JPH0730107B2 - 加水分解酵素活性を有する物質の検出方法及び二環式化合物 - Google Patents

加水分解酵素活性を有する物質の検出方法及び二環式化合物

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JPH0730107B2 JP1177286A JP17728689A JPH0730107B2 JP H0730107 B2 JPH0730107 B2 JP H0730107B2 JP 1177286 A JP1177286 A JP 1177286A JP 17728689 A JP17728689 A JP 17728689A JP H0730107 B2 JPH0730107 B2 JP H0730107B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の目的は加水分解酵素活性を有する物質の検出方
法、その実施に好適に薬剤並びに新規加水分解酵素基質
及びその製法である。
〔従来の技術〕
加水分解酵素（Hydrolase）は最近非常に重要となつて
いる酵素である。一方ではこの酵素は植物、動物及び又
ヒトの物質代謝で重要な役割を演ずる。これらの生物系
の一つで加水分解酵素の濃度が通常そこで存在する濃度
と異なる場合に、病気の原因となりうる。従つて病気が
存在する場合に体液中の加水分解酵素の濃度を測定する
ことによつて標準値との場合による相違を確認すること
が臨床診断の一つの課題である。これは有利には指示薬
反応による加水分解酵素の測定を用いて行われる。この
ために試験すべき試料に該当する加水分解酵素の基質を
加える。基質から生成される生成物の量が存在する加水
分解酵素濃度の尺度である。
他方では加水分解酵素は免疫学的に活性の化合物を標識
付けするための酵素としてしばしば使用される。その
際、免疫学的検査で例えば抗体を標識付けするためにβ
‐ガラクトシダーゼが特に広く使用される〔アナールズ
・オブ・クリニカル・バイオケミストリー（Annals of
Clinical Biochemistry）第16巻、221頁（1979年）〕。
この種の検査は試料中の免疫学的活性の分析物の含量を
測定するために役立つ。これらは分析物の濃度を、標識
として共有結合したβ‐ガラクトシダーゼを有する適合
する免疫相手を用いて測定する。検査を実施することに
よつて、免疫相手の濃度は測定すべき分析物の濃度に直
接左右される。標識付けされた免疫相手濃度は同様に指
示薬反応によつて可視性になる。指示薬反応でβ‐グリ
コシダーゼで標識付けされた免疫相手をβ‐グリコシダ
ーゼの基質と反応させる。
生成物の生成量は免疫相手の濃度に比例する。公知の分
析物濃度を有する試料を用いて作成した検量線の値と比
較することによつて、試料中の未知の分析物濃度を測定
することができる。
加水分解酵素は核酸を検出するための方法で核酸を標識
付けするための酵素としても使用される。β‐グリコシ
ダーゼを酵素標識として使用するこの種の方法は、西ド
イツ特許（DE-A）第2915082号明細書に記載されてい
る。この場合でも標識付け量を指示薬反応で測定する。
加水分解酵素は追跡試薬としても使用される。ここでも
酵素の濃度を正確かつ迅速に測定することが重要であ
る。このために一般に臨床診断学で使用されるものと同
様な方法が用いられる。
その際、基質は大抵は試料液中に可溶性の化合物であ
る。加水分解酵素との反応で、その特性の一つ、例えば
特有の光吸収、光放射（螢光）等が基質とは異なり、そ
れによつて検出することができる生成物が生成される。
免疫学的に活性な物質に基つく試験方法は二つの技術的
な態様に分けられる。一つの頻繁に使用される態様では
検出反応は、光度測定検査で一般に使用されるようなキ
ユベツト中で行われる。次いで指示薬反応の評価を好適
な装置で吸収、発光又は放射能を測定することによつて
行う。
もう１つの態様では、反応は試験指示体の一部である一
層又は数層のフリース又はフイルムで行われる。これら
のフリース又はフイルム上に必要な試薬が塗布されてい
る。次いで指示薬反応の間に加水分解酵素基質から加水
分解酵素活性によつて遊離される生成物の量をこの種の
フリース又はフイルムで直接測定することができる。こ
の態様の利点の一つは、大抵は液状試料のただ一つの溶
液だけを用いて操作することができ、これによつて方法
の実施が著しく簡単になることである。特に生成された
生成物量を特定の波長で光の吸収を測定することによつ
て簡単に追跡することができる。
このために好適な基質は、欧州特許（EP-A）第0146866
号明細書に記載されているフエノールスルホンフタレイ
ニル‐β‐D-ガラクトシド及びその誘導体であり、これ
らからβ‐D-ガラクトシダーゼとの反応によつてフエノ
ールスルホンフタレイン誘導体が遊離される。基質は黄
色の着色を有するが、生成物は赤く着色している。指示
薬反応の間に黄色から橙色を経て赤色へ徐々に色変化が
起こる。この色変化は裸眼では極めて不正確にしか評価
することができないので、測定用に好適な光度計を使用
する。
欧州特許（EP-A）第0156347号明細書に記載されている
レゾルフイン‐βD-グリコシドには、グリコシダーゼと
の反応で黄色から赤色への色変化が起こる基質が該当す
る。黄色から赤色への移行範囲で低いβ‐グリコシダー
ゼ活性においては特に視覚による評価が主観的な結果を
導くことが判明したので、ここでも評価するために装置
を用いる。しかし、これらの装置は比較的複雑であり、
従つて高価である。レゾルフイングリコシドは基質とし
てテスト支持体中で使用するためには好適ではない。そ
れはそれらから生成されるレゾルフインがブリードする
（ausbluten）からである。
加水分解酵素基質、例えばメチルウンベリフエロン誘導
体も加水分解で螢光性の変化しか起こらず、視覚により
評価するために同様に好適ではない。これらは又、試験
片上でブリードしやすい物質を生じる。例えばメチルウ
ンベリフエロンガラクトシドから生じるメチルウンベリ
フエロンはブリードしやすい。
更に、加水分解酵素との反応で有色生成物に変わる着色
されてない加水分解酵素を使用する加水分解酵素活性を
有する物質の検出方法が提案された。従つてこれらの検
出反応では色変化ではなく、色素の形成を評価する。こ
れは色強度をカラースケール（Farbenskala）の色調と
比較することによつて簡単に行うことができる。この種
の検査は色盲の人でも評価することができる。
この種の基質は5-ブロム‐4-クロル‐3-インドリル‐β
‐ガラクトシドである。この基質は分解及び酸化後に色
素を生ずるが、この色素はテスト支持体上でブリードす
る。しかし、基質自体は水溶性が僅かであり、β‐ガラ
クトシダーゼからごく緩漫に脱離されるにすぎない。従
つて生じる着色の強度は極めて僅かであるに過ぎない。
従つてこれに基つく試験も視覚による迅速な評価には適
さない。
バイオヒエミツシエ・ツアイトシユリフト（Biochemisc
he Zeitschrift）第333巻209頁（1960年）に基質として
加水分解でフエノールが遊離する化合物が提案された。
しかしこれはテスト支持体上でブリードしやすい。ニト
ロフエノールの場合には指示薬反応の間に多かれ少なか
れ強い黄色着色が起こる。この波長で僅かな濃度範囲で
は視覚による評価が非常に不利である。
より良好な可視性にするために、付加的な反応で遊離し
たフエノールを酸化的にアミノアンチピリン又はメチル
ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと結合させるか〔アナラ
イテイカル バイオケミストリー（Analytical Biochem
istry）第40巻、281頁（1971年）〕又はジアゾニウム塩
と反応させてアゾ染料に変える〔例えばヒストヒエミー
（Histochemie）第37巻、89頁（1973年）〕。これらの
色料の多くはあまりブリードし易くないので確かにテス
ト支持体に使用するために好適であるが；しかしこれら
のカツプリング反応の使用は他の理由から不利である。
フリース又はフイルム上で試験を実施するためには、こ
の付加的な反応に所望される試薬も全てフリース塗布す
るか又はフイルム中に入れなければならない。これらの
多数の試薬、例えばカツプリング成分は試験実施を複雑
にし、必然的に多くの欠点や難点を伴う；従つて個々の
場合に試薬が早期に相互に反応しないように又は試料溶
液のその他の成分と非特異的に反応しないように配慮し
なくてはならない。即ちアミノアンチピリン又はメチル
ベンゾチアゾリノンヒドラゾンは、例えば被検尿中の成
分とも反応し、従つて測定が誤らまつたものとなる恐れ
がある。その他のカツプリング成分、例えばジアゾニウ
ム塩は貯蔵安定性を損なう。試薬を選択する場合にも、
試薬自体が既に固有の色を有していないこと等に配慮せ
ねばならない。
形成される色素の若干のものでテスト支持体上で起こる
ブリード現象により例えば、色強度がフリース又はフイ
ルムの全ての場所で均一ではなくなり、これは評価する
際に欠点となるうる。即ち例えば測定値が間違つたもの
となる。
〔発明が解決しようとうる課題〕
従つて、前記の欠点を取り除き、加水分解酵素活性を有
する物質をテスト支持体上でも簡単に迅速かつ確実に検
出することができる方法が必要であつた。
本発明の課題はこの要求を満たすことであつた。
〔課題を解決するための手段〕
この課題は試料を加水分解酵素基質及び酸化剤と混合
し、生じる色強度を評価することによつて、試料中の加
水分解酵素活性を有する物質を検出する方法によつて解
決されるが、この方法は加水分解酵素基質として、式I: 〔式中、R1は水素及びアルコキシ基を表し、R2は水素、
ハロゲン、アルコキシ‐、アラルコキシ‐又はアミノ−
基を表し、R3、R4、R5及びR6は同一又は異なるものであ
つてよく、水素、ハロゲン、アルキル‐、アルコキシ
‐、アラルコキシ‐、カルボキシル‐、アルキルカルボ
ニル‐、アルコキシカルボニル‐、カルバモイル‐、ス
ルホ‐又はアミノ‐基を表し、Ｘはグリコシル‐、ホス
フエート‐又はアシル基を表すが、その際基R2とR3、R3
とR4及びR4とR5並びにR5とR6は閉環して各々一つの環系
になつていてよく、基R1及びR2の少なくとも一つは水素
を表し、基R1、R2及びR3の少なくとも一つは水素ではな
い〕の化合物少なくとも１種を使用することを特徴とす
る。
基R1、R2、R3、R4、R5及びR6のアルコキシ基は、有利に
は一つの鎖を形成してもよいし又は分岐鎖状であつても
よい炭素原子１〜４個から成る。特に有利にはメトキシ
‐、イソプロポキシ‐、ｎ−プロポキシ‐及びｎ−ブト
キシ基である。
基R1、R2、R3、R4、R5及びR6のアルコキシ基は１個又は
数個置換されていてもよいし、置換されていなくともよ
い。置換分としてはハロゲン及びアミノ基が有利であ
る。有利な置換されて基は1,1,1-トリフルオル‐エト‐
2-オキシ‐及び1-ブロム‐エト‐2-オキシ基である。ア
ルコキシ基は基O-（CH2‐CH2‐Ｏ）n-R7を表してもよい
が、その際ｎは１〜３まで整数であり、R7は水素、C-原
子数１〜４個を有するアルキル基、有利にはメチル基又
は式Ｉの化合物を表す。基R3、R4、R5及びR6のアルキル
基は有利には炭素原子１〜４個を有する炭化水素基であ
り、メチル基が特に有利である。
基R2、R3、R4、R5及びR6のアラルコキシ基は、有利には
アルキル部に炭素原子１〜４個及びアリール部に炭素原
子６〜10個を有する。ベンジルオキシ基が特に有利であ
る。
基R2、R3、R4、R5及びR6におけるハロゲンとは弗素、塩
素、臭素及び沃素であり、塩素が有利である。
アルキルカルボニル基のアルキル基は、有利には炭素原
子１〜４個を有する。アルコキシカルボニル基のアルコ
キシ基は、有利には炭素原子１〜４個を有する。
基R2、R3、R4、R5及びR6並びにカルバモイル基のアミノ
基は１個又は２個置換されていてもよいか又は置換され
ていなくともよい。置換分としては、有利にはアシル基
及び置換されているか又は非置換のアルキル基である。
アシル基としては特にアセチル基が有利である。
基Ｘのグリコシル基はヘキソースピラノシド系のモノ
‐、オリゴ‐及びポリサツカライド基である。モノサツ
カライド基が有利である。ヘキソースピラノシドとして
はグルコシド‐及びガラキトシド基が有利である。これ
らの中でここでもβ‐グリコシドが特に好適であると判
明した。
基Ｘのアシル基は、有利には炭素原子１〜20個を有し、
飽和又は不飽和、直鎖又は分岐鎖状であつてもよい。ア
セチル基が特に有利である。アシル基にはアミノアシル
基も属す。アミノアシル基として天然起源のα‐L-アミ
ノ酸のカルボキシル基を介して結合している基が有利で
ある。その際、アミノ酸の遊離極性基、例えばアミノ基
は好適な保護基によつて保護されていてよい。特に好適
なアミノ酸基はアミノ基にトシル基を有するアラニル基
である。
ホスフエート基は基‐PO3H2及びその塩である。これら
の塩中の陽イオンとしては全ての陽性に帯電したイオン
が挙げられる。アルカリ金属‐、アルカリ土類金属‐及
びアンモニウムイオンが有利である；特に有利にはナト
リウム‐、カリウム‐、マグネシウム‐及びカルシウム
イオンである。
R2及びR3が一つの環系に閉環している場合には、基R2及
びR3の酸素原子又はアミノ基が６員環を形成するように
結合している化合物が有利である。このようにして形成
された有利な環は、特に2,2-ジメチル‐1,3-ジオキシ環
及び2,2-ジメチル‐3-オキサジン環である。
基R3及びR4又はR5及びR6が一つの環系に閉環している場
合には、環系として芳香族系が有利である。特にベンズ
融合された（benzanellerte）化合物が有利である。
基R4及びR5が一つの環系に閉環している場合には炭素原
子５〜６個を有する環系が有利である。
式Ｉの化合物は、式II: 〔式中、R1からR6は前記のものを表す〕の化合物を式II
I: Ｘ−Ｙ 〔式中、Ｘは前記のものを表し、Ｙは反応性基を表す〕
の化合物と反応させることによつて製造することができ
る。
Ｘがグリコシル基である場合には、反応の間に強力な酸
化感応性のアグリコン成分IIの酸化を防ぐ方法を使用す
べきである。古典的な方法、例えば反応成分として銀塩
又は酸化作用をする重金属塩を使用するケーニツヒ‐ク
ノール‐反応（Ｋnigs-Knorr-Reaktion）又はそれか
ら導出される類似の方法は、この場合には使用すること
ができない。それは使用されるナフトール誘導体が直ち
に酸化されて色素になりうるからである。
式IIのナフトールを水酸化アルカリ水溶液中で式IIIの
活性化された糖と反応させる。その際Ｙが離脱しやすい
親核性基、（gut austreten-de nucleophile grupp
e）、例えばハロゲン、特に弗素、塩素又は臭素、又は
スルホニルオキシ基、特にトルエンスルホニルオキシ‐
又はメタンスルホニルオキシ基を表す化合物が特に有利
であると判明した。その際、糖のヒドロキシ基又はナフ
トール基のアミノ基を反応の間、適当な保護基によつて
保護しておくことが有利であると実証された。
Ｘがアシル基である場合には、有機カルボン酸との反応
によつてアルコール並びに特別なフエノールからエステ
ルを製造するために一般に公知である方法を使用するこ
とができる。アミノ酸の官能性基をエステル化する前
に、有利には好適な保護基によつて遮蔽する。反応後に
保護基を再び脱離させることができる。反応性基Ｙは有
利には離脱しやすい親核性基である。その際ハロゲン、
アルコラート及びカルボキシレートが特に有利である。
例えばこの種の製造はLiebigs Ann.Chem.319〜339頁及
び欧州特許（EP-B）第0039880号明細書に記載されてい
る。
Ｘがホスフエート基である式Ｉの化合物を製造するため
に、Ｘが基‐POZ2又は‐PZ4（式中Ｚが良好な出発基、
特にＣ原子１〜４個を有するアルコラート又は塩素、臭
素又は沃素を表す）を表し、Ｙは基ハロゲニド、有利に
は塩素、臭素又は沃素又はアルコラートを表す式IIIの
化合物が特に好適である。式X-Yの化合物としてオキシ
三塩化燐が特に有利である。式IIの化合物の遊離アミノ
基を反応後脱離可能な保護基によつて遮蔽することが有
利である。
式中、Ｘが‐POZ2又は‐PZ4を表す化合物を公知方法で
加水分解することによつて燐酸塩に変えることができ
る。
この燐酸の塩は、公知方法で例えばイオン交換により酸
から製造することができる。
式II及びIIIの化合物は公知化合物であるか又は有機合
成の公知方法と同様にして製造することができる〔Lieb
igs Ann.Chem.第319巻（1984）、2420（1985）、1847
（1985）、251（1985）、251（1985）、140（1980）、2
97（1987）、1321（1980）、ツアイトシユリフト フユ
ア ナトウーアフオルシユング（Zeitschrift fr Nat
urforschung）第40b巻、534頁（1985年）、第41b巻、37
7頁（1986年）参照〕。特にジヤーナル・フユア・プラ
クテイシユ・ヒエミー（Journal fr Praktische Chem
ie）第62巻、30頁（1900年）から4-メトキシ‐1-ナフト
ールが公知であり、これは酸化により反応させて青色色
料（いわゆるルーシツヒス・インジゴ）に変えることが
できる。この酸化は、アナリテイカル・ケミストリー
（Analytical Chemistry）第36巻、2494頁（1964年）で
過酸化酵素（Peroxidase）を検出するために使用され
た。
若干の4-メトキシ‐1-ナフトール誘導体並びに4-メトキ
シ‐1-ナフトールを酸化により色料に変える方法が数年
も前から公知であつたが、メトキシ‐ナフトール誘導
体、加水分解酵素活性を有する化合物の（その他のカツ
プリング成分の添加なしに色料を生成する）検出方法に
加水分解酵素基質としてこれまで使用されていなかつ
た。
意外にも本発明による式Ｉの新規化合物は、加水分解酵
素基質として非常に好適である。これらの化合物は加水
分解酵素と接触しない限りは水溶性で無色で安定であ
る。極めて良好な水溶性が所望される場合には、有利に
は、式中基R3、R4、R5及びR6の一つ又は数個が極性基、
例えばカルボキシル‐又はスルホ基又は基O-（CH2‐CH2
‐Ｏ）n-R7を表す式Ｉの化合物を使用する。
反応が行われる溶剤の極性を下げるために溶解性を再び
高める好適な有機溶剤又は清浄剤を添加するという欠点
を我慢するなら、親油性基の頻度によつて基質の水溶性
が著しく高められた化合物も加水分解酵素基質として使
用することができる。
加水分解酵素基質とは、加水分解酵素活性を有する該当
する物質によつて変えられる化合物である。基質から水
の吸収下に２種類の生成物が生成される。その際、反応
は酵素動力学で公知の方法に従う。基質の少なくとも大
部分が加水分解酵素活性を有する物質を含有する溶液に
可溶性であるということが、前提条件である。
本発明による方法における加水分解酵素基質としては、
分子部分Ｘが相応する加水分解酵素の天然の基質の分子
部分と同じであるような式Ｉの化合物が特に好適であ
る。即ち例えばβ‐ガラクトシダーゼ基質としては式中
Ｘがβ‐ガラクトシド基を表す式Ｉの化合物が好適であ
り、エステラーゼ基質としてはＸがアシル基を表す式Ｉ
の化合物が好適であり、フオスフアターゼ基質としては
Ｘがフオスフエート基である式Ｉの化合物が特に好適で
ある。
加水分解酵素活性を有する物質は、水の使用下に化合物
を２種類の生成物に分解することができる物質である。
これには酵素主群３の天然及び人工的に製造される加水
分解酵素が属する。特に本発明による方法は、グリコシ
ダーゼ、有利にはガラクトシダーゼ及びエステラーゼ、
有利にはリパーゼ及びフオスフアターゼを検出する方法
といて好適であると実証される。
加水分解酵素活性を有する物質とは、この加水分解酵素
とその他の化合物、例えば免疫学的に活性の化合物又は
核酸との化合物である。免疫学的に活性の化合物には、
例えばハプテン、抗原、抗体及び免疫複合体が挙げられ
るが、抗体のフラグメント、例えばFab-又はＦ（ad′)2
‐フラグメントも挙げられる。加水分解酵素とこの免疫
学的に活性の化合物との結合物は加水分解酵素‐接合体
と呼ばれる。その際加水分解酵素は免疫学的に活性の化
合物を標識付けするために役立つ。本発明による方法は
特に、標識としてアルカリ又は酸性のフオスフアターゼ
又はβ‐ガラクトシダーゼを用いて免疫学的に活性の化
合物を検出するために好適である。
その際、試料は有利には固体又は液体の試料である。
固体試料の場合には可溶性の試料と殆ど不溶性の試料に
分けることができる。
可溶性の試料は、有利には検出用に液状試料に変えられ
る。
殆ど不溶性の試料は有利には、その外部又は内部表面に
加水分解酵素活性を有する物質が結合している固体であ
る。結合方法は本発明による方法では重要ではない。こ
の結合は、例えば共有及びイオン又は吸着性又は生物特
異性のものであつてよい。生物特異性結合は、生物学的
結合相手、例えば抗原又はハプテンとして作用する物質
と抗体、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジン
等の間の結合である。
その中の加水分解酵素活性を有する物質を検出すべきで
ある液状試料は、主として水溶液である。これらの溶液
は例えば水中の加水分解酵素又は加水分解酵素接合体の
溶液であつてもよい。しばしばこれらの溶液に例えば貯
蔵安定性を高めるために混合物、例えば塩、清浄剤等を
添加する。この種の溶液中でも本発明による方法を使用
することができる。液状試料は体液又はそれから添加又
は成分の分離によつて得られる液体であつてよい。これ
には例えば血液、血液血漿、血清又は尿が属す。
液状試料は有利には例えば免疫学的試験法の経過中に生
ずるような液体であつてもよい。これは例えばアナール
ズ・オブ・クリニカル・バイオケミストリー第16巻、22
1頁（1979年）に記載されているようなもの及びその有
利な改良物であり、これらは免疫分析の分野の専門家に
公知である。この種の液体においても加水分解酵素活性
を有する物質を本発明による方法を用いて検出すること
ができる。これらの溶液は大抵、検出を著しく妨げない
緩衝物質、安定化剤、湿潤剤等を含有する。
加水分解酵素活性を有する物質の濃度は有利には10-6〜
10-15モル/l、有利には10-6〜10-12モル/lの範囲で測定
することができる。
この方法はpH値が５〜11、有利には６〜10の間である試
料溶液に好適である。方法を実施する最適pH値は使用さ
れる加水分解酵素による。方法を迅速に実施するために
は、加水分解酵素が最高の活性を有するpH値においてか
又はその近くのpH値で操作するのが有利である。この範
囲の外では著しい酵素による加水分解は起こらないか又
は加水分解酵素の不活性化が起こる恐れがある。
検出反応は有利には吸収性又は膨張性支持体中で行われ
る。
この種の支持体は例えばフリース又はフイルムである。
有利にはフリースである。フリースとは繊維から成る紙
状構造の材料である。繊維材料としては有利にはセルロ
ース、プラスチック又はその混合物が使用される。海綿
状及び／又は多孔性の支持体も好適である。
しかし検出反応は任意の形の容器、例えばキユベツト中
で行うこともできる。反応経過を吸着光度計を用いて追
跡すべきである場合には反応媒体に可溶性である生成物
を生ずるような式Ｉの化合物が好適である。一つの方法
は反応媒体の極性に応じて基R3、R4、R5及びR6の一個又
は数個が極性基、例えばカルボキシル‐又はスルホ基又
は式‐Ｏ（‐CH2‐CH2‐Ｏ）n-R7の基を表す式Ｉの化合
物を使用することである。溶液中の加水分解酵素活性を
有する物質を検出するためのその他の方法は、反応媒体
の極性を低下させる溶剤、例えば有機溶剤又は清浄剤を
添加することである。これらの付加的な成分の欠点を感
受することによつて、加水分解酵素生成物の溶解性が高
められる。
指示薬反応の間に色を発現させるために酸化剤の存在が
必要である。酸化剤としては、その酸化力が遊離ナフト
ールの値より上であるような物質又は物質混合物を使用
することができる。例えばカリウムヘキサシアノフエラ
ート‐III、過硼酸塩／ペルオキシダーゼ、過酸化物／
ペルオキシダーゼ、テトラゾリウム塩又は酸素／ビリル
ビンオキシダーゼが特に有利であると判明した。
本発明の方法を実施するために試料を相応する加水分解
酵素基質及び酸化剤と混合する。
試料と加水分解酵素基質との混合は種々の方法で実施す
ることができる。
試料と加水分解酵素基質及び酸化剤との混合は同時にか
又は前後して行つてもよい。
液状試料の場合には、例えば加水分解酵素活性を有する
物質の溶液に加水分解酵素基質又は酸化剤を固体、例え
ば粉体、錠剤、凍結乾燥物等の形で又は試料の溶液の形
で添加することができる。
検出反応が吸収性又は膨脹性支持体中で行われる場合に
は、試料を加水分解酵素基質並びに場合によつて酸化剤
及び添加剤を含浸した支持体上に載せることが特に有利
であると判明した。含浸させるために前記の物質の溶液
を製造し、この溶液で支持体材料を含浸する。引き続
き、含浸した支持体材料を乾燥させる。
支持体がフイルムである場合には、有利には加水分解酵
素基質並びに酸化剤及び添加剤を製造時に既にフイルム
中に混入する。
酸化剤が加水分解酵素基質と一緒には存在しない場合に
は、酸化剤を、試料を加水分解酵素基質と混合する前か
又はその後に、試料と混合する。
検出反応を容器中で行う場合には、加水分解酵素基質を
固体の形又は溶液として場合によつて酸化剤及び添加剤
と混合して使用することが特に有利であると判明した。
この場合にも酸化剤又は添加物を別々に添加することが
できる。
固体試料の場合には、例えば加水分解酵素活性を有する
物質が支持体材料と結合している場合には加水分解酵素
基質及び／又は酸化剤を試料に溶液の形で添加すること
が有利である；しかし、例えば成分を先ず混合し、次い
で溶液を製造するために液体を添加することもできる。
検出方法の結果にとつて、加水分解酵素基質が試料中に
存在する加水分解酵素活性を有する物質と酵素反応が起
こるように接触しうることが大切である。
指示薬反応の間に強力な色が発現するが、これは置換の
型により赤から青を経てトルコ石色までである。色強度
を公知方法により光度測定器、特に反射光度計を用いて
測定することができる。このために指示薬反応の生成物
が吸収することのできる波長の光を照射する。550〜750
nm、特に600〜700nmの波長が有利である。
色強度を、公知濃度の加水分解酵素活性を有する物質の
値を測定することによつて得られた、各強度を特定の濃
度に関係付けた検量線の値と比較する。この比較は有利
には計算機を用いて行う。
色変化ではなく色発現を観察すべきであるので、評価を
人の肉眼によつて行うことも可能である。これは装置を
使用しなくてよいという利点を有する。又装置の間違つ
た操作等のような誤の原因も絶たれる。
本発明による方法は加水分解酵素活性を有する物質の定
性及び定量検出用に使用することができる。定性評価の
ためには着色が起こるか否かを観察する。定量測定のた
めには一定の時点に各色が特定の濃度順になつている色
段階を用いて色を視覚により比較する。
本発明による方法は、特に試験支持体に特に有利に使用
することができる。利点は、例えば方法が簡単で安価で
あり、確実な結果が得られることである。方法は例えば
視覚によつて評価することができることによつて簡単で
ある；それによつて高価な装置が不必要になる。試験支
持体上でブリード現象が生じないのでとくに確実であ
る。これは非常に有利である。
テスト支持体とは試験を実施することによつて物質を検
出するための用具である。これらは一般に主として基板
又はシートから成り、この上に試験に必要な試薬が多く
の場合にフリース又はフイルムによつて設けられてい
る。
本発明による方法ではその他のカツプリング成分、例え
ばジアゾニウム塩は、副反応を惹起し又は安全性を損な
うので、使用されない。
免疫学的試験方法では加水分解酵素活性を有する物質、
特に加水分解酵素複合体の含量を更に調べるべきである
試料も該当する。
従つて本発明による方法は、加水分解酵素活性を有する
物質を検出するために例えば分析物を検出するための免
疫学的方法に特に使用することができる。この種の方法
は、免疫分析の分野の専門家に公知である〔例えばアナ
ールズ・オブ・クリニカル・ケミストリー第16巻、221
頁（1979年）〕。この方法は、加水分解酵素で標識付け
した免疫学的活性の化合物の所望される検出を本発明に
よる方法を用いて実施するというふうに変えられる。例
えば下記が挙げられる： 分析物が抗原又はハプテンである場合には次の方法が有
利である： ‐分析物を含有する試料溶液に過剰の分析物に対する抗
体及び加水分解酵素から成る接合体を加える。分析物及
び接合体から成る免疫複合体が生成される。過剰の接合
体は免疫反応によつて過剰の分析物又は分析物類似化合
物が結合している支持体に結合される。加水分解酵素及
び免疫複合体から成る接合体を含有する溶液を支持体か
ら分離し、本発明による方法に従つて処理する。加水分
解酵素接合体の実験結果が得られるが、これから分析物
の存在又は量を推論することができる。その他の方法は
支持体と結合した加水分解酵素及び抗体から成る接合体
の検出である。これも本発明による方法に従つて可能で
ある。
‐分析物を含有する試料溶液に過剰の分析物に対する抗
体及び加水分解酵素から成る接合体を加える。分析物及
び接合体から成る免疫複合体が生成される。過剰の接合
体は免疫反応によつて、分析物に対するその他の過剰の
抗体が結合している支持体に結合されている。加水分解
酵素及び抗体からの過剰の接合体を含有する溶液を支持
体から分離し、本発明による方法に従つて支持体から分
離し、本発明による方法に従つて支持体と結合している
免疫複合体と加水分解酵素との接合体又は溶液中に含有
される抗体と加水分解酵素との接合体を検出する。
‐分析物を含有する試料溶液に分析物又は分析物類似物
及び加水分解酵素から成る公知量の接合体を加える。こ
の混合物を分析物及び接合体の合計に対して公知の不足
の分析物及び分析物類似物に対する抗体が結合している
支持体上に載せる。
分析物及び接合体の一部が支持体に結合する。本発明に
よる方法によつて、溶液の分離後に支持体と結合してい
るか又は溶液中に存在する接合体を検出することででき
る。
分析物が抗体である場合には同じ原理を用いることがで
きるが、その場合には前記方法の抗体の代わりに抗原又
はその抗体に対応する抗体を使用すべきである。
分析物を検出するための免疫学的方法で加水分解酵素接
合体の検出に引き続いて、本発明による方法により評価
を行う。即ち、加水分解酵素接合体の存在から又は検出
された加水分解酵素接合体の量の定量的評価に際して、
初めに使用した試料中の分析物の存在又は量を推定する
ことができる。これは例えば検量線を用いて行うことが
できる。
更に加水分解酵素活性を有する物質を検出するための本
発明による方法は核酸を検出するための方法に使用する
ことができる。この種の方法は、核酸のハイブリツド化
検査の分野で専門家に公知である。この検査でその量が
検出すべき核酸の濃度の尺度である酵素標識としての加
水分解酵素を結合している一重又は二重鎖状核酸、特に
DNA又はRNA又はそのフラグメントが検出される。この加
水分解酵素で標識付けされた核酸の検出は、加水分解酵
素活性を有する物質を検出するための本発明による方法
によつて有利に行われる。この新規免疫学的方法及び核
酸の検出法の利点は、加水分解酵素活性を有する物質を
検出するための本発明による方法の利点から生じる。
本発明のもう１つの目的は加水分解酵素活性を有する物
質を検出するための薬剤であるが、これは少なくとも１
種の式Ｉの化合物を含有する。この種の薬剤は試料中の
加水分解酵素活性を有する物質を検出するために好適で
あり、これの前、同時又は引き続く工程で酸化剤を添加
する。
式Ｉの化合物少なくとも１種類及び酸化剤を含有する加
水分解酵素活性を有する物質の検出剤が有利である。
更に、この薬剤は、本来の検出反応には必要ではない
が、有利な作用を生じる添加物を含有する。これには、
検出反応を一定のpH値で行うことを可能にする特別なpH
緩衝剤が属す。これには又、支持体材料を均一に湿潤さ
せる湿潤剤及び清浄剤が包含される。
本発明による薬剤は、有利には１個又は数個の吸収性又
は膨脹性支持体を有する。この種の支持体は例えばフリ
ース又はフイルムであり、有利にはフリースである。海
綿状又は多孔性支持体も好適である。
この薬剤は、有利には１個又は数個の吸収性又は膨脹性
の支持体を含有し、この上に加水分解酵素基質及び酸化
剤が一緒にか又は別々に含浸されているか、又はフイル
ムの場合には導入されている。この種の薬剤の製造は公
知方法により行うことができる。
本発明による薬剤は例えば加水分解酵素基質及び酸化剤
並びに場合によつて存在する添加剤の他に溶剤を含有す
ることができる。有利な溶剤は水である。この場合でも
加水分解酵素基質及び酸化剤は一緒にか又は別々に溶液
として存在してよい。
本発明による薬剤は１種類又は数種類の粉末又は粉末混
合物の形であつてもよい。加水分解酵素基質及び酸化剤
の他にこの種の薬剤は常用の不活性の可溶性のガレヌス
充填剤、例えばポリビニルピロリドン、ポリエチレング
リコール等を含有することができる。粉末又は粉末混合
物を圧縮して錠剤にすることもできる。
この種の薬剤は加水分解酵素活性を有する物質の検出方
法に使用するために好適である。
β‐ガラクトシダーゼ活性を有する物質を検出するため
には、式中Ｘ′がβ‐ガラクトシド基である式IVの化合
物が特に好適である。これらの化合物は新規である。
従つて式IV: 〔式中、R1、R2、R3、R4、R5及びR6は前記のものを表
し、Ｘ′がβ‐ガラクトシド基を表す〕の化合物も本発
明の目的物である。
この化合物は、β‐ガラクトシダーゼ基質が該当するの
で、β‐ガラクトシダーゼ活性を有する物質を検出する
ために本発明による方法で有利に使用することができる
ということによつて卓越している。
もう１つの本発明の目的は、式IVの化合物の製法である
が、これは式II: 〔式中、R1からR6は前記のものを表す〕の化合物を式V: Ｘ′‐Ｙ （Ｖ） 〔式中、Ｘ′はβ‐ガラクトシル基を表し、Ｙは反応性
基を表す〕の化合物と場合によつて保護基の使用下に反
応させることを特徴とする。
本発明のもう１つの目的は、式I: 〔式中、R1は水素又はアルコキシ基を表し、R2は水素、
ハロゲン、アルコキシ‐、アラルコキシ‐又はアミノ‐
基を表し、R3、R4、R5及びR6は同一又は異なるものであ
つてよく、水素、ハロゲン、アルキル‐、アルコキシ
‐、アラルコキシ‐、カルボキシル‐、アルキルカルボ
ニル‐、アルコキシカルボニル‐、カルバモイル‐、ス
ルホ‐又はアミノ‐基、を表し、Ｘはグリコシル‐、ホ
スフエート‐又はアシル基を表すが、その際基R2とR3、
R3とR4及びR4とR5並びにR5とR6は閉環して各々一つの環
系になつていてよく、基R1及びR2の少なくとも一つは水
素を表し、基R1、R2及びR3の少なくとも一つは水素では
ない〕の化合物を加水分解酵素活性を有する物質を検出
するための前記の方法に使用することである。
次に本発明を実施例につき詳説する。
例 １ ａ）4-メトキシ‐1-ナフチル‐2,3,4,6-テトラ‐O-アセ
チル‐β‐D-ガラクトピラノシド アセトブロムガラクトース〔1-ブロム‐2,3,4,6-テトラ
‐O-アセチル‐α‐D-ガラクトピラノーズ、フルカ（Fl
uka）〕96.1g（233.6ミリモル）をアセトン200mlに溶か
し、N2導入により脱酸素する。溶液を持続的に撹拌しな
がら加熱沸騰させ、先ず水13ml中の水酸化カリウム14.3
g（254.9ミリモル）の溶液、次いでアセトン200ml中の4
-メトキシ‐1-ナフトール〔Liebigs Anm.Chem.140（198
0）〕18.5g（106.2ミリモル）の溶液を各々10分以内に
滴加する。反応混合物は滴加する間絶えず還流下に沸騰
させるべきである。引き続き、同じ温度でなお４時間撹
拌し、冷却させ、不溶物を濾別し、濾液を高真空中で蒸
発た濃縮させる。シロツプ状の残渣を３回水各々100ml
で湿浸し、粗生成物として更に精製せずに次の合成段階
に使用する。薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、
溶離剤 クロロホルム／酢酸エチル20:1）RF＝0.40 ｂ）4-メトキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシ
ド 無水メタノール150ml中の例1a）からの化合物の懸濁液
に湿度排除下に１時間以内に無水メタノール中の0.5Mナ
トリウムメタノラート溶液25mlを反応混合物のpH値が薬
13に保たれるように添加する。反応完結後（DC調整）生
成物をシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフイーに
よつて単離する。
収量:10g 薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、溶離剤 クロ
ロホルム／メタノール3:1） RF＝0.401 H−NMR（DMSO-d6）：δ（ppm）＝3.41-3.80（m,6H）;
3.92（s,3H）;4.52-4.89（m,4H）;5.31（d,J＝5Hz,1
H）;6.84（d,J＝8.5Hz,1H）;7.16（d,J＝8.5Hz,1H）;7.
47-7.60（m,2H）;8.08-8.17（m,1H）;8.31-8.41（m,1
H）． MS（pos.FAB）:m/e＝337 例 ２ ｂ）4-クロル‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシド 4-クロル‐1-ナフトール（アルドリツヒ）及びアセトブ
ロムガラクトースから例1a）及び1b）からの方法と同様
にして4-クロル‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシ
ドを製造した。
薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、溶離剤 クロ
ロホルム／メタノール7:3） RF＝0.571 H−NMR（DMSO-d6）：δ（ppm）＝3.30-3.95（m,10H）;
5.05（d,J＝5Hz,1H）,7.24（d,J＝8.5Hz,1H）;7.61-7.8
5（m,3H）;8.13-8.22（m,1H）;8.40-8.53（m,1H） 例 ３ 4-プロポキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシド 4-プロポキシ‐1-ナフトール〔LiebigsAnn.Chem.140（1
980）〕及びアセトブロムガラクトースから例1a）及び1
b）からの方法と同様にして4-プロポキシ‐1-ナフチル
‐β‐D-ガラクトピラノシドを製造した。
薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、溶離剤 クロ
ロホルム／メタノール3:1） RF＝0.4213 C−NMR（CD3OD）：δ（ppm）＝11.09,23.78,62.44,7
0.30,71.02,72.55,75.07,76.94,104.28,105.39,111.52,
122.65,123.27,128.45,126.80,127.61,128.43,148.51,1
51.57 MS-（(TMS)4‐誘導体）:m/s＝652 例 ４ 4-イソプロポキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノ
シド 4-イソプロポキシ‐1-ナフトール及びアセトブロムガラ
クトースから例1a）及び1b）からの方法と同様にして4-
イソプロポキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシ
ドを製造した。
薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、溶離剤 クロ
ロホルム／メタノール3:1） RF＝0.53 MS（neg.FAB）:m/e＝363 例 ５ 4-ベンジルオキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノ
シド 4-ベンジルオキシ‐1-ナフトール〔LiebigsAnn.Chem.14
0（1980）〕及びアセトブロムガラクトースから例1a）
及び1b）からの方法と同様にして、4-ベンジルオキシ‐
1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシドを製造した。
薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、溶離剤 クロ
ロホルム／メタノール3:1） RF＝0.46 MS（(TMS)4‐誘導体）:m/e＝700 例 ６ 4-トリフルオルエトキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクト
ピラノシド 4-トリフルオルエトキシ‐1-ナフトール〔ツアイトシユ
リフト ヒユア ナトウーアフオルジユング40b、534頁
（1985年）〕及びアセトブロムガラクトースから例1a）
及び1b）からの方法と同様にして4-トリフルオルエトキ
シ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシドを製造し
た。
薄層クロマトグラフイー（シリカゲル60、溶離剤 クロ
ロホルム／メタノール3:1） RF＝0.421 H−NMR（CD3OD）：δ（ppm）＝3.46-3.93（m,6H）;4.5
7（q,J＝9Hz,2H）;4.86（d,J＝6Hz,1H）;6.81（d,J＝8H
z,1H）;7.09（d,J＝8Hz,1H）;7.38-7.48（m,2H）;7.99-
8.09（m,1H）;8.25-8.35（m,1H） 例 ７ 2-メトキシ‐1-ナフチル‐ジヒドロゲンフオスフエート 攪拌機、温度計及び滴下漏斗を有する内容500mlの三首
フラスコ中にピリジン150ml中の2-メトキシ‐1-ナフト
ール〔ジヤーナル オブ ザ ケミカル ソサイアテイ
ー（Journal of the Chemical Society）2316（1967
年）〕13.07g（0.075モル）の溶液を前もつて装入し、
冷却下に０〜５℃でオキシ三塩化燐11.5g（6.9ml、0.07
5モル）を撹拌下に徐々に滴加した。２時間後に残渣を
吸引濾過し、濾液を氷200g上に注いだ。５分間撹拌下に
濃水酸化ナトリウム溶液でpH8に調整し、黄色溶液を真
空中で濃縮する。淡色の残渣をアセトンと一緒に撹拌
し、吸引濾過する。粗生成物を熱湯200ml中に溶解さ
せ、不溶性成分を吸引濾過し、母液に燐酸エステルが沈
澱するまで濃塩酸を加え、吸引濾過し、反応生成物を重
量が一定になるまで五酸化二燐上で乾燥させる。無色結
晶の2-メトキシ‐1-ナフチル‐ジヒドロゲンフオスフエ
ート16gが得られる。
融点:171℃、MS:m/e＝254.18 薄層クロマトグラフイー〔シリカゲル60-メルク（Merc
k）、溶離剤：イソプロパノール／酢酸ブチル／H2O（5
0:30:20）〕：RF＝0.381 H‐NMR（D2O,NaOD）： δ（ppm）＝3.98（s,3H）;7.42（ddd,J＝8.2,6.8und1.3
Hz,1H）;7.46（d,J＝8.8Hz,1H）;7.55（ddd,J＝8.2,6.8
und1.3Hz,1H）;7.71（d,J＝9.0Hz,1H）;7.86（d,J＝8.2
Hz,1H）;8.36ppm（d,J＝8.6Hz,1H）． 例 ８ 4-メトキシ‐1-ナフチルホスフエート‐ジナトリウム塩 4-メトキシ‐1-ナフトール14.72g （0.1モル）をピリジン200ml中に溶かし、撹拌及び氷食
塩浴を用いて冷却下に３℃でオキシ三塩化燐15.35g（9.
16ml）を滴加する。２時間撹拌した後に晶状の残渣を吸
引濾過し、橙色に着色した濾液を氷水400ml中に滴加す
る。ガラス電極及びpH測定機を用いて濃水酸化ナトリウ
ム溶液の滴加によつてpH8に調整し、回転蒸発器で50℃
で真空中で蒸発乾固させる。褐色樹脂18gが得られる；
これをイソプロパノール100ml中に熱時溶かし、ジメチ
ルエーテル300mlの添加によつて生成物を沈澱させる。4
-メトキシ‐1-ナフチルホスフエート‐ジナトリウム塩1
6.8gが得られる。1 H‐NMR（D2O,NaOD）： δ（ppm）＝4.02（s,3H）;6.98（d,J＝8.5Hz,1H）;7.38
（dd,J＝8.5und1.5Hz,1H）;7.61,8.19und8.31ppm（ABYZ
-系,2及び各1H） 例 ９ 1-アセトキシ‐4-メトキシナフタリン 4-メトキシ‐1-ナフトール（1.75g、10ミリモル）を無
水酢酸（18ml）中で2.5時間還流下に煮沸させる。その
後、溶液を真空中で濃縮し、油状残渣をカラムクロマト
グラフイー（シリカゲル；トルエン／酢酸エステル:40/
1）により精製する。相応するフラクシヨンを濃縮した
後、粗精製物を石油エーテル（沸点90〜110℃）から再
結晶させる；収量1.27g（58％）；無色結晶、融点51〜5
3℃。
例10 試料中のヒトの絨毛膜ゴナドトロピン（hCG）の検出 Ａ）テスト支持体１（第１図）の製造 ａ）フリース３の製造 一枚の紙｛フイルマ・カルフ（Firma Kalff）社製の型4
210｝を条片（縦2.6cm、横0.6cm）に切断した。DMSO中
の4-メトキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクトピラノシド
40mg/mlの溶液20μｌに水中のポリビニルアルコール24
％溶液20μｌを加えた。この混合物を紙片の中央部に塗
布した。
ｂ）フリース５の製造 一枚の紙〔フイルマ・カルフ（Firma Kalff）社製の型4
210〕を条片（縦2.6cm、横0.6cm）に切断した。一方の
端をPBS-緩衝剤（燐酸塩緩衝食塩水、pH7.0、１％牛血
清アルブミン、0.1％ツイーン 20）100μｌで含浸し
た。条片の中央部に、hCGに対するモノクローナル抗体
のFab-フラグメント及びβ‐ガラクトシダーゼから成る
接合体（ガラクトシダーゼ活性を有する物質）20U/ml、
hCGのβ鎖に対するモノクローナルマウス抗体100μg/ml
及び4-アミノベンジル‐1-チオ‐β‐D-ガラクトピラノ
シド7.5mg/mlを含有する溶液7.5μｌを載せた。緩衝剤
を含浸した端部と反対の端部を水中のポリビニルアルコ
ールの５％溶液10μｌに含浸した。
ｃ）フリース６の製造 一枚の紙〔シユライヒヤー＆シユール（FirmaSchleiche
r＆Schull）社製3512型〕にブロムシアンで活性化した
後、マウス抗体のFc-部に対するヒツジ抗体を固定させ
た。この材料片を切断して条片（縦1.1cm、横0.6cm）に
した。
ｄ）フリース７の製造 一枚の紙〔ワツトマン（Firma Whatmann）社製D-28型〕
を５×0.6cmの大きさに切つた。
ｅ）フリース２と３は、プラスチツクシート４によつて
相互に分けられている。
乾燥させたフリースを幅0.6cmの基板シート２に貼付け
ることによつて第１図に記載の支持体１を製造した。そ
の際フリース５はポリビニルアルコールで含浸された端
部がテスト支持体の端部８の方向であるように貼つけ
る。
Ｂ）試験実施 ａ）試料調製 試料0.5mlを燐酸塩緩衝剤pH7中の過硼酸ナトリウム４ミ
リモル/l及びオランダガラシ‐ペルオキシダーゼ（酸化
剤）10ml/lを含有する溶液0.5mlと混合した。ｂ）試料
のテスト条片への塗布 テスト条片１の端部８を溶液中に入れた。hCGを含有す
る溶液をフリース５及びフリース３中に入れ、そこに存
在する物質を溶かす。hCGとhCGに対するモノクローナル
抗体のβ‐ガラクトシダーゼ標識付けされたFab-フラグ
メント及びhCGのβ‐鎖に対するモノクローナル抗体と
の反応によつてフリース５中の溶液中で３つの成分から
成るβ‐ガラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体が
形成された。この場合には加水分解酵素活性を有する物
質であるこの免疫複合体を本発明による方法を用いてフ
リース６中で検出する。免疫複合体を有する溶液は基質
を有する溶液と全く同じくフリース３からフリース６へ
浸入し、そこでこの基質溶液と混合された。フリース６
中で、形成された免疫複合体並びに過剰のβ‐鎖に対す
るモノクローナル抗体は固定されたヒツジ抗体を介して
フリース６と結合された。場合による過剰のβ‐ガラク
トシダーゼ標識付けされたFab-フラグメントは、更にフ
リース７中に流入した。結合した免疫複合体のβ‐ガラ
クトシダーゼ標識付けにより及び酸化剤を用いて、10分
間以内にフリース６中で青い色が形成された。
試料中にhCGが全く含有されていない場合には、β‐ガ
ラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体も生成できな
かつた。従つて加水分解酵素活性を有する物質はフリー
ス６中で結合されず、従つて色発現は見られない。これ
に対してβ‐ガラクトシダーゼ標識付けされたFab-フラ
グメントは全量まだ溶液中に含有されており、これはフ
リース７中に浸入する。従つて、フリース７でβ‐ガラ
クトシダーゼ標識付けされたFab-フラグメントの反応に
起因する色発現が見られ、これは加水分解酵素活性を有
する物質でもある。即ち、フリース７中でも本発明によ
る方法を実施することによつて試験の対照を行う；これ
は試料中にhCGが全く存在しなかつた場合に特に重要で
ある。
評価は定量的にも行うことができる。それは試料中にhC
Gが、従つてフリース６中に結合されたβ‐ガラクトシ
ダーゼ標識付けされた免疫複合体が多く存在すればそれ
だけ強力に10分後にフリース６中で着色が生じるからで
ある。
例11 チロキシン（T4）の検出 Ａ）テスト条片11（第２図）の製造 ａ）フリース14 フリース14はβ‐ガラクトシダーゼとT4に対する抗体と
の接合体が含浸されている。
ｂ）フリース15 一枚の紙（シユライヒヤー＆シユール3512）をシアン化
臭素で活性化し、それにT4スクシンイミドエステルを結
合させた。
ｃ）フリース16 フリース16は4-メトキシ‐1-ナフチル‐β‐D-ガラクト
ピラノシドで含浸したフリースである。
ｄ）フリース13は試料装入に役立つ。
テスト支持体11を製造するために第２図に示したように
フリースを基板シート12上に固定した。
Ｂ）試験の実施 ａ）試料調製 試料は例10と同様にして調製した。
ｂ）実施 テスト条片11の端部17を溶液中に入れた。T4含有の試料
はフリース13中に浸入した。試料はそこから更にフリー
ス14中に流入し、フリース14によつてβ‐ガラクトシダ
ーゼ複合体を分離した。抗体とT4との免疫反応によつて
β‐ガラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体が生成
された。今やこの免疫複合体の他になお過剰のβ‐ガラ
クトシダーゼ接合体を含有する溶液はフリース15中に浸
入した。そこでこの過剰分は結合されたT4を介して紙と
結合された。
なお免疫複合体を含有する溶液は、フリース16中に浸入
した。そこで加水分解酵素活性を有する物質であるβ‐
ガラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体を検出する
ための本発明による方法が行われる。溶液中にこの複合
体が、従つてT4も多く含まれていればいるほど、10分後
にフリース16がそれだけ強く青色に着色した。T4が存在
しない場合にはフリース16は白いままであつた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の例10によるテスト支持体を示す図で
ある。 第２図は本発明の例11によるテスト支持体を示す図であ
る。 1,11…テスト支持体、２…基板シート、４…プラスチッ
クシート、3,5,6,7,13,14,15,16…フリース、17,18…端
部
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ // Ｃ０７Ｃ 69/017 Ａ 9279−4Ｈ Ｃ０７Ｆ 9/09 Ｋ 9155−4Ｈ (72)発明者 ヴエルナー・ギュートライン ドイツ連邦共和国マンハイム24・イム・ゼ ンタイヒ 31 (72)発明者 マンフレート・クール ドイツ連邦共和国マンハイム31・ヴエルト マンヴエーク23 (72)発明者 ヨハン・ベルガー アメリカ合衆国インデイアナ・インデイア ナポリス・ヘイグ・ロード 9115 (72)発明者 ハーヴエイ・バック アメリカ合衆国インデイアナ・インデイア ナポリス・ヘイグ・ロード 9115 (56)参考文献 特開 平２−131478（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／7643（ＷＯ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．101（1984），Ａｂｓｔｒａ ｃｔ Ｎｏ．126170

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料を加水分解酵素基質及び酸化剤と混合
    し、生じた色強度を評価することによつて試料中の加水
    分解酵素活性を有する物質を検出する方法において、加
    水分解酵素基質として、 式I: 〔式中、R1は水素又はアルコキシ基を表し、R2は水素、
    ハロゲン、アルコキシ‐、アラルコキシ‐又はアミノ‐
    基を表し、R3、R4、R5及びR6は同一又は異なるものであ
    つてよく、水素、ハロゲン、アルキル‐、アルコキシ
    ‐、アラルコキシ‐、カルボキシル‐、アルキルカルボ
    ニル‐、アルコキシカルボニル‐、カルバモイル‐、ス
    ルホ‐又はアミノ‐基を表し、Ｘはグリコシル‐、ホス
    フエート‐又はアシル基を表すが、その際、基R2とR3、
    R3とR4及びR4とR5並びにR5とR6は閉環して各々一つの環
    系になつていてよく、基R1及びR2の少なくとも一つは水
    素を表し、基R1、R2及びR3の少なくとも一つは水素では
    ない〕の化合物少なくとも１種を使用することを特徴と
    する、加水分解酵素活性を有する物質の検出方法。
  2. 【請求項２】式Ｉの化合物少なくとも１種を含有するこ
    とを特徴とする、試料中の加水分解酵素活性を有する物
    質の検出剤。
  3. 【請求項３】式IV: 〔式中、R1は水素又はアルコキシ基を表し、R2は水素、
    ハロゲン、アルコキシ‐、アラルコキシ‐又はアミノ−
    基を表し、R3、R4、R5及びR6は同一又は異なるものであ
    つてよく、水素、ハロゲン、アルキル‐アルコキシ‐、
    アラルコキシ‐、カルボキシル‐、アルキルカルボニル
    ‐、アルコキシカルボニル‐、カルバモイル‐、スルホ
    ‐又はアミノ‐基を表し、Ｘ′はβ‐ガラクトシル基を
    表すが、その際基R2とR3、R3とR4及びR4とR5並びにR5と
    R6は閉環して各々一つの環系になつていてよく、基R1及
    びR2の少なくとも一つは水素を表し、基R1、R2及びR3の
    少なくとも一つは水素ではない〕の化合物。
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KR920000058B1 (ko) 1992-01-06
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ATE130044T1 (de) 1995-11-15
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DD284051A5 (de) 1990-10-31

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