１２２．４１、１２２．６２、１２７．４８、１２７．６６、１２８．２３、１２９．６６、１４３．１７、１４３．３２、１４４．６６、１５６．０１；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．５８１（外部標準Ｈ3ＰＯ4に対して）。
【００９１】
２．アクリダン誘導体２の合成
【化５０】
【００９２】
ａ．９−（フェニチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２８４９５号に記載されたように調製したフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカリボキシラート（７０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ溶液（０．２４ｍｍｏｌ）に添加した。−７８℃で３０分間攪拌後、４ｍＬＴＨＦ中のＰＯＣｌ3（２５μＬ）とピリジン（２１μＬ）溶液を添加した。ドライアイス槽を取り去り、３０分間持続して攪拌した。ＴＬＣ（３０％酢酸エチル／ヘキサン）により、出発物質が完全に反応したことが示された。溶液を氷槽で冷却し、４ｍＬＴＨＦ中のピリジン（２１０μＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（４４μＬ）と反応させた。室温で一晩攪拌後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過除去し、反応溶液を減圧乾燥させた。残留物を分取ＴＬＣ（酢酸エチル）にかけ、生成物を単離した；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．４−２．６（ｍ、４Ｈ）、３．５２１（ｓ、３Ｈ）、３．８−４（ｍ、２Ｈ）、４．０−４．１（ｍ、２Ｈ）、６．９−７．２（ｍ、４Ｈ）、７．２２−７．５（ｍ、７Ｈ）、７．５５−８（ｄｄ、２Ｈ）。
【００９３】
ｂ．９−（フェニルチオホスホリルオキシメチリジン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（５）。
５０ｍｌアセトン中、ビス（シアノエチル）ホスファート化合物（０．５９ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を、アルゴンで３０分間浄化した。１０ｍＬ水中のＮａＯＨ１０４ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）のアルゴン浄化溶液を滴下し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成した沈殿物を、吸引濾過し、５０ｍＬのアルゴン浄化アセトンで洗浄し、風乾した。少量のアセトンを含む淡黄色の固体として０．５ｇの５を得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．３６（ｓ、３Ｈ）、６．９−７．４（ｍ、１１Ｈ）、７．７５−７．８（ｄ、１Ｈ）、８．２−８．２２（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．８５。
【００９４】
実施例３．アクリダン誘導体３の合成。
【化５１】
【００９５】
ａ．４’−クロロフェニル・アクリジン−９−チオカルボキシラート。
クロロ−チオフェノール（４．７５ｇ）と７．２２ｇのアクリジン−９−カルボニルクロライドを、１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、次いで１２．１ｍＬのピリジンに溶解させた。反応混合物は、橙褐色になった。混合物を、アルゴン下、一晩室温で攪拌した。溶媒を乾燥後、固体を、１００ｍＬのヘキサンで洗浄、濾過し、さらに１００ｍＬのヘキサンで洗浄、濾過し、次いで、５００ｍＬの水で洗浄、濾過し、風乾させた。淡茶黄色のチオエステル（８．７１ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．４７−７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．５８−７．６７（ｍ、４Ｈ）、７．８１−７．８６（ｍ、２Ｈ）、８．１２（ｄ、２Ｈ）、８．２９（ｄ、２Ｈ）。
【００９６】
ｂ．４’−クロロフェニルアクリダン−９−チオカルボキシラート。
４’−クロロフェニルアクリジン−９−チオカルボキシラート（２．０ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）中に溶解した。溶液をアルゴンで浄化し、次いで３．７２ｇの亜鉛粉末を添加し、次いで０．４５ｍＬの酢酸を添加した。ＴＬＣにより、出発物質が２０分で消費されたことが示された。混合物を濾過し、固体を、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。複合化ＣＨ2Ｃｌ2溶液を水（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。少量の生成物を分取ＴＬＣによって、特性分析用に精製した。残りの生成物は、さらなる精製を行わずに使用した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ５．２２（ｓ、１Ｈ）、６．２８（ｓ、１Ｈ）、６．７９−７．３１（ｍ、１２Ｈ）。
【００９７】
ｃ．４’−クロロフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート。
４’−クロロフェニルアクリダン−９−チオカルボキシラート（２．０ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）中に、アルゴン下、溶解させ、メチルトリフラート（６．５ｇ）を添加し、一晩攪拌した。褐色溶液を乾燥させ、粗生成物を、３０％酢酸エチル／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。それによって、純生成物（１．８ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．４７（ｓ、３Ｈ）、５．０９（ｓ、１Ｈ）、７．０２−７．３９（ｍ、１２Ｈ）。
【００９８】
ｄ．９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
１０ｍＬ無水ＴＨＦ中、４−クロロフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（０．７０ｇ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ溶液（１．４ｅｑ）に、−７８Ｃで滴下した。−７８Ｃで６０分間攪拌後、黄色溶液を、４ｍＬのＴＨＦ中、ＰＯＣｌ3（０．５１７ｇ）とピリジン（１．５２ｍＬ）溶液で、ゆっくりと処理した。３０分後にドライアイス槽を取り去り、１時間攪拌を続けた。溶液は黄色くなり、沈殿物を形成した。
【００９９】
混合物を氷槽中で冷却し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．８９ｇ）と１．０ｍＬピリジンで処理した。添加終了後、氷槽を取り去った。室温で一晩攪拌後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過除去し、ＴＨＦで洗浄した。複合化濾過物を減圧乾燥し、得られた褐色物質を酢酸エチルに溶解し、４ｘ２５ｍＬの水で洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥させ、濃縮した。残留物を、８０−１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーによって分離し、０．３２５ｇの生成物を単離した；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．４８−２．６４（ｍ、４Ｈ）、３．５３（ｓ、３Ｈ）、３．８６−４．１６（ｍ、４２Ｈ）、６．９４−７．９４（ｍ、１２Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ９．４８（ｐ）。
【０１００】
ｅ．９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（３）。
１０ｍＬアセトン中、ビス（シアノエチル）ホスファート化合物（０．３２５ｇ）溶液をアルゴンで浄化した。２．５ＭＮａＯＨ溶液（４７３μＬ）を添加し、さらに５００μＬの水を添加した。溶液をアルゴン下、一晩攪拌した。形成された沈殿物を、吸引濾過し、風乾した。元溶液には、モノ（シアノエチル）保護化化合物（１４０ｍｇ）が含まれていることが見出された。ＮａＯＨの再脱保護化を繰り返すことによって、二ナトリウム塩の第２の生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．３５（ｓ、３Ｈ）、６．９２−７．３６（ｍ、１０Ｈ）、７．７８（ｄ、１Ｈ）、８．２０（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．２２ｓ。
【０１０１】
実施例４．アクリダン誘導体４の合成。
【化５２】
【０１０２】
ａ．ナフチルアクリジン−９−チオカルボキシラート。
２−ナフタル−エネチオール（４８．８１ｇ）と、６５．１７ｇのアクリジン−９−カルボン酸から調製したアクリジン−９−カルボニルクロライドを、１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、次いで、１２０ｍＬのピリジンを添加した。混合物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌した。溶媒を乾燥後、固体を５００ｍＬヘキサンで洗浄、濾過し、さらに５００ｍＬヘキサンで洗浄、濾過し、次いで、６００ｍＬ水で洗浄、濾過し、一晩風乾させた。チオエステルを、１５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧乾燥させた。褐色固体としてチオエステル（９４．６７ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．５４−８．００（ｍ、１１Ｈ）、８．１７−８．３１（ｍ、４Ｈ）。
【０１０３】
ｂ．ナフチル１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボキシラート・トリフラート。
ナフチルアクリジン−９−チオカルボキシラート（２６．３８ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）に懸濁した。メチルトリフルオロメタンスルホナート（２４．５ｍｌ）を添加し、混合物を一晩攪拌した。混合物を濾過し、固体を、ＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）とヘキサン（５００ｍｌ）で洗浄した。風乾後、黄色固体として生成物（２８．８３ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ５．２０（ｓ、３Ｈ）、７．６６−７．７５（ｍ、２Ｈ）、７．８８−７．９２（ｍ、１Ｈ）、８．０３−８．０９（ｍ、２Ｈ）、８．１５（ｄ、１Ｈ）、８．２６（ｔ、２Ｈ）、８．４８（ｓ、１Ｈ）、８．６１−８．６８（ｍ、２Ｈ）、８．８０（ｄ、２Ｈ）、９．０３（ｄ、２Ｈ）。
【０１０４】
ｃ．ナフチル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート。
ナフチル１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボキシラート・トリフラート（６５．５０ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（１０００ｍＬ）に、アルゴン下、懸濁し、氷酢酸（２１．２ｍｌ）と亜鉛（４０．４３ｇ）を添加した。一晩攪拌後、ＴＬＣにより、出発物質が消失し、新しい生成物の形成が示された。反応混合物を、シリカゲル吸着床に濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2を減圧除去した。得られた淡黄色固体を、イソプロパノール（５００ｍｌ）中で攪拌し、濾過し、さらにイソプロパノール５００ｍｌで洗浄し、風乾した。これによって、純生成物（４６．３６ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．４７（ｓ、３Ｈ）、５．１３（ｓ、１Ｈ）、７．００−７．０６（ｍ、４Ｈ）、７．２５−７．４９（ｍ、７Ｈ）、７．７０−７．７９（ｍ、４Ｈ）。
【０１０５】
ｄ．９−（ナフチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
６００ｍＬ無水ＴＨＦ中のナフチル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（１７．３２ｇ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ溶液（１．２５ｅｑ．）に、−７８Ｃで滴下した。−７８Ｃで９０分間攪拌後、橙褐色溶液を、１５０ｍＬＴＨＦ中のＰＯＣｌ3（２０．８０ｇ）とピリジン（５０ｍＬ）溶液で、穏やかに処理した。ドライアイス槽を６０分後に取り去り、攪拌を１時間続けた。溶液は褐色になり、沈殿物を形成した。
【０１０６】
混合物を、３−ヒドロキシプロピオニトリル（２７．８ｍｌ）で処理した。室温で一晩攪拌後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過除去し、ＴＨＦで洗浄した。複合化濾過物を減圧乾燥し、得られた褐色の油脂を、５０−１００％酢酸エチル−ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーで分離し、生成物を単離した。黄色の油脂を、ＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）に溶解し、水（４５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧乾燥させた。これにより、黄色固体として生成物（１７．７６ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３３−２．５３（ｍ、４Ｈ）、３．５３（ｓ、３Ｈ）、３．８２−４．０６（ｍ、４Ｈ）、６．９３（ｔ、１Ｈ）、７．０３（ｄ、１Ｈ）、７．１０−７．１８（ｍ、２Ｈ）、７．２５−７．５５（ｍ、５Ｈ）、７．７９−７．９２（ｍ、５Ｈ）、７．７９−７．９２（ｍ、５Ｈ）、８．０２（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−９．６９（ｐ）（外部標準Ｈ3ＰＯ4に対して）。
【０１０７】
ｅ．９−（ナフチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（４）。
２００ｍＬアセトン中のビス（シアノエチル）ホスファート化合物（１７．２８ｇ）を、アルゴンで浄化した。５０ｍｌ水中のＮａＯＨ（２．７６ｇ）溶液を添加し、該溶液を、アルゴン下、一晩攪拌した。形成された沈殿物をアセトン中２０％水（３００ｍＬ）で吸引濾過洗浄し、減圧乾燥させた。淡黄色の固体として、生成物（１５．０７ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．２２（ｓ、３Ｈ）、６．６７（ｄ、１Ｈ）、６．８７（ｔ、１Ｈ）、７．０１（ｔ、１Ｈ）、７．０８−７．１５（ｍ、２Ｈ）、７．２３（ｄ、１Ｈ）、７．３１−４４（ｍ、３Ｈ）、７．５１（ｓ、１Ｈ）、７．５９（ｄ、２Ｈ）、７．７３（ｄ、１Ｈ）、７．８６（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．３０（ｓ）。
【０１０８】
実施例５．付加的に調製したさらなる複素環式エノールホスファート。
また、以下の式ＩＶの化合物を調製し、本発明の化学発光反応に用いた。
【化５３】
【０１０９】
Ｒ11−Ｒ16は、示さない限りＨである。化合物６−８は、二重結合異性体の混合物として得られた。化合物５−１４の各々は、実施例１−４に記載された一般的な合成方法により調製した。さらに、式：
【化５４】
[式中、Ｖは、ｔ−ブチル、ＣＨ3、ＯＣＨ3、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＯＣＨ3、ＣＮおよびＮＯ2、ならびに式：
【化５５】
（式中、Ｕは、ｐ−Ｉ、ｐ−ＣＨ3、ｍ−ＯＣＨ3、ｏ−Ｃｌ、ｍ−Ｃｌ、ｏ−Ｂｒ、ｍ−Ｂｒ、ｐ−Ｂｒおよびｐ−ＮＯ2、並びにこの式で３，４−ジクロロ−、２，５−ジクロロ−、および２，６−ジクロロフェニル基を有する化合物）の化合物である]
の化合物を調製し、ジヒドロキシ芳香族化合物との反応時に化学発光を産出させる。
【０１１０】
実施例６．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシフェニルホスファート、二ナトリウム塩の調製。
ヒドロキノンを、０℃でＣＨ2Ｃｌ2中、塩化ベンゾイルとピリジンとの反応により、収量６２％で、一安息香酸エステルとして産出した。ジクロロホスファート誘導体を、１０当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルと反応させて、ビス（シアノエチルホスファート）を８９％収量で産出した。シアノエチルとベンゾイル保護基を、室温で一晩、水性ＮａＯＨ／アセトンで加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、二ナトリウム塩として、４−ヒドロキシフェニルホスファートを産出した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ６．５６（ｄ、１Ｈ）、６．９２（ｔ、１Ｈ）。
【０１１１】
実施例７．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の２−ヒドロキシフェニルホスファート、二ナトリウム塩。
カテコールを、０℃でＣＨ2Ｃｌ2中、塩化ベンゾイルとピリジンとの反応により、収量６２％で、一安息香酸エステルとして保護化した。エステルを、０℃で、ＣＨ2Ｃｌ2中、過剰量のＰＯＣｌ3とピリジンで、リン酸化した。ジクロロホスファート誘導体を、１０当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルと反応させて、ビス（シアノエチルホスファート）を、収量９０％で産出した。シアノエチルとベンゾイル保護基を、室温で一晩、水性ＮａＯＨ／アセトンで加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、固体を再びメタノールで洗浄し、二ナトリウム塩として、２−ヒドロキシフェニルホスファートを産出した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ６．５６−６．６１（ｍ、１Ｈ）、６．６８−６．７１（ｄ、１Ｈ）、６．８２−６．８７（ｍ、１Ｈ）、７．１９−７．２２（ｄ、１Ｈ）。
【０１１２】
実施例８．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルホスファート、二ナトリウム塩の調製。
２，３，５，６−テトラフルオロヒドロキノンを、室温で一晩、ＤＭＦ中、ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドとイミダゾールとの反応により、収量４６％で、モノ（ｔ−ブチルジメチルシリル）エーテルとして保護化した。クロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製後、シリルエーテルを、０℃で、ピリジン中、過剰量のＰＯＣｌ3でリン酸化した。ジクロロホスファート誘導体を、１０当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルと反応させて、ビス（シアノエチルホスファート）誘導体を産出し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中、７５−１００％酢酸エチル）にかけた後、収量５５％で脱シリル化した。シアノエチル保護基を、室温で２日間、水性ＮａＯＨ／アセトンで加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、二ナトリウム塩を産出した。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ４．２４４；19Ｆ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ−１６９．０２（ｄ、２Ｆ）、−１６１．１６（ｄ、２Ｆ）。
【０１１３】
実施例９．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物２−および３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルホスファート、二ナトリウム塩の調製。
２−クロロヒドロキノン、２０ｇ（Aldrich, Milwaukee, Winsconsin）を、３５０ｍＬの暖めた１０％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解して、再結晶させ、濾過し、１．５Ｌのヘキサンを添加した。一晩、４℃に冷却した後、１１ｇのオフホワイトの固体を回収した。精製した２−クロロヒドロキノンを、氷温で、ＣＨ2Ｃｌ2中の塩化アセチル／ピリジンでモノアセチル化し、異性体のモノアセタートとジアセタートとの混合物を産出した。混合物を、０℃で、ピリジン中、過剰量のＰＯＣｌ3でリン酸化した。反応生成物を、過剰量の２−シアノエタノールと反応させ、異性体のビス（シアノエチルホスファート）誘導体の４：１混合物を産出し、カラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ヘキサン）によって、ジアセタートから単離した。アセタートとシアノエチル保護基を、０℃で１９時間、水性ＮａＯＨ／アセトン（ＮａＯＨ３ｅｑ．）で加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、異性体の二ナトリウムリン酸塩を産出した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｄ）δ６．５６−７．１９（ｍ、３Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．３６、１．３９。
【０１１４】
実施例１０．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドの調製。
ヒドロキノンを、エタノール／水性ＮａＯＨ中、α−ブロモガラクトーステトラアセタート（１．５ｅｑ．）と、室温で２日間、遮光した容器中で反応させた。エトキシドナトリウム（５ｅｑ．）を添加し、溶液を１時間後に濃縮した。残留物を、水と酢酸エチルとの間で分配した。水層を乾燥し、生成物をシリカ上のクロマトグラフィー（３０％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ３．５７−３．８８（ｍ、６Ｈ）、４．６８（ｄ、１Ｈ）、６．６８（ｄ、２Ｈ）、６．９６（ｄ、２Ｈ）。
【０１１５】
実施例１１．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシフェニルβ−Ｄ−グルクロニドの調製。
ヒドロキノン（１０ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2中、塩化ベンゾイルとピリジンとの反応により、一安息香酸エステルに転化させた。７ｇのエステルを得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ４．８８０（ｓ、１Ｈ）、６．８７（ｄ、２Ｈ）、７．０８（ｄ、２Ｈ）、７．５２（ｔ、２Ｈ）、７．６４（ｔ、１Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）。
【０１１６】
後者（２００ｍｇ）を、アセトン中の水性ＮａＯＨで脱プロトンし、無水エタノール中のエチルα−Ｄ−ブロモグルクロナートと反応させることによって、β−グルクロニドエチルエステル誘導体に転化させた。分取ＴＬＣによる精製により、５０ｍｇの二重保護化化合物を産出した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ１．２９０（ｔ、３Ｈ）、３．６０１−３．７８０（ｍ、３Ｈ）、４．１４６−４．２５８（ｍ、３Ｈ）、４．６４（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、４．８６（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、５．１９２（ｄ、１Ｈ）、７．１８７−７．２８５（ｍ、４Ｈ）、７．６３５（ｔ、２Ｈ）、７．７６７（ｔ、１Ｈ）、８．２０８（ｄ、２Ｈ）。
【０１１７】
後者化合物の５０ｍｇ試料を、アセトン中水性ＮａＯＨで加水分解し、安息香酸エステルとエチルエステル基を加水分解した。沈殿した生成物（１６ｍｇ）を濾過して乾燥した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ３．４−３．５（ｍ、３Ｈ）、３．６４（ｄ、１Ｈ）、４．６５（ｄ、１Ｈ）、６．５３（ｄ、２Ｈ）、６．８７（ｄ、２Ｈ）。
【０１１８】
実施例１２．ジヒドロキシ芳香族化合物の評価。
複数のジヒドロキシ芳香族化合物をスクリーニングし、１の化学発光反応の誘導における全般的な効果を測定した。テスト化合物の保存溶液（エタノール／１０％ＤＭＳＯもしくはＤＭＳＯ中、２ｘ１０-4Ｍ）を調製した。５μＬの各試料を、９６ウェルマイクロプレートに分注した。０．２Ｍ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇ2+および０．１％ＳＤＳ中に、０．６６ｍＭ化合物１を含む溶液９５μＬを、各ウェルに添加した。全てのウェルで、光強度を３０分間スキャンした。各テストウェルに対して、最大強度と最大になるまでの時間を測定した。
【０１１９】
【０１２０】
実施例１３．化学発光強度の速度推移
アクリダンホスファート１とヒドロキノン（ＤＨＡ−２）を含む組成物からの化学発光の速やかな産出を図１に示す。反応混合物は、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２２１）緩衝液、０．２Ｍ、ｐＨ９．６中に、０．６６ｍＭアクリダンホスファート（１）と４μＭヒドロキノンを含んでいた。
【０１２１】
実施例１４．アクリダンホスファート２とＤＨＡ−１の化学発光の検出。
以下の実施例では、ジヒドロキシ芳香族化合物との化学発光反応の使用によって、微量の複素環式エノールホスファート化合物を検出するための性能を例示する。
【０１２２】
３つの白色マイクロウェルの各々に、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＳＤＳ中のアクリダンホスファート２溶液（６．６ｘ１０-11から６．６ｘ１０-17ｍｏｌの間で含有する希釈液）１００μＬを分注した。水中、２−クロロヒドロキノン（ＤＨＡ−１）の０．０１ｍＭ溶液１００μＬを各ウェルに分注し、光強度を２．５分で測定した。図２に示す結果より、光強度は、試験した全範囲に亘って、ホスファート化合物の量と正の相関関係であった。
【０１２３】
本実施例では、連結可能基で適切に官能基化された誘導体が、特異結合アッセイにおける単一生成標識として機能し得るのに十分な低濃度で、複素環式エノールホスファートを検出し得ることを実証した。
【０１２４】
実施例１５．アルカリホスファターゼの化学発光を検出するための試薬。
アルカリホスファターゼの化学発光を検出するために有効な試薬組成物は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１、および１ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファートを含んでいた。上記組成物１００μＬを、８ｘ１０-17ｍｏｌのＡＰと、Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ−２０ｅルミノメーターに設置したテストチューブ中、２５℃で反応させることにより、容易に測定できる青色の化学発光を産出した。典型的な反応の時間推移を図３に示す。
【０１２５】
実施例１６．その他の複素環式エノールホスファート化合物の化学発光の検出。
前記実施例と同様にして、化合物１の代わりに、各アクリダンホスファート２−４を含む組成物を、ＡＰと、２５℃で反応させた。各々、ＡＰ不在下でのバックグラウンドを越えて識別でき、容易に測定できる化学発光を産出した。
【０１２６】
実施例１７．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の濃度の効果。
加水分解酵素の化学発光アッセイにおいて有用である、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の濃度範囲を、測定するために実験を行った。０から１０ｍＭまでの範囲の濃度の４−ヒドロキシフェニルホスファート（ｍｇ／ｍＬで：ａ、１；ｂ、３．３；ｃ、０．６６；ｄ、０．８３；ｅ、１０；ｆ、０．１；ｇ、０）を含む０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１溶液と０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む試薬を、８ｘ１０-17ｍｏｌのＡＰと、２５℃で反応させた。図４に、化学発光放射の様々な速度推移を示す。４−ヒドロキシフェニルホスファートを欠く溶液は、ほとんど化学発光を産出しなかったことから、光の放射が、単に、エノラートの自動酸化を生じる、ＡＰによる１からのホスファート保護基の除去によるものではないことが明らかである。
【０１２７】
実施例１８．１ステップアッセイにおけるアクリダンホスファートとＡＰの検出直線性。
様々な量のＡＰを、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．６６ｍＭアクリダンホスファート１、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファートおよび０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む試薬組成物１００μＬと、２５℃で、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎルミノメーターに設置した９６ウェルプレート中で、反応させることによって、ＡＰの化学発光アッセイを行った。図５に示すように、２５分で測定した光強度が、８ｘ１０-17から８ｘ１０-20モル範囲の酵素量に相関した。
【０１２８】
実施例１９．β−ガラクトシダーゼの化学発光の検出。
β−ガラクトシダーゼ（Grade VIII、カタログ番号．Ｇ５６３５、Sigma Chemical社）の保存溶液を、０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０１ＭＮａＣｌ、０．０１ＭＭｇＣｌ2中に、４．９ｘ１０-15から１．６ｘ１０-18モル酵素／μＬまでを含むように段階希釈した。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０１ＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2中、１ｍＭの４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド１３０μＬを、各酵素希釈液２．６μＬと共に、３７℃で３５分間インキュベーションした。５０μＬずつ、黒色マイクロウェル２連に分注し、室温まで冷却した。以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート３および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート３溶液５０μＬを、各ウェルに分注した。ウェルにおけるβ−ガラクトシダーゼ酵素量は、４．９ｘ１０-15から１．６ｘ１０-18モルまでの範囲であった。β−ガラクトシダーゼ量に関連して、５分で測定した化学発光強度を、図６に示す。
【０１２９】
実施例２０．β−グルクロニダーゼの化学発光の検出。
β−グルクロニダーゼ（タイプＸ−Ａ、カタログ番号．Ｇ７８９６、Sigma Chemical社、ＭＷ＝２９０，０００）保存液を、０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．１５ＭＮａＣｌ中に、３．３ｘ１０-14から３．３ｘ１０-18モル酵素／μＬを含むように段階希釈した。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０１ＭＮａＣｌ中、１ｍＭの４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−グルクロニド１３０μＬを、各酵素希釈液２．６μＬと共に、３７℃で３０分間インキュベーションした。５０μＬずつ、黒色マイクロウェル２連に分注し、室温まで冷却した。以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート４および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート４溶液５０μＬを、各ウェルに注入した。β−グルクロニダーゼ量に相関して１１分で測定した化学発光強度を、図７に示す。
【０１３０】
実施例２１．アルカリホスファターゼ−抱合体を使用したウェスタンブロットアッセイ。
本発明の組成物を、ウェスタンブロットにおいて、タンパク質抗原、β−ガラクトシダーゼを、ニトロセルロース膜上で、ＡＰ標識化抗体により、検出、定量するために使用した。タンパク質を５０００、１０００、１８０、３０、および５ｐｇずつ含むβ−ガラクトシダーゼ希釈液を、各々、電気泳動し、ニトロセルロース膜（Hybond ECL、Amersham、Arlington Heights、Illinois）に写した。膜を、Ｔ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ＴＢＳは５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌである）中、１％無脂肪ミルク（ＮＦＭ）で、室温、１時間、ブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液中のマウス抗−β−ガラクトシダーゼ溶液３．３μｇ／ｍＬの１：１５００希釈液、Ｔ−ＴＢＳ洗浄用緩衝液、および次いで、ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ抱合体溶液４１６Ｕ／ｍＬの１：６００希釈液で、段階的に処理した。Ｔ−ＴＢＳで洗浄後、膜を、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭヒドロキノンホスファート二ナトリウム塩、０．６６ｍＭアクリダンホスファート３および０．１％ＳＤＳを含む０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６を含む検出用試薬にしばらく浸した。膜を、透明なプラスチックシートの間にはさみ、Ｘ線フィルムに露光した。β−ガラクトシダーゼの５本のバンド全てを、１５分後に、１分露光して検出した。これらの組成物を使用して産出した光によって、少なくとも１日で現像できる強い放射がもたらされた。
【０１３１】
実施例２２．ドットブロットアッセイ。
ドットブロットアッセイにおいて、本発明の試薬の使用の代表液な実施例を、以下の実施例において明らかにする。
【０１３２】
ジゴキシゲニン−標識化ＤＮＡ（ｐＢＲ３２８）、抗−ジゴキシゲニン−ＡＰ抱合体を、キット（Genius 3, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana）として入手し、ブロッキング用緩衝液と陽性に荷電したナイロン膜を、Boehringer-Mannheimkaraetaから得た。洗浄用緩衝液は、０．１Ｍマレイン酸、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％ＳＤＳであった。検出用試薬は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．６６ｍＭアクリダンホスファート２、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファート、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＳＤＳを含んだ。
【０１３３】
ＤＮＡ希釈液（１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１ｐｇ）を、製造元のプロトコールに従って、ナイロン膜上にドットブロットし、ブロッキングし、洗浄し、抗体−ＡＰ抱合体と反応させた。過剰量の緩衝液を排出除去し、ブロットを上記検出用試薬中に、３分間浸した。過剰量の試薬を排出除去し、ブロットを透明のシートにはさみ、様々な長さの時間で、Ｘ線フィルムに露光した。即時１分の露光により、１０ｐｇ−０．３ｐｇのスポットを検出した。３０分後、全７つのスポットを、２０分間の露光で検出した。数日間で多重露光を行うことができた。例えば、５日後、全７つのスポットを、１−５分の露光で検出することができた。０．６６ｍＭアクリダンホスファート３、もしくは０．６６ｍＭ２−および３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルホスファートの混合溶液を含む検出用試薬によっても、同様の結果が得られた。
【０１３４】
実施の形態および実施例は、例示するものに過ぎず、限定するものとしてはみなされない。明確に開示されていない特別の化合物と方法の変形を、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、行うことができると認識される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、室温でのアクリダンホスファート１とヒドロキノンとの反応によって速やかに生じた化学発光を示すプロットである。反応混合物は、０．６６ｍＭアクリダンホスファート１と４μＭのヒドロキノンを、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含有する０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２２１）緩衝液、ｐＨ９．６、中に含む。
【図２】 図２は、化学発光強度とアクリダンホスファート２の量との関係を示したグラフである。０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＳＤＳ中、様々な量のアクリダンホスファート２（６．６ｘ１０-22から６．６ｘ１０-17モルまでを含むように希釈されたもの）からなる組成剤１００μＬを、１００μＬの２−クロロヒドロキノン（ＤＨＡ−１）の０．０１ｍＭ水溶液と反応させることによって放射した化学発光を、２．５分で測定した。
【図３】 図３は、０．１Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中に、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１溶液と１ｍｍ４−ヒドロキシルフェニルホスファートとからなる剤１００μＬに、２５℃で、８ｘ１０-17モルのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を添加してトリガーさせることによって、放射した化学発光強度の時間推移を示すプロットである。
【図４】 図４は、４−ヒドロキシルフェニルホスファートの濃縮機能としての化学発光放射の時間推移を示すプロットである。様々な濃度の４−ヒドロキシルフェニルホスファート（ｍｇ／ｍＬで、ａ、１；ｂ、３．３、；ｃ、０．６６；ｄ、０．８３；ｅ、１０；ｆ、０．１；ｇ、０）を含む０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１溶液と０．８８ｍＭＭｇＣｌ2からなる組成剤を、８ｘ１０-17モルのＡＰと、２５℃で反応させた。
【図５】 図５は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中に、０．６６ｍＭアクリダンホスファート１、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシルフェニルホスファートおよび０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む組成剤１００μＬによって放射された化学発光の強度と、ＡＰの量との関係を示したグラフである。上記組成（１００μＬ）は、８ｘ１０-15から８ｘ１０-20モルの間の酵素を含むＡＰ溶液１０μＬ、またはブランク剤としての水１０μＬと、上記温度で、黒色のマイクロプレートのウェル中で反応させた。光強度を２５分後に測定した。０．１amol未満のＡＰが検出された。
【図６】 図６は、β−ガラクトシダーゼの量と化学発光強度との関係を示したグラフである。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０１ＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2中の４−ヒドロキシフェニルβ−ガラクトシド（１ｍＭ）溶液を、β−ガラクトシダーゼ希釈液と共に、３７℃で３５分間インキュベーションした。一部を、以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート３溶液および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート３溶液の等量と反応させた。ウェル中の酵素量を、β−ガラクドシダーゼの４．９ｘ１０-15から１．６ｘ１０-18モルまでの範囲とした。化学発光強度を５分で測定した。
【図７】 図７は、β−グルクロニダーゼの量と化学発光強度との関係を示したグラフである。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０１ＭＮａＣｌ中、４−ヒドロキシルフェニルβ−グルクロニド（１ｍＭ）溶液を、β−グルクロニダーゼ希釈液と、３７℃で３０分間インキュベーションした。一部を、以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート４溶液および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート４溶液の等量と反応させた。ウェル中の酵素量を、β−グルクロニダーゼの３．３ｘ１０-14から３．３ｘ１０-18モルまでの範囲とした。化学発光強度を１１分で測定した。
【図８】 図８は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中に、０．６６ｍＭアクリダンホスファート４、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファート、０．１％ＳＤＳ、および０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む組成剤を用いたＤＮＡ希釈液のドットブロット解析の画像である。画像は、膜と検出用剤と接触させた３６時間後に１分間露光した結果である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光を産出するための化学発光方法と組成物に関する。特に、本発明は、酸素存在下でジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物とを反応させることを含む、化学発光を産出する方法に関する。また、本発明は、加水分解酵素の作用により、化学発光を産出するための化学発光方法と組成物に関する。化学発光を産出する方法は、加水分解酵素を、ヒドロキシ基の一つが酵素切断可能基で保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と反応させてジヒドロキシ芳香族化合物を遊離させ、これを複素環式エノールフォスファート化合物と反応させて化学発光を産出することを含む。本発明は、さらに、イムノアッセイ、核酸プローブアッセイなどを含む特異結合対アッセイにおいて、加水分解酵素と酵素標識化特異結合パートナーとを含む被検体を検出するためのアッセイにおける本発明の化学発光方法の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１．加水分解酵素の化学発光検出。
アルカリホスファターゼとβ−ガラクトシダーゼなどの加水分解酵素は、しばしば、酵素結合アッセイにおいて、生物学的分子およびその他の興味のある被検体、例えば薬剤、ホルモン、ステロイドおよび腫瘍マーカーなどに対するマーカーもしくは標識（ｌａｂｅｌ）として用いられる。さらに、ホスファターゼ酵素、例えばアルカリホスファターゼ（AP）と酸性ホスファターゼ（AcP）は、医者と獣医の診断において臨床的に重要である。これらの酵素の化学発光の検出には、試料中における酵素量、または酵素標識化被検体もしくは被検体に対する標識化特異結合パートナーの量を、定量的に測定するための、安全で、使いやすく、かつ感度の高い手段が、要求される。特定の加水分解酵素の標識を定量するための多くの化学発光反応の概要が、当該分野において公知である。これらの概要の多くが、複雑かつ高価であり、多数の酵素もしくは複数の試薬を必要とする。大量試験用にそのような方法を商業的に採用することは、遅れている。
【０００３】
ａ．アクリダン（Ａｃｒｉｄａｎ）化合物とアルカリホスファターゼとの化学発光反応。
１９９７年１月１５日に出願されたＰＣＴ出願ＵＳ９７／０００１５号に、ホスファターゼ酵素と、複素環式基およびエノールホスファート基を含む化合物との化学発光反応について記載されている。また、ホスファターゼと複素環式エノールホスファート化合物との化学発光反応において、カチオン性芳香族化合物を組み込むことによって、より改善されることが記載されている。本発明の方法に対して、これらの出願において開示された方法では、ホスファート基を切断するための、ホスファターゼ酵素と複素環式エノールホスファート化合物との反応に依存している。本発明では、ホスファート基を切断するために酵素を用いない。
【０００４】
ｂ．還元剤の生成を含む反応。
アルカリホスファターゼによって触媒作用を及ぼされたホスファートエステルから、還元剤を生成する化学発光方法が報告されている。（M.Maeda, A.Tsuji, K.H.Yang, S.Kamada, Biolum. and Chemilum. Current Status, 119-22(1991); M.Kitamura, M.Maeda, A.Tsuji, J. Biolumin. Chemilumin., 10, 1-7(1995); H.Sasamoto, M,Maeda, A.Tsuji, Anal. Chim. Acta, 306, 161-6(1995))。還元剤を、酸素およびルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）と反応させ、光を産出する。代表的な還元剤は、アスコルビン酸、グリセリン、ＮＡＤＨ、ジヒドロキシアセトン、コルチゾール、およびフェナシルアルコールを含む。また、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０４４００号と文献（H.Arakawa, M.Maeda, A.Tsuji, Anal. Biochem., 199, 238-242(1991)）に、インドキシルホスファート化合物と、脱リン酸化において還元種を生成するその他の関連ホスファート化合物を用いた、アルカリホスファターゼの化学発光アッセイ法が記載されている。化学発光は、ルシゲニンもしくはその他の発光増幅剤の存在下で、Ｈ2Ｏ2またはスーパーオキシドイオンとの反応によって産出する。
【０００５】
Ｍａｈａｎｔに対する米国特許第５５８９３２８号に、化学発光反応について開示されており、それによれば、インドキシルエステル、チオインドキシルエステル、およびベンゾフランエステルが、酵素によって加水分解され、それによって、スーパーオキシドが産出する。この発光は、ルシゲニンなどの化学発光産出剤を添加することによって、増幅される。ルシゲニンは、スーパーオキシドと反応することによって、化学発光を産出する。
【０００６】
ｃ．酵素学的にトリガー可能なジオキシエタン。
保護化フェノールトリガー基を有する安定１，２−ジオキシエタンから、保護基が除去されると、化学発光分解が生じる[A.P.Schaap, T.S.Chen, R.S.Handley, R.DeSilva,およびB.P.Giri, Tetrahedron Lett., 1155(1987);A.P.Schaap, R.S.Handley,およびB.P.Giri, Tetrahedron Lett., 935(1987);A.P.Schaap, M.D.Sandison,およびR.S.Handley, Tetrahedron Lett., 1159(1987);A.P.Schaap, Photochem. Photobiol.,47S, 50S (1988)]。そのような酵素学的トリガー可能なジオキシエタンは、加水分解酵素との反応によってトリガーされ、それによって、次数規模でジオキシエタンの化学発光分解効率が増大する。そのようなトリガー可能なジオキシエタンの数多くの実施例が、当該分野において公知である。しかしながら、ほとんどのトリガー可能なジオキシエタンが有する不都合は、酵素不在下で、除々に熱分解することによって、または、非酵素学的加水分解によって、バックグラウンドの化学発光を生じる傾向にあることである。
【０００７】
ｄ．ルシフェリン誘導体。
ホタルルシフェリンのホスファートとガラクトシド誘導体が、公知である（N.Ugarova, Y.Vosny, G.Kutuzova, I.Dementieva, Biolum. and Chemilum. New Perspectives, P.StanleyおよびL.J.Kricka,版、Wiley, Chichester, 511-4(1981);W.Miska, R.Geiger, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 119-28(1989)）。ホタルルシフェリン誘導体を、適切な酵素で処理することにより、ホタルルシフェリンが遊離し、これが第２工程で、ルシフェラーゼおよびＡＴＰと反応して光を産出する。
【０００８】
ｅ．ルミノール誘導体。
ルミノールのホスファート誘導体とＮＡＧ誘導体が、公知である（K.Sasamoto, Y.Ohkura, Chem. Pharm. Bull., 38,1323-5(1991);M.Nakazono, H.Nohta, K.Sasamoto, Y.Ohkura, Anal. Sci.,8,779-83(1992)）。ルミノール誘導体を、適切な酵素で処理することにより、ルミノールが遊離し、これが続く工程で、 ヘキサシアノ鉄（III）酸塩と反応して光を発する。
【０００９】
ｆ．酵素結合法。
ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０７９１１号において、加水分解酵素を用い、保護化フェノール化合物からフェノール増強剤を酵素学的に生成させることが開示されている。フェノール化合物は、ペルオキシダーゼ酵素と共に、アクリダンカルボン酸誘導体の化学発光酸化を増強する。米国特許第５３０６６２１号は、同様の酵素結合反応について開示しており、ジヒドロフタルアジンイオンが、ペルオキシダーゼの化学発光基質として用いられている。これらの方法では、ジヒドロキシ芳香族化合物がペルオキシダーゼ増強剤でないため、ヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基で保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を使用できない。ホスファターゼ酵素などの加水分解酵素を、酵素結合反応を介して測定するためのその他多くの化学発光方法とアッセイが、公知である。そのような方法が、A.Tsuji, M.Maeda, H.Arakawa, Anal. Sci.,5,497-506(1989)において、一覧に編集されている。全ての酵素結合反応では、２種以上の酵素を要し、化学発光種としてルミノールもしくはルミノール類似体、ルシゲニンもしくは細菌のルシフェリンのいずれかの使用が必要である。
【００１０】
上記方法の多くには、発光シグナルを産出するために、複数の剤や酵素が必要であるという欠点がある。検出感度に優れていることが証明されたにも関わらず、付加された費用、もしくは操作の煩雑性が妨げとなって、これらの方法は商業的に受容されていない。これらの感度レベルに達するが、酵素基質に加えてさらなる酵素や剤を必要としない、加水分解酵素を検出および定量するための化学発光方法が有益である。本発明は、そのような方法と化合物を提供する。
【００１１】
２．電子転移剤（ＥＴＡ）の酵素遊離。
ａ．比色および蛍光検出。
米国特許第４９５２４９５号には、検出可能な種を産出する電子転移反応を仲介することができる基質の酵素学的形成によって加水分解酵素を測定するための方法について開示および請求している。ＥＴＡは、一実施態様において、置換化ヒドロキノン化合物などの還元基質を含むことができる。検出される種は、着色性もしくは蛍光性の生成物を形成する。さらに、検出可能な種が、発色性、蛍光性もしくは化学発光性の種と連結基を介して連結したキノンを含むシフト可能な検出可能種であることができることが示されている。そのようなシフト可能な化合物以外、化学発光で検出可能ないかなる種についても示されていないし、提案されていない。本発明に記載した複素環式エノールホスファート化合物について、全く提案されていないし、示されていない。
【００１２】
ｂ．アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の電流測定検出。
ＡＰによるモノホスファートからのヒドロキノンの酵素学的産出、ベンゾキノンを産出するための電極表面におけるヒドロキノンの酸化、電子を基質のグルコースから転移する第２の酵素のグルコースオキシダーゼによるヒドロキノンの再生を含むアルカリホスファターゼの電流測定検出法が知られている。ＡＰ量は、電流の増加として検出される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明の目的は、ジヒドロキシ芳香族化合物を、ヘテロ環式基およびエノールホスファート基を含む第２の化合物と反応させることによって、化学発光を産出する方法であって、反応を酸素存在下で行わせて、化学発光を産出する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、
ａ）ジヒドロキシ芳香族化合物を産出するために、加水分解酵素を、ヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基によって保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と反応させること、および
ｂ）化学発光を産出するために、ジヒドロキシ芳香族化合物を、複素環式エノールホスファート化合物と反応させること、
を含む、加水分解酵素の作用によって化学発光を産出する方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明の目的は、ジヒドロキシ芳香族化合物と、複素環式エノールホスファート化合物を含む化学発光組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、加水分解酵素との反応時に化学発光を産出する組成物であって、ヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基で保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と、複素環式エノールホスファート化合物とを含む組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を反応させることを含む被検体のアッセイを行う方法を提供することである。
【００１７】
更なる目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を反応させることを含む被検体のアッセイを行う方法であって、複素環式エノールホスファート化合物が特異結合対員の標識として提供される方法を提供することである。
【００１８】
更なる目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を反応させることを含む被検体のアッセイを行う方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、化学発光を産出し、化学発光をサンプル中の加水分解酵素量に関係づけるために、加水分解酵素を含む、もしくは含むと推測される試料を、ヒドロキシ基の一つが酵素切断可能な基で保護された保護化ジヒロキシ芳香族化合物と、複素環式エノールホスファート化合物の存在下で反応させることを含む、試料中の加水分解酵素を検出する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の更なる目的は、化学発光を産出し、化学発光を測定し、化学発光を被検体の量に関係づけるために、加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物とを反応させることを含む被検体の測定を行う方法であって、加水分解酵素が、特異結合対員の標識として提供される方法を提供することである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
定義：
アルキル−１から２０炭素を含む、分枝鎖状、直鎖状、もしくは環状の炭化水素基。ここに用いられる低級アルキルは、８炭素までを含むアルキル基を指す。
【００２２】
アルケニル−少なくとも一つのＣ−Ｃ二重結合を含み、２から２０炭素を含む分枝鎖状、直鎖状、もしくは環状の炭化水素基。ここに用いられる低級アルケニルは、８炭素までを含むアルケニル基を指す。
【００２３】
アルキニル−少なくとも一つのＣ−Ｃ三重結合を含み、２から２０炭素を含む分枝状鎖もしくは直鎖の炭化水素基。ここに用いられる低級アルキニルは、８炭素までを含むアルキニル基を指す。
【００２４】
被検体−アッセイによって、試料中における存在または量が測定される基質。被検体は、有機的かつ生物学的分子を含み、特異的結合親和性を有する特異的結合対が存在する。典型的な被検体は、限定されないが、一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンを含む。また、その他の典型的な被検体は、加水分解酵素、加水分解酵素阻害剤、およびジヒドロキシ芳香族化合物を含む。
【００２５】
アリール−１から５炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であって、Ｈ以外の１以上の置換基で置換することができる。
【００２６】
生体臨床学的分析−興味のある被検体としての生物学的由来試料を分析すること。該分析は、イムノアッセイ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡシークエンスアッセイ、コロニーハイブリダイゼーション、遺伝子発現分析、ハイスループット薬剤スクリーニング、感染物質もしくは病原菌の検出などであることができる。
【００２７】
ジヒドロキシ芳香族化合物−芳香環式系を含む芳香環化合物であって、同様に一つ以上五つ以下の炭素環を含み、偶数の環の炭素原子によって隔てられた二つのヒドロキシ基で置換されている芳香環化合物。この置換のパターンは、ベンゼン環のオルト−とパラ−置換のパターン、および例えば、ナフタレン環の１，２−、１，４−、もしくは２，６−置換のパターンによって例示される。ビフェニルおよびビナフチルなどのジヒドロキシ置換化ビアリール環式系は、二つのヒドロキシ基を隔てる偶数の環の炭素原子があるものに限定する定義の範囲内であるとみなされる。ジヒドロキシ芳香族化合物は、さらにヒドロキシ基、すなわちトリヒドロキシ、テトラヒドロキシなどで置換することができ、さらに、少なくとも一対のヒドロキシ基が、偶数の環の炭素原子によって隔てられていることを規定する定義の範囲内である。
【００２８】
ハロゲン−フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子。
【００２９】
試料−アッセイされる一つ以上の被検体を含む、もしくは含むと推測される液体。化学発光反応法によって分析される典型的な試料は、体液を含む生体試料、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞溶解液、組織抽出液等である。他のタイプの試料は、食物試料と環境試料、例えば土壌、水などを含む。
【００３０】
特異的結合対−相互に結合親和性を示す二つの基質。実施例は、抗原−抗体、ハプテン−抗体もしくは抗体−抗体対、相補のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭化水素、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合タンパク質、および核酸−抗核酸抗体を含む。
【００３１】
「複素環式エノールホスファート化合物」、もしくは「ジヒドロキシ芳香族化合物」、もしくは「保護化ジヒドロキシ芳香族化合物」に関して、唯一の事例であることを明示しない限りは、記載された種の一つ以上を含むことを企図することを注記する。
【００３２】
偶数の環の炭素原子によって隔てられた少なくとも二つのヒドロキシ基で置換された芳香環式系を含むある種のジヒドロキシ芳香族化合物が、複素環式基とエノールホスファート基を含む複素環式エノールホスファート化合物である第２の化合物と、酸素存在下で反応し、容易に検出可能な化学発光を産出することを、予期せず見出した。本発明のジヒドロキシ芳香族化合物の範囲内にまとめられる典型的な芳香環式系は、ベンゼン、ビフェニル、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、ベンゾピレンおよびナフタセン環式系を含む。
【００３３】
ジヒドロキシ芳香族化合物の好ましい基は、式Iを有する。
【化３８】
式中、Ｒ1とＲ3の少なくとも一方はＯＨ基であり、Ｒ1もしくはＲ3の他方と、Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5は、各々独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、カルボキシルエステル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ6、ホルミル−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、アルキルカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ6、アリールカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ9およびハロゲン基から選択され、式中、隣接する基の対が一緒になって５もしくは６員脂肪環もしくは芳香環を完結することができ、式中Ｒ6は低級アルキル基、Ｒ7とＲ8は各々Ｈもしくは低級アルキル基であり、Ｒ9はアリール環式基である。
【００３４】
式Iのより好ましい化合物は、式中、Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5が、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される化合物である。より好ましくは、各Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5が、水素であり、Ｒ1が、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される。
【００３５】
二つのヒドロキシ基を有するジヒドロキシ芳香族化合物に加えて、同じ６員環に置換されたその他のジヒドロキシ芳香族化合物も、ジヒドロキシ芳香族化合物の範囲内であり、本発明の方法に有効であることが認識される。ヒドロキシ基が異なる６員環にある二芳香環式系を含むジヒドロキシ芳香族化合物が、代表的である。本発明の方法に有用であるジヒドロキシ芳香族化合物のいくつかの特別な実施例を、本発明の範囲を限定するためではなく、例示するために、表１に列挙する。
【００３６】
表１．ジヒドロキシ芳香族化合物
ＤＨＡ−１ ２−クロロヒドロキノン
ＤＨＡ−２ ヒドロキノン
ＤＨＡ−３ ２−フェニルヒドロキノン
ＤＨＡ−４ ３，３，３’，３’−テトラメチル−１，１’−スピロビスイン
ダン−５，５’，６，６’−テトロール，
ＤＨＡ−５ ２，３，５，６−テトラフルオロヒドロキノン
ＤＨＡ−６ ２−メチルヒドロキノン
ＤＨＡ−７ ２−メトキシヒドロキノン
ＤＨＡ−８ カテコール
ＤＨＡ−９ １，２−ジヒドロキシアントラセン
ＤＨＡ−１０ ７，８−ジヒドロキシ−６−メトキシクマリン
ＤＨＡ−１１ １−メチル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−
テトラヒドロイソキノリン
ＤＨＡ−１２ ４−アミノレソルシノール
ＤＨＡ−１３ １，４−ジヒドロキシナフタレン
ＤＨＡ−１４ １，２，４−トリヒドロキシベンゼン
ＤＨＡ−１５ ９，１０−ビス（４−ヒドロキシフェニル）アントラセン
ＤＨＡ−１６ ４−ブロモレソルシノール
ＤＨＡ−１７ ２，３−ジヒドロ−９，１０−ジヒドロキシ−１，４−
アントラキノン
ＤＨＡ−１８ エラグ酸
ＤＨＡ−１９ ２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド
ＤＨＡ−２０ ２，３−ジクロロ−５，８−ジヒドロキシ−１，４−
ナフトキノン
【化３９】
【００３７】
本発明の方法に有用である複素環式エノールホスファート化合物と、化学発光を産出するための組成物は、式：
【化４０】
（式中、Ｒ10は、光の産出を許容する有機基であり、各Ｒ11−Ｒ18は独立して選択され、式中、隣接する基の対がベンゼン−融合環を完結することができ、Ｒ19はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される５０原子までを含む有機基であり、ＺはＯとＳ原子から選択され、各Ｍは独立してＨとカチオン性中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である）
を有する。二重結合異性体が可能である式IIIの化合物において、該二重結合異性体の混合物を用いることができる。
【００３８】
前記式IIIに関して、典型的な環の構造は、アスタリスクで環外二重結合部位を表示した以下の構造を含む。全ての潜在的な置換パターンを明示しておらず、各環の位置で水素以外の置換基を含むことができると理解される。
【化４１】
【００３９】
基Ｒ19は、好ましくは、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、アラルキルおよび置換化アラルキル基から選択されることが好ましい。より好ましい基Ｒ19は、置換化および非置換化低級アルキル基と置換化および非置換化ベンゼン基を含む。
【００４０】
上記化合物の全てにおいて、基Ｒ11−Ｒ18は、各々独立して、Ｈもしくは光を産出するための置換基であり、通常、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含む。本発明の代表的な置換基は、限定されないが、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換化アミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノおよびスルホナート基を含む。隣接する基の対、例えばＲ11−Ｒ12は、互いに結合し、ベンゼン融合環を形成することができる。特別の置換とその効果を、以下の特別の実施例に例示するが、如何なる点においても、本発明の範囲を限定しないものとみなされる。
【００４１】
各基Ｍは、独立して、水素原子もしくはカチオン性中心である。カチオン性中心は、ナトリウムイオンＮａ+、アンモニウムイオンＮＨ4 +などの原子基、または１以上の陽性荷電部位を有する分子の一部など、陽性に荷電された原子を意味する。後者の実施例は、米国特許出願第５４５１３４７号に記載されたジカチオン性化合物と、米国特許出願第５３９３４６９号に記載された多重カチオン性基を有するポリマー性化合物を含む。カチオン性中心の陽性電荷は、あらゆる単位値、すなわち１、２、３などを取ることができる。典型的なカチオン性中心は、限定されないが、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第四級アンモニウムイオン、第四級ホスホニウムイオンを含み、原子価で要求される数で存在する。電気的中性のために、二つの基が式Iの化合物中に存在することが要求される場合、それらは同じものであっても異なるものであっても良い。好ましい対イオンは、アルカリ金属イオンである。より好ましいものは、ナトリウムおよびカリウムイオンである。
【００４２】
有機基Ｒ10は、光の産出を許容するあらゆる基であることができる。これは、基Ｒ10としてのいかなる基の存在によっても、最終的に化学発光を産出する式IIIの化合物の性能を妨げないことを意味する。後者によって、式IIIの化合物が、酸素存在下で、ジヒドロキシ芳香族化合物と反応した時に、速やかに化学発光が産出され、１以上の化学発光中間体の産出を伴うことを意味する。
【００４３】
基Ｒ10は、好ましくは、基における原子の原子価を満足するために要求されるＨ原子の必要数を除き、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含む。基Ｒ10として機能できる基は、限定されないが、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、アラルキルおよび置換化アラルキル基を含む。例えばイオン性基または極性基など、Ｈ原子以外の置換基は、化合物の特性を修飾するため、もしくは最終のホスファート化合物の合成を好都合にするために、様々な数で、Ｒ10の炭素鎖もしくは環上の選択された部位に組み込ませることができる。そのような特性は、例えば、産出される化学発光量、酵素との反応効率、放射光の最大強度、放射光の持続時間、放射光の波長、反応培地中での可溶性等を含む。特定の置換およびそれらの効果を、以下の特定の実施例において例示するが、これらは、如何なる点においても、本発明の範囲を限定しないものと見なされる。
【００４４】
化合物の好ましいクラスは、以下の式IIIaを有し、式中、ＺはＯまたはＳ原子であり、Ｒ19は低級アルキル基であり、Ａｒは少なくとも一つの炭素環式芳香環を含むアリール環式基であり、さらに置換されることができる。
【化４２】
基Ｒ11からＲ18は、同一であっても異なっていても良く、各々、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１から５０原子までを含み、光の産出を許容する置換基であり、限定されないが、アルキル、置換化アルキル、アリール、置換化アリール、ベンジルなどのアラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換化アミノ基、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノおよびスルホナート基を含むことができる。好ましい化合物の一セットは、水素と低級アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどから選択された基Ｒ11からＲ18を有する。その他の好ましい化合物は、式IIIbを有し、式中、ＺはＯまたはＳであり、Ａｒはフェニル基、置換化フェニル基、もしくはナフチル基から選択される。
【化４３】
【００４５】
複素環式エノールホスファート化合物のその他の好ましいセットは、化合物が標識として使用されることを許容する基−Ａ−Ｑを含む。好ましい標識化合物は、Ｒ10もしくはＲ18もしくはＲ11からＲ18部位のいずれか一つにおける置換基として、基−Ａ−Ｑを含む。化合物を標識する複素環式エノールホスファートの標識化合物の実施例は、式IIIc、dもしくはeを有する。
【化４４】
【００４６】
基−Ａ−Ｑにおいて、Ａは、Ｃ1−Ｃ10アルキレン、およびＣ2−Ｃ10オキシアルキレン基から選択されたスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）基であり、Ｑは、被検体もしくは特異結合パートナー等に、抱合される分子と共有結合を形成し得る連結基である。連結基Ｑは、ハロゲン、ジアゾ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＣＨＯ、酸無水物、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、スクシンイミドオキシカルボニル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、マレイミド、シアノ、トリアゾールおよびテトラゾール基、および当該分野において一般的に公知である類似体などの求電子部分であることができる。あるいは、連結基Ｑは、ヒドロキシル、−ＣＯＯＨ、チオール、第一級アミノ、第二級アミノ基などの求核部分であることができる。式IIIeの化合物において、基Ａ−Ｑが二つのベンゼン環のどちらか一方に存在できることが企図される。
【００４７】
以下の特定の化合物は、本発明に記載された新規な化学発光法における使用のために、特に好ましいものである：
【化４５】
【００４８】
緩衝水溶液中における式IIIの化合物と、ジヒドロキシ芳香族化合物との反応により、室温で速やかに最大強度に到達する明るい化学発光を産出した。
【化４６】
【００４９】
この点で、この発見の特別のメカニズムの説明を前置きすることは望ましくないのだが、化学発光は、形式的に、複素環式エノールホスファート化合物の二重結合の酸化から得られたケトン化合物IVの電気的励起状態から放射されると考えられる。化学発光を産出するための必要な条件は、反応によりIVの励起状態を形成し、IVが蛍光を放つのに十分なエネルギーが産出されることである。活性酸化剤は、酸素、酸素の還元化型、例えばスーパーオキシドイオン、過酸化イオンもしくは過酸化ラジカルなど、またはジヒドロキシ芳香族化合物の酸化生成物、例えばキノンもしくはセミキノン型などである。
【００５０】
本発明の反応および方法から放射される化学発光は、典型的には、１００−２００ｎｍ幅の放射帯域として産出され、電磁スペクトルの近紫外から可視領域における波長で最大強度を示す。典型的な最大強度の波長、λmaxは、３５０−５００ｎｍの範囲にある。共有結合した発蛍光団を担持している式IIIのホスファート化合物は、分子内エネルギーを伝達し、結果として、発蛍光団の励起状態から長波長で放射されることが企図される。
【００５１】
本発明の方法によって放射された化学発光の光は、可視的に、もしくはルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンターもしくは化学光量計等を用いたその他の好適な公知手段によって、検出することができる。各検出手段は、異なるスペクトル感度を有する。人間の眼は緑色光に対して最適であり、ＣＣＤカメラは赤色光に対して最大の感度を示し、ＵＶ、青色光、もしくは緑色光に対して最大の感応を有するＸ線フィルムが利用できる。検出機器は、適応性、価格、利便性、および恒久的な記録の作製が要求されるかを考慮して、選択される。
【００５２】
酸素存在下における式Iと式IIIの化合物の反応を含む本発明の化学発光反応は、例えば、公知の光スティックおよび関連する新規なアイテム、もしくは非常灯など、化学光源としての使用を見い出せる。他は、生体臨床分析、食物分析もしくは汚染物質の環境分析において、試料中における式Iの化合物の検出方法において、使用できる。
【００５３】
また、本発明の化学発光反応は、検出可能な標識化特異結合対によって、試料中の被検体のアッセイを行う方法においても用いることができる。そのようなアッセイ方法の一実地態様において、化合物Iもしくは化合物IIIが、標識化合物として提供される。標識化合物は、反応性標識基を担持する置換基を含み、それによって、反応性基が、特異結合対の一員と共有結合を形成し、検出可能な標識化特異結合対員を形成することができる。さらに、該分析方法は、標識された特異結合対を形成するための、標識された特異結合対員と被検体を検出するためのパートナーとの反応、および、必要に応じて、被検体を検出するための化学発光を産出するための、標識された特異結合対と化合物Iもしくは化合物IIIとの反応を含む。好ましくは、複素環式エノールホスファートは標識として提供される。
【００５４】
アッセイ方法のその他の実施態様において、化合物Iもしくは化合物IIIは、特異結合対員に抱合されたリポソーム中に内包された検出可能な種として提供される。検出可能な種を含むリポソームの調製方法、および化学発光アッセイにおける検出可能な標識としてのそれらの使用は、ここに参照として組み込まれる米国特許第５５９５８７５号に記載されている。
【００５５】
アッセイ方法のその他の実施態様において、化合物Iおよび化合物IIIは、相補する特異結合対員に付着するように、各々、別々のラテックス粒子物質に内包されて提供される。検出可能な種を含むラテックス粒子物資の調製方法と化学発光分析において検出可能な標識としての使用が、ここに参照として組み込まれる米国特許第５５７８４９８号に記載されている。
【００５６】
アッセイ工程における化学発光測定時に、測定は、光強度を、アッセイ工程における結果に応じた時間の固定点で測定すること、もしくは一連の時間点で測定すること、または瞬間最大強度を測定すること、または特定した光強度に到達するまでの光の総量もしくは時間を測定することを含む。
【００５７】
本発明の実施方法において、酸素は、典型的には、反応溶液中、外気と平衡状態で溶解されて供給される。溶液上の外気は、溶解酸素濃度を高めるために、酸素に富み、または酸素と置換させることができる。また、溶液を、加圧可能な密閉容器中に入れ、容器中の気体の空間を酸素で加圧することができる。その他の酸素の送達方法、例えば、空気もしくは酸素を散布すること、または化学反応によって酸素を産出することは、ここに記載および請求した方法の範囲内であると見なされる。
【００５８】
その他の態様で、本発明は、ｐＨ７−１０．５の範囲の水溶液、濃度０．００１−２０ｍＭの範囲の式Iの化合物、および濃度０．００１−２０ｍＭの式IIIの化合物を含む、化学発光を産出するための試薬組成物に関する。好ましくはｐＨが８−１０の範囲であり、より好ましくはｐＨが９−１０の範囲である。
【００５９】
好ましい実施態様において、組成物は、さらに、アニオン性界面活性剤を、最終濃度が好ましくは０．００１から５ｍｇ／ｍＬの範囲となるように、より好ましくは０．０１から２．５ｍｇ／ｍＬの範囲となるように含む。
【００６０】
化学発光を産出するための好ましい試薬組成物は、ｐＨが８−１０の範囲である水性緩衝液と、濃度約０．０５−５ｍＭの式Iのジヒドロキシ芳香族化合物と、濃度約０．０５−５ｍＭの式IIIcのアクリダンホスファートと、任意で、好ましくは濃度０．０１から２．５ｍｇ／ｍＬの間のアニオン性界面活性剤を含む。より好ましい組成物において、式Iのジヒドロキシ芳香族化合物は、ヒドロキノン、２−クロロヒドロキノン、２−フェニルヒドロキノン、および２，３，５，６−テトラフルオロヒドロキノンから選択される。
【００６１】
加水分解酵素の化学発光の検出
本発明の化学発光反応は、酵素学的化学発光反応の基礎として役立つことができ、これにおいて、加水分解酵素と、ヒドロキシ基の一つが酵素切断可能基で保護された保護化ジヒドロキシ芳香族化合物との反応によって、酵素切断可能基が除去され、ジヒドロキシ芳香族化合物が産出される。ジヒドロキシ芳香族化合物は、酸素存在下で、複素環式エノールホスファートと反応し、化学発光を産出する。好ましい保護化ジヒドロキシ芳香族化合物は、式IIを有し、式中、ジヒドロキシ芳香族化合物Iのヒドロキシ基の一つが加水分解酵素によって切断可能な基で保護されている。これらの方法において有用である保護化ジヒドロキシ芳香族化合物は、式IIの化合物を含む：
【化４７】
（式中、Ｒ1もしくはＲ3のうちの一方はＯＸ基であり、Ｘは加水分解酵素によって除去できる基であり、Ｒ1もしくはＲ3の他方と、Ｒ2、Ｒ4、およびＲ5は、各々独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、カルボキシルエステル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ6、ホルミル−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、アルキルカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ6、アリールカルボキシ−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ9およびハロゲン基から選択され、式中、隣接する基が一緒になって５もしくは６員脂肪環もしくは芳香環を完結することができ、Ｒ6は低級アルキル基、Ｒ7とＲ8は各々Ｈもしくは低級アルキル基であり、Ｒ9はアリール環式基である）。
【００６２】
本発明のジヒドロキシ芳香族化合物において、Ｘ基は、加水分解酵素によって切断できるあらゆる基であることができる。加水分解酵素は、酵素分類系のクラスＥ．Ｃ．３．１もしくは３．２に分類されるそれらの酵素であり、概して、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼおよびエステラーゼ酵素を含む。特別の実施例は、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラクターゼ、カルボキシルエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。可能なＯ−Ｘ基は、使用条件下で安定であり、酵素との反応により切断することができるあらゆる化学脱離基を含み、限定されないが、アルキルもしくはアリールカルボキシルエステル、リン酸塩と硫酸塩を含む無機オキソ酸塩、およびα−Ｄ−ガラクトシドとβ−Ｄ−ガラクトシド、α−グルクロニドとβ−グルクロニド、およびα−グルコシドとβ−クルコシド基を含む酸素−ピラノシド基、および当該分野において通常の技術を有するものにとって明らかである類似体を含む。好ましい加水分解酵素は、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼである。
【００６３】
式IIの化合物と加水分解酵素との反応により、複素環式エノールホスファート化合物（III）の存在もしくは不在下で、ジヒドロキシ芳香族化合物が形成されることができ、それによって、Iの形成と化学発光の産出が、併発してもしくは連続して進行することができる。
【００６４】
化学発光を産出する一つの方法において、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を、緩衝液中の複素環式エノールホスファート化合物の存在下で、適切な加水分解酵素と反応させる。ｐＨは、酵素活性と化学発光反応を促す値、通常は、約ｐＨ８から１０の間に、好ましくは約ｐＨ９から１０の間に維持する。この方法で反応を行うことにより、持続的な化学発光シグナルを得る。
【００６５】
本発明の化学発光を行う代替方法において、保護化ジヒドロキシ化合物を、加水分解酵素と、緩衝液中もしくは固体表面上で、第１のｐＨを好ましくは５．０−９．５の範囲とし、第１の時間を好ましくは数秒から数分までの範囲として反応させる。次いで、この溶液、もしくは該溶液の測定した一部を、複素環式エノールホスファート化合物および任意でアニオン界面活性持を含む第２の溶液と反応させ、光をピーク強度で測定する、または固定した時間もしくは放射光が消光するまでの時間で光を積算することにより測定する。第２の溶液のｐＨは、８以上、好ましくは９から１０の間であり、典型的には緩衝溶液である。
【００６６】
化学発光を産出するこの方法は、大量の試料を同時に処理してまとめて測定するアッセイにおいて有利である。また、この２ステップ方法は、β−ガラクドシダーゼもしくは酸性ホスファターゼなど、酸性から中性のｐＨ（５−８）において、最適の活性を有する加水分解酵素を測定するために有用である。また、そのような化学発光反応もしくはアッセイに組み込ませることができる任意のステップは、全てのさらなる酵素反応を停止させるために、第１の時間後に酵素阻害剤を反応系に添加することである。
【００６７】
これら二つの反応方法は、様々な因子と特定の使用もしくは適用によって、選択されることが望ましい。それにも関わらず、両方法は有効である。酸性ｐＨが最適である酵素の場合は、二つの独立したステップにおける反応を、各々、最適のｐＨ、温度、イオン強度、緩衝塩などで行うことが望ましい。
【００６８】
複素環式エノールホスファート存在下における加水分解酵素と化合物IIとの反応により化学発光を産出する場合、反応は、通常、温度５℃から５０℃、好ましくは２０℃から４０℃で、ｐＨ７から１０．５、好ましくは８．５から１０の水性緩衝溶液中で行わせる。化合物IIIは、濃度１μＭから２０ｍＭ、好ましくは５０μＭから５ｍＭの間で用いられる。化合物IIは、濃度１μＭから２０ｍＭ、好ましくは５０μＭから５ｍＭの間で用いられる。
【００６９】
また、アニオン性界面活性剤は、本発明の化学発光反応において用いられる。アニオン性界面活性剤は、ジヒドロキシ芳香族化合物不在下における複素環式エノールホスファートからの化学発光のバックグラウンドを低減する。使用時に、アニオン性界面活性剤は、最終反応溶液中に、０．０１から５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１から２．５ｍｇ／ｍＬの間の量で用いられる。アニオン性界面活性剤増強剤は、アルキルサルファートとアルキルスルホナートを含む。界面活性剤の各カテゴリーの代表的な構造のより詳細な一覧を、界面活性剤におけるあらゆる標準的な専門書において見出すことができる。好ましい界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳなどのＣ10−Ｃ20のアルキルスルホナートである。
【００７０】
酵素学的化学発光方法の重要な使用は、被検体の存在もしくは被検体量を、化学発光反応によるアッセイ工程において検出するためである。方法は、被検体を含むと推測される試料を本発明の化学発光化合物と加水分解酵素と接触させるステップと、産出した光を質的方法で検出するステップと、定量が所望される場合には産出した光量を被検体量と関係づけるステップを含む。光強度と被検体量との関係は、被検体の既知濃度で検量曲線を構築することによって、容易に識別することができる。化学発光化合物は、典型的には、濃度約１０-5Ｍから約１０-2Ｍ、好ましくは約１０-4Ｍから１０-3Ｍで用いられる。加水分解酵素は、溶液中で検出する場合、好ましくは約１０-9Ｍ以下である。
【００７１】
本発明の方法によってアッセイできる被検体の複数のカテゴリーがある。これらは、さらなる加水分解酵素の添加が不必要である場合に、加水分解酵素を含む。例えば、加水分解酵素がアルカリホスファターゼである場合、そのような測定は、例えば、患者の肝機能状態の指標として、もしくはある病状のインデックスとして、血清中のアルカリホスファターゼのレベルを測定する場合に使用される。また、前立腺の酸性ホスファターゼの測定も、前立腺腫瘍の臨床的診断のインデックスとして有用である。
【００７２】
本発明の化学発光アッセイによる酵素活性の検出および測定は、遺伝子発現アッセイにおいても使用される。β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびアルカリホスファターゼ、特に排出された胎盤において産出されたアイソザイムが、レポーター遺伝子として有用である（J.Alam, J.Cook, Anal.Biochem.188, 245-54(1990)）。この種のアッセイにおいて、レポーター酵素を発現する責任遺伝子を、生物の遺伝物質中にプラスミドを介して、プロモーターもしくはエンハンサー配列の近傍にクローニングする。転写活性におけるプロモーターもしくはエンハンサー配列の効果を、レポーター酵素の産出レベルを測定することによって評価する。
【００７３】
また、この場合に用いられる被検体は、加水分解酵素阻害剤を含む。阻害剤は、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物などの第２の基質と競合することによって可逆的に作用する化合物、並びに酵素を不活化することにより不可逆的に作用する阻害剤を含む。例えば、アルカリホスファターゼ阻害剤は、無機ホスファート、レバミソール、テトラミソールと他のイミダゾ[１，２−ｂ]チアゾール、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−ホモアルギニンを含み、R.B. McComb, G.N.Bowers, S.Posen , Alkaline Phosphatase, Plenum Press, New York 1979, pp.268-275, 332-334, 394-397, 410-413において同定されている。その他の加水分解酵素阻害剤は、通常、酵素アッセイの分野における当業者に公知である。酵素阻害剤を検出するために本発明の化学発光反応を用いる場合、好適な加水分解酵素を、式IIの化合物と反応させてジヒドロキシ芳香族化合物Iを形成させ、阻害剤基質の存在および不在下で、これを複素環式エノールホスファートIIIと反応させ、結果より阻害剤の存在もしくは量を比較測定する。放射された化学発光の差により、阻害剤の存在が示される。
【００７４】
さらに、この場合に使用される被検体は、加水分解酵素で標識できる、もしくは酵素標識特異結合対を介して特異的に検出できる、様々なクラスの生物と生物学的分子を含む。酵素は、直接、標識として、被検体と結合した化合物に取り込まれることができる。あるいは、被検体結合化合物に対する少なくとも一つの酵素標識特異結合基質に、被検体結合化合物を結合させることができる。この形態の典型例は、オリゴヌクレオチドの酵素標識化検出を用いた核酸ハイブリダイゼーションアッセイである。あるいは、被検体結合化合物を、ビオチンなどの少なくとも一つの第２の特異結合基質で標識し、次いで、これをアビジンなど、第２の特異結合基質に対する酵素標識結合対に結合させることができる。
【００７５】
１以上の加水分解酵素に抱合できる生物学的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンを含む。また、生物学的分子と接着するための機能を有する、リポソーム、ミセル、小胞、ポリマーなど、加水分解酵素を含む、もしくは取り込む複合体を、本発明の方法において使用することができる。
【００７６】
酵素アッセイを行う技術は、公知である。ここに解説として実施例に提示されるガイダンスとともに、試料を調製するための様々な手順、試薬の適切な量と割合、反応時間の設定、検量曲線の構築などは、実験手順の一つとして工夫するために当業者が行う技術範囲内である。
【００７７】
反応は、加水分解酵素によって触媒されるので、検出可能な光量を産出するためには、非常に少量の酵素で十分である。 １ａｍｏｌ（１ｘ１０-18モル）以下の感度が達成されている。そのような少量の加水分解酵素を検出する性能により、本発明の化学発光技術は、酵素結合アッセイを用いた多くのタイプの被検体の分析に適している。 そのような分析およびアッセイでは、分析する試料中における被検体の含有量が少ない、もしくは試料量が限られていることにより、少量の加水分解酵素を検出する性能が要求される。このタイプのアッセイにおいて、アルカリホスファターゼは、特異結合対の一員に抱合される。実施例は、化学発光酵素結合イムノアッセイ、いわゆる酵素免疫結合アッセイもしくはＥＬＩＳＡなどである。そのようなアッセイは、一般的に手動型、並びに自動化多重試験イムノアッセイ系で用いられる。典型的なイムノアッセイにおいて、被検体のハプテン、抗原、もしくは抗体を、被検体に対する酵素標識特異結合対もしくは被検体の酵素標識類似体の存在または量を検出することによってアッセイする。様々なアッセイ型と免疫化学ステップを行うためのプロトコールが、当該分野において公知である。これらのアッセイは、概して二つのカテゴリーに属する。競合的アッセイでは、被検体および被検体の類似体、例えば検出可能な標識化被検体分子などとの特異抗体の免疫学的結合が特徴である。サンドウィッチアッセイでは、連続して、もしくは同時に、被検体と二つの抗体（一つは検出可能に標識化）とが結合する。そのように形成された検出可能な酵素標識化結合対は、本発明の化合物と方法によりアッセイすることができる。測定は、当該分野において通常に使用されるビーズ、チューブ、マイクロウェル、マグネット粒子、テスト用細片、膜、およびフィルターなどを含む個体表面もしくは支持物に付着させた酵素標識化種で行うことができる。また、検出可能な酵素標識化種は、溶液中に遊離している、もしくはリポソームなどの構造体に内包されて存在することができ、後者の場合には、リポソームを溶解して検出可能な酵素を遊離するために溶解剤が用いられる。
【００７８】
その他の代表的な使用は、ウェスタンブロッティング技術によるタンパク質の検出である。被検体として興味のあるタンパク質を含む試料を、電気泳動して分離する。分離したタンパク質を、毛管現象により、もしくは電場を使って、ブロッティング膜に写す。そのように写したタンパク質を、典型的には、第１の特異抗体と、第１の抗体を認識して結合する第２の酵素標識化抗体とを用いて、検出する。マーカー酵素活性の可視化は、被検体タンパク質の存在を反映する。本発明の方法をウェスタンブロッティングに適用するために、アルカリホスファターゼもしくはβ−ガラクトシダーゼなどの加水分解酵素に抱合させた第２の抗体を用いることができ、酵素基質として式IIの化合物と、化学発光剤として式IIIの化合物を使用した化学発光により、酵素活性を測定することができる。ビオチン化抗体とアビジン−酵素抱合体の使用などのこの技術の変形は、本発明の方法を用いて行うことができるアッセイの範囲内であると見なされる。
【００７９】
また、前述の抗原−抗体、ハプテン−抗体もしくは抗体−抗体対に加えて、特異結合対は、相補的なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン受容体、レクチン−炭化水素、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合タンパク質および核酸−抗核酸抗体を含むことができる。
【００８０】
本発明の検出方法の特に有用な適用は、酵素標識化核酸プローブの使用による核酸の検出である。酵素標識を使用した核酸の分析および化学発光検出の方法、例えば、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ検出、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリンティング、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークリフトが、十分に確立された技術である。酵素標識（例えば、ＡＰもしくはβ−ｇａｌ）は、オリゴヌクレオチドプローブとの直接的な抱合体として、もしくはオリゴヌクレオチドの捕捉体として存在することができ、もしくは当該分野の公知手段を使用した間接的な結合手段を介して取り込まれることができる。間接的な結合手段の実施例として、ハプテン−標識化オリゴヌクレオチドと抗ハプテン抗体−酵素抱合体、またはビオチン化オリゴヌクレオチドとアビジン−酵素抱合体の使用を含む。そのような核酸アッセイは、ブロッティング膜上、または当該分野において公知であるビーズ、チューブ、マイクロウェル、マグネット粒子、テスト用細片などを含む固体表面に付着させたオリゴヌクレオチドを使用した溶液中で行うことができる。
【００８１】
他の面において、本発明は、加水分解酵素との反応により化学発光を産出する試薬組成物であって、式IIIの化合物と酸素の存在下において、化学発光を産出する式Iのジヒドロキシ芳香族化合物を産出する式IIの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を含む試薬組成物に関する。試薬組成物は、ｐＨ７−１０．５の範囲である水性緩衝液、濃度０．００１−２０ｍＭの式IIの化合物、および濃度０．００１−２０ｍＭの式IIIの化合物を含む。加水分解酵素との化学発光反応のための製剤は、さらに、酵素活性を増強するもしくは維持するために、マグネシウムもしくは亜鉛などの金属塩を、濃度０．０１−１０ｍＭで含むことができる。
【００８２】
好ましい実施態様において、組成物は、さらにアニオン性界面活性剤を、最終反応溶液中、好ましくは濃度０．０１から５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１から２．５ｍｇ／ｍＬの間で含むことができる。
【００８３】
加水分解酵素との反応により、１ステップ方法で化学発光を産出するための好ましい試薬組成物は、ｐＨ８−１０の範囲である水性緩衝液、濃度約０．０５−５ｍＭの式IIの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物、濃度約０．０５−５ｍＭの式IIIcのアクリダンホスファート、および任意で、好ましくは濃度０．１から２．５ｍｇ／ｍＬのアニオン性界面活性剤を含む。より好ましい組成物において、式IIの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物は、式：
【化４８】
（式中、Ｘは、加水分解酵素によって除去できる基である）
を有する。
【００８４】
本発明の様々な局面をより十分に記載するために、化合物、調製方法、使用の組成と方法を記載した以下の実施例を提示する。実施例は、例示するものと見なされ、本発明の範囲を限定しない。
【００８５】
（実施例）
１．アクリダン誘導体１の合成
【化４９】
【００８６】
ａ．フェニルアクリジン−９−カルボキシラート。
アクリジン−９−カルボン酸（１ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、塩化チオニル（５ｍＬ）に懸濁し、反応混合物を３時間還流させた。溶媒を減圧下で除去して得た黄色固体を、アルゴン下で、ＣＨ2Ｃｌ2とピリジン（３５０μＬ）に溶解した。この溶液を氷槽で冷却し、ＣＨ2Ｃｌ2中のフェノール溶液（０．７８ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を、室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物を酢酸エチルに再度溶解し、水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、粗生成物を得て、これをシリカゲル（３０％酢酸エチル／ヘキサン）上、クロマトグラフで分離し、黄色固体として純生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．３５−７．５７（ｍ、５Ｈ）、７．６３−８．３７（ｍ、８Ｈ）。
【００８７】
ｂ．フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシラート・トリフルオロメタンスルホナート。
フェニルアクリジン−９−カルボキシラート（５３０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を、アルゴン下、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、メチルトリフルオロメタンスルホナート（１ｍＬ、８．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で一晩攪拌し、厚い黄色沈殿物を得た。この沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥させて、黄色結晶を得た。1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ５．２２（ｓ、３Ｈ）、７．４７−７．７１（ｍ、５Ｈ）、８．２３−９．０７（ｍ、８Ｈ）。
【００８８】
ｃ．フェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート。
フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシラート・トリフルオロメタンスルホナート（１０ｍｇ、０．０２１６ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（１０ｍＬ）に懸濁し、この混合物を１５分間還流し、透明な溶液を得た。塩化アンモニウム（８８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を溶液の一部に加え、次いで亜鉛（１０８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。亜鉛の添加により、直ちに溶液の黄色が消えた。無色の溶液を２時間還流した。反応混合液のＴＬＣにより、完全に無極性物質に転化していることが示された。溶液を濾過し、沈殿物をエタノール（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。濾過物を濃縮し、オフホワイトの固体を得て、これをＣＨ2Ｃｌ2中に再度溶解し、水（２ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、粗生成物を得て、（３０％酢酸エチル：ヘキサン）を使用した分取ＴＬＣによって精製した。純生成物を、オフホワイトの固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．３８（ｓ、３Ｈ）、５．１６（ｓ、１Ｈ）、６．８９−７．３７（ｍ、１３Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３３．２９、４９．７２、１１２．９３、１２０．１９、１２１．３６、１２５．７３、１２８．６７、１２９．１６、１２９．２６、１４２．３７、１５１．０４、１７０．２２。
【００８９】
ｄ．９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
三口フラスコを、アルゴンで浄化し、５ｍＬの無水ＴＨＦとジイソプロピルアミン（０．０４ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を注入した。フラスコを、ドライアイス−アセトン槽中で冷却した。この溶液に、ｎ−ブチルリチウム（０．１１６ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を加えた。２０分後、５ｍＬＴＨＦ中、ステップ（ｃ）からアクリダンエステル溶液（７０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、この溶液に加え、−７８℃で３０分間、攪拌を続けた。最終的に、３ｍＬＴＨＦ中、ＰＯＣｌ3溶液（０．０２７ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）とピリジン（０．０２３ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を加え、ドライアイス槽を取り去った。４５分後、ピリジン（０．０３９ｍＬ、０．５８ｍｍｏｌ）と３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．０９４ｍＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、一晩攪拌を続けた。次いで、それを濾過し、溶剤を濾過物から除去した。残留物を、分取ＴＬＣ（８０％酢酸エチル／ヘキサン）にかけ、純生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３５−２．５４（ｍ、４Ｈ）、３．４７（ｓ、３Ｈ）、３．７９−３．９０（ｍ、２Ｈ）、３．９８−４．０８（ｍ、２Ｈ）、６．８２５−７．４５（ｍ、１２Ｈ）、７．８０−７．８３（ｄｄ、１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１９．１２、１９．２４、３３．６３、６２．１９、６２．４９、８８．７２、９２．８２、１１２．４０、１１２．５２、１１５．８３、１１６．０７、１１９．６８、１２０．４４、１２０．７１、１２３．８１、１２６．６９、１２８．０３、１２８．２７、１２８．５８、１３０．０９、１４２．３９、１４３．０６、１６５．７３、２０２．０９。
【００９０】
ｅ．９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（１）。
５０ｍＬアセトン中、ビス（シアノエチル）ホスファート化合物溶液（２．８９７ｇ、５．７７ｍｍｏｌ）を、３０分間、アルゴンで浄化（ｐｕｒｇｅ）した。７．５ｍＬ水中、４７９ｍｇ（１２ｍｍｏｌ）ＮａＯＨのアルゴン浄化溶液を滴下し、溶液を一晩攪拌した。形成した沈殿物を濾過し、５０ｍＬのアルゴン浄化アセトンで洗浄し、風乾させた。３．４７３ｇの（１）を、水分を含んだ白色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．３２６（ｓ、３Ｈ）、６．８２５−７．４５（ｍ、１３Ｈ）、７．８０−７．８３（ｄ、１Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３２．９５、１０２．８６、１０２．９２、１１２．３０、１１５．８５、１２０．６８、１２１．０１、１２２．３５、１２２．４１、１２２．６２、１２７．４８、１２７．６６、１２８．２３、１２９．６６、１４３．１７、１４３．３２、１４４．６６、１５６．０１；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．５８１（外部標準Ｈ3ＰＯ4に対して）。
【００９１】
２．アクリダン誘導体２の合成
【化５０】
【００９２】
ａ．９−（フェニチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２８４９５号に記載されたように調製したフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカリボキシラート（７０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ溶液（０．２４ｍｍｏｌ）に添加した。−７８℃で３０分間攪拌後、４ｍＬＴＨＦ中のＰＯＣｌ3（２５μＬ）とピリジン（２１μＬ）溶液を添加した。ドライアイス槽を取り去り、３０分間持続して攪拌した。ＴＬＣ（３０％酢酸エチル／ヘキサン）により、出発物質が完全に反応したことが示された。溶液を氷槽で冷却し、４ｍＬＴＨＦ中のピリジン（２１０μＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（４４μＬ）と反応させた。室温で一晩攪拌後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過除去し、反応溶液を減圧乾燥させた。残留物を分取ＴＬＣ（酢酸エチル）にかけ、生成物を単離した；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．４−２．６（ｍ、４Ｈ）、３．５２１（ｓ、３Ｈ）、３．８−４（ｍ、２Ｈ）、４．０−４．１（ｍ、２Ｈ）、６．９−７．２（ｍ、４Ｈ）、７．２２−７．５（ｍ、７Ｈ）、７．５５−８（ｄｄ、２Ｈ）。
【００９３】
ｂ．９−（フェニルチオホスホリルオキシメチリジン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（５）。
５０ｍｌアセトン中、ビス（シアノエチル）ホスファート化合物（０．５９ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を、アルゴンで３０分間浄化した。１０ｍＬ水中のＮａＯＨ１０４ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）のアルゴン浄化溶液を滴下し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成した沈殿物を、吸引濾過し、５０ｍＬのアルゴン浄化アセトンで洗浄し、風乾した。少量のアセトンを含む淡黄色の固体として０．５ｇの５を得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．３６（ｓ、３Ｈ）、６．９−７．４（ｍ、１１Ｈ）、７．７５−７．８（ｄ、１Ｈ）、８．２−８．２２（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．８５。
【００９４】
実施例３．アクリダン誘導体３の合成。
【化５１】
【００９５】
ａ．４’−クロロフェニル・アクリジン−９−チオカルボキシラート。
クロロ−チオフェノール（４．７５ｇ）と７．２２ｇのアクリジン−９−カルボニルクロライドを、１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中に溶解し、次いで１２．１ｍＬのピリジンに溶解させた。反応混合物は、橙褐色になった。混合物を、アルゴン下、一晩室温で攪拌した。溶媒を乾燥後、固体を、１００ｍＬのヘキサンで洗浄、濾過し、さらに１００ｍＬのヘキサンで洗浄、濾過し、次いで、５００ｍＬの水で洗浄、濾過し、風乾させた。淡茶黄色のチオエステル（８．７１ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．４７−７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．５８−７．６７（ｍ、４Ｈ）、７．８１−７．８６（ｍ、２Ｈ）、８．１２（ｄ、２Ｈ）、８．２９（ｄ、２Ｈ）。
【００９６】
ｂ．４’−クロロフェニルアクリダン−９−チオカルボキシラート。
４’−クロロフェニルアクリジン−９−チオカルボキシラート（２．０ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）中に溶解した。溶液をアルゴンで浄化し、次いで３．７２ｇの亜鉛粉末を添加し、次いで０．４５ｍＬの酢酸を添加した。ＴＬＣにより、出発物質が２０分で消費されたことが示された。混合物を濾過し、固体を、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。複合化ＣＨ2Ｃｌ2溶液を水（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。少量の生成物を分取ＴＬＣによって、特性分析用に精製した。残りの生成物は、さらなる精製を行わずに使用した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ５．２２（ｓ、１Ｈ）、６．２８（ｓ、１Ｈ）、６．７９−７．３１（ｍ、１２Ｈ）。
【００９７】
ｃ．４’−クロロフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート。
４’−クロロフェニルアクリダン−９−チオカルボキシラート（２．０ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）中に、アルゴン下、溶解させ、メチルトリフラート（６．５ｇ）を添加し、一晩攪拌した。褐色溶液を乾燥させ、粗生成物を、３０％酢酸エチル／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。それによって、純生成物（１．８ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．４７（ｓ、３Ｈ）、５．０９（ｓ、１Ｈ）、７．０２−７．３９（ｍ、１２Ｈ）。
【００９８】
ｄ．９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
１０ｍＬ無水ＴＨＦ中、４−クロロフェニル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（０．７０ｇ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ溶液（１．４ｅｑ）に、−７８Ｃで滴下した。−７８Ｃで６０分間攪拌後、黄色溶液を、４ｍＬのＴＨＦ中、ＰＯＣｌ3（０．５１７ｇ）とピリジン（１．５２ｍＬ）溶液で、ゆっくりと処理した。３０分後にドライアイス槽を取り去り、１時間攪拌を続けた。溶液は黄色くなり、沈殿物を形成した。
【００９９】
混合物を氷槽中で冷却し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．８９ｇ）と１．０ｍＬピリジンで処理した。添加終了後、氷槽を取り去った。室温で一晩攪拌後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過除去し、ＴＨＦで洗浄した。複合化濾過物を減圧乾燥し、得られた褐色物質を酢酸エチルに溶解し、４ｘ２５ｍＬの水で洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥させ、濃縮した。残留物を、８０−１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーによって分離し、０．３２５ｇの生成物を単離した；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．４８−２．６４（ｍ、４Ｈ）、３．５３（ｓ、３Ｈ）、３．８６−４．１６（ｍ、４２Ｈ）、６．９４−７．９４（ｍ、１２Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ９．４８（ｐ）。
【０１００】
ｅ．９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（３）。
１０ｍＬアセトン中、ビス（シアノエチル）ホスファート化合物（０．３２５ｇ）溶液をアルゴンで浄化した。２．５ＭＮａＯＨ溶液（４７３μＬ）を添加し、さらに５００μＬの水を添加した。溶液をアルゴン下、一晩攪拌した。形成された沈殿物を、吸引濾過し、風乾した。元溶液には、モノ（シアノエチル）保護化化合物（１４０ｍｇ）が含まれていることが見出された。ＮａＯＨの再脱保護化を繰り返すことによって、二ナトリウム塩の第２の生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．３５（ｓ、３Ｈ）、６．９２−７．３６（ｍ、１０Ｈ）、７．７８（ｄ、１Ｈ）、８．２０（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．２２ｓ。
【０１０１】
実施例４．アクリダン誘導体４の合成。
【化５２】
【０１０２】
ａ．ナフチルアクリジン−９−チオカルボキシラート。
２−ナフタル−エネチオール（４８．８１ｇ）と、６５．１７ｇのアクリジン−９−カルボン酸から調製したアクリジン−９−カルボニルクロライドを、１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、次いで、１２０ｍＬのピリジンを添加した。混合物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌した。溶媒を乾燥後、固体を５００ｍＬヘキサンで洗浄、濾過し、さらに５００ｍＬヘキサンで洗浄、濾過し、次いで、６００ｍＬ水で洗浄、濾過し、一晩風乾させた。チオエステルを、１５００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧乾燥させた。褐色固体としてチオエステル（９４．６７ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．５４−８．００（ｍ、１１Ｈ）、８．１７−８．３１（ｍ、４Ｈ）。
【０１０３】
ｂ．ナフチル１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボキシラート・トリフラート。
ナフチルアクリジン−９−チオカルボキシラート（２６．３８ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）に懸濁した。メチルトリフルオロメタンスルホナート（２４．５ｍｌ）を添加し、混合物を一晩攪拌した。混合物を濾過し、固体を、ＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）とヘキサン（５００ｍｌ）で洗浄した。風乾後、黄色固体として生成物（２８．８３ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）δ５．２０（ｓ、３Ｈ）、７．６６−７．７５（ｍ、２Ｈ）、７．８８−７．９２（ｍ、１Ｈ）、８．０３−８．０９（ｍ、２Ｈ）、８．１５（ｄ、１Ｈ）、８．２６（ｔ、２Ｈ）、８．４８（ｓ、１Ｈ）、８．６１−８．６８（ｍ、２Ｈ）、８．８０（ｄ、２Ｈ）、９．０３（ｄ、２Ｈ）。
【０１０４】
ｃ．ナフチル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート。
ナフチル１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボキシラート・トリフラート（６５．５０ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（１０００ｍＬ）に、アルゴン下、懸濁し、氷酢酸（２１．２ｍｌ）と亜鉛（４０．４３ｇ）を添加した。一晩攪拌後、ＴＬＣにより、出発物質が消失し、新しい生成物の形成が示された。反応混合物を、シリカゲル吸着床に濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2を減圧除去した。得られた淡黄色固体を、イソプロパノール（５００ｍｌ）中で攪拌し、濾過し、さらにイソプロパノール５００ｍｌで洗浄し、風乾した。これによって、純生成物（４６．３６ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．４７（ｓ、３Ｈ）、５．１３（ｓ、１Ｈ）、７．００−７．０６（ｍ、４Ｈ）、７．２５−７．４９（ｍ、７Ｈ）、７．７０−７．７９（ｍ、４Ｈ）。
【０１０５】
ｄ．９−（ナフチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル。
６００ｍＬ無水ＴＨＦ中のナフチル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボキシラート（１７．３２ｇ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ溶液（１．２５ｅｑ．）に、−７８Ｃで滴下した。−７８Ｃで９０分間攪拌後、橙褐色溶液を、１５０ｍＬＴＨＦ中のＰＯＣｌ3（２０．８０ｇ）とピリジン（５０ｍＬ）溶液で、穏やかに処理した。ドライアイス槽を６０分後に取り去り、攪拌を１時間続けた。溶液は褐色になり、沈殿物を形成した。
【０１０６】
混合物を、３−ヒドロキシプロピオニトリル（２７．８ｍｌ）で処理した。室温で一晩攪拌後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過除去し、ＴＨＦで洗浄した。複合化濾過物を減圧乾燥し、得られた褐色の油脂を、５０−１００％酢酸エチル−ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィーで分離し、生成物を単離した。黄色の油脂を、ＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）に溶解し、水（４５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧乾燥させた。これにより、黄色固体として生成物（１７．７６ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３３−２．５３（ｍ、４Ｈ）、３．５３（ｓ、３Ｈ）、３．８２−４．０６（ｍ、４Ｈ）、６．９３（ｔ、１Ｈ）、７．０３（ｄ、１Ｈ）、７．１０−７．１８（ｍ、２Ｈ）、７．２５−７．５５（ｍ、５Ｈ）、７．７９−７．９２（ｍ、５Ｈ）、７．７９−７．９２（ｍ、５Ｈ）、８．０２（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ−９．６９（ｐ）（外部標準Ｈ3ＰＯ4に対して）。
【０１０７】
ｅ．９−（ナフチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（４）。
２００ｍＬアセトン中のビス（シアノエチル）ホスファート化合物（１７．２８ｇ）を、アルゴンで浄化した。５０ｍｌ水中のＮａＯＨ（２．７６ｇ）溶液を添加し、該溶液を、アルゴン下、一晩攪拌した。形成された沈殿物をアセトン中２０％水（３００ｍＬ）で吸引濾過洗浄し、減圧乾燥させた。淡黄色の固体として、生成物（１５．０７ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ３．２２（ｓ、３Ｈ）、６．６７（ｄ、１Ｈ）、６．８７（ｔ、１Ｈ）、７．０１（ｔ、１Ｈ）、７．０８−７．１５（ｍ、２Ｈ）、７．２３（ｄ、１Ｈ）、７．３１−４４（ｍ、３Ｈ）、７．５１（ｓ、１Ｈ）、７．５９（ｄ、２Ｈ）、７．７３（ｄ、１Ｈ）、７．８６（ｄ、１Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．３０（ｓ）。
【０１０８】
実施例５．付加的に調製したさらなる複素環式エノールホスファート。
また、以下の式ＩＶの化合物を調製し、本発明の化学発光反応に用いた。
【化５３】
【０１０９】
Ｒ11−Ｒ16は、示さない限りＨである。化合物６−８は、二重結合異性体の混合物として得られた。化合物５−１４の各々は、実施例１−４に記載された一般的な合成方法により調製した。さらに、式：
【化５４】
[式中、Ｖは、ｔ−ブチル、ＣＨ3、ＯＣＨ3、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＯＣＨ3、ＣＮおよびＮＯ2、ならびに式：
【化５５】
（式中、Ｕは、ｐ−Ｉ、ｐ−ＣＨ3、ｍ−ＯＣＨ3、ｏ−Ｃｌ、ｍ−Ｃｌ、ｏ−Ｂｒ、ｍ−Ｂｒ、ｐ−Ｂｒおよびｐ−ＮＯ2、並びにこの式で３，４−ジクロロ−、２，５−ジクロロ−、および２，６−ジクロロフェニル基を有する化合物）の化合物である]
の化合物を調製し、ジヒドロキシ芳香族化合物との反応時に化学発光を産出させる。
【０１１０】
実施例６．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシフェニルホスファート、二ナトリウム塩の調製。
ヒドロキノンを、０℃でＣＨ2Ｃｌ2中、塩化ベンゾイルとピリジンとの反応により、収量６２％で、一安息香酸エステルとして産出した。ジクロロホスファート誘導体を、１０当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルと反応させて、ビス（シアノエチルホスファート）を８９％収量で産出した。シアノエチルとベンゾイル保護基を、室温で一晩、水性ＮａＯＨ／アセトンで加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、二ナトリウム塩として、４−ヒドロキシフェニルホスファートを産出した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ６．５６（ｄ、１Ｈ）、６．９２（ｔ、１Ｈ）。
【０１１１】
実施例７．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の２−ヒドロキシフェニルホスファート、二ナトリウム塩。
カテコールを、０℃でＣＨ2Ｃｌ2中、塩化ベンゾイルとピリジンとの反応により、収量６２％で、一安息香酸エステルとして保護化した。エステルを、０℃で、ＣＨ2Ｃｌ2中、過剰量のＰＯＣｌ3とピリジンで、リン酸化した。ジクロロホスファート誘導体を、１０当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルと反応させて、ビス（シアノエチルホスファート）を、収量９０％で産出した。シアノエチルとベンゾイル保護基を、室温で一晩、水性ＮａＯＨ／アセトンで加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、固体を再びメタノールで洗浄し、二ナトリウム塩として、２−ヒドロキシフェニルホスファートを産出した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ６．５６−６．６１（ｍ、１Ｈ）、６．６８−６．７１（ｄ、１Ｈ）、６．８２−６．８７（ｍ、１Ｈ）、７．１９−７．２２（ｄ、１Ｈ）。
【０１１２】
実施例８．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルホスファート、二ナトリウム塩の調製。
２，３，５，６−テトラフルオロヒドロキノンを、室温で一晩、ＤＭＦ中、ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドとイミダゾールとの反応により、収量４６％で、モノ（ｔ−ブチルジメチルシリル）エーテルとして保護化した。クロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製後、シリルエーテルを、０℃で、ピリジン中、過剰量のＰＯＣｌ3でリン酸化した。ジクロロホスファート誘導体を、１０当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルと反応させて、ビス（シアノエチルホスファート）誘導体を産出し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中、７５−１００％酢酸エチル）にかけた後、収量５５％で脱シリル化した。シアノエチル保護基を、室温で２日間、水性ＮａＯＨ／アセトンで加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、二ナトリウム塩を産出した。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ４．２４４；19Ｆ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ−１６９．０２（ｄ、２Ｆ）、−１６１．１６（ｄ、２Ｆ）。
【０１１３】
実施例９．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物２−および３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルホスファート、二ナトリウム塩の調製。
２−クロロヒドロキノン、２０ｇ（Aldrich, Milwaukee, Winsconsin）を、３５０ｍＬの暖めた１０％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2中に溶解して、再結晶させ、濾過し、１．５Ｌのヘキサンを添加した。一晩、４℃に冷却した後、１１ｇのオフホワイトの固体を回収した。精製した２−クロロヒドロキノンを、氷温で、ＣＨ2Ｃｌ2中の塩化アセチル／ピリジンでモノアセチル化し、異性体のモノアセタートとジアセタートとの混合物を産出した。混合物を、０℃で、ピリジン中、過剰量のＰＯＣｌ3でリン酸化した。反応生成物を、過剰量の２−シアノエタノールと反応させ、異性体のビス（シアノエチルホスファート）誘導体の４：１混合物を産出し、カラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ヘキサン）によって、ジアセタートから単離した。アセタートとシアノエチル保護基を、０℃で１９時間、水性ＮａＯＨ／アセトン（ＮａＯＨ３ｅｑ．）で加水分解した。沈殿した生成物をメタノールに溶解し、アセトンで沈殿させて、異性体の二ナトリウムリン酸塩を産出した。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｄ）δ６．５６−７．１９（ｍ、３Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ１．３６、１．３９。
【０１１４】
実施例１０．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドの調製。
ヒドロキノンを、エタノール／水性ＮａＯＨ中、α−ブロモガラクトーステトラアセタート（１．５ｅｑ．）と、室温で２日間、遮光した容器中で反応させた。エトキシドナトリウム（５ｅｑ．）を添加し、溶液を１時間後に濃縮した。残留物を、水と酢酸エチルとの間で分配した。水層を乾燥し、生成物をシリカ上のクロマトグラフィー（３０％メタノール／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ３．５７−３．８８（ｍ、６Ｈ）、４．６８（ｄ、１Ｈ）、６．６８（ｄ、２Ｈ）、６．９６（ｄ、２Ｈ）。
【０１１５】
実施例１１．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の４−ヒドロキシフェニルβ−Ｄ−グルクロニドの調製。
ヒドロキノン（１０ｇ）を、ＣＨ2Ｃｌ2中、塩化ベンゾイルとピリジンとの反応により、一安息香酸エステルに転化させた。７ｇのエステルを得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ４．８８０（ｓ、１Ｈ）、６．８７（ｄ、２Ｈ）、７．０８（ｄ、２Ｈ）、７．５２（ｔ、２Ｈ）、７．６４（ｔ、１Ｈ）、８．２０（ｄ、２Ｈ）。
【０１１６】
後者（２００ｍｇ）を、アセトン中の水性ＮａＯＨで脱プロトンし、無水エタノール中のエチルα−Ｄ−ブロモグルクロナートと反応させることによって、β−グルクロニドエチルエステル誘導体に転化させた。分取ＴＬＣによる精製により、５０ｍｇの二重保護化化合物を産出した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ１．２９０（ｔ、３Ｈ）、３．６０１−３．７８０（ｍ、３Ｈ）、４．１４６−４．２５８（ｍ、３Ｈ）、４．６４（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、４．８６（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、５．１９２（ｄ、１Ｈ）、７．１８７−７．２８５（ｍ、４Ｈ）、７．６３５（ｔ、２Ｈ）、７．７６７（ｔ、１Ｈ）、８．２０８（ｄ、２Ｈ）。
【０１１７】
後者化合物の５０ｍｇ試料を、アセトン中水性ＮａＯＨで加水分解し、安息香酸エステルとエチルエステル基を加水分解した。沈殿した生成物（１６ｍｇ）を濾過して乾燥した。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ３．４−３．５（ｍ、３Ｈ）、３．６４（ｄ、１Ｈ）、４．６５（ｄ、１Ｈ）、６．５３（ｄ、２Ｈ）、６．８７（ｄ、２Ｈ）。
【０１１８】
実施例１２．ジヒドロキシ芳香族化合物の評価。
複数のジヒドロキシ芳香族化合物をスクリーニングし、１の化学発光反応の誘導における全般的な効果を測定した。テスト化合物の保存溶液（エタノール／１０％ＤＭＳＯもしくはＤＭＳＯ中、２ｘ１０-4Ｍ）を調製した。５μＬの各試料を、９６ウェルマイクロプレートに分注した。０．２Ｍ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇ2+および０．１％ＳＤＳ中に、０．６６ｍＭ化合物１を含む溶液９５μＬを、各ウェルに添加した。全てのウェルで、光強度を３０分間スキャンした。各テストウェルに対して、最大強度と最大になるまでの時間を測定した。
【０１１９】
【０１２０】
実施例１３．化学発光強度の速度推移
アクリダンホスファート１とヒドロキノン（ＤＨＡ−２）を含む組成物からの化学発光の速やかな産出を図１に示す。反応混合物は、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２２１）緩衝液、０．２Ｍ、ｐＨ９．６中に、０．６６ｍＭアクリダンホスファート（１）と４μＭヒドロキノンを含んでいた。
【０１２１】
実施例１４．アクリダンホスファート２とＤＨＡ−１の化学発光の検出。
以下の実施例では、ジヒドロキシ芳香族化合物との化学発光反応の使用によって、微量の複素環式エノールホスファート化合物を検出するための性能を例示する。
【０１２２】
３つの白色マイクロウェルの各々に、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＳＤＳ中のアクリダンホスファート２溶液（６．６ｘ１０-11から６．６ｘ１０-17ｍｏｌの間で含有する希釈液）１００μＬを分注した。水中、２−クロロヒドロキノン（ＤＨＡ−１）の０．０１ｍＭ溶液１００μＬを各ウェルに分注し、光強度を２．５分で測定した。図２に示す結果より、光強度は、試験した全範囲に亘って、ホスファート化合物の量と正の相関関係であった。
【０１２３】
本実施例では、連結可能基で適切に官能基化された誘導体が、特異結合アッセイにおける単一生成標識として機能し得るのに十分な低濃度で、複素環式エノールホスファートを検出し得ることを実証した。
【０１２４】
実施例１５．アルカリホスファターゼの化学発光を検出するための試薬。
アルカリホスファターゼの化学発光を検出するために有効な試薬組成物は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１、および１ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファートを含んでいた。上記組成物１００μＬを、８ｘ１０-17ｍｏｌのＡＰと、Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ−２０ｅルミノメーターに設置したテストチューブ中、２５℃で反応させることにより、容易に測定できる青色の化学発光を産出した。典型的な反応の時間推移を図３に示す。
【０１２５】
実施例１６．その他の複素環式エノールホスファート化合物の化学発光の検出。
前記実施例と同様にして、化合物１の代わりに、各アクリダンホスファート２−４を含む組成物を、ＡＰと、２５℃で反応させた。各々、ＡＰ不在下でのバックグラウンドを越えて識別でき、容易に測定できる化学発光を産出した。
【０１２６】
実施例１７．保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の濃度の効果。
加水分解酵素の化学発光アッセイにおいて有用である、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物の濃度範囲を、測定するために実験を行った。０から１０ｍＭまでの範囲の濃度の４−ヒドロキシフェニルホスファート（ｍｇ／ｍＬで：ａ、１；ｂ、３．３；ｃ、０．６６；ｄ、０．８３；ｅ、１０；ｆ、０．１；ｇ、０）を含む０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１溶液と０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む試薬を、８ｘ１０-17ｍｏｌのＡＰと、２５℃で反応させた。図４に、化学発光放射の様々な速度推移を示す。４−ヒドロキシフェニルホスファートを欠く溶液は、ほとんど化学発光を産出しなかったことから、光の放射が、単に、エノラートの自動酸化を生じる、ＡＰによる１からのホスファート保護基の除去によるものではないことが明らかである。
【０１２７】
実施例１８．１ステップアッセイにおけるアクリダンホスファートとＡＰの検出直線性。
様々な量のＡＰを、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．６６ｍＭアクリダンホスファート１、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファートおよび０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む試薬組成物１００μＬと、２５℃で、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎルミノメーターに設置した９６ウェルプレート中で、反応させることによって、ＡＰの化学発光アッセイを行った。図５に示すように、２５分で測定した光強度が、８ｘ１０-17から８ｘ１０-20モル範囲の酵素量に相関した。
【０１２８】
実施例１９．β−ガラクトシダーゼの化学発光の検出。
β−ガラクトシダーゼ（Grade VIII、カタログ番号．Ｇ５６３５、Sigma Chemical社）の保存溶液を、０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０１ＭＮａＣｌ、０．０１ＭＭｇＣｌ2中に、４．９ｘ１０-15から１．６ｘ１０-18モル酵素／μＬまでを含むように段階希釈した。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０１ＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2中、１ｍＭの４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド１３０μＬを、各酵素希釈液２．６μＬと共に、３７℃で３５分間インキュベーションした。５０μＬずつ、黒色マイクロウェル２連に分注し、室温まで冷却した。以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート３および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート３溶液５０μＬを、各ウェルに分注した。ウェルにおけるβ−ガラクトシダーゼ酵素量は、４．９ｘ１０-15から１．６ｘ１０-18モルまでの範囲であった。β−ガラクトシダーゼ量に関連して、５分で測定した化学発光強度を、図６に示す。
【０１２９】
実施例２０．β−グルクロニダーゼの化学発光の検出。
β−グルクロニダーゼ（タイプＸ−Ａ、カタログ番号．Ｇ７８９６、Sigma Chemical社、ＭＷ＝２９０，０００）保存液を、０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．１５ＭＮａＣｌ中に、３．３ｘ１０-14から３．３ｘ１０-18モル酵素／μＬを含むように段階希釈した。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０１ＭＮａＣｌ中、１ｍＭの４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−グルクロニド１３０μＬを、各酵素希釈液２．６μＬと共に、３７℃で３０分間インキュベーションした。５０μＬずつ、黒色マイクロウェル２連に分注し、室温まで冷却した。以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート４および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート４溶液５０μＬを、各ウェルに注入した。β−グルクロニダーゼ量に相関して１１分で測定した化学発光強度を、図７に示す。
【０１３０】
実施例２１．アルカリホスファターゼ−抱合体を使用したウェスタンブロットアッセイ。
本発明の組成物を、ウェスタンブロットにおいて、タンパク質抗原、β−ガラクトシダーゼを、ニトロセルロース膜上で、ＡＰ標識化抗体により、検出、定量するために使用した。タンパク質を５０００、１０００、１８０、３０、および５ｐｇずつ含むβ−ガラクトシダーゼ希釈液を、各々、電気泳動し、ニトロセルロース膜（Hybond ECL、Amersham、Arlington Heights、Illinois）に写した。膜を、Ｔ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ＴＢＳは５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌである）中、１％無脂肪ミルク（ＮＦＭ）で、室温、１時間、ブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液中のマウス抗−β−ガラクトシダーゼ溶液３．３μｇ／ｍＬの１：１５００希釈液、Ｔ−ＴＢＳ洗浄用緩衝液、および次いで、ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ抱合体溶液４１６Ｕ／ｍＬの１：６００希釈液で、段階的に処理した。Ｔ−ＴＢＳで洗浄後、膜を、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭヒドロキノンホスファート二ナトリウム塩、０．６６ｍＭアクリダンホスファート３および０．１％ＳＤＳを含む０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６を含む検出用試薬にしばらく浸した。膜を、透明なプラスチックシートの間にはさみ、Ｘ線フィルムに露光した。β−ガラクトシダーゼの５本のバンド全てを、１５分後に、１分露光して検出した。これらの組成物を使用して産出した光によって、少なくとも１日で現像できる強い放射がもたらされた。
【０１３１】
実施例２２．ドットブロットアッセイ。
ドットブロットアッセイにおいて、本発明の試薬の使用の代表液な実施例を、以下の実施例において明らかにする。
【０１３２】
ジゴキシゲニン−標識化ＤＮＡ（ｐＢＲ３２８）、抗−ジゴキシゲニン−ＡＰ抱合体を、キット（Genius 3, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana）として入手し、ブロッキング用緩衝液と陽性に荷電したナイロン膜を、Boehringer-Mannheimkaraetaから得た。洗浄用緩衝液は、０．１Ｍマレイン酸、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％ＳＤＳであった。検出用試薬は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．６６ｍＭアクリダンホスファート２、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファート、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＳＤＳを含んだ。
【０１３３】
ＤＮＡ希釈液（１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１ｐｇ）を、製造元のプロトコールに従って、ナイロン膜上にドットブロットし、ブロッキングし、洗浄し、抗体−ＡＰ抱合体と反応させた。過剰量の緩衝液を排出除去し、ブロットを上記検出用試薬中に、３分間浸した。過剰量の試薬を排出除去し、ブロットを透明のシートにはさみ、様々な長さの時間で、Ｘ線フィルムに露光した。即時１分の露光により、１０ｐｇ−０．３ｐｇのスポットを検出した。３０分後、全７つのスポットを、２０分間の露光で検出した。数日間で多重露光を行うことができた。例えば、５日後、全７つのスポットを、１−５分の露光で検出することができた。０．６６ｍＭアクリダンホスファート３、もしくは０．６６ｍＭ２−および３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルホスファートの混合溶液を含む検出用試薬によっても、同様の結果が得られた。
【０１３４】
実施の形態および実施例は、例示するものに過ぎず、限定するものとしてはみなされない。明確に開示されていない特別の化合物と方法の変形を、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、行うことができると認識される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、室温でのアクリダンホスファート１とヒドロキノンとの反応によって速やかに生じた化学発光を示すプロットである。反応混合物は、０．６６ｍＭアクリダンホスファート１と４μＭのヒドロキノンを、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含有する０．２Ｍの２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（２２１）緩衝液、ｐＨ９．６、中に含む。
【図２】 図２は、化学発光強度とアクリダンホスファート２の量との関係を示したグラフである。０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＳＤＳ中、様々な量のアクリダンホスファート２（６．６ｘ１０-22から６．６ｘ１０-17モルまでを含むように希釈されたもの）からなる組成剤１００μＬを、１００μＬの２−クロロヒドロキノン（ＤＨＡ−１）の０．０１ｍＭ水溶液と反応させることによって放射した化学発光を、２．５分で測定した。
【図３】 図３は、０．１Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中に、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１溶液と１ｍｍ４−ヒドロキシルフェニルホスファートとからなる剤１００μＬに、２５℃で、８ｘ１０-17モルのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を添加してトリガーさせることによって、放射した化学発光強度の時間推移を示すプロットである。
【図４】 図４は、４−ヒドロキシルフェニルホスファートの濃縮機能としての化学発光放射の時間推移を示すプロットである。様々な濃度の４−ヒドロキシルフェニルホスファート（ｍｇ／ｍＬで、ａ、１；ｂ、３．３、；ｃ、０．６６；ｄ、０．８３；ｅ、１０；ｆ、０．１；ｇ、０）を含む０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中、０．３３ｍＭアクリダンホスファート１溶液と０．８８ｍＭＭｇＣｌ2からなる組成剤を、８ｘ１０-17モルのＡＰと、２５℃で反応させた。
【図５】 図５は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中に、０．６６ｍＭアクリダンホスファート１、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシルフェニルホスファートおよび０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む組成剤１００μＬによって放射された化学発光の強度と、ＡＰの量との関係を示したグラフである。上記組成（１００μＬ）は、８ｘ１０-15から８ｘ１０-20モルの間の酵素を含むＡＰ溶液１０μＬ、またはブランク剤としての水１０μＬと、上記温度で、黒色のマイクロプレートのウェル中で反応させた。光強度を２５分後に測定した。０．１amol未満のＡＰが検出された。
【図６】 図６は、β−ガラクトシダーゼの量と化学発光強度との関係を示したグラフである。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０１ＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2中の４−ヒドロキシフェニルβ−ガラクトシド（１ｍＭ）溶液を、β−ガラクトシダーゼ希釈液と共に、３７℃で３５分間インキュベーションした。一部を、以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート３溶液および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート３溶液の等量と反応させた。ウェル中の酵素量を、β−ガラクドシダーゼの４．９ｘ１０-15から１．６ｘ１０-18モルまでの範囲とした。化学発光強度を５分で測定した。
【図７】 図７は、β−グルクロニダーゼの量と化学発光強度との関係を示したグラフである。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、０．０１ＭＮａＣｌ中、４−ヒドロキシルフェニルβ−グルクロニド（１ｍＭ）溶液を、β−グルクロニダーゼ希釈液と、３７℃で３０分間インキュベーションした。一部を、以下の組成：０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ2、０．６６ｍＭアクリダンホスファート４溶液および０．１％ＳＤＳを有するアクリダンホスファート４溶液の等量と反応させた。ウェル中の酵素量を、β−グルクロニダーゼの３．３ｘ１０-14から３．３ｘ１０-18モルまでの範囲とした。化学発光強度を１１分で測定した。
【図８】 図８は、０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６中に、０．６６ｍＭアクリダンホスファート４、０．６６ｍＭ４−ヒドロキシフェニルホスファート、０．１％ＳＤＳ、および０．８８ｍＭＭｇＣｌ2を含む組成剤を用いたＤＮＡ希釈液のドットブロット解析の画像である。画像は、膜と検出用剤と接触させた３６時間後に１分間露光した結果である。
Claims (65)
- ａ）炭素環式芳香環を１から５個含み、環の偶数個の炭素原子で隔てられた二つのヒドロキシ基で置換されているジヒドロキシ芳香族化合物；およびｂ）式
を有する複素環式エノールホスファート化合物、を、酸素存在下で、反応させることを含む化学発光を産出する方法。 - 該ジヒドロキシ芳香族化合物が、ベンゼン、ビフェニル、ナフタレン、およびアントラセン環から選択される芳香環式系を含む請求項１に記載の方法。
- 該ジヒドロキシ芳香族化合物が、式Ｉ
を有する請求項１に記載の方法。 - 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から各々独立して選択される、請求項３に記載の方法。
- 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が各々水素であり、Ｒ1が水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される、請求項３に記載の方法。
- 複素環式エノールホスファート化合物における基Ｒ19が、置換化および無置換化低級アルキル基と置換化および無置換化ベンジル基から選択される、請求項１に記載の方法。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項１に記載の方法。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項５に記載の方法。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 複素環式エノールホスファート化合物が、基−Ａ−Ｑを含む、請求項１に記載の方法。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、Ｒ10もしくはＲ19もしくはＲ11−Ｒ18のいずれか一つの位置における置換基として、基−Ａ−Ｑを含む請求項７に記載の方法。
- ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物を含む溶液中に、酸素が外気と平衡状態で溶解して供給される、請求項１に記載の方法。
- ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファート化合物が、ｐＨ７から１０．５までの水性緩衝液を含む溶液中に存在し、ジヒドロキシ芳香族化合物が濃度０．００１−２０ｍＭで存在し、複素環式エノールホスファート化合物が濃度０．００１−２０ｍＭで存在する、請求項１に記載の方法。
- ａ）炭素環式芳香環を１から５個含み、環の偶数個の炭素原子で隔てられた二つのヒドロキシ基で置換されているジヒドロキシ芳香族化合物；およびｂ）式
を有する複素環式エノールホスファート化合物、を含む、酸素存在下で化学発光を産出するための組成物。 - 該ジヒドロキシ芳香族化合物が、ベンゼン、ビフェニル、ナフタレン、およびアントラセン環から選択される芳香環式系を含む請求項１５に記載の組成物。
- 該ジヒドロキシ芳香族化合物が、式Ｉ
を有する請求項１５に記載の組成物。 - 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が、各々、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される、請求項１７に記載の組成物。
- 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が各々水素であり、Ｒ1が水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される、請求項１７に記載の組成物。
- 複素環式エノールホスファート化合物における基Ｒ19が、置換化および無置換化低級アルキル基と置換化および無置換化ベンジル基から選択される、請求項１５に記載の組成物。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項１５に記載の組成物。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項１９に記載の組成物。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 複素環式エノールホスファート化合物が、基−Ａ−Ｑを含む、請求項１５に記載の組成物。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、Ｒ10もしくはＲ19もしくはＲ11−Ｒ18のいずれか一つの位置における置換基として、基−Ａ−Ｑを含む請求項２５に記載の組成物。
- 濃度０．００１−２０ｍＭのジヒドロキシ芳香族化合物と、濃度０．００１−２０ｍＭの複素環式エノールホスファート化合物を含有するｐＨ７から１０．５までの範囲の水性緩衝液を含む請求項１５に記載の組成物。
- ｐＨが８−１０の範囲であり、濃度０．０５−５ｍＭのジヒドロキシ芳香族化合物と、濃度０．０５−５ｍＭの複素環式エノールホスファート化合物を含有する請求項２７に記載の組成物。
- さらに、ジヒドロキシ芳香族化合物の一つのヒドロキシ基が酵素切断可能基Ｘによって保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物を、酵素切断可能基を除去するために加水分解酵素と反応させることによって、ジヒドロキシ芳香族化合物を産出することを含む、請求項１に記載の方法。
- 加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物との反応が、複素環式エノールホスファート不在下で行われる、請求項２９に記載の方法。
- 加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物との反応が、複素環式エノールホスファート存在下で行われる、請求項２９に記載の方法。
- 加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼから選択され、酵素切断可能基が、ホスファート、β−ガラクトシド、β−グルクロニドおよびβ−グルコシド基から選択される、請求項２９に記載の方法。
- 保護化ジヒドロキシ芳香族化合物が、式
を有する、請求項２９に記載の方法。 - 基Ｒ3がＯＸ基であり、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が各々水素であり、Ｒ1が水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される、請求項３３に記載の方法。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項２９に記載の方法。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、
- ａ）炭素環式芳香環を１から５個含み、環の偶数個の炭素原子で隔てられた二つのヒドロキシ基で置換されていて、一つのヒドロキシ基が酵素切断可能基Ｘによって保護されている、保護化ジヒドロキシ芳香族化合物；およびｂ）式
を有する複素環式エノールホスファート化合物、を含み、加水分解酵素との反応により酸素存在下で化学発光を産出するための組成物。 - 該ジヒドロキシ芳香族化合物が、ベンゼン、ビフェニル、ナフタレン、およびアントラセン環から選択される芳香環式系を含む請求項３７に記載の組成物。
- 該保護化ジヒドロキシ芳香族化合物が、式Ｉ
を有する請求項３７に記載の組成物。 - 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＸ基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から独立して選択される、請求項３９に記載の組成物。
- 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＸ基であり、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が各々水素であり、Ｒ1が水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される、請求項３９に記載の組成物。
- 複素環式エノールホスファート化合物における基Ｒ19が、置換化および無置換化低級アルキル基と置換化および無置換化ベンジル基から選択される、請求項３７に記載の組成物。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項３７に記載の組成物。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項３７に記載の組成物。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 濃度０．００１−２０ｍＭの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と、濃度０．００１−２０ｍＭの複素環式エノールホスファート化合物を含有するｐＨ７−１０．５の範囲の水性緩衝液を含む請求項３７に記載の組成物。
- ｐＨが８−１０の範囲であり、濃度０．０５−５ｍＭの保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と、濃度０．０５−５ｍＭの複素環式エノールホスファート化合物を含有する請求項４６に記載の組成物。
- さらにアニオン性界面活性剤を含む請求項４６に記載の組成物。
- アニオン性界面活性剤がＣ10−Ｃ20アルキルサルファートである請求項４８に記載の組成物。
- アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項４８に記載の組成物。
- ａ）炭素環式芳香環を１から５個含み、環の偶数個の炭素原子で隔てられた二つのヒドロキシ基で置換されており、かつ、ジヒドロキシ芳香族化合物の一つのヒドロキシ基が酵素切断可能基Ｘで保護されている保護化ジヒドロキシ芳香族化合物と加水分解酵素とを反応させて、脱保護されたジヒドロキシ芳香族化合物を産出すること；
ｂ）化学発光を産出するために、ジヒドロキシ芳香族化合物を式
を有する複素環式エノールホスファート化合物と、酸素存在下で反応させること；
ｃ）化学発光を測定すること；および
ｄ）化学発光を、被検体の量と関係づけること、
を含む、加水分解酵素、加水分解酵素阻害剤、又は加水分解酵素標識特異結合対の一員から選択される被検体のアッセイを行う方法。 - 該保護化ジヒドロキシ芳香族化合物が、ベンゼン、ビフェニル、ナフタレン、およびアントラセン環から選択される芳香環式系を含む請求項５１に記載の組成物。
- 該保護化ジヒドロキシ芳香族化合物が、式Ｉ
を有する請求項５１に記載の方法。 - 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が、水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から独立して選択される、請求項５３に記載の方法。
- 式Ｉの化合物における基Ｒ3がＯＨ基であり、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5が水素であり、Ｒ1が水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、アリールおよびアラルキル基から選択される、請求項５３に記載の方法。
- 複素環式エノールホスファート化合物における基Ｒ19が、置換化および無置換化低級アルキル基と置換化および無置換化ベンジル基から選択される、請求項５１に記載の方法。
- 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項５１に記載の方法。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、式
を有する、請求項５３に記載の方法。 - 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 複素環式エノールホスファート化合物が、
- 加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物との反応が、複素環式エノールホスファート不在下で行われる、請求項５１に記載の方法。
- 加水分解酵素と保護化ジヒドロキシ芳香族化合物との反応が、複素環式エノールホスファート存在下で行われる、請求項５１に記載の方法。
- 加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼから選択され、酵素切断可能基が、ホスファート、β−ガラクトシド、β−グルクロニドおよびβ−グルコシド基から選択される、請求項５１に記載の方法。
- 被検体が加水分解酵素である請求項５１に記載の方法。
- 加水分解酵素が、特異結合対の一員の標識として提供される、請求項５１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/021,322 US5840963A (en) | 1997-05-13 | 1998-02-10 | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates |
| US09/021,322 | 1998-02-10 | ||
| PCT/US1998/011489 WO1999040161A1 (en) | 1998-02-10 | 1998-06-12 | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002502596A JP2002502596A (ja) | 2002-01-29 |
| JP4365026B2 true JP4365026B2 (ja) | 2009-11-18 |
Family
ID=21803555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000530578A Expired - Fee Related JP4365026B2 (ja) | 1998-02-10 | 1998-06-12 | ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファートを使用した化学発光反応 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5840963A (ja) |
| EP (1) | EP1054933B1 (ja) |
| JP (1) | JP4365026B2 (ja) |
| AT (1) | ATE338798T1 (ja) |
| CA (1) | CA2320208A1 (ja) |
| DE (1) | DE69835834T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999040161A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6126870A (en) * | 1997-09-12 | 2000-10-03 | Lumigen, Inc. | Chemiluminescent labeling compounds |
| DE102004063133A1 (de) * | 2004-12-22 | 2006-07-13 | Schott Ag | Organisches elektrisches oder elektronisches Bauelement mit erhöhter Lebensdauer |
| DE102004063134B4 (de) * | 2004-12-22 | 2010-05-20 | Schott Ag | Organisches elektrolumineszentes Bauelement mit Löschsubstanz für Singulett-Sauerstoff und Verfahren zu dessen Herstellung |
| WO2006116683A1 (en) * | 2005-04-27 | 2006-11-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nanostructure enhanced luminescence |
| US20090246888A1 (en) * | 2005-04-27 | 2009-10-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nanoassays |
| US7919019B2 (en) * | 2005-04-27 | 2011-04-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nanostructure enhanced luminescent devices |
| CN104418887A (zh) * | 2013-09-06 | 2015-03-18 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种与磷酸酶反应产生化学发光的化合物、组合物和新型制备方法 |
| CN109580958B (zh) * | 2018-12-05 | 2022-02-01 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种心肌肌钙蛋白i的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法 |
| CN109459420B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-06-04 | 华南师范大学 | 一种水体中二/三价铁离子的检测方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451347A (en) * | 1993-06-24 | 1995-09-19 | Lumigen, Inc. | Methods and compositions providing enhanced chemiluminescence from chemiluminescent compounds using dicationic surfactants |
| CA2213317C (en) * | 1996-01-16 | 2001-07-03 | Lumigen, Inc. | Chemiluminescent compositions for reaction with phosphatase enzymes, and methods of use |
| US5772926A (en) * | 1997-05-13 | 1998-06-30 | Lumigen, Inc. | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates |
-
1998
- 1998-02-10 US US09/021,322 patent/US5840963A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 DE DE69835834T patent/DE69835834T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 CA CA002320208A patent/CA2320208A1/en not_active Abandoned
- 1998-06-12 EP EP98928882A patent/EP1054933B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-12 JP JP2000530578A patent/JP4365026B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-12 WO PCT/US1998/011489 patent/WO1999040161A1/en active IP Right Grant
- 1998-06-12 AT AT98928882T patent/ATE338798T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE338798T1 (de) | 2006-09-15 |
| EP1054933A4 (en) | 2003-07-09 |
| CA2320208A1 (en) | 1999-08-12 |
| JP2002502596A (ja) | 2002-01-29 |
| DE69835834D1 (de) | 2006-10-19 |
| DE69835834T2 (de) | 2007-04-12 |
| EP1054933B1 (en) | 2006-09-06 |
| US5840963A (en) | 1998-11-24 |
| WO1999040161A1 (en) | 1999-08-12 |
| EP1054933A1 (en) | 2000-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6218137B1 (en) | Compounds, compositions and methods for generating chemiluminescene with phosphatase enzymes | |
| US5772926A (en) | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates | |
| US8137990B2 (en) | Compositions for chemiluminescent detection of hydrogen peroxide | |
| CA2353872C (en) | Multiple enzyme assays | |
| US7459284B2 (en) | Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes | |
| WO1991008490A1 (en) | Enzyme amplified lanthanid chelate luminescence assay | |
| JP2001516760A (ja) | ペルオキシダーゼにより化学ルミネセンスを発生する新規化合物 | |
| US6162610A (en) | Xanthan-ester and acridan substrates for horseradish peroxidase | |
| JP4365026B2 (ja) | ジヒドロキシ芳香族化合物と複素環式エノールホスファートを使用した化学発光反応 | |
| EP1203091B1 (en) | Chemiluminescent substrates of hydrolytic enzymes such as phosphatases | |
| AU743524B2 (en) | Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates | |
| JPH0730107B2 (ja) | 加水分解酵素活性を有する物質の検出方法及び二環式化合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050602 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080513 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080808 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090303 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090528 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090721 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090820 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120828 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120828 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130828 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |