JPS62249979A - 基質又は酵素活性を測定するための方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は基質又は酵素活性を、Ａ１１ｌ　′Ａｆ反応と
して酸化還元反応を使用して定ｉ１１的に測定する方法
に関する。

従来の技術 臨床及び製薬化学、生化学及び食品化学に４？いて基質
又は酵素活性を測定するために多数の指示薬法が使用さ
れる。しかし例えば酸化還元色素指示薬系の吸光の変化
又は電１位又は電流の変化が特に重要であり、これは好
適な！袷に工り測定することができる。この種の酸化還
元反応は特に臨床化学で広く使用される。

ｉ＄１１１定反応として酸化還元反応を使用することに
基づく特定の基質又は酵素の光度測定法的測定に使用さ
れる試薬系で有利な酸化還元成分の他になおその他の還
元作用金＊する物質が存在する場合には、測定反応が妨
害されることを考慮せねばならない。この種の妨害は周
知の如く特に、内因及び外因起源の還元作用′（ｌ−肩
する物質を考量に含有しうる生物学的試料、例えば尿、
血漿又は血清を使用する場合に考慮せねばならない。そ
の際内因性妨害物質としては特にピリル♂ンが挙げられ
る。外因性の還元作用ヲホする妨害物質は例えばアスコ
ルビン酸塩、種々の薬剤又はその代謝物質である。生物
学的試料中にしばしば存在し、その還元性特性により障
害となる薬剤は例えばα−メメチドーパｙｒｉカルシウ
ム「ペシレートである。ｂｂ　８作用を有する代謝物質
は例えばホモゲンチシン酸力゛公知である。

還元作用を有する物質に、【る妨害はＩＦ′ｙに、試料
中の測定すべき基質又は酵素の濃度又は活性が比較的低
く、十分な測定精密度を→成するために比較的高い試料
−／試薬容随比が必弗である場合に、者しい。このこと
は例えば血清又は血漿中の尿酸、クレアチニン又はイ１
（酸喘ヲ測定する場合に該当する。その際測定すべき基
質は酵素と反応１−で過酸化水素金牛成す乙が、その際
生じる過酸化水素はベルオギシダーゼの存在で例えば２
つのカップリング成分の酸化縮合のような化学量論的色
素生成反応で使用１さｆする。

これまで還元作用含有する物ａ（てよる１（Ｉｊ　１１
３會同時に迅速かつ効果的にかつ１ｌｌｌｌ定に７１４
ｅ々貸元反応全更に妨害１〜ないで除去するととは不可
能であつ友。このために化学では強力な酸化作用を有す
る物質が一般的である。しか（２こねら（−、Ｉ基質及
び酵素全攻撃し破壊するので、臨床及び製薬化学、生化
学又は食品化学では使用することができない。更にそれ
らはしばしば、試薬盲検値吸光度を高める副反応を惹起
する。

多くの金属塩及びその錯体も還元作用を有する物質と反
応して相応する２価又は３価のイオンを生じる。こね、
らは指示薬反応に必要な酵素を阻止する。更に生じる倉
元作用を有する金属イオンは試料中に存在する妨害物質
と同様に妨害しうる。金属イオンの付加的な欠点は、そ
れらの酸化が強酸性条件下で最適であるということであ
る。これらの条件下では酵素は大抵破壊される。

これら慣用の方法の他に、特にアスコルビン酸に対して
は空中酸素を用いるブスコルピン酸塩の急速な酸化分解
が挙げられる。しかしこれは酵素が変性されるか又は不
活性化される強アルカリ性条件下にのみ可能である。

代りに、この反応用の触媒としてアスコルベートオキシ
ダーゼの使用が提案された（西ドイツ特許公開公報第２
６２５８３４号明細書）。

この方法は酵素アスコル♂ン酸嘔化酵素の特異性に↓ジ
アスコルビン酸塩用の外にその他の還元作用を有する妨
ｇ物質には使用することができない。酵素の最適…はＰ
１１５〜６であり、従って多くの臨床試験で重妾な酵素
の最適−から遥かに離れている。例えばクレアチニン又
は尿酸の測定はｐＨ８で行われる。この−値ではアスコ
ルベート−オキシダーゼの活性は迅速に妨害を除去する
ために十分ではない。更にこの酵素は常用の試験成分、
例えばアジＶ又はギレート化剤、例えばＥＤＴＡにより
妨害される。

発明が解決しょうとする問題点 従って酸化還元反応で還元作用を有する物質による妨害
は除去するが測定反応に不利な影響を与えない基質又は
酵素活・注の測定用に一般に使用可能な方法及び試薬が
必要とされていた。

更に試薬は取扱いが簡単であシ、安価であるべきである
。本発明の課題はこの要求を満たすことであった。

問題点を解決するための手段 この課題は、酸化還元反応が測定反応として役立ち、１
種又は越種の付加的に添加したテトラゾリウム地の存在
で行なわれる基質又は酵素活性の測定用の本発明による
方法に１って解決される。この方法の利点は、該当する
基質−又は酵素試験で一般的な条件下で妨害作用を行う
還元作用七肩する物質金一般的に不可逆に、簡単で迅速
に除去することである。これによって妨害されない測定
が可能である。

テトラゾリウム塩及びそのホルマザンへの還元は既に曲
世紀終りに公知である。それらは主とし゛て化学、生化
学及び組織化学で還元作用を有する物質全検出するため
に使用される〔比較：ペルクメイヤー（Ｂｅｒｇｍａｙ
θｒ）、メソツズ・オプ・エンシマティック暢アナリシ
ス（Ｍｓｔｈｏａａｏｆ　Ｅｎｓａｙｍａｔｉｏ　Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ　）第１巻、１９９頁以降（１９８４年）
又はアルドマンｒＡｌｔｍａｎｎ　）、Ｆ、Ｐ、　、プ
ログレス・イン・ヒストケミストリ（ＰｒＯｇｒθｓｓ
　ｉｎ　ＨＩＪｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第９巻、１頁
以降（１９７６年）〕。しかしこれまで、テトラゾリウ
ム塩のホルマザンへのこの還元を検出反応としてではな
く妨害を排除する反応として使用する目的で、色素指示
薬として作用する酸化還元反応をテトラゾリウム塩還元
と組合せることは考慮されなかった。これまでの関心は
還元に際して出来る限シ有色のホルマザンを生じ、従っ
て酸化還元反応で色素指示薬として使用されるテトラゾ
リウム塩を見出することにあった。

測定反応として使用され、光度測定的に実施可能な酸化
還元反応で色素指示薬系を妨害しないために、還元作用
を有する妨害物質全除去するために使用されるテトラゾ
リウム塩は、光を全くか又は無視しうる程度でしか固有
な色素指示薬系の測定波長で吸収しない工うなホルマザ
ンを生成すべきである。従って特に最高吸収波長５００
〜６００　ｎｍ　ｔ−有する臨床化学で常用の色素指示
薬系用には本発明に工り原則的にはこの波長で全くか又
は無視しうる程度にしか吸収しない任意のテトラゾリウ
ム塩を使用するこ゛　とができる。

本発明では、特に一般式Ｉ： 〔式中Ｒ１は水素、カルボキシル−、アルキル−、フェ
ニル−、ニトロフェニル−、ジニトロフェニル−、カル
ボキシルを換されたフェニル−又Ｕトリアルキルアンモ
ニウムフェニル基ヲ１ｆ）Ｌ、Ｒ２Ｈフェニル−、ニト
ロフェニル−、ビフェニリル−又はナプチル基金表ワＬ
、Ｒ３はフェニル−、カルざキシル置換サレタフェニル
ー、カルボキシル置換されたとドロ卑ジフェニル−又は
ジメチルチアプリル基を表わし及び八−は普通の反対イ
オンを表わす〕のテトラゾリウム塩が有利である。

定義Ｒ１のアルキル基は炭素原子１〜１０個、有利には
１〜７個から成る。特に翁利にはメチル−、エチル−及
びｎ−ブチル基である。

定義Ｒ１及びＢ２のニトロフェニル基として特に有利に
はパラ−ニトロフェニル基である。

定義Ｒ１で記載したジニトロフェニル基は特に２．４−
ジニトロフェニル基である。

定義Ｒ’及びＢ３のカルだキシル置換フェニル基はフェ
ニル基が４位でカルボキシル基により置換されている場
合に有利である。更に定義Ｒ３でフェニル基が２位にカ
ルボキシル置換分を有する場合に特に有利である。

定ｆｉＲ１ノ）ＩＪアルキルアンモニウムフェニル基ハ
、フェニル基が４位にトリアルキルアンモニウム置換分
子：有する場合に特に有利であると判明した。アンモニ
ウム置換外のアルキル基はＲ１のアルキルと同じ定義に
相応（２、同一であっても良いし異なるものであっても
良い。

定義Ｒ２のビフェニリル基は有利にはその４位でテトラ
ゾリウム塩に結合している。

定義Ｒ２のナフチル基は有利にはその２位でテトラゾリ
ウム塩に結合している。

定義Ｒ３のカルボキシル置換ヒドロ卑ジフェニル基は特
に、２位にカルざキシル置換外を有しその４位でテトラ
ゾリウム塩に結合している工うなヒ「ロキシフェニル基
でアル。

定義Ｂ３のジメチルチアゾリル基はその２位でテトラゾ
リウム塩に結合している。有利表ジノチルチアψリル基
は４−及び５位にメチル基を有する。

定義へ−の普通の反対イオンは特に１価の陰イオンであ
る。このために一般に無機陰イオン、例えばハロゲンイ
オンを使用する。この有利なハロゲンイオンは塩素−及
び臭素イオンである。

カルボキシル置換基Ｒ１又はＲ３の場合には反対陰イオ
ンＡ−はカルボキシレートイオンであっても良い。

次の表に記載の化合物が特に有利である。

特に有利な化合物は化合物Ｔ１、Ｔ２、Ｔ６、Ｔ４、Ｔ
５、Ｔ６及びＴ８である。

測定反応の妨害を除去するために添加されるテトラゾリ
ウム塩の濃度は試料中の予期される還元作用を有する妨
害物質の量による。一般にテトラゾリウム塩０．００１
〜１００ミリモル／ｌ、有利には０．０１〜２０ミリモ
ル／ｌ、特に有利には０．０５〜５ミリモル／Ｉｋ、使
用する。

測定反応として酸化還元反応を用い、還元作用７！ｉ″
肩する妨害物質金除去するために１種又は倣種のテトラ
ゾリウムｔｊｌ添加して基質又は酵素活性を測定するた
めの本発明による方法は、その都度の方法に必要な酵素
によりシ１値６〜１１で実施することができる。範囲６
．５〜９が有利である。緩衝剤としては所望される一範
囲で十分な緩衝能を有する工うな任意の物質を使用する
ことができる。しかし有利には燐酸塩−又はトリス緩衝
剤が使用される。緩衝剤の濃度は０．０１〜１モル／ｌ
、有利には０．０５〜０．２モル／ｌである。

妨害除去用に添加されるテトラゾリウム塩から生じるホ
ルマザンの溶解度全改良し、妨害の除去された反応の反
応速度を高めるために、測定すべき試料に場合に工す非
イオン性清浄剤、例えばトリトｙ　（Ｔｒｉｔｏｎ　）
　Ｘ　−１００、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　３　Ｑ又
はポリビニルピロリドンを添加することができる。場合
により添加されるこの種の清浄剤の濃度は各清浄剤の臨
界ミセル濃度による。一般に０．０１〜５チ、特に０．
０５〜０．５憾である。

この方法の有利な態様では、妨害を除去するテトラゾリ
ウム塩作用を１種又は数種の電子伝達体を添加すること
によって促進する。妨害除去反応を促進するために及び
妨害物質の酸化の際の助剤として若干の電子伝達体全使
用することができる。例えばフェナジン−メトスルフェ
ート、フェナジン−エトスルフェート、８−ジメチルア
ミノ−２，３−ベンゾフェノキサジン、１−メトキシ−
５−メチルツェナジニウム−メチルスルフェート又はジ
アホラーゼが挙げられる。このうちフェナジン−エトス
ルフェート又はジアホラーゼが特に有利である。

測定反応として酸化還元反応を用いて基質又は酵素活性
を測定する際に、付加的なテトラゾリウム塩なしでも一
定の妨害除去効果が電子伝達体だけを用いても確認する
ことができる。しかし前記電子伝達体の作用は酸化還元
反応の十分であるか又は全く完全な妨害除去用には十分
ではない。このために本発明によるテトラゾリウム塩と
の組合せが必要である。

妨害除去すべき試料に添加する電子伝達体の濃度は有利
には０．００５〜１００ミリモル／ｌ。

特に有利には０．０５〜５ミリモル／ｌでアル。

ジアホラーゼの場合には有利には０．００１〜１００Ｕ
／ｍＪの量ヲ使用するが、その際０．１〜２０Ｔ１／ｍ
ｔの範囲が特に有利である。

本発明のその他の目的は基質又は酵素活性の光度測定法
的測定用の試薬であるが、これは測定反応として酸化還
元反応を用いて基質又は酵素を測定するための系統及び
付加的に、当該基（２］） 質−又は酵素試験で一般的な条件）で敵元作用を廟する
妨害物’ｇｒを小口［ｊψ的に容艶口（こカ・つ迅速に
除去し、それによって妨害されない４１１１定を司能に
する１ｆａ又は数種のテトラゾリウムｔｔＡ　ｋ含有す
る。

原則的にはこの種の試薬用に、ｉ＄ｌｌＩ定反応會行う
波長範囲で全くか又は無視しうる程度にしか吸収しない
工うな全てのテトラゾリウム地ヲ使用することができる
。どの波長範囲は臨床化学で重要な多数の基質又は酵素
の場合に５００〜６００　ｎｍである。従って特に一般
式１のテトラゾリウム塩が有利である。測定に必要な残
りの試薬成分と組合せて化合物Ｔ１〜Ｔ１７が特に有利
である。この為にテトラゾリウム塩Ｔ１、Ｔ２、Ｔ６、
Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６及びＴ８が特に有利であると判明（−
た。

本発明による試薬は１種又は数種のテトラゾリウム塩を
含有するが、その濃度はｉ＃元作用を有する妨害物質の
予想すべき瞼による。一般に濃度はテトラゾリウムｍ　
０．００１〜１００ミリモル／ｌ、有利には０．０１〜
２０ミリモル／１３゜特に有利には０．０５〜５ミリモ
ル／ｌである。

測定反応として酸化還元反応全使用し、還元作用含有す
る妨害物質全除去するために１種又は数種のテトラゾリ
ウム塩を添加して基質又は酵素活性を測定する際に必要
な酵素に応じて一定の一値會保持するために、本発明に
よる試薬は緩衝剤を含有することができる。本発明によ
る試薬の−はｐＨ３〜１１の範囲であり、有利にはｐＨ
６，５〜９の範囲である。この種の値に調整することの
できる緩衝剤は原則的にはそれらのｐＫ値が前記−１範
囲であるような全てのものである。本発明による試薬は
これらのうちの任意の緩衝剤を含有することができる。

本発明による試薬は有利な緩衝剤として燐酸塩−又はト
リス緩衝剤を含有する。試薬中の緩衝剤の濃度は０．０
１〜１モル／ｌ、有利には０．０５〜０．２モル／ｌで
あって良い。

妨害除去用に添加されるテトラゾリウム塩から生じるホ
ルマザンの溶解性を改良し、妨害除去反応の反応速度を
高めるために、本発明Ｑ・Ｃよる試薬は場合に工す非イ
オン性清浄削、例えばトリトンｘ−ｉｏｏ、ツイーン８
０又はポリ−ニルピロリドン全含有することができる。

この種の清浄剤の濃度は各々のｔＲ浄削の臨１．？ｊ　
ミセル濃度による。それは一般ＶＣｏ、ｏｉ〜５％、特
に０．０５〜０．５憾である。

特に有利な本発明による試薬１ｔｉ、、１種又は数種の
テトラゾリウム塩の他に１挿又は数種の電子伝達体を含
々することを特徴とする。この種の電子伝達体としては
例えばフェナジン−メトスルフェート、フェナジン−エ
トスルフェート、８−ジメチルアミノ−２，３−ベンゾ
フエノキサジン、１−メトキシ−５−メチルツェナジニ
ウム−メチルスルフェート又を丁ジアホラーゼが挙げら
れる。

特に好適な電子伝達体は特定の基質又は酵素活性の測定
に必要な残りの反応成分と場合せて７エナジンーエトス
ルフエート及び／又はジアホラーゼであると判明した。

試薬中の電子伝達体の濃度は０．００５〜１００ミＩＪ
そル／ｌ、有利には０．０５〜５ミリモル／ｌである。

ジアホラーゼの場合に試薬は有利には酵素０．００１〜
１００Ｕ／ｍ／ｅ含有する。濃度範囲０．１〜２０Ｕ＃
Ｉ／が特に有利である。

本発明による試薬は、測定反応として酸化還元反応−用
いて基質又は酵素を測定するための系として、例えばグ
ルコース測定用に；グルコース−オキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、４−アミノ７エナプン及びフェノール、尿
酸測定用に：ウリカーゼ、ペルオキシダーゼ、２−ヒト
ラブノー２．３−ジヒＦロー３−メチル−６−スルホベ
ンゾチアゾール及びＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチル
−ｍ−）ルイジン又ハコレステリン測定用に：コレステ
リンーエステラーゼ、コレステリン−オキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、４−アミノフェナジン及びフェノール
を含有することができる。

前記の例に挙げた基質の測定用のこれらの系は全て公知
である。これらの代シに本発明による試薬で基質又は酵
素の測定用のその他の公知の系を使用することもできる
。

本発明による試薬は、還元作用奮４１する妨害物質を除
去するために１種又は数種のテトラゾリウム塩及び基質
又は酵素測定系の成分として８２０８生成酵素、例えば
前記１．たグルコース−オキシダーゼ、ウリカーセフ１
丁コレステリンーメキシダーゼを含々する場合に特に有
効であると判明した。同様に本発明しこよる試薬が６１
１１定反応用にフェノール、例えばフェノールそれ自体
又は２．４．６−）リプロムヒドロキシ安ぐ香酸又はア
ニリン誘導体、例えばＮ−エチル−Ｎ−β−スルホエチ
ル−ｔｏ−）ルイジンにｊｌ　１ｊ＃Ｊ：薬例えば４−
アミノフェナジン、４−アミノ−アンチぎリン又は２−
ヒドラゾノー２．５−ジヒドロ−３−メチル−６−スル
ホベンゾチア−ｒ−ルと酸化的に結合を−うる）を含有
する場合に特に有利であると判明【２友。測定反応とし
、てこの種の酸化還元反応の例はグルコース−１尿酸−
又はコレステリン測定用に既に記載されている。

本発明は迅速診断薬の分野でも使用することができる。

この種の迅速診断薬は一般に方法実施に必要な種々の試
薬全吸収性の不溶性支持体、例えば祇、フリース等に含
浸してか又は好適表結合剤會用いて支持体シート又は膨
化性フィルム上に被覆として塗布して含有する。

１態様では、還元作用を有する妨害物質を除去するため
に１種又は数種のテトラゾリウム塩を含有する本発明に
よる試薬を吸収性支持体、例えば紙上に含浸させる。こ
の様にして例えばグルコース、尿酸又はコレステリン検
出用の例えばアスコルビン酸により事実上妨害されない
試験紙が得られる。

しかし本発明によれば、テトラゾリウム塩を別の支持体
上に塗布し、これを残りの試薬の支持体と例えばその上
に置くか貼９着けるか又は−緒に封入するかして合する
こともできる。この種の実施例では例えば水溶性の紙（
例えば西ドイツ特許公開公報第２４３６５９８号明細書
）をテトラ・！リウム地で含浸することかでき、一方基
質又は酵素活性の測定用に必要な糸は水に不溶性の吸収
性の支持体材料上に含浸されている。２つの支持体材料
を有利には、測定すべき試料が先ずテトラゾリウム塩と
接し次いで水に不溶性の支持体材料に接する工うに相互
に積層する。

有利な１態様では、支持体材料の別々の帯域をテトラゾ
リウム塩及び試ｌ試薬で含浸しても良い。この場合に、
有利には支持体音検査すべき溶液と、溶液が先ずテトラ
ゾリウム地含有の帯域と接触１−１そこから残しの必要
な試験試薬を含有する帯域へ吸収されるように接触させ
る。

この種の態様を説明するために第１図に、装置の例を横
断面で図示するが、この装置に工り、西ドイツ特許出願
公告第３０２９５７９号明細書によれば、一方では全面
から試験に必要力血清又は血漿を分離し、他方では試薬
−及び助剤層の特別に形成された構造にエリ温度調整、
前反応及び主反応の目的とされる開始が可能と乃る。

第１図による装置は次のような構成である；不活性の支
持体フィルム８上にガラス繊維から成る移送フリース７
が固定されている。この移送フリース七部分的に被って
同様にガラス繊維から成るフリース５が固定網６により
固定されている。フリース５と移送フリース７の間には
、測定反応を妨害する還元作用を有する物質を除去する
ことができる物質全含浸しである妨害除去織物４が配置
されている。移送フリース７の側面には接着部９を介し
て透明なプラスチックから成る透明なシート１が固定さ
れている。この透明なシート１の下には、測定反応に必
要な物質が混入されている膨張性又は吸収性のフィルム
から成る試薬層２が付与されている。試薬層２の下には
一般に、強力な反射作用を有する物質例えば硫酸バリウ
ム、二酸化チタン又は類似物と混合しであり光学的に白
色背景として役立つプラスチック−又はゼラチンフィル
ムから成る被覆層３が設けられている。観察用に照射さ
れる光は十分完全に軽減され、フリース７の場合による
変色は顕者では斤い。試薬層２及び被覆層３は共通して
試ＳＡ層と称されろ。

固定網６上に全血全戦せると、これはガラス繊維フリー
ス５中で血清と赤血球に分離され、その際赤血球が固持
される。妨害除去織物４全通過する際に測定反応を妨害
する還元作用を有する内容物質は除去されるので、移送
フリース７の左側部分に測定全妨害する物質を含まない
血清だけが移る。透明シート１′ｆ：押１．た後測定反
応は、血清が移送フリース７を完全に満たした後に開始
する。血清は圧縮接触に依って被覆＃３を通って試薬層
２に浸透し、この層を均一に完全に湿らす。反応は透明
シー）　１　’ｅ１ＪＪＪＬ、て試薬層２の変色により
観察される。

７／′ 本発明による方法及び試薬に使用することができるテト
ラゾリウム塩５−カルボキシ−３−（２−カルボキシフ
ェニル）−２−フェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒド
ロキシド、分子内塩（Ｔ１）、６−（２−カルボキシフ
ェニル）−２，５−ジフェニル−２−Ｈ−テトラゾリウ
ムヒドロキシド、分子内塩（Ｔ２）、２．３−ジフェニ
ル−５−（２，４−ジニトロフエニノリー２−Ｈ−テト
ラゾリウムクロリ）’（Ｔ！＋）、２．３−ジフェニル
−５−（４−（）リメチルアンモニオフェニル））−２
−Ｈ−テトラツリウム−ジクロリド（Ｔ５）及び６−（
２−カルボキシフェニル）−５−（４−カルボキシフェ
ニル）−２−フェニル−２−Ｈ−テトラツリウムヒドロ
キシＰ１分子内塩（ＴＩ　６）及び６゜５−ビス−（２
−カルボキシフェニル）−２−フェニル−２−Ｈ−テト
ラゾリウムクロリド（Ｔ１７）は新規化合物であシ、同
様に本発明の目的である。これらは一般式Ｉ′： 〔式中、Ｒ”はカルボキシル基、未置換又は２−又は４
位でカルボキシル基によって、２−及び４位でニトロ基
によって２渦換されているか又は４位でトリメチルアン
モニウムによジ置換きれているフェニル基全表わし、Ｒ
″目未置換のフェニル基金表わし、Ｒ３′は未置換又は
２位でカルボキシル基によジ置換されたフェニル基を表
わし及びＡ′−は普通の反対陰イオンを表わす〕によシ
衣わさねる。

定義Ａ′−の普通の反対陰イオンは、一般式■のＡ−に
記載したものに相応する。

化合物は良好な水齢性の他に、所望により波長範囲５０
０〜６００　ｎｍで光吸収を行わす、測定反応を妨害し
ない。

これら化合物の！！ｉ！ｍは、下記文献に記載きれてい
る自体公知方法によｐ行わｆする：Ｒ，クーン（Ｋｕｈ
ｎ　）、Ｄ、イエルヒエル（Ｊｅｒｃｈｅｌ　）、ヘリ
ヒテ・デル・ドイチェン・ヒエミツジエン−ｒデルシャ
フト（Ｂｅｒｉｃｈｔｅ　ｄｅｒ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ
Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅｎ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　）
第７４巻、９４頁（１９４１年）；Ｄ、イエルヒエル、
Ｗ、メーレ（Ｍ６ｈ’ｌｅ　）　、ベリヒテ・デル・ド
イチェン・ヒエミツジエン・グゼルシャフト第７７巻、
６００頁（１９４４年）；Ｒ，ヴイツィンｒル（Ｗｉｚ
ｉｎ−ｇｅｒ　）、Ｖ、ビスｏ　（Ｂ１５ｒｏ　）、ヘ
ルペチカ・ヒミカ・アクタ（Ｎｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈ
ｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　）第６２巻、９０９頁（１９４
９年）。

その際、一般式■： 〔式中Ｒはエステル化されたカルボキシル基、非置換の
フェニル基又は２−又は４位でカルボキシル基によって
、２−及び４位でニトロ基によって２置換されているか
又は４位でトリメチルアンモニウムによって置換された
フェニル基金表わし及びＲ”は非置換のフェニル基を表
わす〕の文献公知のアルデヒＰフェニルヒドラゾンを一
般式ｌ； ＋ ＮａＮ−Ｒ”　　　　　　　　　　　　（１）Ａ／　− 〔式中Ｒａ′は非置換又は２位でカルボキシル基により
置換されているフェニル基を表わし及び八１は普通の反
対陰イオンを表わす〕のシアψニウム塩とアルカリ性カ
ップリンク（Ｃよって一般式■： 〔式中Ｒ及びＲｇ／は一般式■に記載４しＺｃものを表
わし及びＲ３′は一般式−に記載したものを表わす〕の
ホルマザンに変える。

その際、定義Ｈのエステル化されたカルボキシル基は有
利には低級アルキルエステルイしヶれたカルボキシル基
であり、その際低級アルキルはＣ１〜Ｃ４炭化水累基を
表わす。特に有利にはメチル−又はエチルエステルであ
る。

定義Ａ′−の普通の反対陰イオンは一般式■のＡ−で記
載したものと同じものである。

アルカリ性アゾカップリング用の塩基性反応媒体として
例えはジメチルホルムアミド及び／又はアルコール又は
アルコール性アルカリ溶液に俗解したｇ　ＩＪジン、酢
酸す）　ＩＪウム全使用することができる。

アルコールは低級脂肪族アルコール、有利にはメタノー
ル又はエタノールである。

一般式■のホルマずンを一般式ｌ′のテトラゾリウム塩
に変えることは、アルコール性塩酸中の亜硝酸インペン
チルを用いて、Ｄ、イエルヒエル、Ｈ，フィッシャー（
Ｆｉｓｃｈｅｒ　）著、ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、第５６３巻、２００頁（１９４９年）と同様にし
てか又は四酢酸鉛を用いてＲ。

クーン、Ｄ、イエルヒエル著ベリヒテ・デル・ドイチェ
ン・ヒエミツジエン・ゲデルシャフト第７４巻、９４１
貞（１９４１年）又はり、イエルヒエル、Ｈ，フィッシ
ャーＷ　Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ。

Ｃｈｅｍ、第５６６巻、２００自（１９４９年）と同様
にしてクロロホルム中で、酸化Ｖこより行われる。

その際、亜硝酸アミル法は、費用のかかるカラムクロマ
トグラフィーによる後精製を省略しうるという利点を有
する。しかしこの方法は亜硝酸塩の酸化力が備かである
ために一般的に使用することができない。

窒素系中でテトラゾリウム埠のニル結合及び陽電荷は局
在性でないので、本発明による一般式■′の化合物を製
造するために勿論同様に一般式■′： 〔式中Ｒ％Ｒに′及びＲ５′は一般式■の定義と同じも
のを表わす〕のホルマザ′ンから出発することもできる
。

一般式■′のホルマずンは前記方法と同様にして一般式
ｎ′： のアルデヒドフェニルヒドラゾン及び一般式１′：＋ ＮｇＮ−Ｒに’　　　　　　　　　（１’）のジアゾニ
ウム塩から製造することができる。

前記の基は一般式■及びＩＫ記載したものと同じものを
表わす。

実施例 次に本発明を実施例につき詳説する。

例　　１ アミン０，１モルヲ水１００１ｎｌに懸濁し、１２Ｎ塩
酸０．３モルのｆＪΣ加後亜硝酸す）　ＩＪウム１．０
４モルの濃水浴ｇを０〜５℃で部側することによってジ
アプ化する。３０分以内に冷却したジアゾニウム塩浴液
を攪拌下及び１０’Ｕ以下に冷却下にエタノール１８Ｑ
ｍｇ及びジメチルホルムアミド１００１中のアルデヒド
フェニルヒドラゾン０．１モル及び酢酸ナトリウム０．
６５七ル（又はピリジン１００ｍε）の浴液に滴加し、
１時間後攪拌する。生じた晶泥を吸引聞過し、水で良く
洗浄し、次いで少１°のメタノールで洗浄し、引続き乾
燥する。こうして得らｔするホルマずンの精製は、氷酢
酸、メタノール／水からか又はジメチルホルムアきド／
水から再結晶することによってか又は溶離剤として塩化
メチレン／メタノール５：１又は塩化メチレンを用いて
珪酸グル６０（メルク）でのカラムクロマトグラフィー
により行うことができる。この方法によ勺次のホルマず
ンが得られた。

マ　吠　　　　　τ　夜 へ　ｊ　　　　　　１ｓ１ １へ　＼　　　　　、へ＼ べ素　　　　ぺ依 −Ｌス　　二Ｘ Ｖ　＼　　　　　Ｖ　＼ ロ　　ヘ　　　　　　　　　ロ　　ヘ ヘム　　ヘΔ （＋（ト １ヘ　ス　Ｆｌへ　λ　セ タ延・・　　只祷・・ 枦Ｂ叩　　１」り ま　・・　１１　　　　也・・　ｌ 覧廣　　　覧識 占Ｗ　　　壜養 ４月　々　　　　　　　−１４１伽 屯　妃　　　　　曹　仕 ｍ　　　　　　　　＜ Ｎ Ｎつ く　　　　　　　　　へ　　　　　　　　　　　　　−
〕［−１日 ℃　　　　　　　　　ト、 Ｌ　　　　　　　　　　ｒｘ４ 媒体Ａニジメチルホルムアミド／酢酸ナトリウム Ｂニジメチルホルムアミド／ピリジン Ｃ：エタノール性アルカリ溶＠　（ＫＯＨ又はＮａＯＨ
） Ｆｌ　　２−（３−カルボキシエチル−５−フェニル−
１−ホルマザン）安息香酸 Ｆ２　２−（３，５−ジフェニル−１−ホルマザン）安
息香酸 Ｆ３　１，５−ジフェニル−３−（２，４−ジニトロフ
ェニル）ホルマザン Ｆ５　４−（１，５−ジフェニル−３−ホルマず））−
Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニオクロリド Ｆｌ６２．４’−（５−フェニル−１，３−ホルマザン
シリル）ビスー安息査酸 Ｆｌ７　２．２’−（５−フェニル−１，３−ホルマず
ンジリル）ビス−安息香酸 （１）ｌホルマザンの酸化 （Ａ）四酢酸鉛法 ホルマずン０．１モルヲ無水クロロりルムニ溶解し、四
酢酸鉛０．１２モルを加える。６０分間攪拌し、その後
不溶物を吸引濾過する。濾液を蒸発濃縮し、残渣を水の
添加後に吸引濾過し、濾液を２Ｎ＠酸で酸性にする。こ
うして沈澱した塩化鉛を吸引濾過し、濾液を濃縮し、残
渣をエタノールから再結晶するか又は溶離剤としてクロ
ロホルム／メタノール１９：１、クロロホルム／塩化メ
チレン５：１又は塩什メチレン／メタノール５：１を用
いて珪酸デル６０（メルク）でカラムクロマトグラフィ
ーにかけることによって精製する。

ホルマず２０．１モルを１０〜２０倍量のエタノールに
懸濁し、亜硝酸イソペンチル０．２モルを添加し、２０
分以内にエタノール性塩酸０．１５モルを攪拌下に部側
する。引続き１時間後攪拌する。次いで反応混合物がま
だ褪色しない場合には、完全に褪色するまで４０°Ｃに
加熱する。

テトラゾリウム塩をエーテル添加により沈澱さく４０） せ、吸引濾過し乾燥する。ｈＩ裂するために生成物をメ
タノール又はインゾロパノールと混合し、吸引濾過し、
乾燥する。再結晶はメタノール、メタノール／水又は氷
酢酸から行うことができる。有利にはテトラゾリウム塩
を精製するためニ、クロロホルム／メタノール１９：１
、クロロホルム／塩化メチレン５：１又は塩化メチレン
／メタノール−５：１を用いて珪酸ケゞル６０（メルク
）のカラムクロマトグラフィーを用いる。

２つの方法（Ａ）又は（Ｂ）により下記のテトラゾリウ
ム塩を製造した。

マ　歳　　　　ｉ　歳 へ　１　　　　　へ　１ １へＳＸ１へ＼ べ気　　　　ぺ気 ムλ　　ムλ ン＼　　　　ン＼ ご　　八　　　　　　　　　口　　八 へΔ　　へΔ ＜本　　４叡 Ｉぺ　＼−１へ　＼で ９Ｓ子・・　　似ザ・・ ｖ−Ｉ」唖　　←」り 歳・・　ｌｌ　　　　鐵・・　１１ Ｙ塚　　　■ 邂響　　　綴聾 型ｊＩＡ　　　　型底 ＜　　　　　　　− Ｅ＠Ｅ−１ 酸化方法Ａ：四酢酸鉛−クロロホルム Ｂ：亜硝酸イソペンテルーエタノニル 性塩酸 Ｔ１　５−カルボキシ−３−（２−カルボキシフェニル
）−２−フェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシ
ド、分子内塩 Ｔ２　３−（２−カルボキシフェニル）−２゜５−ジフ
ェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド、分子内
塩 Ｔ３　２．３−ジフェニル−５−（２，４−ジニトロフ
ェニル）−２−Ｈ−テトラプリウムクロリド Ｔ５’２．３−ジフェニル−５−（４−（）リメチルア
ンモニオペンチル））−２−Ｈ−テトラゾリウム−ジク
ロリド Ｔ１６３−（２−カルざキシフェニル）−５−（４−カ
ルホキジフェニル）−２−７二二ルー２−Ｈ−テトラゾ
リウムヒドロキシド、分子内塩 Ｔ１７３．５−ビス−（２−カルボキシフェニル）−２
−フェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド 例　　２ 層厚１ｃｒｎのキュペラ）Ａ、Ｂ及びＣ中に下記の浴液
をピペットで入れる： 試料　　　　　　　　　　５０μｍ　　５０μｍ　５０
μｔｏ、１Ｍ燐酸カリウム緩伽剤　　　１７５μｔ１７
５μｔ※種類及び濃度は例２（ａ）〜（ｈｌに各々＝ｔ
２戟されている。

各々のキュベツトにぎペットで入ねた俗′ｅ、を混合し
、１分間２５℃で恒温保持する。次いで下記組成の尿酸
試薬２紅を添加する； 燐酸カリウム　０．１モル／ｌ　ｓ　ｐＨａ４−アミノ
アンチピリン　０．１ミリモル／ｌナトリウムアジド　
　　　１　ｇ／ｌ ペルオキシダーゼ　　　　４Ｕ／計 ウリカーゼ　　　　　　　　２Ｕ／ｒｕ１２５℃で５分
間恒温保持後、各反応混合物の吸光を波長５４６　ｎｍ
で試薬盲検値（試料なし）に対して測定する。検定用に
測定すべき試料の代りに水性尿酸標準物質（６１ｎｇ／
ｄｔ）を用いる。

キュベツトＡ（妨害物質なし）中の測定した尿酸濃度を
１００％として使用する。妨害物質の存在における尿酸
再現率（Ｈａｒｎｓａｕｒｅ　ｗｉｅｄｅｒ−ｆｉｎｄ
ｕｎｇｓｒａｔｅ　）を次の例２　（ａｌ　〜２　（ｈ
ｌで実験的に測定する。この結果から、キュベツト系列
Ｃ（テトラゾリウム塩添加）中の再現率は添加なしくキ
ュベツト系列Ｂ）よりも著しく高いことが肛門される。

テトラゾリウム塩及び／又は電子伝達体の下記に記載し
た濃度は、この遅質及び緩衝剤の階加後の測定すべき溶
液中の最終濃度に関する。

（ａ）妨害物質：アスコルビン酸塩６ｍＱ／ｄｔＴ　３
　：　０．４ミリモル／ｌ フェナジン−エトスルフニー）　（ＰＥ５）　：２０μ
モル／ｌ Ｐ１現率（係） ヒトの血清１　　　　　　　　　６１　　　１００ヒト
の血清２　　　　　　　　６５　　　１００ヒトの血清
３　　　　　　　　６２　　　９２ヒトの血清４　　　
　　　　　　５８　　　１１０ヒトの血清５　　　　　
　　　８３　　　１０５（ｂ）妨害物質：ビリルビン Ｔ　８　：　０．４ミリモル／ｌ ｐｇｓ　：　２０μモル／ｌ 試料（ヒトの血清）中の　　　　　　　　再現率（％）
ビリルビン濃度　　　　　　　　　　　　Ｂ　　　　　
　Ｃ１００ＩｎＱ／ｌ　　　　　　　　　　　７６　　
　８９２００〜／ｌ　　　　　　　　　　　　６３　　
　　８６（ｃ）妨害物質：α−メチル−ドーパ２ｏ〜／
ｌＴ３又はＴ　５　：　０．６ミリモル／１ＰＥＳ　：
　２５μモル／を 試料：尿酸−標準物質６〜／　ｄｔ Ｐ＋埃率（％） Ｔ３　　　　　　　　　　　　６２　　　９４Ｔ　５　
　　　　　　　　　　　６２　　　９４（ｄ）妨害物質
：カルシウムードペシレート２５呼／ｌ Ｔ　３　：　０．６ミリモル／１ ＰＥＳ　：　２５μモル／を 再現率（係） （ｅ）妨害物’！：アスコルビン酸塩６１ｎＱ／ｄｔテ
トラゾリウム塩：　０．０６ミリモル／１ＰＥＳ　：　
２５μモル／を 試料：尿酸−標準物質６岬／　ｄｉ 丹埃率（係） Ｔ２　　　　　　　　　　３９　　　８８Ｔ３　　　　
　　　　　　３９　　　８２Ｔ　４　　　　　　　　　
　３９　　　８９Ｔ　５　　　　　　　　　　３９　　
　９４Ｔ　６　　　　　　　　　　３９　　　９３（ｆ
）　妨Ｗ　物質：アスコルビン酸塩３　ｎη／ｄｔＴ　
　８　　：　　０．４　　ミ　リ　モル／　ｔＰ’Ｅ８
　：　２　Ｑμモル／を 試料：ヒトの血清 ８現率（％） （ｇｌ妨害物質：アスコルビン酸塩３睨／ｄ／＝Ｔ　８
　：　０．４ミリモル／ｌ ジアホラーゼ　０．４Ｕ／ｍＡ’ 再現率（％） （ｈ）妨害物質：アスコルビン酸塩１７．６　ｍｙ／　
ｄｔＰＥＳ：　２５μモル／を 試料：尿酸標準物質　６■／ｄｔ 再現率（％） 例　　６ Ｍ　Ｊ９１１　ｃｍのキュベツトＡ％Ｂ及びＣに下記溶
准をピペットで入れる： ＢＣ 試料　　　　　　　　　　５Ｕμｌ　　ｂ１μｔ　　５
０ノ１１テトラゾリウム塩：Ｔ３ 及び簀子伝導体：　　　　　　　　　　　　　　−１７
５μｔフェナジン−エトスルフェート（ＰＥＳ）０．１
Ｍ燐酸カリウム緩衝剤　　　１７５μｔ１７５μｔ　　
−ｐＨ７，８ 各キュベツトにピペットで入れた浴液を混合し、５分間
２５°Ｃで恒温保持する。次いで下記組成のグルコース
試薬２ｍｌの添加を行う：フェノール　　　　　　　　
　１１ミリモル／１３．４−ジクロルフェノ　２．１ミ
リモル／を一ル 脂肪アルコールポリグリ　０．２４％ コールエーテル ４−アミノフェナジン　　０．８ミリモル／ｌペルオキ
シダーゼ　　　　１Ｕ／１ｎｂの吸光を波長５４６　ｎ
ｍで試薬盲検値（試料なし）に対して測定する。検定用
に測定すべき試料の代υに水性グルコース標準物質（１
００ｍ９／ｄｔ）を用いる。

キュベラ）Ａ（妨害物質なし）中の測定したグルコース
濃度を１００％として使用する。妨害物質の存在におけ
るグルコース再現率を下記実施例６（ａ）及び３（ｂ）
で実験的に測定する。この結果から、キュベツト系列Ｃ
（テトラゾリウム塩添加）の再現率が添加なしくキュベ
ツト系列Ｂ）に比して者しく高いことが証明される。

テトラゾリウムｔｍＴ３及び電子伝達体ＰＥＳの下記に
Ｂ１載した濃度はこれらの物質及び緩衝剤の添加後の測
定すべき溶液の最終濃度に関する。

妨害物質アスコルビン酸の濃度は各々緩衝剤、Ｔ６及び
ＰＥ８　施加前の試料中の濃度に関する。

（ａ）グルコース濃度：２５〜／ｄｔ 妨害物質：アスコルビン酸塩 ’Ｉ’　３　：　０．２５ミリモル／１ＰＥＳ：　２０
μモル／ｌ 再現率（％） ３１１１Ｑ／　ｄｔ　　　　　　　　　　　　　　　６
５　　　　　９４６■／　ｄｔ２７　　　　　９１ １２■／　ｄｔｒｌ　　　　　　８５ （ｂ）グルコース濃度＝５０〜／ｄｔ 妨害物質：アスコルビン酸塩　６〜／ｄｔ’Ｉ’　　３
　　：　　０．２　５　　ミ　リ　モル／　１ＰＥＳ：
　２　Ｄμモル／ｌ Ｐ十大児率　（％） 例　　４ 下記成分から核種材料を製造し、湿潤フィル層厚２００
μｍで透明シート１土に塗布し、乾燥する；酢酸ビニル
及びプローオン酸ビニルから取る共惠合体のプラスチッ
ク分散液１８ｇ；アルギン酸塩１．３８ｇ；）リス−ク
エン酸塩−緩衝剤ｐＨ７，５，０，４５ｍ、６９ｇ；指
示薬２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニ
ル）−４−（５）−（４−ジメチルアミノフェニル）−
５−（４）−メチル−（１Ｈ）−イミダｓ１”−ルーヒ
トｏりｏｌＪ　）’０．４７＃　；　１−　（３−クロ
ルフェニル）−セミカルバジド０．０２５ｉ　　；　　
ＭｇＫ２ＥＤＴＡ、２Ｈ２００−０２５１１；　　ｔ”
　　！Ｊ　　ト　：’　Ｘ１ｏｏ　　ｏ、ｓ、ｙ；ヘキ
サノール０．６．９；ペルオキシダーゼ２００ＫＵ；ウ
リカーゼ２　Ｋ　Ｕｏこうして製造した試薬層２上ｖＣ
，被榛層３を層厚２００μｍで下記組成の光学的に白色
の背景として塗布し、乾燥する：　０．１　ｍ　）リス
−クエン酸塩−緩衡剤ｐａ１７．０　５２　ｍｅ　；二
酸化チタン５．５ｇ；珪藻土２．７　、！ｉｌ　；アル
ギン酸塩０．４　Ｉｌ；酢酸ビニル及びゾロピオン酸ビ
ニルから成る共１１合体のプラスチック分散ｆｉ１．４
Ｉｌ：　トＩＪ　）ンＸ１００　　０．２９゜ ナイロン織物〔チューリツヒヤー・ボイテルテウ−７７
アプリーク（Ｆｉｒｍａ　ＺｕｒｉｃｈｅｒＢｅｕｔｅ
ｌｔｕｃｈｆａｂｒｉｋ　）社のタイプ（Ｔｙｐｅ　）
　ＮＹ７５　ＨＣ）を下記溶准で含浸し、６０℃で乾燥
する： ５−（２，４−ジニトロフェニル）−２，３−ジフェニ
ル−テトラゾリウム−クロリド（Ｔ６）５１ｎ９；フェ
ナジン−エトスルフェート５〜ニジオクチルスルホサク
シネート−ナトリウム６０■：０．５Ｆ７１燐酸塩緩衝
剤ＰＨ７，５で金蓋１００計。

比較試験用材料として同じ織物を、緩衝剤及び湿潤剤の
みを含有するがテトラゾリウム塩及びフェナジン−エト
スルフェートは含有しない相応する溶液で含浸する。

（ｃ）　ｍ合糸 前Ｈピ成分を第１図による試薬系に加工する。

この試薬は血液、血漿及び血清からの尿酸の測定に好適
である。

（ｄ）試験実施 尿酸を測定するために血清６０μを會固定網６上にのせ
、透明シート１を１分後に押しつけ、更に２分後に反射
光度計音用いて生じた色を測定し、前以って測定した検
量線から尿酸値を求める。

尿酸含量６．２■／ｄｔを有する血清試料を２つの部分
に分ける。１つの部分にアスコルビン酸を、含ｆ２ｒｎ
Ｑ／ｄｔが生じるように添加する。

２つの血清試料をテトラゾリウム塩を含有する試薬系及
び比較用に役立つテトラゾリウム塩不含の試薬系を用い
て検査する。

下記の尿酸値（ＩＩＫＩ／ｄｔ）が測定される：テトラ
ゾリウム塩含有　　　　　　６．２７　　　　　６．０
９テトラゾリウム塩不含　　　　　　６．０２　　　　
　４．６１である。図中、１・・・透明シート、２・・
・試薬層、（ｂ６） ３・・・被棲層、４・・・妨害除去懺物、５・　ガラス
線維フリース、６・・・固定網、７・・・移送フリース
、８・・・支持体シート、９・・・接着部。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、付加的に添加される１種又は数種のテトラゾリウム
   塩の存在で操作することケ特徴とする、測定反応として
   酸化還元反応を使用して基質又は酵素活性を測定する方
   法。 ２、付加的なテトラゾリウム塩として一般式 I ：▲数
   式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１は水素、カルボキシル−、アルキル−、フ
   ェニル−、ニトロフェニル−、ジニトロフェニル−、カ
   ルボキシル置換されたフェニル−又はトリアルキルアン
   モニウムフェニル基を表わし、Ｒ＾２はフェニル−、ニ
   トロフェニル−、ビフェニリル−又はナフチル基を表わ
   し、Ｒ＾３はフェニル−、カルボキシル置換されたフェ
   ニル−、カルボキシル置換されたヒドロキシフェニル−
   又はジメチルチアゾリル基を表わし及びＡ＾−は普通の
   反対イオンを表わす〕を有するようなものを使用する、
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、更に１種又は数種の電子伝達体を使用する、特許請
   求の範囲第１項及び第２項のいずれか１項に記載の方法
   。 ４、電子伝達体としてフェナジンメトスルフェート、フ
   ェナジンエトスルフェート、８−ジメチルアミノ−２，
   ３−ベンゾフェノキサジン、１−メトキシ−５−メチル
   フェナジニウム−メチルスルフェート又はジアホラーゼ
   を使用する、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、測定反応として酸化還元反応を用いて基質又は酵素
   を測定する系を含有する基質又は酵素活性の酵素的測定
   試薬において、付加的に１種又は数種のテトラゾリウム
   塩を含有することを特徴とする、基質又は酵素活性を測
   定するための試薬。 ６、付加的なテトラゾリウム塩として、一般式▲数式、
   化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１は水素、カルボキシル−、アルキル−、フ
   ェニル−、ニトロフェニル−、ジニトロフェニル−、カ
   ルボキシル置換されたフェニル−又はトリアルキルアン
   モニウムフェニル基を表わし、Ｒ＾２はフェニル−、ニ
   トロフェニル−、ビフェニリル−又はナフチル基を表わ
   し、Ｒ＾３はフェニル−、カルボキシル置換されたフェ
   ニル−、カルボキシル置換されたヒドロキシフェニル−
   又はジメチルチアゾリル基を表わし及びＡ＾−は普通の
   反対イオンを表わす〕を有するようなものを含有する、
   特許請求の範囲第５項に記載の試薬。 ７、付加的に１種又は数種の電子伝達体を含有する、特
   許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項に記
   載の試薬。 ８、不溶性支持体上に含浸して存在する、特許請求の範
   囲第５項から第７項までのいずれか１項に記載の試薬。 ９、一般式 I ′： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′） 〔式中、Ｒ＾１′はカルボキシル基、非置換又は２−又
   は４位でカルボキシル基によって、２−及び４位でニト
   ロ基によって置換されているか又は４位でトリメチルア
   ンモニウムにより置換されているフェニル基を表わし、
   Ｒ＾２′は未置換のフェニル基を表わし、Ｒ＾３′は非
   置換又は２位でカルボキシル基により置換されたフェニ
   ル基を表わし及びＡ′＾−は普通の反対陰イオンを表わ
   す〕のテトラゾリウム塩。 １０、一般式 I ′： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′） 〔式中Ｒ＾１′はカルボキシル基、非置換又は２−又は
   ４位でカルボキシル基によって、２−及び４位でニトロ
   基によって置換されてい るか又は４位でトリメチルアンモニウムにより置換され
   ているフェニル基を表わし、Ｒ＾２′は非置換のフェニ
   ル基を表わし、Ｒ＾３′は未置換又は２位でカルボキシ
   ル基により置換されたフェニル基を表わし及びＡ′＾−
   は普通の反対陰イオンを表わす〕の化合物を製造するに
   当り、 （ａ）一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中Ｒはエステル化されたカルボキシル基、未置換の
   フェニル基又は２−又は４位でカルボキシル基によって
   、２−及び４位でニトロ基によって２置換されているか
   又は４位でトリメチルアンモニウムによって置換されて
   いるフェニル基を表わし及びＲ＾２′は非置換のフェニ
   ル基を表わす〕のアルデヒドフェニルヒドラゾンを一般
   式III： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中Ｒ＾３′は非置換又は２位でカルボキシル基によ
   り置換されているフェニル基を表わし及びＡ′＾−は普
   通の反対陰イオンを表わす〕のジアゾニウム塩とアルカ
   リ性で結合させて一般式IV： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔式中Ｒ、Ｒ＾２′及びＲ＾３′は前記のものを表わす
   〕のホルマザンにするか又は （ｂ）一般式II′： ▲数式、化学式、表等があります▼（II′） 〔式中Ｒはエステル化されたカルボキシル基末置換のフ
   ェニル基又は２−又は４位でカルボキシル基によって、
   ２−及び４位でニトロ基によって２置換されているか又
   は４位でトリメチルアンモニウムにより置換されている
   フェニル基を表わし及びＲ＾３′は未置換又は２位でカ
   ルボキシル基により置換されたフェニル基を表わす〕の
   アルデヒドフェニルヒドラゾンを一般式III′： ▲数式、化学式、表等があります▼（III′） 〔式中Ｒ＾２′は未置換のフェニル基を表わし及びＡ′
   ＾−は普通の反対陰イオンを表わす〕のジアゾニウム塩
   とアルカリ性で結合させて一般式IV′： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV′） 〔式中Ｒ、Ｒ＾２′及びＲ＾３′は前記のものを表わす
   〕にしかつこれを引続き酸化する、一般式 I ′の化合
   物の製法。