JP2566790B2

JP2566790B2 - ジフェニルアミン誘導体

Info

Publication number: JP2566790B2
Application number: JP62231842A
Authority: JP
Inventors: 和典齋藤; 啓正鈴木; 千津子照屋; 明道牧; 昇深作
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Priority date: 1987-09-16
Filing date: 1987-09-16
Publication date: 1996-12-25
Anticipated expiration: 2011-12-25
Also published as: JPS6475470A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は過酸化水素の定量法に使用する新規なジフエ
ニルアミン誘導体に関する。

〔従来の技術およびその問題点〕

近年、臨床検査において過酸化水素の定量が重要とな
つてきた。すなわち、生体内の微量成分、例えば尿或は
血液中のコレステロール、中性脂肪、グルコース、リン
脂質、遊離脂肪酸、尿酸、無機リン、ピルビン酸、Ｌ−
乳酸等、或はコリンエステラーゼ、α−アミラーゼ、モ
ノアミンオキシダーゼ、トランスアミナーゼ等の酵素活
性を定量する際に、最終ステツプで、被分析物に適当な
オキシダーゼを作用させ、目的の被分析物に相当する過
酸化水素を生成させ、この過酸化水素をパーオキシダー
ゼの存在下過酸化水素分析用試薬にて発色させ、その色
素を比色定量して被分析物量を求めるという方法が行わ
れている。

従来、斯かる過酸化水素を定量する際の分析用試薬と
しては、一般に４−アミノアンチピリン（4AA）とフエ
ノール、アニリン、トルイジン、アニシジンまたはそれ
らの誘導体を組合せたものが使用されていた。しかしな
がら、これらの組み合わせによる酸化縮合生成物は、そ
の極大吸収波長（λmax）が500nm付近と短かいため、ヘ
モグロビン、ビリルビン等の共存する有色物質の影響を
受けやすく、また濁りの影響も大きい。更に、感度が低
いため、微量成分の分析に問題があつた。

また、フエノチアジン誘導体またはジフエニルアミン
誘導体を用いる方法も提案されている（特公昭60−3347
9号）が、ロイコメチレンブルー誘導体等のフエノチア
ジン誘導体の場合には、ロイコ色素誘導体が溶液状態で
不安定であると共に、発色後の色素が測定セルに吸着す
るという欠点があり、また従来のジフエニルアミン系ロ
イコ色素誘導体は測定条件である中性付近で水に溶け難
いという欠点があつた。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行つた結
果、後記一般式（Ｉ）で表わされるジフエニルアミン誘
導体が上記欠点を克服して優れた特性を有することを見
出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）［式中、Ｘは−（CH₂）_３−を示し、R₁、R₂及びR₃は単
独でシアノ基またはカルボキシル基が置換することのあ
る低級アルキル基を、R₆、R₇及びR₈は単独で水素原子を
示すか、またはR₁とR₆、R₂とR₇、R₃とR₈が一緒になって
−（CH₂）_３−を示してもよい。R₄及びR₅は、水素原子
または低級アルキル基を示し、Ｒは基−CONH−Ph（Phは
フェニル基を示す）、基−CSNH−R₉（R₉は水素原子、ス
ルホン基が置換することのある低級アルキル基、メチル
カルボニル基またはフェニルカルボニル基を示す）また
は基−CO−Ph−R₁₀（R₁₀はアミノ基またはアルキルアミ
ノ基を示す）を示す］で表わされるジフエニルアミン誘導体またはその塩を提
供するものである。

本発明のジフェニルアミン誘導体（Ｉ）またはその塩
は、これと過酸化水素を、パーオダーゼまたはパーオキ
シダーゼ様物質の存在下にて反応させ、生成する色素を
比色定量することで過酸化水素を定量することができ
る。

本発明のジフエニルアミン誘導体（Ｉ）において、
（Ｉ）式中、R₁〜R₃またはR₉の何れか１個以上が−（CH
₂）_ｎ−COOH、−（CH₂）_ｎ−SO₃H〔ｎは１〜４の整数を
示す〕またはその塩で表わされる基の化合物は水溶性が
よく特に好ましい。

本発明のジフエニルアミン誘導体（Ｉ）は、例えば次
の反応式に従つて製造される。

（式中、R₁〜R₈及びＲは前記と同じ意味を有する）すなわち、工程１において、アニリン誘導体とフエニ
レンジアミン誘導体を原料とし、酸性溶媒中重クロム酸
ナトリウム、フエリシアン化ナトリウム等の酸化剤の存
在下、通常氷冷〜室温で酸化反応させ、酸化縮合体（I
I）を得る。この酸化縮合体（II）を単離することな
く、工程２において、ハイドロサルフアイト等の還元剤
により、通常室温で脱色されるまで還元し、ロイコ色素
（III）を得る。ロイコ色素（III）を単離精製しまたは
単離することなく、工程３において、塩化メチレン等の
有機溶媒中、イソシアン酸エステル、イソチオシアン酸
エステルまたはアシル化剤を加えて室温で反応させ、常
法により単離精製し、目的とするジフエニルアミン誘導
体（Ｉ）を得る。

ジフエニルアミン誘導体（Ｉ）を用いた過酸化水素の
定量に使用されるパーオキシダーゼ様物質としては、パ
ーオキシダーゼと同様の能力を有するものであれば特に
限定されず、例えばチトクロムＣ、ヘモグロビン、ミク
ロパーオキシダーゼ等が挙げられる。

過酸化水素の定量方法を実施するには、５〜50℃の一
定温度に保持したpH2〜11の緩衝液中に検体及びパーオ
キシダーゼもしくはパーオキシダーゼ様物質を加えて反
応を行い、この反応液中に生成した色素の量を光学的手
段で測定することにより行われる。

過酸化水素の定量方法に使用するジフエニルアミン誘
導体（Ｉ）は生成する過酸化水素と等モル以上、特に20
〜200μmol/が、また、パーオキシダーゼもしくはパ
ーオキシダーゼ様物質は0.1〜1000単位/ml、特に0.1〜1
00単位/mlが好ましい。

緩衝液としては、前記pH範囲を保持できれば特に制限
されないが、例えば酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸
緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、グツドの緩衝
液等が用いられる。

検体中の過酸化水素量を求めるに当たつては、まず、
生成した色素に適した波長で吸光度変化量を測定する
か、または一定時間後に酸、アルカリまたは界面活性剤
を加えて反応を停止させて同様の波長で吸光度を測定す
る。次いで測定された吸光度から盲検の吸光度を差し引
いて得られた吸光度、または吸光度変化量を、あらかじ
め求めておいた標準液の吸光度または吸光度変化量と比
較することにより、検体中の過酸化水素量が求められ
る。

〔作用〕

本発明のジフエニルアミン誘導体（Ｉ）は、過酸化水
素、パーオキシダーゼとの反応により、次のような色素
（II）を生成するものと考えられる。

この色素（II）は、Ｘ基の導入により縮合環を形成す
ることで公知のこの種の色素に比べ極大吸収波長（λma
x）を長波長側にし、更には発色の感度を高めている。
従つて、ＸのほかR₁とR₆、R₂とR₇、R₃とR₈が全て縮合環
を形成している色素が最も長波長のλmaxを有する。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに
限定されるものではない。

実施例１化合物（４）（第１表に示す。以下同様）の
合成：ユロリジン500mgと９−アミノユロリジン600mgを1NHC
l12mlに溶解し、Na₂Cr₂O₇−K₃〔Fe（CN）_６〕/H₂O3.45g
−3.35g/100mlの試薬（以下酸化用試薬と略記）25mlを
少しずつ加えて０℃で反応させた。反応液が緑色になつ
た時点でハイドロサルフアイトをこの緑色が消えるまで
加えた。50mlのクロロホルムで抽出し、無吸硫酸マグネ
シウムで乾燥後、過した。この液にフエニルイソシ
アネート2.5mlを加えて室温で一晩撹拌した。反応混合
物にメタノールを加え、室温にて３時間撹拌して過剰の
イソシアネートを分解した。反応混合物をシリカゲルカ
ラムに流し、酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて溶出を行つ
た。得られた溶出液を濃縮乾固して化合物（４）716mg
を白色〜淡黄色結晶性粉末として得た。

実施例２化合物（３）の合成：１−ベンジルオキシカルボニルエチル−1,2,3,4−テ
トラヒドロキノリン470mgと６−アミノ−１−ベンジル
オキシカルボニルエチル−1,2,3,4−テトラヒドロキノ
リン530mgを1NHCl6mlに溶解し、酸化用試薬12mlを加え
て０℃で反応させる。次に、反応液が緑色になつた時点
でこの緑色が消えるまでハイドロサルフアイトを加え
た。30mlのクロロホルムで抽出し、無吸硫酸マグネシウ
ムで乾燥後過した。この液にフエニルイソシアネー
ト1.2mlを加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物にメ
タノールを加え、室温にて３時間撹拌して過剰のイソシ
アネートを分解した。反応混合物をシリカゲルカラムに
流し、酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて溶出を行つた。得
られた溶出液を濃縮乾固して化合物（３）のジベンジル
エステル体の淡褐色アモルフアス382mgを得た。これを
アセトン10mlに溶解し、10％Pd−C40mgを加えてH₂（10a
tm）で加圧接触還元を一晩行つた。反応終了後過し、
液を濃縮乾固して化合物（３）220mgを白色〜淡黄色
アモルフアスとして得た。

実施例３化合物（２）の合成：ユロリジンの代わりに１−シアノエチル−1,2,3,4−
テトラヒドロキノリンを、９−アミノユロリジンの代わ
りに６−アミノ−１−シアノエチル−1,2,3,4−テトラ
ヒドロキノリンを用いる以外は実施例１と同様に行つて
化合物２を結晶性粉末で得た。

実施例４化合物（８）の合成：フエニルイソシアネートの代わりにチオシアン酸アン
モニウム及びベンゾイルクロライドのアセトン溶液を用
いる以外は実施例１と同様に反応、精製して化合物
（８）を得た。

実施例５化合物（10）の合成：フエニルイソシアネートの代わりにチオシアン酸アン
モニウム及びアセチルクロライドのアセトン溶液を用い
る以外は実施例１と同様に反応、精製して化合物（10）
を得た。

実施例６化合物（６）の合成：フエニルイソシアネートの代わりにチオシアン酸アン
モニウム及びベンゾイルクロライドのアセトン溶液を用
いる以外は実施例３と同様に反応、精製して化合物
（６）を得た。

実施例７化合物（９）の合成：フエニルイソシアネートの代わりにチオシアン酸アン
モニウム及びアセチルクロライドのアセトン溶液を用い
る以外は実施例３と同様に反応、精製して化合物（９）
を得た。

実施例８化合物（７）の合成：フエニルイシソアナートの代わりにチオシアン酸アン
モニウム及びベンゾイルクロライドのアセトン溶液を用
いる以外は実施例２と同様に反応、精製して化合物
（７）を得た。

実施例９化合物（11）の合成：化合物（８）522mgを濃塩酸0.3mlに溶解し、10分間還
流した。中和後、クロロホルムで抽出し、無吸硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、ろ過、濃縮後、シリカゲルカラムク
ロマトグラフイーにて酢酸エチル−ｎ−ヘキサンで溶出
する。得られた溶出液を濃縮乾固して化合物（11）をア
モルフアスとして得た。

実施例10 化合物（15）の合成：フエニルイソシアネートの代わりにｐ−ニトロベンゾ
イルクロライドを用いる以外は実施例１と同様に反応、
精製して得た化合物を10％HCl−EtOH溶液に溶解し、10
％Pd−Ｃを加えてH₂（10atm）で加圧接触還元を一晩行
つた。反応終了後ろ過し、ろ液をシリカゲルカラムクロ
マトグラフイーにて酢酸エチル−ｎ−ヘキサンで溶出し
た。得られた溶出液を濃縮乾固して化合物（15）を得
た。

実施例11 化合物（13），（14）の合成：ユロリジンの代わりに１−シアノエチル−1,2,3,4−
テトラヒドロキノリンを、９−アミノユロリジンの代わ
りに６−アミノ−１−シアノエチル−1,2,3,4−テトラ
ヒドロキノリンを用いる以外は実施例10と同様に反応、
精製して得られた化合物をエタノールに溶解し、10％Pd
−Ｃ及び37％CH₂Oを加えてH₂（10atm）で加圧接触還元
を行い、化合物（13），（14）を得た。

実施例12 化合物（１）の合成：１−ベンジルオキシカルボニルエチル−1,2,3,4−テ
トラヒドロキノリンの代わりにN,N−ジメチルアニリン
を用いる以外は実施例２と同様に行つて化合物（１）を
結晶性粉末で得た。

実施例13 化合物（５）の合成：１−ベンジルオキシカルボニルエチル−1,2,3,4−テ
トラヒドロキノリンの代わりにN,N−ジメチル−ｍ−ト
ルイジンを用いる以外は実施例２と同様に行つて化合物
（５）を結晶性粉末で得た。

実施例14 化合物（12）の合成：化合物（11）250mgとプロパントルトン75mgをピリジ
ン0.5mlに溶解し２時間還流した。反応溶液を濃縮しク
ロロホルムに溶解し炭酸ナトリウム水溶液で洗い無吸硫
酸マグネシウムで乾燥しろ過、濃縮後シリカゲルカラム
クロマトグラフイーにてクロロホルム−メタノールで溶
出した。得られた溶出液を濃縮乾固して化合物（12）を
結晶性粉末として得た。

過酸化水素分析用試薬として用いられる本発明のジフ
エニルアミン誘導体（Ｉ）の具体例を第１表に示す。

これらの化合物についてのスペクトルデータを以下に
示す。

MSm/z（％）:478（15.5）〔Ｍ〕⁺,359（100）〔Ｍ−PhN
HCO＋１〕^＋ MSm/z（％）:549（2.15）〔Ｍ＋１〕⁺,385（92.79）
〔Ｍ−CSNHCOPh＋１〕⁺,345（100）〔Ｍ−CSNHCOPh−CH
CN〕 MSm/z（％）:587（67.34）〔Ｍ＋１〕⁺,306（100）〔Ｍ
−CSNHCOPh−CHCOOH−CHCOOH〕^＋ MSm/z（％）:523（85.68）〔Ｍ＋１〕⁺,358（91.17）
〔Ｍ−CSNHCOPh〕^＋（９）¹H−NMR:2.6（3H,s,−CH₃） MSm/z（％）:487（87.90）〔Ｍ＋１〕⁺,306（91.81）
〔Ｍ−CSNHCOCH₃−CHCN−CHCN〕^＋（10）¹H−NMR:2.65（3H,s,−CH₃） MSm/z（％）:461（92.51）〔Ｍ＋１〕⁺,359（80.1）
〔Ｍ−CSNHCOCH₃＋１〕^＋（11）¹H−NMR:5.75（2H,br,−NH₂） MSm/z（％）:418（2.27）〔Ｍ〕⁺,384（100）〔Ｍ−S
H₂〕⁺,359（12.54）〔Ｍ−CSNH₂＋１〕^＋（12）¹H−NMR:6.65（4H,s,Ar−Ｈ）（13）¹H−NMR:3.80（3H,s,−CH₃） MSm/z（％）:518（100）〔Ｍ〕^＋（14）¹H−NMR:3.80（6H,s,−CH₃） MSm/z（％）:532（100）〔Ｍ〕⁺,518（48.24）〔Ｍ−CH
₂〕^＋ MSm/z（％）:478（52.49）〔Ｍ〕⁺,358（100）〔Ｍ−CO
PhNH₂〕^＋試験例１第１表に示すジフエニルアミン誘導体について、以下
の操作により極大級数波長λmax、感度、呈色の安定性
及び試薬ブランクの着色を調べ、結果を第２表に示す。

0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に第１表の化合物を40μm
ol/、パーオキシダーゼを１単位/ml、リポノツクスNC
K（ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル、ライ
オン社製）を0.2重量％となるように溶解した。この溶
液2mlにH₂O₂試料20μを加えて反応させ、反応液のλm
axにおける反応直後（約１分後）の吸光度A₀と37℃60分
後の吸光度A₆₀を測定した。感度は過酸化水素分析用試
薬として4AA（４−アミノ−アンチピリン）−DAOS〔3,5
−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）アニリンナトリウム〕を用いた時の
吸光度を100とした相対値で示した。呈色の安定性は反
応直後と37℃60分後の吸光度変化量比が±５％程度のものを（±）、±10％程度のものを
（＋）、±20％程度のものを（）、それ以上のものを
（）として示した。試薬ブランクの着色は0.1Mリン酸
緩衝液（pH7.0）に第１表の化合物を40μmol/、リポ
ノツクスNCKを0.2％となるよう溶解した液を用いて試薬
ブランクの着色を同液の吸光度変化で比較した。LBG
（ビンドシエドラーズ・グリーン・ロイコベース）を対
照とし、これを「Ｃ」、LBGより安定なものを「Ｂ」、L
BGよりかなり安定なものを「Ａ」とした。

試験例２過酸化水素の定量： 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に化合物２を40μmol/
、パーオキシダーゼを１単位/ml、リポノツクスNCKを
0.1重量％の濃度になるように溶解し、試薬とした。試
料20μに試薬2mlを加えて37℃で５分間加温後、試薬
ブランクを対照に波長750nmにおける吸光度を測定し
た。測定値より検量線を作成し、第１図に示す。

試験例３グリコールの定量： 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に化合物９を40μmol/
、パーオキシダーゼを１単位/ml、グルコースオキシ
ダーゼを30単位/ml、リポノツクスNCKを0.1重量％の濃
度になるように溶解し、試薬とした。試料20μに試薬
2mlを加えて37℃で15分間加温後、試薬ブランクを対照
に波長750nmにおける吸光度を測定した。測定値より検
量線を作成し、第２図に示す。

試験例４コレステロールの定量： 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に化合物４を40μmol/
、パーオキシダーゼを１単位/ml、コレステロールオ
キシダーゼを0.5単位/ml、リポノツクスNCKを0.1重量％
の濃度になるように溶解し、試薬とした。試料20μに
試薬2mlを加えて37℃で10分間加温後、試薬ブランクを
対照に波長755nmにおける吸光度を測定した。測定値よ
り検量線を作成し、第３図に示す。

試験例５尿酸の定量： 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に化合物10を40μmol/
、パーオキシダーゼを１単位/ml、ウリカーゼを0.04
単位/ml、リポノツクスNCKを0.1重量％の濃度になるよ
うに溶解し、試薬とした。試料20μに試薬2mlを加え
て37℃で10分間加温後、試薬ブランクを対照に波長755n
mにおける吸光度を測定した。測定値より検量線を作成
し、第４図に示す。

試験例６中性脂肪の定量： 0.1Mグツド緩衝液（pH6.5）に化合物１を40μmol/
、パーオキシダーゼを１単位/ml、グリセロールキナ
ーゼを0.5単位/ml、グリセロリン酸オキシダーゼを３単
位/ml、ATP・２ナトリウムを1mmol/、塩化マグネシウ
ムを2mmol/、リポノツクスNCKを0.1重量％の濃度にな
るように溶解し、試薬とした。試料20μに試薬2mlを
加えて37℃で10分間加温度、試薬ブランクを対照に波長
735nmにおける吸光度を測定した（但し試料はグリセロ
ールを用い、後にトリオレインに換算した）。測定値よ
り検量線を作成し、第５図に示す。

試験例７遊離脂肪酸の定量： 0.2Mグツド緩衝液（pH6.5）に化合物３を40μmol/
、パーオキシダーゼを１単位/ml、アシルCoAシンセタ
ーゼを１単位/ml、アシルCoAオキシダーゼを５単位/m
l、CoエンザイムＡを10μmol/、ATPを1mmol/、リポ
ノツクスNCKを0.1重量％の濃度になるように溶解し、試
薬とした。試料20μに試薬2.5mlを加えて37℃で10分
間加温後、試薬ブランクを対照に波長750nmにおける吸
光度を測定した。測定値より検量線を作成し、第６図に
示す。

試験例８モノアミンオキシダーゼの測定： 50mM β−グリセロリン酸緩衝液（pH6.8）に化合物
３を40μmol/、パーオキシダーゼを１単位/ml、アリ
ルアミン塩酸塩を10mmol/になるように溶解し、試薬
とした。試料20μに試薬2mlを加えて37℃で20分間加
温後、試薬ブランクを対照に波長750nmにおける吸光度
を測定した。測定値より検量線を作成し、第７図に示
す。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明のジフエニルアミン誘導体
（Ｉ）は、過酸化水素分析用試薬として要求されていた
各種条件、すなわち試薬自身が溶液状態で安定であるこ
と、呈色の感度が高いこと、呈色が安定であること、測
定セル等への吸着がないこと、中性付近での水溶性が良
好であること、ヘモグロビン、ビリルビンまたは濁りの
影響を回避するためより長波長側にλmaxを有すること
などを全て充たしたものである。

【図面の簡単な説明】

各図面は本発明のジフエニルアミン誘導体及び定量方法
による各種成分の測定値から作成された検量線であり、
第１図は過酸化水素、第２図はグルコース、第３図はコ
レステロール、第４図は尿酸、第５図は中性脂肪、第６
図は遊離脂肪酸、第７図はモノアミンオキシダーゼの検
量線を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者牧明道東京都墨田区業平５丁目５番12号第一化学薬品株式会社東京研究所内 (72)発明者深作昇茨城県那珂郡東海村村松2117

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（Ｉ）［式中、Ｘは−（CH₂）_３−を示し、R₁、R₂及びR₃は単
独でシアノ基またはカルボキシル基が置換することのあ
る低級アルキル基を、R₆、R₇及びR₈は単独で水素原子を
示すか、またはR₁とR₆、R₂とR₇、R₃とR₈が一緒になって
−（CH₂）_３−を示してもよい。R₄及びR₅は、水素原子
または低級アルキル基を示し、Ｒは基−CONH−Ph（Phは
フェニル基を示す）、基−CSNH−R₉（R₉は水素原子、ス
ルホン基が置換することのある低級アルキル基、メチル
カルボニル基またはフェニルカルボニル基を示す）また
は基−CO−Ph−R₁₀（R₁₀はアミノ基、またはアルキルア
ミノ基を示す）を示す］で表わされるジフェニルアミン誘導体またはその塩。