JP2825754B2 - 分析物を比色定量するための方法及び薬剤、及びニトロソアニリン化合物 - Google Patents

分析物を比色定量するための方法及び薬剤、及びニトロソアニリン化合物

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、電子富有芳香族ニトロ
ソ化合物の群からの電子受容体の存在下でのピロロキノ
リンキノン（ＰＱＱ）依存性デヒドロゲナーゼを用いる
酵素的酸化、及び分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の量の尺度
としての、色の形成による、還元された電子受容体の定
量による分析物の比色定量法に関する。更に、本発明
は、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼ、電子富有芳香族ニ
トロソ化合物、更に、還元の際に電子富有芳香族ニトロ
ソ化合物から形成されるイミノ化合物のための色形成非
酸化検出試薬を包含する、酵素的酸化による分析物の比
色定量のための薬剤に関する。更に、本発明は、新規の
ニトロソ化合物、その製造、更に、分析物の比色的酵素
的定量のためのその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】分析学において、酵素的酸化は、種々の
試料材料中の物質の検出及び定量を可能にする。この場
合に、酸化酵素は、酸化反応の電子を受け取る受容体の
存在下で、適当な酵素基質に作用する。電子受容体の還
元は、酵素基質の存在を示す。この際、還元された電子
受容体を色形成(colour formation)により検出すること
ができる場合に、特に、有利であることが証明された。
それというのも、この場合、必ずしも、高価な測定装置
を用いて可能なのではなく、場合により目で見て実施す
ることもできるからである。
【０００３】酸化作用を有する酵素による物質の公知の
比色定量法は、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼを使
用する。双方の酵素群は、オキシドレダクターゼの主要
群に属し（“Rompps Chemielexikon,Francksche Verlag
buchhandlung,Stuttgart”、8th Ed.1985,Vol.4,2952
頁;“Lexikon Biochemie,Publisher H.D.Jakubke,“Ver
lag Chemie,Weinheim”,2nd Edition,1981,194頁)”、
これらの員は、その自然の電子受容体によって異なって
いてよい。
【０００４】オキシダーゼのための自然電子受容体は、
分子酸素である（“Rompps Chemielexikon,Francksche
Verlagbuchhandlung,Stuttgart”、8th Ed.1985,Vol.4,
2946頁）。分析物定量において、分析物を、オキシダー
ゼ及びＯ2により、この方法で酸化する。形成されるＨ2
Ｏ2は、ペルオキシダーゼの補助により、ロイコ染料の
酸化のために使用される。クンスト等（A.Kunst et a
l.）は、メソッズ・イン・エンジュマティック・アナリ
シス（ Methods in enzymatic analysis）、ベルグマイ
ヤー「フェアラーク・ヒェミー、バインハイム」(Publ.
H.U.Bergmeyer,“Verlag Chemie,Weinheim,"3rd Editio
n,1984,Volume 6 ,178-185頁)中で、分析物の比色定量
のためのオキシダーゼの使用における技術水準に関する
代表物であると記載している。この文献中、グルコース
は、血清、血漿中又は除タンパク質血液中で、水溶液中
でのグルコースオキシダーゼ及び大気酸素との反応によ
り検出され、この際、酸素の還元によりこの反応で形成
された過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在下で還元
され、かつ従って、反応混合物中にも存在するフェノー
ル及び４−アミノフェンアゾンに作用して、色を生じ
る。Ｈ2Ｏ2の高い酸化還元電位及びペルオキシダーゼの
非選択性及び不安定性は、しばしば、このような試験の
制限を意味する。例えば、遷移金属イオン又はヘム又は
ヘムタンパク質、例えば、血液から誘導された試料中に
簡単に生じうるものは妨害をする。それというのも、そ
れらは、過酸化水素を分解するからである。試料成分、
例えばビリルビン及び薬物、例えばメチルドーパ（これ
らは、血液から誘導された試料中に又は尿中に実際に存
在しうる）は、過酸化水素及びペルオキシダーゼでの色
形成をもたらし、かつ従って誤った結果をもたらしう
る；これらは、既に生じた染料を還元及び従って漂白す
ることもできる。
【０００５】いわゆる乾燥試験において、特に、前記し
た定量の方法を、固体担持剤上で実施する場合に、オキ
シダーゼの酸素必要量は、付加的な欠点であることも証
明された。高い濃度の酵素基質を酸化するために多くの
酸素が必要とされる場合に、大気からの酸素の、反応媒
体中への拡散は、特に、律速段階になりえ、かつこれ
は、長い反応時間を又は特に、運動論的定量法におい
て、誤った結果をもたらす。
【０００６】デヒドロゲナーゼは、一般的に、酵素基質
の酸化のために自然直接電子受容体としてニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）を
必要とするものと、非−ＮＡＤ依存性又は非−ＮＡＤＰ
依存性であり、かつ従って、酵素酸化反応において自然
直接電子受容体として他の基質を使用するものに分解す
ることができる。特に、ＰＱＱ依存性及びフラビン依存
性デヒドロゲナーゼは、非−ＮＡＤ依存性又は非−ＮＡ
ＤＰ依存性デヒドロゲナーゼの群の一部である。
【０００７】比色測定のためのＮＡＤ依存性デヒドロゲ
ナーゼの使用は、例えばドイツ国特許出願公開（ＤＥ−
Ａ）第２１４７４６６号明細書から公知である。この明
細書は、乳酸デヒドロゲナーゼが、乳酸及びニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドの、ピルビン酸塩及び還元
されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドへの変換
を触媒作用することを記載している。次いで、形成され
たＮＡＤＨを、例えば酵素ジアホラーゼの存在下で、テ
トラゾリウム塩と反応させて、ＮＡＤ及び着色されたホ
ルマザンを形成し、その濃度を、測光的に定量すること
ができる。ジアホラーゼの代わりに、Ｎ−メチルフェナ
ジニウムメトスルフェートも、ＮＡＤＨからのテトラゾ
リウム塩上への電子の移動のための還元触媒として挙げ
られている。
【０００８】この方法の欠点は、ＮＡＤＨの他に、生態
学的試料、例えば、血液、血漿、血清又は尿中に存在し
うる還元作用を有する他の物質、例えばグルタチオン又
は薬物、例えばメチルドーパ又はドベシレート(dobesyl
ate)も、テトラゾリウム塩を、非特異的還元触媒、例え
ばジアホラーゼ又はＮ−メチルフェナジウニウムメトス
ルフェートの存在下で、相当するホルマザンに変えてし
まい、かつ従って、それらは、還元触媒の不存在下で
は、迅速には、テトラゾリウム塩と反応しないにもかか
わらず、間違った−ポジティブな結果を生じるという事
実に見ることができる。
【０００９】電子富有芳香族ニトロソ化合物を用いるフ
ラビン依存性オキシダーゼ又は非−ＮＡＤ依存性デヒド
ロゲナーゼ、例えばＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼによ
る分析物の酸化的な酵素的検出は、欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第０３５４４４１号明細書から公知である。この検
出方法においては、芳香族ニトロソ化合物を酵素的に還
元して、相当する電子富有芳香族アミンにし、これを、
沈殿した、難溶解性のヘテロポリ酸を用いるヘテロポリ
ブルー形成(heteropolyblue formation)により検出する
か、又は酸化剤の存在下でカップリング試薬とカップリ
ングさせて染料を生じる。しかしながら、ヘテロポリブ
ルー形成の帯青灰色のカラーグラデーションは、実際の
視覚評価に余り適さない。通常着色されていないか又は
非常に弱く着色された芳香族アミンの、色素原(chlomog
enic)カップリング試薬を用いる比色定量の欠点は、酸
化剤が付加的に必要であることである。このような酸化
剤は、芳香族アミンへの芳香族ニトロソ化合物の酵素的
還元を妨害するので、検出反応は、２つの別々の工程で
実施しなくてはならない：第１工程で、芳香族ニトロソ
化合物を酵素的に還元して芳香族アミンにし、かつ別の
第２の工程で、酸化剤を、色素原カップリング試薬を用
いる芳香族アミンの酸化カップリングのために添加す
る。
【００１０】この方法の検出のもう一つの欠点は、１当
量の芳香族ニトロソ化合物を芳香族アミンに還元するた
めに、２当量の分析物を酸化させなくてはならないこと
である。このことは、特に、低い分析物濃度において、
このような検出方法の不満足な敏感性をもたらしうる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、従来技術の前記した欠点を除去し、かつ妨害に対し
て余り敏感ではなく、かつ改善された方法で、光学的に
評価することができる、分析物の酸化的検出のためのよ
り簡単で、より敏感な方法及び薬剤を提供することであ
った。これは、特に、１工程で実施することができ、全
可視波長領域にわたって、目で見て容易に評価すること
ができる色を生じる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この課題は、請求の範囲
に特徴付けられたような本発明により解決される。
【００１３】従って、電子富有芳香族ニトロソ化合物
を、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼの存在下で、分析物
の酸化を伴って、イミノ化合物に還元し、かつこのイミ
ノ化合物を、芳香族アミンを形成するための更なる酵素
的還元なしに、色形成により検出することを特徴とす
る、還元された電子受容体を、分析物の量の尺度として
の色形成により定量する、電子富有芳香族ニトロソ化合
物の群からの直接電子受容体の存在下での、オキシドレ
ダクターゼを用いる分析物の酵素的酸化による分析物の
比色定量法が見つけられた。
【００１４】本発明は、特に、電子富有芳香族ニトロソ
化合物を、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼの存在下で、
分析物の酸化を伴って、イミノ化合物に還元し、かつこ
のイミノ化合物を、芳香族アミンへの更なる酵素的還元
の代わりに色素原非酸化的検出反応との反応により比色
的に定量することを特徴とする、その際、還元された電
子受容体を、分析物の量の尺度としての色形成により定
量する、電子富有芳香族ニトロソ化合物の群からの直接
電子受容体の存在下での、オキシドレダクターゼを用い
る分析物の比色定量法に関する。
【００１５】更に、酵素的還元の際に着色されたイミノ
化合物を形成する電子富有芳香族ニトロソ化合物を含有
するか、又は、付加的に、電子富有ニトロソ化合物の還
元により形成されるイミノ化合物のための色素原非酸化
的検出試薬を含有することを特徴とする薬剤が、ＰＱＱ
依存性デヒドロゲナーゼ及び電子富有芳香族ニトロソ化
合物からの直接電子受容体を包含する分析物の酵素的酸
化による分析物の比色定量のために見つけられた。
【００１６】本発明によれば、「分析物(analyte)」と
は、酵素的に酸化される物質を意味する。多くの場合、
分析物は、試験すべき試料中の、直接検出又は量的に定
量しようとする物質である。例えば、グルコースを、Ｐ
ＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース染
料オキシドレダクターゼ（glucose dye oxidoreductas
e))を用いて直接酸化し、かつ比色的に定量することが
できる。しかしながら、分析物を、先ず、１つ又は幾つ
かの予めの反応により他の物質から形成して、従って、
出発物質の濃度を、分析物の比色定量から非直接的に示
すことができる。
【００１７】本発明における分析物は、使用されたＰＱ
Ｑ依存デヒドロゲナーゼのための基質とみなされる物質
である。
【００１８】ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼは、補因子
としてピロールキノリンキノンを含有する。このような
「キノタンパク質」の報告は、Ｊ．Ａ．ジョンゲヤーン
（Ｊｏｎｇｅｊａｈｎ）等により、「ＰＱＱ・アンド・
キノンプロテインズ」（“ＰＱＱ ａｎｄ Ｑｕｉｎｏ
ｎｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｋｌｕｖｅｒ Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｕｂｌ．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａ
ｎｄｓ １９８９）中に記載されている。本発明により
使用されうる酵素の例は、ＰＱＱ依存性グルコースデヒ
ドロゲナーゼ（グルコース染料オキシドレダクターゼ、
Ｅ．Ｃ．１．１．１．５０／１．１．１．９１／１．
１．１．９７）、アルコールデヒドロゲナーゼ又は乳酸
デヒドロゲナーゼである。本発明方法においては、ＰＱ
Ｑ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、特に、グルコ
ースの比色定量のために有利に使用することができる。
【００１９】オキシダーゼ及び非−ＮＡＤＨ依存性デヒ
ドロゲナーゼのための電子受容体として欧州特許（ＥＰ
−Ａ）第０３５４４４１号及び欧州特許（ＥＰ−Ａ）第
０４４１２２２号明細書から知られている電子富有芳香
族ニトロソ化合物を、酵素／補因子系 デヒドロゲナー
ゼ／ＰＱＱから電子を受け取る直接電子受容体として使
用し、その際、ニトロソ基は、電子富有芳香族核に直接
結合している。「直接」電子受容体とは、酵素触媒下
で、電子を、還元触媒の必要性なしに、酵素／補因子系
から直接受け取ることを意味する。
【００２０】本発明の意味の範囲内で、還元可能な電子
富有の芳香族ニトロソ化合物は、使用されるＰＱＱ依存
性デヒドロゲナーゼに相当する適当な基質の酸化により
形成される電子を酵素から受け取り、かつこの工程でイ
ミノ化合物を形成する化合物である。相当するイミノ化
合物は、その二重結合を介して、前記の芳香族核に結合
し、かつその二重結合電子と共役するイミノ基＝ＮＨを
含む。電子富有芳香族ニトロソ化合物は、電子放出によ
り前記芳香族核を介してイミノ基と共役することにより
イミノ化合物の形成を促進する芳香族核上又は芳香族核
内の電子供与残基又は基を１個以上含有する。
【００２１】これらは、一方では、芳香族核上の＋Ｍ効
果を発揮する置換基である；
【００２２】芳香族核に結合した＋Ｍ効果を有する残基
Ｒの例は、置換基、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ア
リールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、
モノアルキルアミノ、モノアリールアミノ、ジアルキル
アミノ及びジアリールアミノ残基である。
【００２３】ニトロソベンゼン誘導体の場合、これらの
置換基は、例えば、それらがニトロソ基に対して、オル
ト及び／又はパラ位にある場合に、その効果を特に発揮
する。
【００２４】電子供与及びイミン構造促進効果を有する
基は、ヘテロ芳香族環系の成分であってもよい。
【００２５】その例は、還元後に、外部の＋Ｍ置換基
が、メソメリー的に安定化されたイミン基の形成に必要
ではないほど、芳香族環系が電子に富んでいる、過剰の
π電子を有するヘテロ芳香族ニトロソ化合物である。過
剰のπ電子は、π電子がその上に分布していてよい環原
子より多くの芳香族π電子が存在しているという事実の
結果である。このようなヘテロ環は、当業者に公知であ
る。
【００２６】このような芳香族ヘテロ環の例は、アンチ
ピリン、ピラゾロヘテロ環及びピラゾールである。
【００２７】本発明により使用された電子富有芳香族ニ
トロソ化合物の電子の豊富さは、これらのニトロソ化合
物がある程度は、ケト−エノール互変異性によって、当
量のオキシム共鳴構造と平衡するという付加的効果を有
する。
【００２８】 Ｒ−Ａｒ−Ｎ＝Ｏ ⇔ Ｒ′＝Ａｒ′＝Ｎ−ＯＨ 本発明の範囲内では、互変異性の双方の共鳴構造を、本
発明に使用されうる物質として、「芳香族ニトロソ化合
物」なる用語で包含する。
【００２９】前記の＋Ｍ置換基の場合、アルコキシ、ア
ルキルチオ、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノ
残基は、その中のアルキルが炭素原子１〜６個を有する
炭化水素残基を表わし、それぞれが、ヒドロキシ、アミ
ノ基（これは、場合により炭素原子１〜６個を有するア
ルキルにより１回又は数回置換されていてよい）、ＰＯ
3Ｈ2、ＳＯ3Ｈ又はＣＯ2Ｈにより置換されていてよい。
酸残基 ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈ及びＣＯ2Ｈは、そのものと
して、又はアンモニウム塩、アルカリ塩又はアルカリ土
類塩のような塩の形で存在していてよい。
【００３０】アリールオキシ及びアリールチオ残基は、
炭素原子６〜１０個を有する芳香族残基を含有し、その
際、フェノキシ及びフェニルチオ残基が特に有利であ
る。
【００３１】アンモニウム塩は、アンモニウムイオンＮ
Ｈ4 +を包含するもの又はアルキル、アリール又はアラル
キル残基により１回又は数回置換されているアンモニウ
ムカチオンを包含するものである。アルキル及びアラル
キル残基中のアルキルは、炭素原子１〜６個を有する炭
化水素残基を示す。アリール及びアラルキル残基中のア
リールは、炭素原子６〜１０個を有する芳香環系であ
り、その際、フェニルが有利である。有利なアラルキル
残基は、ベンジルである。
【００３２】アルカリ塩は、有利には、リチウム、ナト
リウム又はカリウムのものである。アルカリ土類塩は、
有利には、マグネシウム又はカリウムのものである。
【００３３】前記した＋Ｍ置換基の例は、完全な記載と
して理解すべきではない。当業者は、個々の場合におい
て、与えられた残基Ｒが＋Ｍ置換基であるかどうか、及
びどの位置で、それが芳香系に対するこの効果を発揮す
るか、又はどの芳香族ヘテロ環が環系にこのような相当
する基を含有するか知っていて、かつこの観点において
は、これらの全ての残基が、本発明により使用されうる
芳香族ニトロソ化合物中の可能な置換基であるはずであ
る。
【００３４】有利に使用される芳香族ニトロソ化合物の
基本的な芳香族構造は、５〜７個、特に５〜６個の炭素
原子又はヘテロ原子の電子富有芳香環を表わし、これ
は、芳香族環及び／又は脂環式環１個又は２個と縮合さ
れていてよい。この場合、芳香族炭素系も、それぞれ５
〜７個及び有利には５〜６個の炭素原子又はヘテロ原子
を有するヘテロ芳香族系も、縮合された芳香族環とみな
される。
【００３５】脂環式環は、５〜７個の炭素原子又はヘテ
ロ原子、有利には炭素原子５〜６個を有する飽和又は不
飽和の脂環式化合物を意味する。ヘテロ原子は、窒素、
酸素又は硫黄を意味する。
【００３６】本発明に使用される有利なニトロソ化合物
は、ニトロソベンゼン誘導体である。
【００３７】ニトロソベンゼン誘導体は、１個又は数個
の芳香族及び／又は脂肪族環と縮合されているニトロソ
ベンゼンを包含することも意味する。この場合、芳香族
炭素系も、環原子５〜７個及び有利には５〜６個を有す
るヘテロ芳香族も、芳香環として認められる。この例
は、縮合されたベンゼン又はナフタレン環又は縮合され
たピリジン環である。
【００３８】一般式Ｉのニトロベンゼン誘導体：
【００３９】
【化５】
【００４０】〔式中、Ｒ1 は、水素、ヒドロキシ、アル
キル（これは、場合によりヒドロキシ、ＣＯＯＨ、ＰＯ
3 Ｈ2 又はＳＯ3 Ｈにより置換されていてよい）、アル
コキシ、アルキルチオ、アリールオキシ、アリールチ
オ、ハロゲン又はアミノ（これは、場合により、ヒドロ
キシ、ＰＯ3 Ｈ2 、ジアルキルホスフィニル、ＳＯ3 Ｈ
又はＣＯ2 Ｈにより置換されていてよいアルキルにより
１回又は数回置換されていてよい）を表し、かつＲ
2 は、ヒドロキシ基、アルコキシ、アリールオキシ、ア
リールチオ又はアルキルチオ基を表し、ここで、アルキ
ル残基は、更に、場合によりヒドロキシ基、アルコキシ
基、場合によりアルキルにより１回又は数回置換された
アミノ基、そのものとしての又はアンモニウム塩、アル
カリ塩又はアルカリ土類塩の形のＰＯ3Ｈ2 、ＳＯ3 Ｈ
又はＣＯ2 Ｈにより置換されていてよく、又はＲ2 は、
アミノ基ＮＲ3 Ｒ4 を表し、ここで、Ｒ3 及びＲ4 は、
同じか又は異なっていてよく、かつ水素、アリール又は
アルキル基（これらは、場合により、更に、ヒドロキ
シ、アルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、場合によりヒ
ドロキシにより置換されていてもよいポリアルコキシ
基、又はアルキルにより１回又は数回置換されていてよ
いアミノ基により置換されていてよい）を表すか、又は
Ｒ3 及びＲ4 は、場合により酸素、硫黄又は窒素により
中断されていてもよいアルキレン基を表し、ここで、窒
素は、アルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアル
コキシアルキル、アルコキシヒドロキシアルキル、アル
コキシカルボニルアルキル、ジオキサニルイルアルキル
又はポリアルコキシアルキル残基により置換されてい
て、かつこのそれぞれは、アルキル部分で、場合によ
り、更に、ヒドロキシ残基により置換されていてもよ
く、又はＲ1 がＮＲ3 Ｒ4 に対してオルト位にある場
合、Ｒ3 又はＲ4 は、Ｒ1 と一緒になって、アルキレン
残基を表してもよい〕のニトロソベンゼン誘導体は、特
に有利である。
【００４１】この場合、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭
素又はヨウ素を表わす。フッ素及び塩素が、特に有利で
ある。
【００４２】アルキル、アルコキシ又はアルキルチオ中
のアルキルは、炭素原子１〜６個を有する炭化水素残基
を表わし、炭素原子１〜３個を有する残基は、特に有利
である。アルキルに関する前記定義は、ヒドロキシアル
キル、ジアルキルアミノアルキル、ヒドロキシアルコキ
シアルキル、アルコキシアルキル、ポリアルコキシアル
キル、アルコキシヒドロキシアルキル及びジオキサニル
イルアルキル基中のアルキル部分にも当てはまる。ジオ
キサニルイルアルキル基は、ジオキサン環系がアルキル
基に結合している基である。１，４−ジオキサン環系、
すなわち
【００４３】
【化６】
【００４４】が有利である。
【００４５】ポリアルコキシアルキル残基は、−アルキ
ル−（アルコキシ）n−アルコキシ残基であり、ここ
で、ｎ＝１〜１０である。有利には、ｎ＝１〜４であ
る。特に有利には、ｎ＝１〜３である。アルキレン基
は、直鎖状又は分枝鎖状（有利には直鎖状）の、飽和又
は不飽和（有利には飽和）の、２つの自由な結合位置を
有するＣ原子２〜５個、及び有利には２〜４個の炭化水
素鎖である。
【００４６】アリール及びアラルキル残基中のアリール
は、炭素原子６〜１０個を有する芳香族環系であり、そ
の際、フェニルが有利である。
【００４７】アンモニウム塩は、アンモニウムイオンＮ
Ｈ4 +を包含するもの、又はアルキル、アリール又はアラ
ルキル基により１回又は数回置換されたアンモニウムカ
チオンを包含するものである。
【００４８】アルカリ塩は、リチウム、ナトリウム又は
カリウムのものである。アルカリ土類塩は、有利には、
マグネシウム又はカリウムのものである。
【００４９】有利な残基Ｒ1は、水素及びアルキル、特
に水素である。
【００５０】有利な残基Ｒ2は、アルコキシ基及びアミ
ノ基ＮＲ3Ｒ4である。
【００５１】一般式Ｉの窒素原子の取り込みにより形成
されたモルホリン又はチオモルホリン又はピペラジン残
基は、Ｒ1とＲ3が酸素、硫黄又は窒素により中断された
アルキレン基を意味する場合に有利である。ピペラジン
残基は、特に有利である。
【００５２】一般式Ｉの芳香族環の取り込みにより形成
されるインドリン又は１，２，３，４−テトラヒドロキ
ノリン残基は、Ｒ1及びＲ3から形成されたアルキレン残
基を意味する場合に有利である。
【００５３】強酸、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸
及びリン酸の塩は、本発明による式Ｉのニトロソアニリ
ン誘導体の塩として有利である。塩酸塩、すなわち塩酸
の塩は、特に有利である。
【００５４】一般式Ｉの有利なニトロソ化合物は、次の
ものである； Ｎ，Ｎ′−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−ｐ−ニト
ロソアニリン Ｎ，Ｎ′−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリン Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−ニトロソアニリン Ｎ−メチル−Ｎ′−（４−ニトロソフェニル）−ピペラ
ジン Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−５−ニトロソインドリ
ン ２，４−ジメトキシ−ニトロソベンゼン Ｎ，Ｎ′−ビス−（２−メトキシエチル）−４−ニトロ
ソアニリン Ｎ−（４−ニトロソフェニル）−モルホリン Ｎ−（２，２−ジエトキシ−エチル）Ｎ′−（４−ニト
ロソフェニル）−ピペラジン−ｐ−ニトロソフェノール ３−メトキシ−４−ニトロソフェノール。
【００５５】外部の＋Ｍ置換基がニトロソ／オキシム互
変異性のため又はイミン形成のために必要でない程、そ
の芳香環系が電子中に豊富である電子富有ヘテロ芳香族
ニトロソ化合物のうち、本発明方法に特に適当なもの
は、例えば、ウルマンス・エンサイクロペディア・オブ
・インダストリアル・ケミストリー（Ullmanns Encycop
aedia of Industrial Chemistry 5th ed.,Vol.A20,72〜
74頁）中に記載されているようなピラゾロン、ピラゾー
ル及び特にニトロソ基により置換されたピラゾール化合
物である。この場合、一般式ＩＩ：
【００５６】
【化７】
【００５７】の３−ニトロソ−ピラゾロ化合物は、特に
有利である。
【００５８】これらの化合物の多くは、相当する３−ア
ミノピラゾロ化合物の製造合成のための前駆体として、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０４３３８５４号明細書から公
知である。式ＩＩ中、Ｘ−Ｙは、ＮＲ５−ＣＯ又はＮ＝
ＣＲ６を表わし、Ｒ５は、水素、場合によりヒドロキ
シ、カルボキシ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２、ジアルキルホ
スフィニルにより置換されていてもよいアルキルを表わ
し、Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、
アルキルチオ、アリール、アリールチオ、アラルキル
（このそれぞれは、場合により、ヒドロキシ、カルボキ
シ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２、これらの酸残基のうちいず
れか一つの塩及び／又はアルコキシカルボニルにより置
換されていてもよい）を表わすか；又は場合によりアミ
ノ（これは、場合により、１個又は数個のヒドロキシ、
カルボキシ及び／又はアルコキシカルボニル残基を有し
ていてよいアルキル残基１個又は２個により置換されて
いてよい）を表わし、その際、アミノがアルキル基２個
で置換されている場合、これらの残基は、直接結合し
て、アミノ基のＮ原子とは別に、場合により酸素、硫黄
又は更なる窒素原子により中断されていてもよい環を形
成するか、又は、場合により１個又は２個のアシル基、
アルコキシ、及び／又はアラルコキシカルボニル基、Ｈ
２Ｎ−ＣＯ、アルキル、アラルキル及び／又はアリール
カルバモイル基により置換されていてよいアミノを表わ
すか；又はカルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボ
キサミド又はハロゲンを表わし、Ｒ７は、アルキル、チ
オアルキル又はアラルキル（これらは、場合によりヒド
ロキシ、カルボキシ、ＳＯ３Ｈ又はＰＯ３Ｈ２により置
換された）又はアミノ（これは、場合により、更に、ヒ
ドロキシ、カルボキシ、ＳＯ３Ｈ、ジアルキルホスフィ
ニル又はＰＯ３Ｈ２により置換されていてよいアルキル
基１個又は２個により置換された）を表わし、ここで、
Ｒ６及び／又はＲ７の少なくとも一方はアミノ基を表わ
し、かつＲ８は、アルキル又はアラルキル基（これら
は、場合によりヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ３Ｈ又は
ＰＯ３Ｈ２により置換されていてよい）を表わし、又
は、式中、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって、窒素原子又
は炭素原子、及び場合により、１個又は数個の窒素又は
硫黄原からなる３又は４員を有する飽和又は不飽和の鎖
を表わし、この際、炭素原子は、場合によりアルキル、
アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、アラルキル、
アリール、カルボキシ、カルボキサミド、アルコキシカ
ルボニル、シアノ、ハロゲン、アミノ（これは、場合に
より、１個又は数個のヒドロキシ、カルボキシ及び／又
はアルコキシカルボニル基を有しているアルキル残基１
又は２個により置換されていてよい）により置換されて
いてよく、かつこの際、二重結合を介して結合していな
い窒素原子は、アルキル、アラルキル又はジアルキルホ
スフィニル（場合によりヒドロキシ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３
Ｈ２、カルボキシ又はジアルキルホスフィニルにより置
換されている）により置換されているか、又は隣接する
２個の鎖状置換基はアルキレンを形成してもよく、これ
は、更に、場合によりアリールで置換されているか、又
は縮合されている、場合により相当する互変異性体形及
びその塩。
【００５９】この場合、「アルキル」（アルキルチオ、
ジアルキルホスフィニル、アルキルカルバモイル及びア
ラルキル基においても）は、Ｃ原子１〜６個、特に１〜
４個を有する直鎖又は分枝鎖状のアルキル基を表わす。
【００６０】この例は、メチル、エチル、プロピル、イ
ソブチル又はｔ−ブチル基である。
【００６１】アミノ基がアルキル残基２個により置換さ
れている場合、これらの残基は、全体として、窒素原子
により中断された１つの環を表わすように、直接結合し
て環を形成してもよい。この場合、これらのアミノ基
は、合計５又は６員を有する環を表わし、かつそれ自
体、酸素、硫黄又は窒素で中断されているものが有利で
ある。モルホリノ基は、特に有利である。
【００６２】「アルコキシ」（アルコキシ及びアラルコ
キシカルボニル残基においても）は、Ｃ原子１〜６個、
有利にはＣ原子１〜４個を有する直鎖又は分枝鎖状のア
ルコキシ残基を表わす。この例は、メトキシ、エトキ
シ、プロピルオキシ、イソブチルオキシ又はｔ−ブチル
オキシ基である。
【００６３】「アリール」（アリールカルバモイル基に
おいても）は、炭素芳香族又はヘテロ芳香族残基、有利
には６〜１０個の環原子を有するもの及び特に、更に、
アルキル、アルコキシ及び／又はハロゲンにより置換さ
れていてよいフェニル及びナフチル基を表わす。フェニ
ル残基は、特に有利である。
【００６４】「アラルキル」残基（アラルキルカルバモ
イル基においても）は、前記のようなアルキル基が前記
で特徴付けたようなアリール基で置換されている残基を
表わす。ベンジル基は、有利である。
【００６５】例えば、アラルコキシ−カルボニル基にお
けるような「アラルコキシ」残基は、前記したようなア
ルコキシ基が前記で特徴付けたようなアリール基で置換
されている基を表わす。ベンジルオキシ基が有利であ
る。
【００６６】「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及び
ヨウ素を表わす。フッ素及び塩素が有利である。
【００６７】アシル基は、アルキル、アラルキル又はア
リール残基を含有していてよいカルボン酸残基を表わ
す。アセチル、フェニルアセチル又はベンゾイル残基は
有利である。
【００６８】アルキレン基は、２個の自由な結合位置を
有するＣ原子３〜５個、特に３又は４個有する直鎖又は
分枝鎖、飽和又は不飽和炭化水素鎖を意味する。
【００６９】例えば、
【００７０】
【化８】
【００７１】である。
【００７２】ブタジエンジイル基（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ
＝ＣＨ−）及びテトラメチレン基（−（ＣＨ2）4−）は
有利である。
【００７３】アルケニル残基は、少なくとも１個の二重
結合を有する、Ｃ原子２〜５個の直鎖又は分枝鎖状の炭
化水素残基である。例えばビニル残基は有利である。ジ
アルキルホスフィニル基は、残基：
【００７４】
【化９】
【００７５】［式中、アルキルは、前記のものを表わ
す］を意味する。ジメチルホスフィニル残基は有利であ
る。
【００７６】ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2及びカルボキシ基の塩
として、アルカリ塩又はアルカリ土類金属塩又はアンモ
ニウム塩を使用することができる。アルカリ塩は、リチ
ウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム及びセシウム
塩を意味し、この際、リチウム、ナトリウム及びカリウ
ム塩及びとりわけ、ナトリウム及びカリウム塩が有利で
ある。アルカリ土類金属塩は、ベリリウム、マグネシウ
ム、カルシウム、ストロンチウム又はバリウムの塩であ
る。マグネシウム及びカルシウム塩が有利であり、カル
シウム塩は特に有利である。非置換のアンモニウムイオ
ンＮＨ4 +の塩を、アンモニウム塩として使用することが
できる。しかしながら、アンモニウムイオンがアルキ
ル、アリール又はアラルキル残基１〜４個により置換さ
れているようなアンモニウム塩を使用することもでき
る。前記した定義は、アルキル残基として、メチル、エ
チル及びｎ−プロピルが特に有利であり、アリール残基
としてフェニル残基が特に有利であり、かつアラルキル
残基としてベンジル基が特に有利である、これらの残基
に当てはまる。
【００７７】カルボキサミド残基は、残基ＣＯＮＨ2と
して、及びその中のアミノ基が、場合により１個又は数
個のヒドロキシ、カルボキシ及び／又はアルコキシカル
ボニル基を有しているアルキル残基１個又は２個により
置換されている残基としても理解される。
【００７８】これらの化合物は、本発明による一般式Ｉ
Ｉ［式中、Ｒ7及びＲ8が前記のように飽和又は不飽和の
鎖を形成する］のニトロソ化合物として有利に使用され
る。これに関して、この鎖が不飽和である場合、特に有
利であり、不飽和鎖の二重結合電子及び不飽和鎖の遊離
窒素電子対は、一般式ＩＩの二重結合又は架橋Ｎ原子に
共役しいて、縮合された芳香族環が形成される。
【００７９】場合により、一般式ＩＩの物質のために、
互変異性体形成も可能である。一般式ＩＩ中にこれらを
包含することも意図される。
【００８０】本発明によれば、一般式ＩＩＩ〜ＸＩＩの
ニトロソ化合物が有利である。
【００８１】
【化１０】
【００８２】及び場合により相当する互変異性体形及び
その塩。
【００８３】この場合、Ｘ−Ｙは、前記したのと同様の
ものを表わす。同じ又は異なっていてよいＲ9、Ｒ10、
Ｒ11及びＲ12は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコ
キシ、アルキルチオ、アラルキル、アリール、カルボキ
シ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、シアノ、
アミノ（これは、１個又は数個のヒドロキシ、カルボキ
シ及び／又はアルコキシカルボニル基を有しているアル
キル残基１個又は２個により置換されていてよい）を表
わすか、又はこれらは、ハロゲンを表わし、ここで、場
合により２個の隣接する基はアルキレン基を形成し、こ
れは、場合により、更に、アリールで置換されている
か、又は縮合されていて、かつＲ13はアルキル、又は場
合によりヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2
又はジアルキルホスフィニルにより置換されていてよい
アラルキルを表わす。残基の定義は、一般式ＩＩの物質
に関して記載したものに相当する。
【００８４】式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及
びＩＸの物質及び場合により相当する互変異性体形及び
その塩は、特に本発明による使用に適当である。これら
の物質は、特に、Ｘ−ＹがＮ＝ＣＲ6［式中、Ｒ6は、一
般式ＩＩに関して記載したものを表わす］を表わす場合
に特に有利である。
【００８５】化合物３−ニトロソ−２−メチル−ピラゾ
ロ−［１．５ａ］−ピリジン、３−ニトロソ−ピラゾロ
−［１．５ａ］−ピリジン及び３−ニトロソ−ピラゾロ
［３．２−ｃ］−ｓ−トリアゾール及びそれらの塩、特
に、塩酸塩は、本発明による使用のために非常に適当で
あることが分かった。
【００８６】前記したように、発明方法のために、芳香
族ニトロソ化合物を、試験すべき試料及び本ＰＱＱ依存
性デヒドロゲナーゼとの接触に作用させる。欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第０３５４４４１号明細書及び同第０４４
１２２２号明細書中には、オキシダーゼ及び非−ＮＡＤ
依存性デヒドロゲナーゼが、芳香族ニトロソ化合物を電
子富有芳香族アミノ化合物へ還元し、これを、更に、色
素原カップリング試薬及び酸化剤を用いる酸化カップリ
ングにより検出することができることが記載されてい
る。
【００８７】意外にも、キノイドイミノ化合物のための
非酸化的色形成検出試薬及びＰＱＱ依存性デヒドロゲナ
ーゼの存在下で、芳香族ニトロソ化合物が、分析物の酸
化を伴って、ＰＱＱ依存デヒドロゲナーゼ−触媒作用酵
素還元により、電子富有アミンへ完全には還元されない
が、しかし、その代わり、部分的酵素還元後に形成され
たイミノ中間体を非酸化的色形成検出試薬により獲得
し、かつ検出できることが判明した。
【００８８】更に意外にも、既に色素原残基を有してい
る一定の芳香族ニトロソ化合物を選択する場合に、これ
らの芳香族ニトロソ化合物がＰＱＱ依存性デヒドロゲナ
ーゼの存在下で還元されて、着色されたイミノ化合物に
なり、本質的に、芳香族アミンへの更なる酵素的還元が
起きないので、色形成検出試薬との反応の必要性がな
く、着色されたイミノ化合物それ自体を、分析物の量の
尺度として測定することができる。本発明により使用す
ることができる適当な色素原ニトロソ化合物の例を、次
に示す。
【００８９】電子富有芳香族ニトロソ化合物の範囲は非
常に大きいにもかかわらず、これらは、全て、ＰＱＱ依
存性デヒドロゲナーゼにより、直接電子受容体として受
け入れられる。電子富有芳香族残基に結合しているニト
ロソ基だけは、必要不可欠であるようである。
【００９０】反応は、次の反応式により、例として、ニ
トロソアニリンを用いて、推定上表わすことができる：
【００９１】
【化１１】
【００９２】芳香族ニトロソ化合物（１）を、分析物の
酸化を伴って、芳香族ヒドロキシルアミン（２）に還元
し、これを、自然に脱水してキノイドイミノ中間体を形
成する。欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０３５４４４１号及び
同第０４４１２２２号明細書から公知のように、これを
更にＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼにより芳香族アミン
に酵素的に還元する前に、例えば、カップリング試薬
（ＨＲ）によりこれを獲得し、かつ着色されたカップリ
ング生成物（４）として比色的に定量することができる
か、又はこれが既に出発化合物（５）中に、カップリン
グ生成物の色素原残基を有していて、かつ従って、酵素
的還元の後に、直接、着色されたイミノ化合物（４）と
して比色的に定量することができる。
【００９３】ＰＱＱ依存デヒドロゲナーゼを用いる場
合、特に、イミノ中間体（３）を検出試薬を用いて獲得
することができるか、又は欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０３
５４４４１号明細書から公知のような、アミンを形成す
るための更なる酵素的還元なしに、本発明により直接検
出されることは、特に意外である。欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第０３５４４４１号明細書によれば、芳香族ニトロ
ソ化合物も還元するフラビン依存性オキシダーゼを使用
する場合、少量のイミノ中間体を検出することのみが可
能であるので、多量のイミノ中間体は、非常に迅速に酵
素還元されて、分析物の酸化を伴って芳香族アミンにな
る。
【００９４】イミノ化合物の検出は、本発明により、そ
の固有色により達成されうる。
【００９５】キノイドイミノ化合物の検出は、本発明に
より、色素原非酸化的試薬を用いても達成されうる。色
素原的(Chromogenic)とは、色形成試薬とイミノ化合物
との反応により、吸収最大が、使用したニトロソ化合物
及び反応前の色形成試薬のそれとは異なる、着色された
物質が得られることを意味する。非酸化的色素原検出試
薬とは、検出すべき化合物に対する酸化作用を有する検
出試薬（例えば、検出試薬中に存在している付加的酸化
剤による）なしに、検出試薬が検出すべき化合物と反応
し、かつ色を生じることを意味する。
【００９６】本発明方法により形成されたイミノ化合物
の検出は、色形成カップリング試薬とイミノ化合物との
反応により達成されうる。この方法において、その構造
の一部としてイミノ化合物を含有する、着色された物質
が得られる。しかしながら、検出は、イミノ化合物がロ
イコ染料分子を着色された分子に酸化させることによっ
ても達成されうる。
【００９７】カップリング試薬と検出すべきイミノ化合
物の分子とのカップリングにより、着色されていないロ
イコ染料分子を形成し、これを、イミノ化合物の他の分
子により酸化して染料を形成することによる、双方の検
出法の組合せも可能である。
【００９８】イミノ化合物のためのこの種の多くの色形
成検出試薬は公知である。例えば、基本的に、酸化され
たｐ−フェニレンジアミン誘導体と反応して色を生じる
全ての物質が考えられる。
【００９９】色形成カップリング検出試薬の例は、芳香
族化合物、有利にはフェノール及びナフトール化合物で
あり、これらは、良好な離脱基を用いて置換されてい
て、従ってこれらの離脱基は、色形成を伴って、検出す
べきイミノ化合物により、簡単にかつ非常に迅速に置換
されうる。有利な例は、１−ナフトール−４−スルホン
酸、２，４，６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香
酸、２，４−ジクロロ−１−ナフトール、タトラジン
（tatrazine)又はオレンジ１である。
【０１００】イミノ化合物に連結するのではなく、むし
ろアミンへのイミノ化合物の還元の間に着色された化合
物を形成する検出試薬も、本発明方法において、イミノ
化合物の検出のために使用することができる。これは、
しばしば、ロイコ染料の二量体化を伴って生じる。適当
なロイコ染料は、Ｈ2Ｏ2又はペルオキシダーゼのための
検出法から当業者に公知である。このようなロイコ染料
の例は、特に、次のものである；１−ナフチルアミノス
ルホン酸、トリアリールイミダゾール（ドイツ国特許出
願公開（ＤＥ−ＯＳ）第２７３５６９０号明細書）、ジ
アリル−イミダゾール（米国特許（ＵＳ−Ｐ）第４９１
９８９０号明細書）、アミノカルバゾール（ドイツ国特
許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第２２０５７３３号明細書、
同第２３３８９３２号明細書）、オキサゾール、チアゾ
ール（（欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０１６７９７３号明細
書）。
【０１０１】その還元電位の結果としてイミノ化合物を
還元することができる全てのロイコ染料が適当である。
【０１０２】最後に、イミノ化合物のためのカップリン
グ成分としてイミノ化合物と共に無色のロイコ化合物を
形成する試薬を用い、生じた無色のロイコ化合物を、相
当する芳香族アミンに還元させるイミノ化合物の第２分
子により、酸化させて染料にすることによる、カップリ
ング試薬でのカップリングの検出法と、ロイコ染料の酸
化とを組み合わせることも可能である。もっとも一般的
な、いわゆる「カプラー（couplers）」（これは、カラ
ー写真においてよく知られている）は、フェノール、ナ
フトール、アニリン、ナフチルアミン、同様にその誘導
体及び活性メチレン化合物である。この種のカプラーの
報告は、Ｔ．Ｈ．ジェームス(James)により、「ザ・セ
オリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス(The
Theoryof the Photographic Process、3rd ed.,Mc Mil
lan,New York,1966,17章、385-390頁)」中に記載されて
いる。
【０１０３】本発明による方法は、試験すべき試料を、
ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼ、１個又は数個の前記し
た電子富有芳香族ニトロソ化合物及びイミノ化合物のた
めの検出試薬と同時に接触させるようにして実施され
る。試料が、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼにより酸化
される分析物を含んでいる場合、芳香族ニトロソ化合物
が酵素還元により反応して、相当するイミノ化合物を形
成する。これは、色形成検出試薬と反応し、従って、生
じる色を試料中の分析物の濃度と関係付けることができ
る。色の測定は、直接、参考色を用いて視覚法により、
又は測光的に達成することができる。
【０１０４】次いで、分析物の酸化的検出のための殊に
簡単な方法は、芳香族ニトロソ化合物の還元により形成
されるイミノ化合物がそれ自体着色されていて、かつ色
形成検出試薬を用いるカップリングにより又はロイコ染
料の酸化により予め検出しなくてもよい場合である。前
記したように、着色されたイミノ化合物は、実際に、カ
ラー写真及び検出の分析法から、当業者に公知である。
【０１０５】着色したキノイドイミノ化合物の直接測定
による、分析物の酸化的検出のための本発明のために、
式ＸＩＶの着色されたキノイドイミンに還元される式Ｘ
ＩＩＩのニトロソアニリン化合物：
【０１０６】
【化１２】
【０１０７】［一般式ＸＩＩＩ中、Ｒ1は、水素、ヒド
ロキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アリー
ルオキシ又はアリールチオール、場合によりヒドロキ
シ、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2又はＳＯ3Ｈにより置換され
たアルキル、場合によりアミノ（これは、更に、場合に
よりヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニル、
ＳＯ3Ｈ又はカルボキシにより置換されていてもよいア
ルキルにより１回又は数回置換された）を表わし、Ｘ−
Ｙは、ＮＲ5−ＣＯ又はＮ＝ＣＲ6を表わし、ここで、Ｒ
5及びＲ6は、一般式ＩＩ中と同じものを表わし、かつＡ
は、１個の窒素又は硫黄原子と２個の炭素原子、又は２
個の窒素原子と１個の炭素原子を有する３員からなる飽
和又は不飽和鎖を表わし、ここで、炭素原子は、場合に
より、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキ
シ、アラルキル、アリール、カルボキシ、カルボキサミ
ド、アルコキシカルボニル、シアノ、ハロゲン、アミノ
（これは、場合により１個又は数個のヒドロキシ、カル
ボキシ及び／又はアルコキシカルボニル残基を有してい
るアルキル基１個又は２個により置換されていてよい）
により置換されていてよく、かつここで、二重結合を介
して結合していない窒素原子は、水素、アルキル（これ
は、場合によりＳＯ3Ｈ2又はジアルキルホスフィニルに
より置換されていてよい）又はアラルキルにより置換さ
れているか、又は隣接する２個の鎖状置換基は、場合に
よりアルキレン基を形成し、これは、更に、アリールで
置換されていてよいか又は縮合されている］、場合によ
り、相当する互変異性体形及びその塩は、直接的色素原
電子受容体として、特に適当であることが証明された。
【０１０８】個々の置換基の表わすものは、この場合、
一般式ＩＩの化合物中と同様である。
【０１０９】この場合、Ｒ1の有利な基は、水素及びア
ルキルであり、かつＸ−Ｙの有利なものは基Ｎ＝ＣＲ6
である。
【０１１０】Ａが隣接するヘテロ環と一緒になって、そ
の炭素原子がＡの一般的定義中で記載した置換基を有し
ていてよいイミダゾール、トリアゾール、ベンズイミダ
ゾール、チアゾール又はジヒドロイミダゾール環を形成
することは、殊に有利である。この場合、イミダゾール
環が、特に有利である。
【０１１１】特に、有利な化合物は、次のものである： １）（２，４−ジメチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イ
ミダゾール−３−イル）−（４−ニトロソフェニル）−
アミン ２）（４−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−４−ニトロソフェニル）−アミン ３）（４−（ジメチルホスフィニルメチル）−２−メチ
ル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イ
ル）−（４−ニトロソフェニルアミン） ５）（５，６−ジヒドロ−４−ジメチルホスフィニルメ
チル−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−（４−ニトロソフェニル）−アミン ６）（４−（ジメチルホスフィニルメチル−２−メチル
−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）
−（４−ニトロソフェニル）−アミン ７）２，６−ジメチル−４−ジメチルホスフィニルメチ
ル−ピラゾロ−［３．２ｃ］−ｓ−トリアゾール−３−
イル）−（４−ニトロソフェニル）−アミン。
【０１１２】本発明方法を、芳香族ニトロソ化合物の還
元によって式ＸＶＩＩの着色されたキノンジイミン化合
物を直接形成するようにして実施する場合、試験すべき
試料を、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼ及び１種又は数
種の一般式ＸＶＩの電子富有芳香族ニトロソ化合物と同
時に接触させる。試料が、ＰＱＱ依存性デヒドロゲナー
ゼにより酸化される分析物を含有する場合、電子富有芳
香族ニトロソ化合物は、反応して、相当する着色された
キノンジイミドを形成する。色素原電子富有ピラゾール
環に縮合された環Ａ上の付加的な電子の豊富さは、形成
されたキノンジイミン化合物がもはや、相当するアミン
に酵素的に還元されないが、その代わり、着色されたキ
ノンジイミン化合物を、吸光度の測定の形で直接測定す
ることができ、かつ試料中の分析物の濃度と関係付ける
ことができるという、意想外の作用を有する。色素原芳
香族ニトロソ化合物の迅速な酵素還元を達成するために
は、これらが、十分に水溶性である場合が特に有利であ
る。式ＸＩＩＩの色素原ニトロソ芳香族を用いる場合、
溶液中のその濃度が少なくとも１０~3ｍｏｌ／ｌ及び有
利には少なくとも１０~2ｍｏｌ／ｌである場合が、本発
明方法に特に有利である。
【０１１３】良好な溶解性は、特に、色素原ニトロソ化
合物が親水基を有することにより達成することができ
る。
【０１１４】本発明方法に非常によく適する、適当な色
素原ニトロソ化合物は、例えば、前記化合物３、４及び
７である。
【０１１５】この方法は、いわゆるウェットテストで、
例えば、キュベット中で、又は適当な試薬担体上でのい
わゆるドライテストで実施されえ、この際、試験試薬
は、試験担体上及び特に吸収材料又は膨潤の能力のある
ものの上に存在している。このような試験担体は、例え
ばドイツ国特許（ＤＥ−Ａ）第３２４７６０８号明細
書、欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０２６２４４５号明細書又
は欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０２５６８０６号明細書から
公知である。
【０１１６】更に、本発明は、特許請求の範囲に記載し
たような酵素的酸化による分析物の比色定量用の薬剤に
関する。このような薬剤は、測定すべき分析物の酵素的
酸化に必要なＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼの他に、分
析物の酵素的酸化の間に放出されるＰＱＱ／デヒドロゲ
ナーゼ系からの電子を受け取る直接電子受容体としての
少なくとも１種の芳香族ニトロソ化合物の他に、更に、
イミノ化合物のための色形成非酸化検出試薬を包含す
る。
【０１１７】本発明方法のために前記された物質は、Ｐ
ＱＱデヒドロゲナーゼ、芳香族ニトロソ化合物及びキノ
イドイミノ化合物用の色素原検出試薬として使用され
る。アニリン窒素に結合した色素原残基を既に含む式Ｘ
ＩＩＩの電子富有芳香族ニトロソ化合物を、本発明方法
で使用する場合、薬剤はイミノ化合物のための色形成検
出試薬を含有していないのが有利である。それというの
も、還元の間に形成される式ＸＩＶのキノンジイミン
は、既に着色されているからである。
【０１１８】特に使用される酵素及びイミノ化合物のた
めの検出試薬に依存する、方法に適当なｐＨ値を保持す
るために、本発明による薬剤は、緩衝系を含有してい
る。薬剤は、有利には、試験溶液中のｐＨ値を４〜９の
値に調節する緩衝系を有している。僅かに酸性の５〜
６．５のｐＨ値は、特に有利である。
【０１１９】本発明による薬剤は、溶液の形で存在して
いているか、又は吸収担体又は膨潤性のあるもの上に塗
布されていてよい。溶液の形では、薬剤は、有利には、
本発明方法に必要な全ての試薬を含有している。水、及
び水溶性有機溶剤、例えば、メタノール、エタノール、
アセトン又はジメチルホルムアミドとの混合物も、溶剤
として有利に使用される。安定性の理由から、試験する
ために必要な試薬を、実際の試験まで混合しない２つ又
は幾つかの溶液に分けることが有利である。しかしなが
ら、芳香族ニトロソ化合物及びイミノ化合物のための検
出試薬が試験開始前に溶液中に存在するように注意する
ことが好都合である。使用した芳香族ニトロソ化合物の
濃度は、測定すべき分析物の濃度に依存する。
【０１２０】本発明方法で試験されるべき分析物の典型
的濃度は、１０~6〜１０~2ｍｏｌ／ｌ及び特に１０~5〜
１０~3ｍｏｌ／ｌである。従って、使用したニトロソ化
合物の典型的濃度は１０~4〜１０~1ｍｏｌ／ｌである。
１０~3ｍｏｌ／ｌより多いニトロソ化合物及び特に式Ｘ
ＩＶの色素原ニトロソ化合物の濃度は、十分に迅速な酵
素還元を達成するために、殊に有利である。使用したＰ
ＱＱ依存性デヒドロゲナーゼの濃度は、その活性及び分
析物の濃度に依存する。キュベット試験における酵素濃
度の典型的な値は、１ｍＵ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌである。
【０１２１】イミノ化合物の検出試薬は、使用するニト
ロソ化合物に対して少なくとも化学量論比で、有利には
１．５〜２倍過剰で使用される。
【０１２２】本発明による薬剤は、試験ストリップ（st
rip）の形で存在していてもよい。このような試験スト
リップは、種々異なる態様で、例えば欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第００１６３８７号明細書、ドイツ国特許（ＤＥ−
Ａ）３２４７６０８号明細書、欧州特許（ＥＰ−Ａ）第
０２６２４４５号明細書又は欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０
２５６８０６号明細書から知られている。試験ストリッ
プにおいては、定量の方法を実施するために必要とされ
る試薬が、固体担体層上に存在している。担体層として
は、特に、試験すべき試料液体により湿られさている吸
収剤及び／又は膨潤材料が考えられる。この例は、ゼラ
チン、セルロース又は合成繊維フリースである。試薬
は、これらの担体材料中又は担体材料上に固体形で存在
する。試薬液体を試験ストリップに塗布する場合、又は
試験ストリップを試薬液体中に浸漬する場合に、液体環
境がストリップ中に形成され、その中で検出反応が起き
る。反応により起きる色形成は、目で見て又は測光的
に、例えば反射測光により評価することができる。
【０１２３】試験ストリップ上の個々の試薬の有利な濃
度は、次のものである： 分析物 典型的に１０~4〜１０~1Ｍ ニトロソ化合物 １０~3〜１Ｍ 非酸化検出試薬 １０~3〜１Ｍ 酵素 試験帯域当たり０．１〜１００Ｕ。
【０１２４】本発明は、不特定の還元触媒、例えばジア
ホラーゼ又はメチルフェナジニウム−メトスルフェート
が電子受容体の還元に必要でなく、その還元が、特定の
分析物／酵素系を用いて直接達成される利点を示す。妨
害となる副反応を避けることができる。電子受容体とし
てニトロソ化合物を用いることにより、例えば電子受容
体として酸素を使用する場合のような遅すぎる拡散によ
る、電子受容体の制限はもはや起きない。検出すべきイ
ミノ中間体１当量当たり、１当量の分析物のみを酸化す
る。これは、高感度の分析物検出を生じる。更なる酸化
剤は、色形成試薬との反応に必要ない。
【０１２５】従って、全体の検出反応は、１工程で、か
つ共通の溶液中で、妨害なしに実施することもできる。
カラー写真から公知であるものを包含する、使用されう
る広い範囲の色素原検出試薬は、測定を実施することを
目的とする波長の、及び測定の敏感性を定量する吸収係
数の、自由な選択を可能にする。
【０１２６】本発明は、特に、着色されたイミノ化合物
を直接形成し、かつ色素原試薬との反応が不必要である
場合に、特に簡単に実施される。
【０１２７】更に、本発明は、式ＸＩＩＩ：
【０１２８】
【化１３】
【０１２９】［式中、Ｒ1は、水素、ヒドロキシ、ハロ
ゲン、アルコキシ又はアルキルチオ、アリールオキシ又
はアリールチオ、アルキル（これは、場合によりヒドロ
キシ、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2、アルキル、ジアルキルホ
スフィニル又はＳＯ3Ｈにより置換されていてよい）、
アミノ（これは、場合により、更に、ヒドロキシ、ＰＯ
3Ｈ2、ＳＯ3Ｈ又はカルボキシにより置換されていてよ
いアルキルにより１回又は数回置換されている）を表わ
し、かつＸ−Ｙは、ＮＲ5−ＣＯ又はＮ＝ＣＲ6を表わ
し、ここで、Ｒ5は、水素、場合によりヒドロキシ、カ
ルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニ
ルにより置換されたアルキルを表わし、かつＲ6は、水
素、場合によりヒドロキシ、ジアルキルホスフィニル、
カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、これらの酸残基のう
ちいずれか一つの塩及び／又はアルコキシカルボニルに
より置換されたアルキルを表わすか；又は場合により、
アミノ（これは、場合によりヒドロキシ、カルボキシ及
び／又はアルコキシカルボニル基を有するアルキル残基
１個又は２個により置換された）を表わし、その際、ア
ミノがアルキル残基２個により置換されている場合、こ
れらの基は、直接結合して、アミノ基のＮ原子とは別
に、場合により、酸素、硫黄又は更なる窒素原子又はア
ミノにより中断されていてもよい環を形成するか、又は
場合により１個又は２個のアシル基、アルコキシ及び／
又はアラルコキシカルボニル基、Ｈ2Ｎ−ＣＯ、アルキ
ル、アラルキル及び／又はアリールカルバモイル基によ
り置換されていてよいアミノを表わすか；又は水素、カ
ルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド又は
ハロゲンを表わし、かつＡは、１個の窒素又は硫黄原子
と２個の炭素原子、又は２個の窒素原子と１個の炭素原
子を有する３員からなる飽和又は不飽和鎖を表わし、こ
こで、炭素原子は、場合により、アルキル、アルコキ
シ、アルキルチオ、ヒドロキシ、アラルキル、アリー
ル、カルボキシ、カルボキサミド、アルコキシカルボニ
ル、シアノ、ハロゲン、アミノ（これは、場合により１
個又は数個のヒドロキシ、カルボキシ及び／又はアルコ
キシカルボニル残基を有しているアルキル残基１個又は
２個により置換されている）により置換されていてよ
く、かつここで、二重結合を介して結合していない窒素
原子は、水素、アルキル（これは、場合によりヒドロキ
シ、ＳＯ3Ｈ2、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2又はジアルキルホ
スフィニルにより置換されていてよい）又はアラルキル
により置換されているか、又は隣接する２個の鎖状置換
基は、場合によりアルキレン基を形成し、これは、更に
アリールで置換されていてよいか又は縮合されている］
の新規色素原ニトロソアニリン化合物、場合により相当
する互変異性体形及びその塩に関する。
【０１３０】個々の置換基の意味は、この場合に、一般
式ＩＩの化合物中と同様のものである。
【０１３１】有利な置換基Ｒ1は、水素及び非置換又は
置換されたアルキルである。Ｘ−Ｙは、有利には、基Ｎ
＝ＣＲ6を形成し、ここで、Ｒ6は有利には水素か又は非
置換又は置換されたアルキルを表わす。
【０１３２】Ａが隣接するヘテロ環と一緒になって、イ
ミダゾール、トリアゾール、ベンズイミダゾール、チア
ゾール又はジヒドロイミダゾール環（ここで、環置換基
は、一般式ＩＩＩのものに相当する）を形成すること
は、特に有利である。
【０１３３】Ａがイミダゾール環を形成するものは、特
に有利である。特に有利な化合物は、次のものである： １）（２，４−ジメチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イ
ミダゾール−３−イル）−（４−ニトロソフェニル）−
アミン ２）（４−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−４−ニトロソフェニル）−アミン ３）（４−（ジメチルホスフィニルメチル）−２−メチ
ル−ピペラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イ
ル）−（４−ニトロソフェニルアミン） ５）（５，６−ジヒドロ−４−ジメチルホスフィニルメ
チル−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−（４−ニトロソフェニル）−アミン ６）（４−（ジメチルホスフィニルメチル−２−メチル
−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）
−（４−ニトロソフェニル）−アミン ７）２，６−ジメチル−４−ジメチルホスフィニルメチ
ル−ピラゾロ−［３．２ｃ］−ｓ−トリアゾール−３−
イル）−（４−ニトロソフェニル）−アミン。
【０１３４】本発明による式ＸＩＩＩの化合物は、公知
の方法、例えばＪ．Ｔ．ハイス(Hays)等、Ｊ．Ｏｒｇ．
Ｃｈｅｍ．３２，１５８（１９６７）中に記載したよう
なものにより製造される。このために、エーテル及び有
利にはｐ−ニトロソフェノール誘導体のメチルエーテル
を、適当な３−アミノ−ヘテロ環と、プロトン触媒下で
反応させる。式ＸＩＩＩの第２アミンは、メトキシ基の
置換により形成される。
【０１３５】使用されたヘタリールアミンは、文献中に
記載されているか、又は公知の方法と同様にして製造す
ることができる。特に、基本的構造ブロックとしてピラ
ゾロヘテロ環を含有するアミノ化合物は、欧州特許（Ｅ
Ｐ−Ａ）第０４３３８５４号明細書中に記載されてい
る。
【０１３６】安定性の理由から、中間生成物として必要
とされるアミノ化合物は、通常、強酸、例えば、鉱酸の
塩として存在している。慣例の方法により、例えば水中
に塩を溶解し、ｐＨ８〜１０まで塩基を加え、かつ有機
溶剤、例えば酢酸エチル又は塩化メチレンを用いて遊離
塩基を抽出することにより得られるアミノ化合物の遊離
塩基は、ｐ−ニトロソアニソールとの反応のために有利
に使用される。アミノ化合物が抽出しにくい場合には、
二者選択的なものとして、特に、次の方法を使用するこ
とができる：アミノ化合物を、メタノール中に溶かし、
次いで、メタノール溶液のｐＨ値が、湿ったｐＨ紙上で
約５〜６の値に達するまで、塩基、例えばＮａＨＣＯ3
溶液、トリエチルアミン等を加える。引き続き、第２の
反応成分、ｐ−ニトロソアニソールを加える。
【０１３７】
【実施例】
例１ ＰＱＱ依存性グルコース染料オキシドレダクターゼ及び
カップリング試薬としての１−ナフトール−スルホン酸
を用いるグルコースの定量 次のものを、キュベット中で混合した： クエン酸塩緩衝液／ピロリン酸塩緩衝液 （５０ｍＭ）ｐＨ７．５ ０．３８ｍｌ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン （緩衝液中５ｍＭ） ０．４０ｍｌ カップリング試薬としての１−ナフトール−４−スルホン酸 （Ｈ2Ｏ中１０ｍＭ) ０．２０ｍｌ 試料溶液（グルコース０〜４０ｍＭ） ０．０１ｍｌ。
【０１３８】試験を、酵素溶液（グルコース染料オキシ
ドレダクターゼ、ＥＣ１．１．９９．１７、９００Ｕ／
ｍｌ、８００Ｕ／ｍｌ）０．０１ｍｌの添加により開始
し、かつ吸光度の変化を６０６ｎｍで測定した。一定の
吸光度が、最大５分後に得られた（図１）。
【０１３９】例２ ＰＱＱ依存性グルコース染料オキシドレダクターゼ及び
検出試薬としての２，４，６−ブロモ−３−ヒドロキシ
安息香酸を用いるグルコースの検出 測定混合物（最終濃度） クエン酸塩緩衝液ｐＨ５．８ １００ｍＭ ２，４，６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香酸 １０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン１ｍＭ グルコース染料オキシドレダクターゼ １０Ｕ／ｍｌ 硝酸ナトリウム ０．１Ｍ グルコース １００〜５００ｍＭ。
【０１４０】緑染料の増加する形成が、グルコース濃度
の増加と共に認められる（最大＝７００ｎｍ、図２）。
【０１４１】例３ 図１中に示されたイミンのための他のカップリング試薬
を、同じ方法で使用することができる。図１は、Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｐ−キノンジイミン
と、記載したカップリング剤とのカップリング後に得ら
れた吸収最大を示す。
【０１４２】
【表１】
【０１４３】例４ 第２表中に記載した種々の電子富有芳香族ニトロソ化合
物を、例１と同様にして使用した。第２表は、１−ナフ
トール−２−スルホン酸又は１−ナフトール−４−スル
ホン酸とのカップリング後に得られた色及び吸収最大を
示す。
【０１４４】
【表２】
【０１４５】例５ ＰＱＱ依存性グルコース染料オキシドレダクターゼ及び
グルコースオキシダーゼの間の還元的カップリングによ
るイミノ化合物の検出によるグルコース定量の比較 次のものをキュベット中に入れる： リン酸塩緩衝液ｐＨ７．５ １００ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン１ｍＭ １−ナフトール４−スルホン酸 １０ｍＭ グルコース染料オキシドレダクターゼ １００Ｕ／ｍｌ。
【０１４６】相当する量の色が、グルコースの添加（０
〜６０ｍＭ）により得られた（図３）。
【０１４７】グルコース染料オキシドレダクターゼを同
量のグルコースオキシダーゼに変える場合、生じた色の
量は８倍低い。それというのも、形成される主容量のキ
ノンジイミン中間物は、グルコースオキシダーゼにより
更に還元されて、グルコースの消費を伴なってフェニレ
ンジアミンを形成するからである（図４）。
【０１４８】例６ 着色されたイミノ化合物の還元的形成によるＰＱＱ依存
性グルコース染料オキシドレダクターゼを用いるグルコ
ースの定量
【０１４９】
【化１４】
【０１５０】（３）及び（３ａ）のスペクトルを図５中
に示す。
【０１５１】 測定混合物（最終濃度） クエン酸塩緩衝液ｐＨ６ ２００ｍＭ ｐ−ニトロソアニリン（第３表中のＮｏ．３） １ｍＭ ＣａＣｌ2 ２０Ｕ／ｍｌムタロターゼ １ｍＭ グルコース染料オキシドレダクターゼ １０Ｕ／ｍｌ。
【０１５２】吸光度における変化を、最終濃度０〜５０
μＭの間の、種々異なる量のグルコースの添加の５分後
に、測定した（図６）。
【０１５３】第３表の化合物を、同様に使用する。第３
表は、使用したニトロソ化合物の吸収最大及び形成され
た着色されたキノンジイミンの吸収最大を示す。
【０１５４】
【表３】
【０１５５】例７ 芳香族ニトロソ化合物からの着色されたイミノ化合物の
還元形成によるＰＱＱ依存性グルコース染料オキシドレ
ダクターゼの酵素活性の定量例６中に記載した反応は、
ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼの酵素活性の測定のため
にも使用することができる。
【０１５６】測定混合物（最終濃度） クエン酸塩緩衝液ｐＨ５．８ ２００ｍＭ 例６からのｐ−ニトロソアニリン（３） １ｍＭ ＣａＣｌ2 １ｍＭ グルコース ３０ｍＭ。
【０１５７】速度測定を、グルコース染料オキシドレダ
クターゼ０〜１ｍＵを用いて開始し、かつ色の変化を時
間に関して測定した(図７）。
【０１５８】例８ （４−（ジメチルホスフィニルメチル）−２−メチル−
ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−
（４−ニトロソフェニル）−アミン（３） ３−アミノ−２−メチル−４−（ジメチルホスフィニル
メチル）−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾールジヒ
ドロクロリド１３．７ｇを、メタノール３５０ｍｌ中に
溶かす。溶液を約５℃まで冷却し、かつ湿潤ｐＨ紙上に
約６のｐＨ値が示されるまで濃縮した重炭酸ナトリウム
水溶液を加える。メタノール３５ｍｌ中のｐ−ニトロソ
アニソール７．８ｇの溶液を、３０分かかって滴加す
る。混合物を室温で４時間撹拌し、かつ更なるＮａＨＣ
Ｏ3の添加によりｐＨ値を６に保つ。
【０１５９】反応混合物を濾過し、シリカゲル約１５０
ｍｌと混合し、蒸発乾固させる。シリカゲルをシリカゲ
ルカラムに充填し、かつ生成物をトルエン／メタノール
２：１での溶離により単離する。帯黒褐色の塊状物１
０．３ｇが得られ、これを、再び、塩化メチレン／メタ
ノール１２：１を用いる、シリカゲル上でのクロマトグ
ラフィーにかける。表題化合物４．９ｇが、融点２０４
℃を有して得られる（その間に分解）。
【０１６０】Ｒf（シリカゲル） トルエン／メタノー
ル ２：１＝０．３ ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール１２：１＝０．２１
【０１６１】
【化１５】
【０１６２】出発生成物の製造 ａ）４−ジメチルホスフィニルメチル−２−メチル−ピ
ラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール
（J.Het.Chem.10,441(1973)）３７ｇを乾燥メチルホル
ムアミド３７０ｍｌ中に溶かし、かつクロロメチルジメ
チルホスファンオキシド５４．２ｇ及び炭酸カリウム１
１９ｇを加える。混合物を１１５℃（浴温度）で１０時
間撹拌する。沈殿物を吸引濾過し、かつ濾液を蒸発によ
り濃縮する。残分をシリカゲル上でのクロマトグラフィ
ーにかける（移動溶剤：酢酸エチル／メタノール２：
１）。表題化合物合計３６．６ｇが褐色結晶及び褐色油
状物の混合物として得られる。
【０１６３】 ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール２：１） Ｒf＝０．２ ｂ）３−アミノ−４−ジメチルホスフィニルメチル−２
−メチルピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール×２Ｈ
Ｃｌ 前記して得られた化合物を濃塩酸２５ｍｌ及び水５０ｍ
ｌ中に溶かす。水２５ｍｌ中の亜硝酸ナトリウム６．２
ｇの溶液を０℃で滴加する。０℃で３０分後に、溶液を
重炭酸ナトリウム溶液の添加により弱アルカリ性にし、
次いで、亜ジチオン酸ナトリウム２１．４ｇを少しずつ
加える。混合物を、更に３０分かかって撹拌し、かつジ
オキサン１００ｍｌ中のジ−ｔ−ブチルジカルボネート
１７ｇの溶液を加える。反応混合物を室温で１晩かかっ
て撹拌し、ジオキサンを蒸留により除去し、かつ残分を
ｎ−ブタノール／酢酸エチル３：１を用いて数回抽出す
る。有機相の乾燥及び蒸発後に残った残分を、ＨＣlで
飽和させたメタノール３２０ｍｌ中に溶かす。更に２時
間撹拌し、氷浴中で冷却し、かつ沈殿した結晶を濾過す
る。合計１８．１ｇの表題化合物が得られる。
【０１６４】 ＴＬＣ（シリカゲル、トルエン／メタノール ３：１） Ｒf＝０．１。
【０１６５】例９ （４−ニトロソフェニル）−２−メチル−（４−スルホ
プロピル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３
−イル）−アミン（４） 例７と同様にして、３−アミノ−４−スルホプロピル−
ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾールを、メタノール
中のｐ−ニトロソアニソールと反応させる。反応混合物
を濾過し、濾液を蒸発により濃縮する。残分を、トルエ
ン／メタノール２：１を用いて、シリカゲル上でのクロ
マトグラフィーにかける。次いで、生成物を、更なる精
製のための吸着質樹脂(resin)ＨＰ２０ＳＳ（Mitsubish
i Co.）カラムに供給し、かつメタノール／水１：９〜
２：８の段階的勾配を用いて溶離する。生成物を包含す
るフラクションを集め、濃縮して、少量のエタノール中
に取り、かつ生成物をエーテルの添加により沈殿させ
る。表題生成物が褐色粉末の形で得られる。
【０１６６】ＴＣＬ（シリカゲル、エタノール：Ｒf＝
０．６、イソプロパノール／酢酸ブチル／水 ５：３：
２ Ｒf＝０．４８）。
【０１６７】
【化１６】
【０１６８】出発生成物の製造 ａ）２−メチル−４−スルホプロピル−ピラゾロ−
［１．５ａ］−イミダゾール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール
を、アニリンからジアゾ化による常法で得られるフェニ
ルジアゾニウム塩と、ｐＨ２〜５で反応させる。得られ
た２−メチル−３−フェニルアゾ−ピラゾロ−［１．５
ａ］−イミダゾール（５．６ｇ）をジメチルホルムアミ
ド６０ｍｌ中に溶かし、かつプロパンスルホン３．４ｇ
及び炭酸カリウム７ｇと混合する。混合物を１１０℃で
６時間撹拌し、プロパンスルホン５ｇ及び炭酸カリウム
７ｇを再び加え、かつこれを１１０℃で更に８時間撹拌
する。冷却後に、これを濾過し、残分をメタノールで２
回良く洗浄する。溶液を濃縮し、かつ残分をシリカゲル
上でのクロマトグラフィーにより分離する（移動溶剤：
酢酸エチル／メタノール／水 ７５：１５：１０）。
【０１６９】収量：帯黄褐色結晶５．３ｇ ＴＣＬ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール／水 ７
５：１５：１０） Ｒf＝０．３ ｂ）３−アミノ−２−メチル−４−スルホプロピル−ピ
ラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール 前記で得られたアゾ化合物４．３ｇを氷酢酸４０ｍｌ中
に溶かし、かつ亜鉛粉末４ｇを１時間かかって少しずつ
添加する。混合物を更に３０分間撹拌し、吸引濾過し、
かつ蒸発させる。残分を酢酸エチル３０ｍｌと共に粉砕
し、吸引濾過し、かつ濾液を捨てる。帯灰褐色粉末が得
られ、これは、更なる工程のために十分に純粋である。
【０１７０】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／アセト
ン／氷酢酸／水５：２：２：１） Ｒf＝０．１４ 例１０ 第４表の化合物を、例８又は９と同様にして製造した。
アミノ出発化合物の合成は、次の方法で行なう： ａ）第４表中の５のための出発化合物の製造：３−アミ
ノ−５，６−ジヒドロ−、４−ジメチルホスフィニルメ
チル−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾリン
３．９ｇ、酢酸ナトリウム２．７ｇ及びｐ−メトキシベ
ンゼンジアゾニウムテトラフルオロホウ酸塩７．４ｇを
氷酢酸４０ｍｌ中に溶かし、かつ溶液を１時間かかって
４０〜５０℃まで加熱する。反応混合物を蒸発させ、残
分をＮａＨＣＯ3溶液及び酢酸エチル中に取る。酢酸エ
チルで抽出し、乾燥させ、かつ蒸発により濃縮する。残
分をシリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製す
る（移動溶剤：酢酸エチル／リグロイン１：１〜２：
１；酢酸エチル；酢酸エチル／メタノール９５：５）。
相当する３−アゾ化合物４．１２ｇが得られ（ＴＬＣ：
シリカゲル、酢酸エチル／メタノール ９５：５；Ｒf
＝０．５）、これは、イミダゾリン環の窒素上で、クロ
ロメチルジメチルジメチルホスファンオキシドによりア
ルキル化されている。３−アミノ化合物への変換は、例
８ｂと同様に、アゾ基の還元により実施される。
【０１７１】単離及び精製のために、粗製アミノ化合物
を少量の水中に溶かし、固体重炭酸ナトリウムを加え、
かつジオキサン中の３倍モル量のジ−ｔ−ブチルジカル
ボネートの溶液を加える。混合物を１晩撹拌し、蒸発さ
せ、先ずエーテルで、副産物を除去するために抽出し、
かつ次いで、生成物を単離するために塩化メチレンで５
回抽出する。結晶のｔ−ブトキシカルボニル化合物が得
られ（ＴＬＣ：酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水 ５
０：２５：１２：５：１２：５、Ｒf＝０．５）、これ
を、ｔ−ブトキシカルボニル基を層剥離するためにメタ
ノール性塩酸５０ｍｌ中に溶かす。室温で１時間後に、
これを容量が半分になるまで濃縮し、かつ生成物をエー
テルで沈殿させる。表題化合物が塩酸塩として得られ
る。
【０１７２】 ＴＬＣ：ｎ−ブタノール／氷酢酸／水 ２：１：１ Ｒf＝０．３ ｂ）第４表中の６のための出発化合物の製造：３−アミ
ノ−４−ジメチルホスフィニルメチル−２−メチル−ピ
ラゾロ−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール 表題化合物を、例１０と同様にして、２−メチル−ピラ
ゾロ−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール（J.prakt.Ch
em.３２６、８２９（１９８４））とフェニルジアゾニ
ウム塩との反応、クロロメチル−ジメチルホスファンオ
キシドでのＮ−アルキル化及び氷酢酸中での亜鉛を用い
るアゾ基の還元により得る。表題化合物は、融点１９２
℃（分解）のトリヒドロクロリド−二水和物として得ら
れる。
【０１７３】ＴＬＣ：シリカゲル、イソプロパノール／
酢酸ブチル／水 ５０：３０：２０） Ｒf＝０．３８ ｃ）第４表中の７のための出発化合物の製造：３−アミ
ノ−２，６−ジメチル−４−ジメチルホスフィニル−ピ
ラゾロ−［３．２ｃ］−ｓ−トリアゾール ２，６−ジメチル−ピラゾロ−［３．２ｃ］−ｓ−トリ
アゾール６ｇを、ジメチルホルムアミド６５ｍｌ中に溶
かし、かつ溶液にクロロメチル−ジメチルホスファンオ
キシド３．９ｇ及び炭酸カリウム８ｇを加える。混合物
を１００℃で２時間撹拌し、熱い間に吸引濾過し、かつ
濾液を蒸発により濃縮する。残分をシリカゲル上でのク
ロマトグラフィーにかける（移動溶剤：酢酸エチル／メ
タノール４：１）。けん化及び脱炭酸のために、生成物
を濃塩酸中で、還流下に７時間加熱する。反応混合物を
蒸発させる。明かるい褐色の油状物が得られる。
【０１７４】ＴＬＣ（シリカゲル：酢酸エチル／メタノ
ール ２：１） Ｒf＝０．３７ 前記で得られた生成物の３−アミノ化合物への変換は、
相当する３−アミノピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ールに関する例８中に記載した方法（８ｂ）と同様にし
て、実施する。表題化合物が融点２２５℃（分解）の塩
酸塩として得られる。
【０１７５】 ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール３：１） Ｒf＝０．２
【０１７６】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グルコースの濃度増加に伴う吸光度の
変化を示す線図である。
【図２】図２は、グルコースの濃度増加に伴う吸光度の
変化を示す線図である。
【図３】図３は、グルコースの濃度増加に伴う吸光度の
変化を示す線図である。
【図４】図４は、グルコース染料オキシドレダクターゼ
を同量のグルコースオキシダーゼに変えた場合のグルコ
ースの濃度増加に伴う吸光度の変化（６１０ｎｍ）を示
す線図である。
【図５】図５は、ｐ−ニトロソアニリン（３）及びキノ
リンジイミン（３ａ）のスペクトルを示す線図である。
【図６】図６は、グルコースの添加（最終濃度０〜５０
μＭ）の５分後に測定した吸光度の変化を示す線図であ
る。
【図７】図７は、グルコース染料オキシドレダクターゼ
（０〜１ｍＵ）を用いた場合の色の変化を時間に関して
測定した線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フォルカー ウンクリッヒ ドイツ連邦共和国 ラーデンブルク シ ュタールビュールリング 27 (56)参考文献 特開 平７−10814（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−213051（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−174695（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−67370（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−86661（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−35358（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−220345（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/77 C09B 51/00 C09B 53/02 C12Q 1/32 G01N 21/78 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 電子富有芳香族ニトロソ化合物の群から
    の直接電子受容体の存在下でのオキシドレダクターゼを
    用いる分析物の酵素的酸化、及び分析物の量の尺度とし
    ての、色形成による、還元された電子受容体の定量によ
    る、分析物の比色定量法において、電子富有芳香族ニト
    ロソ化合物を、ピロロキノリンキノン依存性デヒドロゲ
    ナーゼの存在下で、分析物の酸化を伴って、イミノ化合
    物へ還元し、かつこれを、芳香族アミンへの更なる酵素
    的還元なしに、色形成により検出することを特徴とす
    る、分析物の比色定量法。
  2. 【請求項２】 イミノ化合物を、非酸化色素原検出試薬
    と反応させることにより比色的に定量する、請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 芳香族ニトロソ化合物として、式Ｉ： 【化１】 〔式中、Ｒ1 は、水素、ヒドロキシ、アルキル（これ
    は、非置換又はヒドロキシ、ＣＯＯＨ、ＰＯ3 Ｈ2 又は
    ＳＯ3 Ｈにより置換されていてよい）、アルコキシ、ア
    ルキルチオ、アリールオキシ、アリールチオ、ハロゲン
    又はアミノ（これは、必要に応じて、非置換又はヒドロ
    キシ、ＰＯ3 Ｈ2 、ジアルキルホスフィニル、ＳＯ3 Ｈ
    又はＣＯ2 Ｈにより置換されていてもよいアルキルによ
    り１回又は数回置換されていてよい）を表し、かつＲ2
    は、ヒドロキシ基、アルコキシ、アリールオキシ、アリ
    ールチオ又はアルキルチオ基（ここで、アルキル残基
    は、更に、ヒドロキシ基、アルコキシ基、場合によりア
    ルキルにより１回又は数回置換されていてよいアミノ
    基、そのものとしての又は塩、例えばアンモニウム塩、
    アルカリ塩又はアルカリ土類塩の形のＰＯ3 Ｈ2 、ＳＯ
    3 Ｈ、ＣＯ2 Ｈにより置換されていてよい）を表すか、
    又はＲ2 はアミノ基ＮＲ3 Ｒ4 を表し、ここで、 Ｒ3 及びＲ4 は、同じか又は異なっていてよく、かつ水
    素、アリール又はアルキル基（これらは、更に、ヒドロ
    キシ、アルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、非置換又は
    ヒドロキシにより置換されていてもよいポリアルコキシ
    基、又はアルキルにより１回又は数回置換されていてよ
    いアミノ基により置換されていてよい）を表すか、又は
    ここで、Ｒ3 及びＲ4 は、酸素、硫黄又は窒素により中
    断されていてもよいアルキレン基を表し、ここで、窒素
    は、アルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコ
    キシアルキル、アルコキシヒドロキシアルキル、アルコ
    キシカルボニルアルキル、ジオキサニルイルアルキル又
    はポリアルコキシアルキル残基により置換されていて、
    このそれぞれは、更にアルキル部分でヒドロキシ残基に
    より置換されていてもよく、又はＲ1 がＮＲ3 Ｒ4 に対
    してオルト位にある場合、Ｒ3 又はＲ4 は、Ｒ1 と一緒
    になって、アルキレン残基を表してもよい〕の化合物を
    使用する、請求項１又は２記載の方法。
  4. 【請求項４】 芳香族ニトロソ化合物として、式II： 【化２】 ［式中、Ｘ−Ｙは、ＮＲ5 −ＣＯ又はＮ＝ＣＲ6 を表わ
    し、ここでＲ5 は、水素、非置換又はヒドロキシ、カル
    ボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニル
    により置換されていてもよいアルキルを表わし、 Ｒ6 は、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ア
    ルキルチオ、アリール、アリールチオ、アラルキルを表
    わし、このそれぞれは、ヒドロキシ、ジアルキルホスフ
    ィニル、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、これらの酸
    残基のうちいずれか一つの塩及び／又はアルコキシカル
    ボニルにより置換されていてよく；又はアミノ（これ
    は、必要に応じて、１個又は数個のヒドロキシ、カルボ
    キシ及び／又はアルコキシカルボニル残基を有していて
    もよいアルキル残基１又は２個により置換されていてよ
    い）を表わし、ここで、アミノがアルキル基２個により
    置換されている場合、これらの残基は、直接結合して、
    アミノ基のＮ原子とは別に、所望に応じて酸素、硫黄又
    は更なる窒素原子により中断されていてもよい環を形成
    するか、又は１個又は２個のアシル基、アルコキシ及び
    ／又はアラルコキシカルボニル基、Ｈ2Ｎ−ＣＯ、アル
    キル、アラルキル、及び／又はアリールカルバモイル基
    により置換されていてもよいアミノを表わすか；又は水
    素、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミ
    ド又はハロゲンを表わし、かつＲ7 はアルキル、チオア
    ルキル又はアラルキル（これらは、非置換又はヒドロキ
    シ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ又はＰＯ3Ｈ2により置換され
    ていてもよい）又はアミノ（これは、非置換又は更にヒ
    ドロシキ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ジアルキルホスフィ
    ニル又はＰＯ3Ｈ2 により置換されていてもよいアルキ
    ル基１個又は２個により置換されていてもよい）を表わ
    し、ここで、Ｒ6 及び／又はＲ7 の少なくとも一方はア
    ミノ基を表わし、かつＲ8 は、アルキル又はアラルキル
    基（これらは、非置換又はヒドロキシ、カルボキシ、Ｓ
    Ｏ3Ｈ又はＰＯ3Ｈ3 により置換されていてもよい）を表
    わすか、又はＲ7 とＲ8 は、窒素原子又は炭素原子、及
    び必要に応じて、１個又は数個の窒素又は硫黄原子から
    なる３又は４員を有する飽和又は不飽和鎖を表わし、こ
    こで、炭素原子は、アルキル、アルコキシ、アルキルチ
    オ、ヒドロキシ、アラルキル、アリール、カルボキシ、
    カルボキサミド、アルコキシカルボニル、シアノ、ハロ
    ゲン、アミノ（これは、必要に応じて１個又は数個のヒ
    ドロキシ、カルボキシ及び／又はアルコキシカルボニル
    残基を有しているアルキル残基１個又は２個により置換
    されていてもよい）により置換されていてもよく、かつ
    ここで、二重結合を介して結合していない窒素原子は、
    アルキル、アラルキル又はジアルキルホスフィニルによ
    り置換されているか、または、隣接する２個の鎖状置換
    基は、必要に応じて、アルキレン基を形成してもよく、
    これは、更に、非置換またはアリールで置換されている
    か又は縮合されている］の化合物、必要に応じて相当す
    る互変異性体形及びその塩を使用する、請求項１又は２
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 非酸化色素原検出試薬は、イミノ化合物
    のためのカップリング試薬である、請求項２記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 イミノ化合物は、ロイコ染料の染料への
    酸化により検出される、請求項２記載の方法。
  7. 【請求項７】 酵素的に反応して、分析物の量の尺度と
    しての着色したキノンジイミンを形成する、一般式XII
    I： 【化３】 ［式中、Ｒ1 は水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アルコキ
    シ、アルキルチオ、アリールオキシ又はアリールチオー
    ル、非置換又はヒドロキシ、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2 又
    はＳＯ3Ｈに置換されていてもよいアルキル、アミノ
    （これは、更に、非置換又はヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ジ
    アルキルホスフィニル、ＳＯ3Ｈ又はカルボキシにより
    置換されていてもよいアルキルにより１回又は数回置換
    されていてもよい）を表わし、 Ｘ−Ｙは、ＮＲ5 −ＣＯ又はＮ＝ＣＲ6 を表わし、ここ
    でＲ5 は、水素、非置換又はヒドロキシ、カルボキシ、
    ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニルにより置
    換されていてもよいアルキルを表わす、 Ｒ6 は、水素、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ア
    ルキルチオ、アリール、アリールチオ、アラルキルを表
    わし、このそれぞれは、ヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ
    3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、これらの酸残基のうちいずれか１つの
    塩及び／又はアルコキシカルボニルにより置換されてい
    てよく；又はアミノ（これは、必要に応じて１個又は数
    個のヒドロキシ、カルボキシ及び／又はアルコキシカル
    ボニル残基を有していてよいアルキル残基１又は２個に
    より置換されていてよい）を表わし、ここで、アミノが
    アルキル残基２個により置換されている場合、これらの
    残基は、直接結合して、アミノ基のＮ原子とは別に、必
    要により酸素、硫黄又は更なる窒素原子により中断され
    ていてもよい環を形成するか、又は非置換又は１個又は
    ２個のアシル基、アルコキシ及び／又はアラルコキシカ
    ルボニル基、Ｈ2Ｎ−ＣＯ、アルキル、アラルキル、及
    び／又はアリールカルバモイル基により置換されていて
    もよいアミノを表わすか；又はカルボキシ、アルコキシ
    カルボニル、カルボキサミド又はハロゲンを表わし、か
    つＡは、１個の窒素又は硫黄原子と２個の炭素原子、又
    は２個の窒素原子と１個の炭素原子を有する３員からな
    る飽和又は不飽和鎖を表わし、ここで炭素原子は、非置
    換又はアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキ
    シ、アラルキル、アリール、カルボキシ、カルボキサミ
    ド、アルコキシカルボニル、シアノ、ハロゲン、アミノ
    （これは、必要に応じて、１個又は数個のヒドロキシ、
    カルボキシ及び／又はアルコキシカルボニル残基を有し
    ているアルキル基１個又は２個により置換されていてよ
    い）により置換されていてよく、かつここで、二重結合
    を介して結合していない窒素原子は、水素、アルキル
    （これは、ＳＯ3Ｈ2 、ＰＯ3Ｈ2、カルボキシ又はジア
    ルキルホスフィニルにより置換されていてもよい）又は
    アラルキルにより置換されているか、又は隣接する２個
    の鎖状置換基は、必要に応じて、アルキレン基を形成
    し、これは、更にアリールで置換されていてもよいか又
    は縮合されている］の芳香族ニトロソアニリン化合物、
    必要に応じて互変異性体形及びその塩を使用する、請求
    項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 ピロロキノリンキノン依存性デヒドロゲ
    ナーゼ及び電子富有芳香族ニトロソ化合物を包含する、
    分析物の酵素的酸化により分析物を比色定量するための
    薬剤において、これが、更に、イミノ化合物のための色
    形成非酸化的検出試薬を包含していることを特徴とす
    る、分析物を比色定量するための薬剤。
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