JPH0272899A - 加水分解酵素活性を有する物質の検出方法及び二環式化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の目的は加水分解酵素活性を有する物質の検出方
法、その実権に好適な薬剤並びに新規加水分解ひ素基質
及びその製法である。

〔従来の技術〕

加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　）は最近非常に重
要となっている酵素である。一方ではこの酵素は植物、
動物及び又ヒトの物質代謝で重要な役割を演する。これ
らの生物系の一つで加水分解酵素の濃度が通常そこで存
在する濃度と異なる場合に、病気の原因となりうる。従
って病気が存在する場合に体液中の加水分解酵素のｅｋ
度を測定することによって標準値との場合による相違を
確昭することが臨床診断の一つの課題である。これは有
利には指示薬反応による加水分解酵素の測定を用いて行
われる。このために試験すべき試料に該当する加水分解
酵素の基質を加える。基質から生成される生成物の壕が
存在する加水分解酵素濃度の尺度である。

池方では加水分解酵素は免疫学的に活性の化合物を標識
付けするための酵素としてしばしば使用される。その際
、免疫学的検査で例えば抗体を標識付けするためにβ−
がラクトシル基ゼが特に広く使用される〔アナールズ・
オデ・クリニカル・バイオケミストリー（Ａｎｎａｌｓ
　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）　Ｋ　１６巻、２２１頁（１９７９年）〕。この稿の
検査は試料中の免疫学的活性の分析物の含ｔｔ−測定す
るために役立つ。これらは分析物のａ度を、標識として
共有結合したβ−がラクトシダーぜを有する適合する免
疫相手を用いて測定する。検査を実施することによって
、免疫相手の濃度は測定すべき分析物の濃度にｉｌ！接
左右される。標識付けされた免疫相手ａ度は同様に指示
薬反応によって可視性になる。指示薬反応でβ−グリコ
シダーゼで標識付けされた免疫相手をβ−グリコシダー
ゼの基ノぼと反応させる。

生成物の生成量は免疫相手の濃度に比例する。

公知の分析物製団を有する試料を用いて作成した検ｌｌ
線の値と比較することによって、試料中の未知の分析物
濃度を測定することができる。

加水分解酵素は核酸を検出するための方法で核酸ヲｆｊ
識付けするための酵素としても使用される。β−グリコ
シダーゼを酵素標識として使用するこの種の方法は、西
ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第２９１５０８２号明細書に記
載されている。この場合でも標識付けｉＩヲ指示薬反応
で測定する。

加水分解酵素は追跡試薬としても使用される。

ここでも酵素の濃度を正確かつ迅速に測定することが重
要である。このために一般に臨床診断学で使用されるも
のと同様な方法が用いられる。

その際、基質は大抵は試料液中に可溶性の化合物である
。加水分解酵素との反応で、その特性の一つ、例えば特
有の光吸収、光放射（螢光）等が基質とは異なり、それ
によって検出することができる生成物が生成される。

免疫学的に活性な物質に基つく試験方法は二つの技術的
な態様に分けられる。一つの頻繁に使用される態様では
検出反応は、光度測定検査で一般に使用されるようなキ
ュベツト中で行われる。欠いで指示薬反応の評価を好適
な装置で吸収、発光又は放射能を測定することによって
行う。

もう１つの態様では、反応は試験指示体の−部である一
層又は数層のフリース又はフィルムで行われる。これら
のフリース又はフィルム上に必要な試薬が塗布されてい
る。欠いで指示薬反応の間に加水分解酵素基質から加水
分解酵素活性によって遊離される生成物のｔ’にこの種
のフリース又はフィルムで直接測定することができる。

この態様の利点の一つは、大抵は液状試料の念だ一つの
溶液だけ音用いて操作することができ、これによって方
法の実施が著しく簡単になることである。特に生成され
た生成物置を特定の波長で光の吸収を測定することによ
って簡単に追跡するＯとができる。

このために好適な基質は、欧州特許（ｇｐ−Ａ）第０１
４６８６６号明細書に記載されているフェノールスルホ
ンフタレイニル−β−Ｄ−がラクトシト及びその誘導体
であり、これらからβ−り一がラクトンダーゼとの反応
によってフェノールスルホンフタレイン誘導体が遊離す
れる。基質は黄色の着色を有するが、生成物は赤く着色
している。指示薬反応の間に黄色から橙色を舒て赤色へ
徐々に色変化が起こる。この色変化は裸眼では極めて不
正確にしか評価するＣとができないので、測定用に好適
な光度計を使用する。

欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０１５６３４７号明細書に記載
されているレゾルフィン−β−Ｄ−グリコシドには、グ
リコシダーゼとの反応で黄色から赤色への色変化が起こ
る基質が該当する。

黄色から赤色への移行範囲で低いβ−グリコシダーゼ活
性においては特に視覚による評価が主観的な結果を導く
ことが判明したので、ここでも評価するために装置を用
いる。しかし、これらの装置は比較的複雑であり、従っ
て高価である。し・戸ルフィングリコシドは基質として
テスト支持体中で使用するためには好適ではない。

それはそれらから生成されるし・戸ルフィンがブリード
する（　ａｕｓｂｌｕｔｅｎ　）からである。

加水分解酵素基質、例えばメチルウンベリフェロン誘導
体も加水分解で螢光性の変化しか起こらず、視覚により
評価するために同様に好適ではない。これらは又、試験
片上でデＩＪ　−Ｐ　ｌ。

やすい物質を生じる。例えばメチルウンベリフェロンが
ラクトンｒから生じるメチルウンベリフェロンはデリー
トしやすい。

（に、加水分解酵素との反応で有色生成物に変わる着色
されてない加水分解酵素を使用する加水分解酵素活性を
有する物質の検出方法が提案された。従ってこれらの検
出反応では色変化ではなく、色素の形成全評価する。こ
れは色強度をカラースケールＣＦ’ａｒｂｅｎｓｋａｌ
ａ　）の色調と比較することによって簡単に行うことが
できる。

この種の検査は色盲の人でも評価することができる。

この種の基質は５−ブロム−４−クロル−６−インドリ
ル−β−がラクトンｆである。この基質は分解及び酸化
後に色″Ｘを生ずるが、この色素はテスト支持体上でデ
リートする。しかし、基質自体は水溶性が僅かであり、
β−がラクトンダーゼからごく緩漫に脱離されるにすぎ
ない。

従って生じる着色の強度は極めて僅かであるに過ぎない
。従ってこれに基つく試験も視覚による迅速な評価には
適さない。

バイオヒエミツシエ・ツアイトシュリフト（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｃｈｅ　Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　）第６６５
巻２０９ｉ（１９６０年）に基質として加水分解でフェ
ノールが遊離する化合物が提案された。しかしこれはテ
スト支持体上でデリートしやすい。ニトロフェノールの
場合には指示薬反応の間に多かれ少なかれ強い黄色着色
が起こる。この波長で僅かな濃度範囲では視覚による評
価が非常に不利である。

より良好な可視性にするために、付加的な反応で遊離し
たフェノールを酸化的にアミノアンチピリン又はメチル
ベン−戸チア・戸すノンヒドラ・戸ンと結合させるか〔
アナライティカル　バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第４０巻、２
８１頁（１９７１年）〕又はジアゾニウム塩と反応させ
てア・戸染料に変える〔例えばヒストヒエミー（）（ｉ
ｓｔｏｃｈｅｍｉｅ　）第３７巻、８９頁（１９７り１
年）〕。これらの色料の多くはあまりデリート易くない
ので確かにテスト支持体に使用するために好適であるが
：しかしこれらのカップリング反応の使用は他の理由か
ら不利である。フリース又はフィルム上で試験を実施す
るためには、この付加的な反応に所Δされる試薬も全て
フリース塗布するか又はフィルム中に入れなければなら
ない。これらの多数の試薬、例えばカップリング成分は
試＠実施を複雑にし、必然的に多くの欠点や錐点を伴う
；従って個々の場合に試薬が早期に相互に反らしないよ
うに又は試料溶液のその他の成分と非特兄的に反応しな
いように配慮しなくてはならない。

即ちアミノアンチピリン又はメチルベンゾチア・アリノ
ンヒゾラチンは、例えば被検床内の成分とも反応し、従
って測定が誤らまったものとなる恐れがある。その他の
カップ！）ング成分、例えばシア・戸ニウム塩は貯蔵安
定性を損なう。試薬全選択する場合にも、試薬自体が既
に固有の色全有してい々いこと等に配慮せねばならない
。

形成される色素の若干のものでテスト支持体上で起こる
デリート現象により例えば、色強度がフリース又はフィ
ルムの全ての場所で均一ではなくなり、これは評価する
際に欠点となろうる。即ち例えば測定値が間違ったもの
となる。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、前記の欠点を取り除き、加水分解酵素活性を有
する物質をテスト支持体上でも簡単に迅速かつ確実に検
出することができる方法が必要であった。

本発明の課題はこの要求を満たすことであったＱ 〔課題′ｔ−解決するための手段〕 この課題は試料を加水分解酵素基質及び酸化剤と混合し
、生じる色強度を評価することによって、試料中の加水
分解酵素活性を有する物質を検出する方法によって解決
されるが、この方法は加水分解酵素基質として、式Ｉ： 〔式中　Ｒ１は水雲又はアルコキシ基を表し、Ｒ”ｈ水
Ｒ、ハロゲン、アルコヤシ−アラルコキシ−又はアミノ
−基金表し　Ｒ３Ｈ４、Ｒ５及びＲ６は同−又は異なる
ものであってよく、水素、ハロゲン、アルキル−アルコ
中シーアラルコキシ−カルざΦシルー　アルキルカルビ
ニル−、アルコヤシカルざニル−カルバモイル−、スル
ホ−又はアミノ−基を表し、Ｘはグリコシルー、ホスフ
ェート−又はアシル基を表すが、その除幕Ｒ２とＲ３Ｒ
ｒ５とＲ４及びＲ４とＲ５並びにＲ６とＲ６は閉環して
各々一つの環系になっていてよく、基Ｒ１及びＲ２の少
なくとも一つは水軍ヲ表し、基ＲＩ　　Ｒ２及びＲ３の
少なくとも一つは水雲ではない〕の化合物少なくともＩ
Ｎ！ｆ使用することを特徴とする。

基ＲＩ　　Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５及びＲ６のアルコキシ基は
、有利には一つの４４を形成してもよいし又は分岐鎖状
であってもよい炭素原子１〜４個から成る。特に有利に
はメトキシ−インプロポキシ−ｎ−プロポキシ−及びｎ
−ブトキシ基である。

基ＲＩ　　Ｒ２、Ｒ５、Ｒ４Ｈ５及びＲ６のアルコキシ
基は１個又は数個置換されていてもよいし、置換されて
いなくともよい。置換分としてはハロゲン及びアミノ基
が有利である。有利な置換された基は１，１．１−トリ
フルオル−エト−２−オキシ−及び１−ブロム−エト−
２−オキシ基である。アルコキシ基は基０−（Ｃ）（２
−Ｃ’Ｈ２−０）ｎ−Ｒ７を表してもよいが、その際ｎ
は１〜３まで整数であり、Ｒ７は水素、Ｃ−原子数１〜
４個を有するアルキル基、有利にはメチル基又は丈■の
化合物を表す。基Ｒ’、Ｒ４Ｒ’及びＲ６のアルキル基
は有利には炭素原子１〜４個を有する炭化水素基であり
、メチル基が特に有利である。

基Ｒ２Ｒ３Ｒ４ＲＩＳ及びＲ６のアラルコキシ基は、有
利にはアルキル部に炭素原子１〜４個及びアリール部に
炭鳶原子６〜１０個を有する。ベンジルオキシ基が特に
有利である。

基Ｒ”　　Ｒ３Ｒ４Ｒａ及びＲ６におけるノ１０ア９ン
とは弗素、塩素、臭素及び沃素であり、塩素が有利であ
る。

アルキルカル、＋ｆ：ニル基のアルキル基は、有利には
炭素原子１〜４個を有する。アルコキシカルボニル眉の
アルコヤシ、基は、有利には炭素原子１〜４個を宵する
。

基Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｈ６及びＲ６並びにカルバモイル基のア
ミノ基は１岱又は２個置撲されていて屯よいか又は置換
されていなくともよい。

置換分としては、有利にはアシル基及び置換されている
か又は非置換のアルキル基である。アシル基としては特
にアセチル基が有利である。

基Ｘのグリコジル基はヘキノースビラノンー系の七ノー
　オリイー及びポリサッカライド基である。モノサッカ
ライド基が有利である。ヘキソースピラノシドとしては
グルコシド−及びがラキトシド基が有利である。これら
の中でここでもβ−グリコシドが特に好適であると判明
した。

基Ｘのアシル基は、有利には炭素原子１〜２０個を有し
、飽和又は不飽和、＠領又は分岐鎖状であってよい。ア
セチル基が特に有利である。アシル基にはアミノアシル
基も属す。アミノアシル基として天然起源のα−し一ア
ミノ酸のカルホキクル基を介して結合している基が有利
である。その際、アミノ酸の遊離極性基、例えばアミノ
基は好適な保護基によって保護されていてよい。特に好
適なアミノ酸基はアミノ基にトシル基含有するアラニル
基である。

ホスフェート基は基−Ｐｏ３Ｈ２及びその塩である。こ
れらの塩中の陽イオンとしては全ての陽性に帯電したイ
オンが挙げられる。アルカリ金属−、アルカリ土類金属
−及びアンモニウムイオンが有利である；特に有利には
ナトリウム−カリウム−マグネシウム−及びカルシウム
イオンである。

Ｒ２及びＲ３が一つの環系に閉環している場合には、基
Ｒ２及びＲ３の酸素原子又はアミン基が６員環全形成す
るように結合している化合物が有利である。このように
して形成された有利な環は、特に２．２−ジメチル−１
，３−ジオキシ環及び２，２−ジメチル−５−オキサジ
ン環である。

基Ｒ３及びＲ４又はＲ５及びＲ６が一つの環系に閉環し
ている場合には、環系として芳香族系が有利である。特
にベンズ融合された（　ｂｅ−聞ｅｌｉｅｒ　ｔｏ）化
合物が有利である。

基Ｒ４及びＲ６が一つの環系に閉環している場合には炭
素原子５〜６個を有する環系が有利である。

式Ｉの化合物は、式■： ＲＪ　　　Ｒ４ 〔式中　Ｒ１からＲ６は前記のものを表す〕の化合物金
式■ニ −Ｙ 〔式中、Ｘは前記のものを表し、Ｙは反応性基金表す〕
の化合物と反応させることによって製造することができ
る。

Ｘがグリコジル基である場合には、反応の間に強力な酸
化感応性のアグリコン成分Ｈの酸化を防ぐ方法を使用す
べきである。古典的な方法、例えば反応成分として銀塩
又は酸化作用をする重金属塩を使用するケーニッヒ−ク
ツ−ルー反応（Ｋｉ：ｉｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ−Ｒｅａ
ｋｔｉｏｎ　）又はそれから導出される類似の方法は、
この場合には使用することができない。それは使用され
るナフトール誘導体が直ちに酸化されて色素になりうる
からである。

式「のナフトール全水酸化アルカリ水溶液中で弐■の活
性化された糖と反応させる。その際Ｙが離脱しゃすい親
核性基、（ｇｕｔ　ａｕｓｔｒｅｔｅｎ−ｄｅ　ｎｕｃ
ｌｅｏｐｈｉｌｅｇｒｕｐｐｅ　）　、例えばハＯＪｆ
　７、特に弗素、塩素又は臭素、又はスルホニルオキ７
基、０にトルエンスルホニルオキシ−又ハメタンスルホ
ニルオキシＴ５を表す化合物が特に有利であると判明し
た。その際、糖のヒげロキシ基又はナフトール基のアミ
ノ基金反応の間、適当な保樽基によって保循しておくこ
とが有利であると実証された。

Ｘがアシル基である場合には、有機カルざン酸との反応
によってアルコール並びに特別なフェノールからエステ
ル業製造するために一鰺に公知である方法を使用するこ
とができる。アミノ酸の官能性基をエステル化する前に
、有利には好適な保獲基によって遮蔽する。反応後に保
護基金再び脱離させることができる。反応性基Ｙは有利
には離脱しゃすい親核性基である。そノ際ハロｒン、ア
ルコラード及びカルボキシレートが特に有利である。例
えばこの種の製造はＬｉｅｂｉｇｓ　ＡｎＩＬ　Ｃｈｅ
ｍ、　３１９〜３３９頁及び欧州特許（ｇＰ−Ｂ）第０
０３９８８０号明細書に記載されている。

Ｘがホスフェート基である式Ｉの化合物全製造するため
に、ｘ　カ基−ＰＯＺ２又は−ＰＺ、（式中Ｚが良好な
出発基、特にＣ卓子１〜４偲を有するアルコラード又は
塩素、臭素又は沃素を表す）金表し、Ｙは基ハロｒニド
、有利には塩素、臭素又は沃素又はアルコラードを表す
式■の化合物が特に好適である。弐Ｘ−Ｙの化合物とし
てオキシ三塩化燐が特に有利である。式■の化合物のａ
離アミノ基を反応後脱離５Ｔ能な保ｎ基によって遮蔽す
ることが有利である。

式中、Ｘが−ＰＯＺ２又は−ｐｚ、を表す化合物を公知
方法で加水分解することによって燐酸塩に変えることが
できる。

この燐酸の塩は、公知方法で倒λ−ばイオン交換により
酸から製造することができる。

式■及び■の化合物は公知化合物であるか又は有機合成
の公知方法と同様にして製造することができるＣ　Ｌｉ
ｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ、　Ｃｈｅｍ、第５１９巻（１９８
４）、２４２０（１９８５）、１８４７（１９８５）、
２５１（１９８５）、２５１（１９８５）、　１４０（
１９８０）、　２９７（１９８７）、１３２１　（１９
８０）、ツアイトシュリフト　フェア　ナトウーアフオ
ルシュング（Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｉｉｒ　Ｎａ
ｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　）第４０ｂ巻、５３４頁（
１９８５年）、第４１ｂ巻、３７７ぼ（１９８，１５年
）参照〕。特にジャーナル・フェア・プラクティシュ・
ヒエミー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｉｉｒ　Ｐｒａｋｔｉｓ
ｃｈｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　）第６２巻、３０頁（１９００
弛）から４−メトキシ−１−ナフトールが公知であり、
これは醸化により反応させて青色色料（いわゆるルーシ
ラヒス・インシイ）に変えることができる。この酸化は
、アナリテイカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒＹ　）第！１６巻、２４９４頁（１
９５４年）で過酸化奪素（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　）を
検出する念めに使用された。

若干の４−メト中シー１−ナフトール誘導体並びに４−
メトキシ−１−ナフトールを酸化により色料に変える方
法が数年も前から公知であったが、メトキシ−ナフトー
ル誘導体は、加水分解酵素活性を有する化合物の（その
他のカップリング成分の添加なしに色料金生成する）検
出方法に加水分解酵素基質としてこれまで使用されてい
なかった。

意外にも本発明による式■の新規化合物は、加水分解酵
素基質として非常に好適である。これらの化合物は加水
分解酵素と接触しない限りは水溶性で無色で安定である
。極めて良好な水溶性が所望される。場合には、有利に
は、式中基Ｒ３Ｒ４Ｒ５及びＲ６の一つ又は数個が極性
基、例えばカルボキシル−又はスルホ基又は基０−（Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−０）ｎ−Ｒ’を表す式■の化合物を使用
する。

反応が行われる溶剤の極性を下げるために溶解性を再び
高める好適な有機溶剤又は清浄剤を添加するという欠点
を我慢するなら、親油性基のＭ４１ｆによって基質の水
溶性が著しく高められた化合物も加水分解酵素基質とし
て使用することができる。

加水分解酵素基質とは、加水分解酵素活性を有する該当
する物質によって変えられる化合物でちる。基質から水
の吸収下に２種類の生成物が生成される。その際、反応
は酵素動力学で公知の方法に従う。基質の少なくとも大
部分が加水分解酵素接合体有する物質を含有する浴液に
可溶性であるということが、前提条件である。

本発明による方法における加水分解酵素基質としては、
分子部分Ｘが相応する加水分解酵素の天然の基質の分子
部分と同じであるような式Ｉの化合物が特に好適である
。即ち例えばβ−がラクトクダーゼ基質としては式中Ｘ
がβ−がラクトシト基を表す式■の化合物が好適であり
、エステラーゼ基質としてはＸがアシル基を表す式Ｉの
化合物が好適であり、フオスファターぜ基′えとじては
Ｘがフォスフェート等である弐■の化合物が特に好適で
ある。

加水分解酵素接合体写する物質は、水の使用下に化合物
号２穐頌の生成物に分解することができる物質である。

これには酵素主群３の天然及び人工的に製造される加水
分解酵素が属する。

特に本発明による方法は、グリコシダーゼ、有利にはが
ラクトシダーゼ及びエステラーゼ、有利にはリパーゼ及
びフォスファターゼ全検出する方法として好適であると
実証される。

加水分解酵素活性を有する物質とは、この加水分解＃素
とその他の化合物、例えば免疫学的に活性の化合物又は
核醇との化合物である。免疫学的に活性の化合物には、
例えばハブテン、抗原、抗体及び免疫複合体が挙げられ
るが、抗体の７ラグメント、例えばＦａｂ−又はＦ（ａ
ｂ’）２−フラグメントも挙げられる。加水分解酵素と
この免疫学的に活性の化合物との結合物は加水分解酵素
−接合体と呼ばれる。その際加水分解酵素は免疫学的に
活性の化合物を標識付けするために役立つ。本発明によ
る方法は特に、標識としてアルカリ又は耐性のフォスフ
ァターゼ又はβ−がラクトシダーゼを用いて免疫学的に
活性の化合物を検出するために好適である。

その際、試料は有利には固体又は液体の試料である。

固体試料の場合には可溶性の試料と殆ど不俗性の試料に
分けることができる。

可溶性の試料は、有利には検出用に液状試料に変えられ
る。

殆ど不溶性の試ｒ＋は９利には、その外部又は内部表面
に加水分′４酵素活性を有する物質が結合してｈる固体
である。結合方法は本発明による方法では重要で＜−１
な論。この結合は、例えば共有及びイオン又は吸着注文
は生物：￥ｊ渇性のものであってよい。生物性ツ牲枯合
は、生物学的結合相手、例えば抗原又はハプテンとして
１用する中質とぐ九体、ビオチン及びアビジン又はスト
レプトアビクン等の間の結合である。

その中で加水分解酵素活性全存する物質？検出すべきで
ある液状試料は、主として水溶液である。これらの溶液
は例えば水中の加水分解酵素又は加水分解酵素接合体の
溶液であってよい。

しばしばこれらの溶液に例えば貯蔵安定性を高めるため
に混合物、例えば塩、清浄剤等を添加する。この種の溶
液中でも本発明による方法を使用することができる。液
状試料は体液又はそれから添加又は成分の分離によって
得られる液体であってよい。これには例えば血液、血液
血漿、血清又は尿が属す。

液状試料は有利には例えば免疫学的試験法の経過中に生
ずるような液体であってもよい。これは例えばアナール
ズ・オプ・クリニカル・バイオケミストリー第１６巻、
２２１頁（１９７９年）に記載されているようなもの及
びその有利な改良物であり、これらは免疫分析の分野の
専門家に公知である。この種の液体においても加水分解
酵素活性を有する物質を本発明による方法を用いて検出
することができる。これらの溶液は大抵、検出を著しく
妨げない緩衝物質、安定化剤、湿潤剤等を倉荷する。

加水分解酵素活性を有する物質の濃度は有利ニｌｄ　１
０−’　〜１０−１５モル／　ｌ、　有利にハ１０−’
〜ｊ　Ｑ−１２モル／ｌの範囲で測定することができる
。

この方法は一値が５〜１１、有利には６〜１０の間であ
る試料溶液に好適である。方法を実施する最適−値は使
用される加水分解酵素による。

方法を迅速に実施するためには、加水分解酵素が最高の
活性を有する一１値においてか又はその近くの一値で操
作するのが有利である。この範囲の外では著しい酵素に
よる加水分解は起こら々いか又は加水分解酵素の不活性
化が起こる恐れがある。

検出反応は有利には吸収性又は膨張性支持体中で行われ
る。

この種の支持体は例えばフリース又はフィルムである。

有利にはフリースである。フリースとは＃Ｌ雄から成る
紙状構造の材料である。ＰＲ維材料としては有利にはセ
ルロース、プラスチック又はその混合物が使用される。

海綿状及び／又は多孔性の支持体も好適である。

しかし検出反応は任意の形の容器、例えばキュベツト中
で行うこともできる。反応旺過を吸着光度計を用いて追
跡すべきである場合には反応媒体に可溶性である生成物
を生ずるような式Ｉの化合物が好適である。一つの方法
は反応媒体の極性に応じて基Ｒ３Ｒ４ＲＩ５及びＲ６の
一個又は数個が極性基、例えばカルボキシル−又はスル
ホ基又は式−〇（−〇）Ｉ２−ＣＨ２−０）ｎ−Ｒフの
基を表す弐■の化合物を使用することである。溶液中の
加水分解酵素活性を有する物質を検出するためのその他
の方法は、反応媒体の極性を低下させる溶剤、例えば有
機溶剤又は清浄剤を添加することである。これらの付加
的な成分の欠点を感受することによって、加水分解酵素
生成物の溶解性が高められる。

指示薬反応の間に色を発明させるために酸化剤の存在が
必要である。酸化剤としては、その酸化力が遊離ナフト
ールの値より上であるような物質又は物質混合物を使用
することができる。

例えばカリウムへキサシアノフエラートー■、過硼酸［
／ペルオキシダーゼ、過酸化物／ペルオキシダーゼ、テ
トラゾ、リウム塩又は酸素／ビリルビンオキシダーゼが
特に有利であると判明し念。

本発明の方法を実施するために試料を相応する加水分解
酵素基質及び酸化剤と混合する。

試料と加水分解酵素基質との混合は種々の方法で実施す
ることができる。

試料と加水分解酵素基質及び酸化剤との混合は同時にか
又は前後して行ってもよい。

液状試料の場合には、例えば加水分解酵素活性を有する
物質の溶液に加水分解酵素基質又は酸化剤を固体、例え
ば粉末、錠剤、凍結乾燥物等の形で又は試料の溶液の形
で添加することができる。

検出反応が吸収性又は膨張性支持体中で行われる場合に
は、試料を加水分解酵素基質並びに場合によって酸化剤
及び添加剤を含浸した支持体上に載せることが特に有利
であると判明した。

含浸させる丸めに前記の物質の溶液を製造し、この溶液
で支持体材料を含浸する。引き続き、含浸した支持体材
料を乾燥させる。

支持体がフィルムである場合には、有利には加水分解酵
素基質並びに醸化剤及び添加剤全製造時に跣にフィルム
中て混入する。

酸化剤が加水分解酵素基質と一緒には存在しない場合に
は、酸化剤を、試料を加水分解酵π基質と混合する前か
又はその後に、試料と混合する。

検出反応を容器中で行う場合には、加水分解酵素基質を
固体の形又は溶液として場合によって酸化剤及び添加剤
と混合して使用することが特に有利であると判明した。

この場合にも酸化剤又はぶ加物を別々に添加することが
できる。

固体試料の場合には、例えば加水分解酵素活性を有する
物質が支持体材料と結合している場合には加水分解酵素
基質及び／又は酸化剤を試料に溶液の形で重加すること
が有利である；しかじ、例えば成分を先ず混合し、次い
で溶液を製造するために液体を添加することもできる。

検出方法の結果にとって、加水分解酵素基質が試料中に
存在する加水分解酵素活性を有する物質と酵素反応が起
こるように接触しうることが大切である。

指示薬反応の間に強力な色が発現するが、これはｔｆｔ
換の型により赤から臂を経てトルコ石色までである。色
強度を公知方法により光度測定器、特に反射光度計を用
いて測定することができる。このために指示薬反応の生
成物が吸収することのできる波長の光音照射する。５５
０〜７５０ｎｍ、特に６００〜７００　ｎｍの波長が有
利である。

色強度金、公知濃度の加水分だ酵素活性を有する物質の
＠全剣定することによって得られた、各強度を特定の濃
度に関係付けた検量線の値と比較する。この比較は有利
には計Ｗ、＠を用いて行う。

色変化ではなく色発現を観察すべきであるので、評価を
人の肉眼によって行うことも可能である。これは装置を
使用しなくてよいという利点を■する。又装置の間違っ
た操咋等のような誤の原因も絶たれる。

本発明による方法は加水分解酵素活性を有する物質の定
性及び定量検出用に使用することができる。定性評価の
ためには着色が起こるか否かを観察する。定検測定のた
めには一定の時点に各色が特定のｌ！を間層になってい
る色Ｆ９．ｍ金用い音用を視覚により比較する。

本発明による方法は、特に試験支持体に特に有利に使用
することができる。利点は、例えば方法が簡風で安価で
あり、（ｉ！実な結果が得られることである。方法は例
えば視覚によって評価することができることによって簡
単である；それによって高価な装置が不必要になる。試
験支持体上でデリート現象が生じないのでとくに確実で
ある。これは非常に有利である。

テスト支持体とは試験を実権することによって物質全検
出するための用具である。これらは一般に主として基板
又はシートから成り、この上に試験に必要な試薬が多く
の場合に７リース又はフィルムによって設けられている
。

本発明による方法ではその他のカップリング成分、例え
ばジアゾニウム塩は、副反応を惹起し又は安全性ｔ−損
なうので、使用されない。

免疫学的試験方法では加水分解酵素活性を有する物質、
特に加水分解酵禦複合体の含ｉ１ｒ：更に調べるべきで
ある試料も該当する。

従って本発明による方法は、加水分解酵素活性を有する
物質を検出するために例えば分析物全検出するための免
疫学的方法に特に使用することができる。この種の方法
は、免疫分析の分骨の専門家に公知である〔例えばアナ
ールｆ・オデ・クリニカル・ケミストリー笛１６巻、２
２１頁（１９７９年）〕。この方法は、加水分解酵素で
標識付けした免疫学的活性の化合物の所望される検出を
本発明による方法を用いて実施するというふうに変えら
れる。例えば下記が嗜げられる： 分析物が抗原又はハプテンである場合には次の方法が有
利であるニ ー分析物を含有する試料溶液に過剰の分析物に対する抗
体及び加水分ｊ４酵素から成る接合体を加える。分析物
及び接合体から成る免疫複合体が生成される。過剰の接
合体は免疫反応によって過剰の分析物又は分析物類似化
合物が結合している支持体に結合される。加水分解酵素
及び免疫複合体から成る接合体を含有する溶液全支持体
から分離し、本発明による方法に従って処理する。加水
分解酵素接合体の実験結果が得られるが、これから分析
物の存在又はｔＶ推論することができる。その他の方法
は支持体と結合した加水分解酵素及び抗体から成る接合
体の検出である。これも本発明による方法に従って可能
である。

一分析物を含有する試料溶液に過剰の分析物に対する抗
体及び加水分解酵素から成る接合体を加える。分析物及
び接合体から成る免疫複合体が生成される。過剰の接合
体は免疫反応によって、分析物に対するその他の過剰の
抗体が結合している支持体に結合されてＡる。加水分解
酵素及び抗体からの過剰の接合体を含有する溶液を支持
体から分離し、本発明による方法に従って支持体と結合
している免疫複合体と加水分解酵素との接合体又は溶液
中に含有される抗体と加水分解酵素との接合体を検出す
る。

−分析物を含有する試料溶液に分析物又は分析物類似物
及び加水分解酵素から成る公知情の接合体を加える。こ
の混合物を分析物及び接合体の合計に対して公知の不足
の分析物及び分析物類似物に対する抗体が結合している
支持体上に載せる。

分析物及び接合体の一部が支持体に結合する。

本発明による方法によって、溶液の分子ｉ後に支持体と
結合しているか又は溶液中に存在する接合体を検出する
ことでできる。

分析物が抗体である場合には同じ原理を用いることがで
きるが、その場合には前記方法の抗体の代わりに抗原又
はその抗体に対応する抗体を使用すべきである。

分析物を検出する念めの免疫学的方法で加水分解酵素接
合体の検出に引きｉｚで、本発明による方法により評価
を行う。即ち、加水分解酵素接合体の存在から又は検出
された加水分解酵素接合体の量の定量的評価に際して、
初めに使用した試料中の分析物の存在又は債を推定する
ことができる。これは例えば検量線を用いて行うＯとが
できる。

更に加水分解酵素活性を有する物質を検出するための本
発明による方法は核酸を検出するための方法に使用する
ことができる。この種の方法は、核酸のハイブリッド化
検査の分野で専門家に公知である。この検査でその普が
検出すべき核酸の濃度の尺度である酵素標識としての加
水分解酵素と結合している一重又は二重鎖状核酸、特に
ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそのフラグメントが検出される。

この加水分解酵素で標識付けされた核酸の検出は、加水
分解酵素活性を有する物質を検出するための本発明によ
る方法によって有利に行われる。この新規免疫学的方法
及び核酸の検出法の利点は、加水分解酵素活性を有する
物１１−検出するための本発明による方法の利点から生
じる。

本発明のもう１つの目的は加水分解酵素活性を有する物
質全検出するための薬剤であるが、Ｏれは少なくとも１
種の式■の化合物′！！ｉ−含有する。この種の薬剤は
試料中の加水分解酵素接合体有する物質を検出するため
に好適であり、これの前、同時又は引き続く工程で酸化
剤を重加する。

式Ｉの化合物少なくとも１種類及び酸化剤を含有する加
水分解酵素活性を有する物質の検出剤が有利である。

更に、この薬剤は、本来の検出反応には必要ではないが
、有利な作用を生じる添加物を含有する。これには、検
出反Ｃｋ一定の一重で行うことを可能にする特別な一緩
衝剤が属す。これには又、支持体材料を均一に湿潤させ
る湿潤剤及び清浄剤が包含される。

本発明による薬剤は、有利には１個又は数個の吸収性又
は膨張性支持体を有する。この種の支持体は例えばフリ
ース又はフィルムであり、有利にはフリースである。海
綿状又は多孔性支持体も好適である。

この薬剤は、有利には１個又は数個の吸収性又は膨張性
の支持体全含有し、この上に加水分解酵素基質及び酸化
剤が一緒にか又は別々に含浸されているか、又はフィル
ムの場合には導入されている。この穆の薬剤の製造は公
知方法により行うことができる。

本発明による薬剤は例えば加水分解酵素基質及び酸化剤
並びに場合によって存在する添加剤の他に溶剤を含有す
ることができる。有利な溶剤は水である。この場合でも
加水分解酵素基質及び酸化剤は一緒にか又は別々に溶液
として存在してよい。

本発明による薬剤は１覆類又は数種類の粉末又は粉末混
合物の形であってもよい。加水分解酵素基質及び酸化剤
の他にこの種の薬剤は常用の不活性の可溶性のがレヌス
光填剤、例えばポリビニルピロリーン、ポリエチレンク
リコール等全含有することができる。粉末又は粉末混合
物を圧縮して錠剤にすることもできる。

この種の薬剤は加水分解酵素活性を有する物質の検出方
法に使用する九めに好適である。

β−がラクトシダーゼ活性を有する物ｇｔ全検出するた
めには、式中Ｘ′がβ−がラクトシト基である式■の化
合物が特に好適である。これらの化合物は新規である。

従って式ｌｖ： Ｒ３Ｎ２ 〔式中、ＲＩ　　Ｒ２Ｒ’　　Ｒ’　　Ｒ５及びＲ６は
前記のもの全表し、Ｘ′がβ−がラクトシト基を表す〕
の化合物も本発明の目的物である。

この化合物は、β−がラクトシト基ゼ基質が該当するの
で、β−がラクトシダーゼ活性を有する物質を検出する
ために本発明による方法で有利に使用することができる
ということによって卓越している。

もう１つの本発明の目的は、式■の化合物の製法である
が、これは式ｌｌ： 〔式中　Ｒ１からＲ６は前記のものを表す〕の化合物上
式Ｖ： ｘ’−Ｙ　　　　　　　　　　ＣＶ） 〔式中、Ｘ′はβ−がラクトシル基を表し、Ｙは反応性
基金表す〕の化合物と場合によって保護基の使用下に反
応させることを特徴とする。

本発明のもう１つの目的は、式■： Ｒ３Ｒ２ 〔式中　Ｒ１は水素又はアルコキシ基金表し、Ｒ２は水
素、ハロビン、アルコ中シー　アラルコキシ−又はアミ
ノ−基を表し、Ｒ’Ｒ’Ｒδ及びＲ６は同−又は民なる
ものであってよく、水素、ハロケ９ン、アルキル−アル
コキシ−アラルコキシ−カル♂キシル−アルキルカルビ
ニル−アルコキシカルビニル−カルバモイル−スルホ−
又はアミノ−基ｋｍし、Ｘはグリコシルー　ホスフェー
ト−又はアシル基を表すが、その除晶Ｒ２とＮ３　　Ｒ
３とＲ４及びＲ４とＲ６並びにＲδとＲ６は閉環して各
々−りの環系になっていてよく、基Ｒ１及びＲ２の少な
くとも一つは水ｆｆｉ’に表し、基ＲＩＲ２及びＲ３の
少なくとも一つは水素ではない〕の化合物全加水分解酵
素活性を有する物ｇｔヲ検出するための前記の方法に使
用することである。

次に本発明を実施例につき詳説する。

例　　１ ａ）　　４−メトキシ−１−ナフチル−２、３、４゜６
−テトラ−０−アセチル−β−Ｄ−がラクトピラノシド アセトブロムがラクトース〔１−ブロム−２゜５．４．
６−チトラー○−アセチル−α−Ｄがラクトビラノーズ
、フル力（ＦＬｕｋａ　）　）９６−１９　（２５３，
＜Ｓミリモル）をアセトン２００−に溶かし、Ｎ２導入
により脱酸素する。溶液を持続的に攪拌しながら加熱那
ル書させ、先ず水１３μ中の水酸化カリウム１４．３．
９　（２５４，９ミリモル）の溶液、欠いでアセトン２
００−中の４−メトキシ−１−ナフト−／ｌ／　（Ｌｉ
ｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ。

Ｃｈｅｍ、　１４０　（１９８０）　）　１８−５　、
！ｉ’　（１０６−２ミリモル）の溶液を各々１０分以
内に滴加する。

反応混合物は滴加する間絶えず′Ｊ＃流下に沸騰させる
べきである。引き続き、同じ温度でなお４時間攪拌し、
冷却させ、不溶物ｔ−ａ別し、濾液を高Ｘ空中で原発濃
縮させる。シロップ状の残渣を３口承各々１００１１４
で湿浸し、粗生成物として更に精製せずに久の合成段階
に使用する。

ＷＩＲクロマトグラフィー（シリカダル６０、溶ｆｆｌ
剤　　クロロホルム／酢酸エチル２０：１）ＲＦ　−０
，４０ ｂ）　　４−メトキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−がラク
トビラノシド 無水メタノール１５０１１１／中の例１　ａ）からの化
合物の懸濁液に湿肛排除下に１時間以内に無水メタノー
ル中の０．５Ｍナトリウムメタノラード溶液２５ｍ１′
ｆｃ反応混合物の−（値が約１３に保たれるように脩加
する。反応完結後（ＤＣ調整）生成物をシリカビルを用
いるカラムクロマトグラフィーによって単離する。

収夛：１０ｇ 薄層クロマトグラフィー（シリカール６０、溶離剤　　
クロロホルム／メタノール３：１）Ｒシー０．４０ ＩＨ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）　：δ（ｐｐｍ）　＝
　３．４１−３．８０　（ｍ。

６Ｈ）；３．９２　（ｓ、　３Ｈ）；　４．５２−４．
８９　Ｃｍ、　４Ｈ’）：　５−３１（ｄ、　Ｊ　＝　
５１（ｚ、　ＩＨ）ｙ　６−８４　（ｄ、　Ｊ　−８，
５Ｈｚ、　１Ｈ）：　７．１６　（ｄ、Ｊ−８−５Ｈｚ
−１Ｈ）：　７−４７−７．６０（ｍ、２Ｈ）：　８−
０８−８−１７　（ｍ、ＩＨＧ　８．３１−８．４１（
ｍ。

１Ｈ）。

ＭＳ　（ｐｏｓ、　ＦＡＢ）　：　ｒｒＶ／ｅ　−３！
１７例　　２ ｂ）　　４−クロル−１−ナフチル−β−Ｄ−がラクト
ピラノシｒ ４−クロル−１−ナフトール（アルドリッヒ）及びアセ
トブロムがラクトースから例１　ａ）及び１　ｂ）から
の方法と同様にして４−クロル−１−ナフチル−β−り
一がラクトピラノシドを製造し九。

薄層クロマトグラフィー（シリカ’ｆｋ６０．ｆｌＪ離
剤　クロロホルム／メタノール７：３）ＲＦ　−０，５
７ １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ、）：δ（ｐｐｍ）　＝　
３．３０−３．９５　（ｍ。

１０Ｈ）；　５．０５　（ｄ、　、Ｔ　−５Ｈｚ、　１
Ｈ）１７．２４　（ｄ、　Ｊ−８，５Ｈｚ＃　ＩＨ）；
　７．６１−７．８５　（ｍｐ　３Ｈ）：　８．１５−
８．２２（ｍ、ｆＨ）；　８−４０−８−５３　（ｏｌ
Ｉｐ　ｆＨ）例　　３ ４−プロポキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−ｆｆラクトピ
ラノシド ４−グロボΦシー１−ナフトール［ＬｉｅｂｉｇｓＡｎ
ｎ、　Ｃｈｅｍ、　１４０　（１９８０）　］及びアセ
トデロムがラクトースから例１　ａ）及び１　ｂ）から
の方法と同様にして４−クロボキシ−１−ナフチル−β
−Ｄ−がラクトピラノシドｅ！！！遺した。

薄層クロマトグラフィー（シリカビル６０．溶離剤　　
クロロホルム／メタノール３：１　）Ｒ１−０，４２ １３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）：δ（１）Ｉ）ｍ）　−
１１，０９１２５，７８゜６２．４４．７０．３０．７
１．０２．７２．５５．７５．０７．７６．９４゜１０
４．２８．１０５．３９．１１１．５２．１２２．６５
．１２３．２７゜１２８．４５．１２５．８０．１２７
．６１．１２８．４３．１４８．５１゜１５１．５７ ＭＳ　（（ＴＭ８）、−誘導体）　：　ｒｒＶ′ｅ　−
６５２例　　４ ４−イソプロポ中シー１−ナフチル−β−Ｄ−がラクト
ピラノシド ４−インプロポキシ−１−ナフトール及びアセトブロム
がラクトースから例１　ａ）及び１　ｔ））からの方法
と同様にして４−インプロポキシ−１−ナフチル−β−
り一がラクトピラノシドを製造した。

薄層クロマトグラフィー（シリカダル６０、溶［＋１　
　クロロホルム／メタノール！ｌ：１）ＲＦ　−０，５
３ ＭＳ　　（ｎｅｇ、　　ＦＡＢ）　　：　　ｍ／ｅ　−
！＋　６３例　　５ ４−ベンジルオ中シー１−ナフチル−β−Ｄ−がラクト
ピラノシド ４−ベンジルオキシ−１−ナフトール（Ｔ、ｉｅｂｉｇ
ｓＡｎｎ、　Ｃｈｅｍ、　１４０　（１９８０）　）及
びアセトブロムがラクトースから例１　ａ）及び１　ｂ
）がらの方法と同様にして、４−ベンジルオキシ−１−
ナフチル−β−り一がラクトピラノシドを製造した。

薄層クロマトグラフィー（シリカ２ル６０．溶離剤　ク
ロロホルム／メタノール３：１）ＲＦ　−０，４６ ＭＳ　（（ＴＭＳ）４−　ｉｌｌ導体）　：　ｒＶ′ｅ
　＝　７００例　　６ ４−トリフルオルエトキシ−１−ナフチル−β−Ｄ−が
ラクトピラノシド ４−トリフルオルエトキシ−１−ナフトール〔ツアイト
シュリフト　ヒュア　ナトウーア７オルシュング４０１
）、５３４ぼ（１９８５年）〕及びアアセトプロがラク
トースから例１　ａ）及び１　ｂ）からの方法と同様に
して４−トリフルオルエトヤシ−１−ナフチル−β−Ｄ
−がラクトピラノシドを製造した。

ＨＲＧクロマトグラフィー（シリカビル６０、溶離剤　
　クロロホルム／メタノールろ：１）ＲＦ　−０，４２ １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）：δ（ｐｐｍ）　−５−４
６−３−９５（ｍ、　６Ｔ（）：　４−５７　（ｑ、Ｊ
　−９Ｈｚ、２Ｈ）：　４−８６　（ｄ、Ｊ　−６）（
Ｚ、　ＩＨ）；　６．８１　（ｄ、　Ｊ　−８Ｈｚ、　
ＩＨ）；　７．０９　（ｄ。

Ｊ””　８　Ｈｚ、ＩＨ）＊　７．３８−７．４８　（
ｍ、２Ｈ）；７−９９−８．０９　（ｍ＋　１）Ｉ）；
　８．２５−８．３５　（ｍ、　１Ｈ）例　　７ ２−メトキシ−１−ナフチル−ジヒドロビンフォスフェ
ート 攪拌機、ｍ闇討及び滴下漏斗を有する内容５００　ｍｌ
の三首フラスコ中にピリジン１５０μ中の２−メトキシ
−１−ナフトール〔ジャーナル　オデ　デ　ケミカル　
ソサイアテイ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　
　Ｃｈｅｔｎｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｙ　）２３．１
６（１９６７年）　１１５．０７９　（０，０７５モル
）の溶液上前もって装入し、冷却下に０〜５℃でオキシ
三塩化燐１１．５９　（６，９ｒｎｌ、　　０．０７５
モル）を攪拌下に徐々に滴加した。２時間後に残渣を吸
引σン過し、ａ！液を氷２００ｙ上に注いだ。

５分間攪拌下に濃水酸化す）　ＩＪウム溶液で七８に調
整し、黄色溶液を真空中で濃縮する。淡色の残ｍをアセ
トンと一緒に攪拌し、吸引濾過する。粗生成物を熱湯２
００ゴ中に溶解させ、不溶性成分を吸引濾過し、母液に
燐酸エステルが沈澱するまで濃塩酸を加え、吸引濾過し
、反応生成物を画情が一定になるまで五酸化二燐上で乾
燥させる。無色結晶の２−メトキシ−１−ナフチル−ジ
ヒドロビンフォスフェート１６ｇが得られる。

融点：１７１°０、”Ｓ’　Ｉｖ′ｅ　＝　２５４．１
８薄層クロマトグラフィー〔シリカゾル６０−メルク（
Ｍｅｒｃｋ　）　、溶離剤：イソプロパノール／酢酸ジ
チル／　Ｈ２Ｏ（５Ｄ　：　５０　：　２０　）　］　
：　ＲＦ−０，３８ ”Ｈ−１（ＭＲ（Ｄ２０．　Ｎａ０Ｄ）　　’δ（ρｐ
ｒｎ）　−５，９８（ｓ、３Ｈ）ｔ　７−４２　（ｄｄ
ｄ、Ｊ−８−２−６，８ｕｎｄ　１．５　Ｈｚ、　ＩＨ
）：　７．４６　（ｄ、　Ｊ　−８−８Ｈｚ。

１Ｈ）；　７−５５　（ｔＸｄｄｅ　Ｊ−８−２＋　６
−８　ｕｎｄ　１．５　Ｈｚｅ　ＩＩ（）；　７．７１
　（ａ、　、Ｔ　−９，ＯＨｚ、　ＩＨ）；　７．８６
（ａ、　Ｊ−＝１８．２　Ｈｚ、　ＩＨ）；　８．３−
６　ｐｐｍ　（ｄ、　Ｊ　−８，６Ｈｚ、　ＩＨ）−例
　　８ ４−メトキシ−１−ナフチルホスフェート−ジナトリウ
ム塩 ４−メトヤシ−１−ナフトール１４．７２９（０，１モ
ル）をぎりジン２００ゴ中に溶かし、攪拌及び水食塩浴
を用いて冷却下に６℃でオキシ三塩化燐１５．５５ｇ（
９，１６ｄ）ｔ−滴加する。

２時間攪拌した後に晶状の残渣を吸引濾過し、橙色に着
色した濾液を氷水４００１中に滴加する。がラス電極及
び−測定Ｐ１を用いて濃水酸化ナトリウム溶液の滴加に
よってＰ）（８に、９ＮＩＬ、回転蒸発器で５０°Ｃで
真空中で蒸発乾固させる。

褐色樹脂１８ｇが得られる；これをイソゾロ７マノール
１００ｄ中に熱時溶かし、ジメチルエーテル３ｏＯｒＩ
Ｌｔの添加によって生成物を沈澱させる。４−メトキシ
−１−ナフチルホスフェート−ジナトリウム塩１６．８
ｇが得られる。

”Ｈ−Ｎ＋ｌＦ’＝　（Ｄ２０＋　Ｎａ０Ｄ）　：δ（
ｐｐｍ）　−４−０２（ｓ、３Ｈ）：　６−９８　（ｄ
＃　Ｊ　＝　８．５Ｈｚ、　ＩＨ）ｙ　７−５８　（ｄ
ｄ、　Ｊ　＝　８．５　ｕｎｄ　１．５　Ｈｚ、　ＩＨ
）ニア、６１．８．１９　ｕｎｄ　８．５１　ｐｐｍ　
（ＡＢＹＺ−系、２及び各ＩＨ） 例　　９ １−アセトキシ−４−メトキシナフタリン４−メトキシ
−１−ナフトール（１，７５＆、１０ミリモル）を無水
酢酸（１８ｒｎｔ）中で２．５時間僻流下に煮沸させる
。その後、溶液を真空中で＠縮し、油状残渣をカラムク
ロマトグラフィー（シリカビル；トルエン／酢酸エステ
ル＝４０／１）により精製する。相応するフラクション
を濃縮した後、粗精製物全石油エーテル（沸点９０〜１
１０°Ｃ）から再結晶させる；収ｆｔ１．２７．９（５
８憾）；無色結晶、融点５１〜５３℃。

例１０ 試料中のヒトの絨毛膜プナドトロビン（ｈｃＧ）の検出 Ａ）テスト支持体１（第１図）の製造 ａ）フリース３の製造 一枚の紙（フイルマ・カル７（Ｆｉｒｍａ　Ｋａｌｆｆ
）社製の型４２１０１ｅ条片（ｅ１２．６　ｃｍ、横０
．＜５ＣＩｎ）に切断し念。ＤＭＳＯ中の４−メトキシ
−１−ナフチル−β−Ｄ−がラクトピラノシド４０ｍ９
／　ｒｎｌの溶液２０μｔに水中のポリビニルアルコー
ル２４幅溶液２０μｔを加えた。この混合物全紙片の中
央部に塗布した。

ｂ）フリース５の製造 一枚の紙〔フイルマ・カル７（Ｆｉｒｍａ　Ｋａｌｆｆ
）社製の型４２１０）’を条片（縦２．６ｃｍ、横０．
６ｃ７ｎ）に切断し之。一方の端ｉ　ＰＢＳ−緩衝剤（
燐酸塩緩衝食壇水、ＰＨ７，０，１壬生血清アルデミン
、０．１壬ツイーン■２０）１００μｔで含浸した。条
片の中央部に、ｈＣＧに対するモノクローナル抗体のＦ
ａｂ−フラグメント及びβ−がラクトシダーゼから成る
接合体（がラクトシダーゼ活性を■する物Ｍ　）　２０
　Ｕ　／ｍｌ、　ｈｅｎのβ−鎖に対する七ツクローナ
ルマウス抗体１００μｙ／１及び４−アミノベンジル−
１−チオ−β−Ｄ−がラクトピラノシド八５＋ｎｙ／μ
を含有する溶液７．５μｍ１載せた。緩衝剤全含浸した
端部と反対の端ＰＡｔ−水中のポリビニルアルコールの
５ｅ６溶液１０μｔに含浸した。

Ｃ）フリース６の製造 一枚の紙〔シュライヒヤー＆ジュール（ＦｉｒｍａＳｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆ｌ　５ｃｈｕｌｌ　）社１！！３
５１２型〕にブロムシアンで活性化した後、マウス抗体
のＦｃ−部に対するヒツジ抗体を固定させた。この材料
片を切断して条片（縦１．１儂、横０．６ｃｍ）にした
。

ｄ）フリース７の製造 一枚の紙〔ワットマン（Ｆｉｒｍａ　ｗｈａｔｍａｎｎ
　）社製Ｄ−２８型〕ｆｔ５　ｘ　０．６傭の大きさに
切った。

ｅ）フリース２と３は、プラスチックシート４によって
相互に分けられている。

乾燥させたフリースを幅０．６１の基板シート２に貼付
けることによって第１図に記載の支持体１を製造し几。

その際フリース５はポリビニルアルコールで含浸された
端部がテスト支持体の端部８の方向であるように貼つけ
る。

Ｂ）試験実権 ａ）試料調製 試料０．５ｄを燐酸塩緩衝剤ＰＩ″！Ｚ中の過硼酸ナト
リウム４ミリモル／を及びオランダがラシーペルオキシ
ダーゼ（酸化剤）ＩＤｆｆ＋６／／１．を官有する溶液
０．５１と混合した。ｂ）試料のテスト条片への塗布 テスト条片１の端部８を溶液中に入れた。

ｈＣ（’）　を含有する溶液をフリース５及びフリース
３中に入れ、そこに存在する物質を溶かす。

ｈＣＧ　トｈｃＧに対するモノクローナル抗体のβ−が
ラクトシダーゼ標識付けされたＦａｂ−フラグメント及
びｈｃＧのβ−頓に対するモノクローナル抗体との反応
によってフリース５中の溶液中で５つの成分から成るβ
−がラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体が形成さ
れた。この場合には加水分解酵素活性を有する物質であ
るこの免疫複合体全本発明による方法を用いてフリース
６中で検出する。免疫複合体を有する溶液は基質を有す
る溶液と全く同じくフリース３からフリース６へ浸入し
、そこでこの基質溶液と混合された。フリース６中で、
形成された免疫複合体並びに過剰のβ−鎖に対するモノ
クローナル抗体は固定されたヒツジ抗体を介してフリー
ス６と結合された。場合による過剰のβ−がラクトシダ
ーゼ標識付けされたＦａｂ−フラグメントは、更にフリ
ース７中に流入した。結合した免疫複合体のβ−がラク
トシダーゼ標識付けにより及び酸化剤を用いて、１０分
間以内に７リース６中で青い色が形成された。

試料中にｈｃＧが全く含有されていない場合には、β−
がラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体も生成でき
なかった。従って加水分解酵素活性を有する物質はフリ
ース６中で結合されず、従って色発現は見られない。こ
れに対してβ−がラクトシダーゼ標識付けされたＦａｂ
−フラグメントは全ｔｔだ溶液中に含有されており、こ
れはフリース７中に浸入する。従って、フリース７でβ
−がラクトシダーゼ標識付けされたＦａｂ−フラグメン
トの反応に趨因する色発均が見られ、これは加水分解酵
素活性を有する物質でもある。即ち、フリース７中でも
本発明による方法を実施することによって試験の対照を
行う；これは試料中にｈＣＧが全く存在しなかった場合
に特に重装である。

評価は定量的にも行うことができる。それは試料中にｈ
ｃｆｌが、従ってフリース６中に結合されたβ−がラク
トシダーゼ標識付けされた免疫複合体が多く存在すれば
それだけ強力に１０分後にフリース６中で着色が生じる
からである。

例１１ チロキシン（Ｔ４）の検出 Ａ）テスト条片１１（第２図）の製造 ａ）フリース１４ フリース１４はβ−がラクトシダーゼとＴ４に対する抗
体との接合体が含浸されてｒる。

ｂ）フリース１５ 一枚の紙（シュライヒャー＆ジュール３５１２）をシア
ン化臭素で活性化し、それにＴ４スクシンイミドエステ
ルを結合させた。

Ｃ）フリース１６ フリース１６は４−メトキシ−１−ナフチル−β〜Ｄ−
がラクトピラノシドで含浸したフリースである。

ｄ）７１１−ス１３１ｄ試料装入に役立つ。

テスト支持体１１全製造するために第２図に示したよう
にフリースを基板シート１２上に固定した。

Ｂ）試験の実施 ａ）試料調製 試料はｆｌ＋１０と同様にして調製した。

ｂ）実施 テスト条片１１の端部１７ｔ−溶液中に入れた。

Ｔ４を有の試料はフリース１３中に浸入した。

試料はそこから更にフリース１４中に流入し、フリース
１４によってβ−がラクトシダーゼ複合体を分離した。

抗体とＴ４との免疫反応によってβ−がラクトンダーゼ
環識付けされた免疫複合体が生成された。年やこの免疫
腹合体の他になお過剰のβ−がラクトシダー上１接合体
を含有する溶液はフリース１５中に浸入した。そこでこ
の過剰分は結合されたＴ４に一介して紙と結合された。

なお免疫複合体を含有する溶液は、フリース１６中に浸
入した。そこで加水分解酵素活性を有する物質であるβ
−がラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体全検出す
るための本発明による方法が行われる。溶液中にこの複
合体が、従ってＴ４も多く含まれていればいるほど、１
０分後にフリース１６がそれだけ強く育色に着色した。

Ｔ４が存在しない場合にはフリース１６は白ｌＡままで
あった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の例１０１Ｃよるテスト支持体？示す
図である。 第２図は本発明の例１１によるテスト支持体？示す図で
ある。 １．１１・・・テスト支持体、２・・・基板シート、４
・・・プラスチックシート、３，５，６，７゜１３．１
４，１５，１６・・・フリース、１７゜１８・・・端部 し−一−Ｊ １．１１　＋スト支持体 ２，１２　故仮／−ト 第１図 ツ ノ′ 牛、−ｔ゛ラスチツク／ト ８．１７・端部 第２図 ／ 〆

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料を加水分解酵素基質及び酸化剤と混合し、生じ
   た色強度を評価することによつて試料中の加水分解酵素
   活性を有する物質を検出する方法において、加水分解酵
   素基質として、式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１は水素又はアルコキシ基を表し、Ｒ＾２
   は水素、ハロゲン、アルコキシ−、アラルコキシ−又は
   アミノ−基を表し、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５及びＲ＾６
   は同一又は異なるものであつてよく、水素、ハロゲン、
   アルキル−、アルコキシ−、アラルコキシ−、カルボキ
   シル−、アルキルカルボニル−、アルコキシカルボニル
   −、カルバモイル−、スルホ−又はアミノ−基を表し、
   Ｘはグリコシル−、ホスフェート−又はアシル基を表す
   が、その際、基Ｒ＾２とＲ＾３、Ｒ＾３とＲ＾４及びＲ
   ＾４とＲ＾５並びにＲ＾５とＲ＾６は閉環して各々一つ
   の環系になつていてよく、基Ｒ＾１及びＲ＾２の少なく
   とも一つは水素を表し、基Ｒ＾１、Ｒ＾２及びＲ＾３の
   少なくとも一つは水素ではない〕の化合物少なくとも１
   種を使用することを特徴とする、加水分解酵素活性を有
   する物質の検出方法。２、式 I の化合物少なくとも１
   種を含有することを特徴とする、試料中の加水分解酵素
   活性を有する物質の検出剤。 ５、式IV： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１は水素又はアルコキシ基を表し、Ｒ＾２
   は水素、ハロゲン、アルコキシ−、アラルコキシ−又は
   アミノ−基を表し、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５及びＲ＾６
   は同一又は異なるものであつてよく、水素、ハロゲン、
   アルキル−アルコキシ、アラルコキシ−、カルボキシル
   −、アル キルカルボニル−、アルコキシカルボニル−、カルバモ
   イル−、スルホ−又はアミノ−基を表し、Ｘ′はβ−ガ
   ラクトシル基を表すが、その際基Ｒ＾２とＲ＾３、Ｒ＾
   ３とＲ＾４及びＲ＾４とＲ＾５並びにＲ＾５とＲ＾６は
   閉環して各々一つの環系になつていてよく、基Ｒ＾１及
   びＲ＾２の少なくとも一つは水素を表し、基Ｒ＾１、Ｒ
   ＾２及びＲ＾３の少なくとも一つは水素ではない〕の化
   合物。