JPH01118768A

JPH01118768A - 発色試液の安定化方法

Info

Publication number: JPH01118768A
Application number: JP62276667A
Authority: JP
Inventors: Yoshitsugu Sakata; 佐方　由嗣; Toshiro Hanada; 寿郎花田; Toyoji Mukai; 向井　豊治
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1987-10-31
Filing date: 1987-10-31
Publication date: 1989-05-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の利用分野］本発明は、生体成分或は生体中の過酸化物質の定量等に
於いて用いられる、高呈色感度の被酸化性呈色試薬を発
色成分として含む発色試液の安定化方法に関する。

［発明の背景］生体成分、例えば血液や尿等の体液成分を測定すること
は、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患の
診断、病態の解明、治療経過の判定を行う上で、必須な
ものとなっている。例えば、血液中のコレステロール、
トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、胆汁
酸、モノアミンオキシダーゼ等を始め、非常に他種類の
微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断上役立
っていることは周知の通りである。

現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行い、これによ
る生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素法
”が一般に広く普及している。なかでも、Ｈ２Ｏ２生成
酵素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当
するＨ２Ｏ２を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及
び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導
き、その呈色を比色定置することにより目的成分量を求
める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加し
つつある。例えば、コレステロール−コレステロールオ
キシダーゼ、トリグリセライド−リボプロティンリパー
ゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼ等の
組み合わせて発生するＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ）、被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、そ
の呈色の吸光度を測定することにより目的成分量を求め
る方法である。この方法に於いて用いられる発色成分で
ある被酸化性呈色試薬には様々な種類があり、使用目的
に応じて、適した波長と呈色感度を有するものが選択さ
れて用いられている。しかしながら、被酸化性呈色試薬
は酸化を受けやすい性質を有するものであり、特に水溶
液中では溶存酸素による酸化を受けやすい。その為、発
色試液として水溶液の状態で保存すると、経時的に着色
が見られ、発色試液としての性能が劣化するという欠点
があり、しかも、呈色感度の高い被酸化性呈色試薬を含
む発色試液はどこの傾向は強い。

主に極微量の体液成分の測定に用いられる染料前駆体く
ロイコ色素）のジフェニルアミン誘導体（特公昭６０−
０３３４７９号公報、特開昭５９−１８２３６１号公報
等に開示。）は極めて高感度な被酸化性呈色試薬であり
、大部分のものは４−７ミノアンチビリンとフェノール
の鞘み合わせにより得られる呈色感度の１０倍以上もの
高呈色感度を有している。しかしながら、これらのジフ
ェニルアミン誘導体は高呈色感度であるが故に、前述し
た如く、光、空気中の酸素、溶液中の溶存酸素等による
影響を受けやすく、発色試液等の溶液状態で保存した場
合の安定性は、従来の被酸化性呈色試薬を用いて調製し
たものに比べて一般的にかなり悪い。即ち、発色試液と
して調製した後の使用可能期間が短いのみならず、誘導
体の種類によっては、試薬盲検の上昇速度が早く測定値
に誤差を生じゃすいものがあり、また、呈色後の色素の
安定性が悪い為測定に要する時間を厳密に一定としない
と測定値に変動が生じるものがある等の欠点もあり、発
色試液として応用するには、解決すべき様々な問題点を
有していた。

［発明の目的］本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたものて、高
呈色感度の被酸化性呈色試薬を発色成分として含む発色
試液の安定化方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］上記の目的を達成するために、本発明は、次の構成より
なる。

「一般式［Ｉ］［式中、Ｚはアミノ基、置換アミノ基又はヒドロキシ基
を示し、Ｒ１は水素原子、アミン基、置換アミノ基、ヒ
ドロキシ基、アルコキシ基、アルキル基又はアルケニル
基を示し、Ｒ２−Ｒ５は夫々独立して水素原子、アルキ
ル基、アルケニル基、アシル基、ハロゲン原子、ニトロ
基、スルホン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基又はア
ルコキシ基を示し、Ｒ６は水素原子又は一般式（式中、Ｙは酸素原子又は硫黄原子を示しＲ７は水素原
子、アルキル基、アミノ基、置換アミノ基、アルケニル
基又はアリール基を示す。）て表わされる基を示す。又
、一般式［Ｉ［］中のＪは酸素原子、硫黄原子、−ＣＨ
２−又は−ＮＨ−を表わす。］て示される被酸化性呈色試薬を発色成分として含有する
発色試液にシクロデキストリン又は／及びその誘導体を
共存させることを特徴とする該発色試液の安定化方法。

」即ち、本発明者らは、一般式［Ｉ］又は［ＩＩ］で示さ
れる高呈色感度の被酸化性呈色試薬及び該試薬が酸化さ
れて生じる色素の安定性を向上させるべく鋭意研究の結
果、該被酸化性呈色試薬を発色成分として含む発色試液
中にシクロデキストリン（以下、ＣＤと略記する。）及
び／又はその誘導体を共存させることによりその目的を
達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

一般式［Ｉ］又は［ＩＩ］で示される本発明に係わる被
酸化性呈色試薬に於いて、Ｚとしてはアミノ基、置換ア
ミノ基［置換アミノ基の置換基としては、例えばメチル
基、エチル基、プロピル基。

ブチル基、アミル基、ヘキシル基環炭素数１〜６の低級
アルキル基（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）又は
、例えばヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、
スルホプロピル基、２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル基等の置換アルキル基が挙げられる。コ又はヒドロキ
シ基が挙げられる。

Ｒ１としては水素原子、アミノ基、置換アミ°ノ基［置
換アミノ基の置換基としては、例えばメチル基、エチル
基、プロピル基、ブチル基、アミル基。

ヘキシル基環炭素数１〜６の低級アルキル基（直鎖状、
分枝状のいずれにても可。）又は、例えばヒドロキシエ
チル基、ヒドロキシプロピル基、スルホプロピル基、２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基等の置換アルキル
基が挙げられる。］、ヒドロキシ基、例えばメトキシ基
、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、アミルオキ
シ基、ヘキシルオキシ基環炭素数１〜６の低級アルコキ
シ基（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）、例えばメ
チル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミル基、
ヘキシル基環炭素数１〜６の低級アルキル基（直鎖状、
分枝状のいずれにても可。）又は例えばビニル基、プロ
ペニル基、ブテニル基等のアルケニル基が挙げられる。

Ｒ２−Ｒ５としては水素原子、例えばメチル基、エチル
基、プロピル基。

ブチル基、アミル基、ヘキシル基環炭素数１〜６の低級
アルキル基（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）、例
えばビニル基、プロペニル基、ブテニル基等のアルケニ
ル基、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基
等のアシル基、例えば塩素、臭素、沃素等のハロゲン原
子、ニトロ基、スルホン基（スルホン基は、ナトリウム
、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩、又はアンモ
ニウム塩等の塩の形になっていてもよい。）、カルボキ
シル基（カルボキシル基は、ナトリウム、カリウム、リ
チウム等のアルカリ金属塩、又はアンモニウム塩等の塩
の形になっていてもよい。）、ヒドロキシ基又は例えば
メトキシ基、エトキシ基。

プロポキシ基、ブトキシ基、アミルオキシ基、ヘキシル
オキシ基環炭素数１〜６の低級アルコキシ基（直鎖状、
分校状のいずれにても可。）が挙げられる。また、Ｒ６
としては水素原子又は一般式で示される基が挙げられる
。但し、Ｙは酸素原子又は硫黄原子を示し　Ｒ７として
は、水素原子、例えばメチル基、エチル基、プロピル基
、ブチル基。

アミル基、ヘキシル基環炭素数１〜６の低級アルキル基
（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）、アミノ基、置
換アミノ基［置換アミノ基の置換基としては、例えばメ
チル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミル基、
ヘキシル基環炭素数１〜６の低級アルキル基（直鎖状、
分枝状のいずれにても可。）、例えばヒドロキシエチル
基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カル
ボキシエチル基、スルホプロピル基、２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル基（但し、カルボキシメチル基、カ
ルボキシエチル基、スルホプロピル基はナトリウム、カ
リウム、リチウム等のアルカリ金属塩又はアンモニウム
塩等の塩の形になっていてもよい。）、アルコキシカル
ボニルアミノアルキル基（アルコキシ基及びアルキル基
は夫々独立して炭素数１〜６のもののうちから選択され
る。）等の置換アルキル基、例えばシクロプロピル基、
シクロへブチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキ
ル基、フェニル基、置換フェニル基（置換フェニル基の
置換基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、ブチル基等の低級アルキル基（直鎖状、分枝状のい
ずれにても可。）、例えばメトキシ基、エトキシ基、プ
ロポキシ基、ブトキシ基等の低級アルコキシ基（直鎖状
、分枝状のいずれにても可。）、例えば塩素、臭素、沃
素等のハロゲン原子、例えばアセチル基、プロピオニル
基、ブチリル基等のアシル基、スルホン基（スルホン基
は、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属
塩、又はアンモニウム塩等の塩の形になっていてもよい
。）、カルボキシル基（カルボキシル基は、ナトリウム
、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩、又はアンモ
ニウム塩等の塩の形になっていてもよい。）、ヒドロキ
シ基、アミノ基、ニトロ基、アルコキシカルボニルアミ
ノ基（アルコキシ基は炭素数１〜４のもののうちから選
択される。）、アルコキシカルボニルアミノアルキル基
（アルコキシ基及びアルキル基は夫々独立して炭素数１
〜６のもののうちから選択される。）等が挙げられる。

）、ナフチル基、置換ナフチル基（置換ナフチル基の置
換基としては、上記置換フェニル基の置換基と同じもの
が挙げられる。）、フェニルスルホニル基、アルコキシ
カルボニルアミノアルキル基（アルコキシ基及びアルキ
ル基は夫々独立して炭素数１〜６のもののうちから選択
される。）、例えばベンジル基、フェネチル基等のアラ
ルキル基、置換アラルキル基（置換アラルキル基の置換
基としては、上記置換フェニル基の置換基と同じものが
挙げられる。）等が挙げられる。］、例えばビニル基、
プロペニル基、ブテニル基等のアルケニル基、例えばフ
ェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、メチル
ナフチル基等のアリール基等が挙げられる。

また、一般式［ｎ］中のＪとしては、酸素原子、硫黄原
子、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−が挙げられる。

本発明に用いられる一般式［Ｉ１又は［Ｕ］で示される
被酸化性呈色試薬は、例えば、特公昭６０−０３３４７
９号公報；特開昭５９−１８２３６１号公報等に記載の
一般的製造方法により容易に合成することかできるので
、そのようにして合成されたものを用いることで足りる
。このうち、特に一般式［Ｉ］又は［■］に於いてＲ６
がＣ−Ｒ７である化合物についてその製造法の概略を示すと、下記
の如くなる。即ち、一般式［ｍ］又は［ＩＶ］（但し、
Ｚ、Ｒ’〜Ｒ５は前記に同じ。）で示される化合物と、
通常これと等モルの一般式［］％式％［］（但し、Ｒ８はＲ７で示される基、又はアルカリ処理に
よりＲ７に変り得る基を示す。）て示されるイソシアネート誘導体とを適当な有機溶媒（
例えばクロロホルム、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ジメ
チルホルムアミド等）中、室温乃至要すれば加温下に数
時間乃至数十時間反応させる。

反応後は、例えばカラムクロマトグラフィ等により生成
物を単離、精製するなど自体公知の方法に従って後処理
を行うことにより、また、必要に応じてこれをさらにア
ルカリ処理し、然る後、常法に従って後処理を行うこと
により目的の一般式［Ｉ１又は［■］の化合物が得られ
る。

一般式［ＩＩ［］で示される化合物は、古くから知られ
ているインダミンの製法［例えば、Ｃｈｅｗ、　Ｂｅｒ
、、　、ｌｉ、４６４（１８８３）等コに準じて、例え
ばアニリン誘導体とフェニレンジアミン誘導体とを過ヨ
ウ素酸等で酸化縮合して色素を合成した後、これを還元
することにより容易に得られるから、このようにして得
られたものを用いることで足りる。一般式［ＩＶ］で示
される化合物は、公知文献（例えば、大有機化学、第１
７巻、１７−１９頁、３３−３４頁、朝食書店、昭和４
１年第４版等）に記載のフェノチアジン、フェノキサジ
ン等の製法に準じて容易に合成し得るので、このように
して得られたものを用いることで足りる。また、一般式
［Ｖ］で示されるイソシアネート誘導体も、公知文献（
例えば、大有機化学、第５巻、４５２−４５３頁、朝食
書店、昭和４２年第６版等）に記載のイソシアネートの
製法に準じて容易に合成し得るので、このようにして得
られたものを用いることて定りる。

本発明に於いて用いられるＣＤとしては、α−２β−９
γ−ＣＤの他に、マルトシクロデキストリンの様な分枝
を有するＣＤも挙げられる。また、本発明に用いられる
ＣＤ誘導体としては、たとえばヘプタキス（２，６−ジ
ー０−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス
（６−０−２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキ
ストリン、ヘプタキス（６−０−３−ヒドロキシプロピ
ル）−β−シクロデキストリン。

β−シクロデキストリン−エピクロルヒドリン縮合体、
トリス（６−０−スルホプロピル）−β−シクロデキス
トリン、トリス（６−０−力ルボキシメチル）−β−シ
クロデキストリン、ヘプタキス（６−０−ヒドロキシエ
チル）−β−シクロデキストリン等°、水溶性のＣＤ誘
導体が挙げられるが、これら以外のものでも水溶性のも
のであれば特に限定されない。

これら本発明に於いて使用されるＣＤ誘導体は、例えば
米国特許第３，４５３，２５８号明細書；米国特許第３
．４５３，２５９号明細書：米国特許第３，４５９，７
３１号明細書；　Ｐｏｌｙｍｅｒ　　Ｊｏｕｎａｌ、Ｖ
ｏｌ、＋３．Ｎｏ、８，７７７頁（１９８１）等に記載
の一般的製造方法により容易に合成することができるの
で、そのようにして合成されたものを用いることで足り
る。

本発明は、発色成分として一般式［Ｉ］又は［ＩＩ］で
示される被酸化性呈色試薬を用いて通常の臨床検査用試
薬と同様の組成の発色試液を調製し、これに、更にＣＤ
又は／及びその誘導体を添加して溶解することにより容
易に実施することができる。また、予め一般式［Ｉ］又
は［ＩＩ］で示される被酸化性呈色試薬とＣＤ又は／及
びその、誘導体との包接化合物を通常の包接化合物の製
造法、即ち、飽和水溶液法、混練法、凍結乾燥法等によ
り調製、単離し、これを発色成分として用いて通常の臨
床検査用試薬と同様の組成の発色試液を調製することに
よっても同様に実施することができる。

本発明に於いて用いられる、一般式［Ｉ］又は［■］で
示される被酸化性呈色試薬の使用濃度としては、特に限
定されないが、通常発色試液中の濃度として数μｍａｔ
／Ｉ以上、好ましくは５０μｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏ
ｌ／Ｉの濃度が用いられる。

本発明に於いて用いられる、ＣＤ又はその誘導体は、単
独で用いても良いし、二種以上組み合わせて用いても良
く、その使用濃度としては、発色試液中に溶解可能な範
囲であれば特に限定されるものではないが、好ましくは
発色試液中に０．１〜２　Ｗ／Ｖχの範囲で添加される
。

本発明の方法により安定化された発色試液（以下、本発
明に係わる発色試液と称する。）は、酸化性物質の定量
やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色試液とし
て有効に用い得るが、とりわけ酵素反応により生成した
過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、
その呈色を比色定量することにより行う生体試料中の微
量成分の定量に於ける発色試液として特に有効に使用し
得る。

即ち、本発明に係わる発色試液は、基質又は酵素反応に
より生成した基質に、酸化酵素を作用させ、生成する過
酸化水素を定量することにより行う生体試料中の微量成
分の測定、即ち、基質の定量或いは酵素活性の測定に特
に効果的に使用し得る。

本発明に係わる発色試液により測定可能な生体試料中の
微量成分としては、例えばコレステロール、グルコース
、グリセリン、トリグリセライド。

遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミンオキ
シダーゼ、グアナーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げら
れるが、これらに限定されるものではなく、酵素反応に
より生成する過酸化水素を定量することにより測定可能
な生体成分はすべて測定可能である。

本発明に係わる発色試液を用いる測定法は、発色試液と
して本発明に係わる発色試液を用いる以外は、自体公知
の、Ｈ２Ｏ２生成酵素を用いる酵素法による測定法に準
じてこれを行えば足りる。

本発明に係わる発色試液を用いる測定法に於いて、過酸
化水素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オ
キシダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並び
に酵素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び
使用量は、被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成
分の定量法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適
宜選択すればよい。また、本発明の過酸化水素の定量方
法に於いて用いられるペルオキシダーゼとしては、その
起源、由来に特に限定はなく、動物、植物。

微生物起源のペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様
物質が、一種若しくは要すれば二種以上組み合わせて用
いられる。また、その使用量は目的に応じて適宜定めら
れ、特に限定されない。

本発明に係わる発色試液を用いる測定法による生体成分
の定量は、通常、ｐＨ４，０〜１Ｏ００、より好ましく
はｐＨ６，０〜８．０で実施される。このｐＨ範囲を保
つ為に用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸
塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝“剤、グツド（Ｇｏ
ｏｄｓ”）緩衝剤等が挙げられるが、特にこれらに限定
されない。

本発明に係わる発色試液は、過酸化水素等酸化性物質の
定量に有効に用い得るが、又、これと過酸化水素とを組
み合わせることによりペルオキシダーゼ様物質の定量を
行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様物質として
は、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロビンその
他のヘム化合物が挙げられる。

即ち、本発明に係わる発色試液は、例えば、ペルオキシ
ダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法にも応用可
能であり、また、血清中のヘモグロビンを過酸化水素若
しくは過ホウ素酸ナトリウムの様な酸化性物質を用いて
測定子る場合等にも有効に使用し得る。。

また、本発明に係わる発色試液に於いて、安定剤として
β−ＣＤ又は／及びβ−ＣＤ誘導体を用いた場合には、
α−２γ−ＣＤ又は／及びα−２γ−ＣＤ誘導体を使用
した場合に比べて更に安定性が良い。また、β−ＣＤ又
は／及びβ−ＣＤ誘導体を用いた場合の本発明に係わる
被酸化性呈色試薬の分子吸光係数（ε）は、α−９γ−
ＣＤ又は／及びα−２γ−ＣＤ誘導体を使用した場合、
或はＣＤ又はＣＤ誘導体を全く添加していない場合のそ
れよりも約１０％程度大きくなり、より高呈色感度の発
色試液となる。また、β−ＣＤ又は／及びβ−ＣＤ誘導
体を用いた場合には該被酸化性呈色試薬の極大吸収波長
は約１０ｎｍ程度長波長側にシフトする。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが
、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

［実施例］実施例１゜（試薬） α−９β−，７−ＣＤ各々を０．５χ含む２５ｍＭ　Ｐ
ＩＰＥＳ［ピペリジンＮ、Ｎ’−ビス（２−エタンスル
ホン［Ｉ９）］−ＮａＯ１１緩衝液（ｐＨ６，７５）に
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７
−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、　Ｎａ塩（
ＣＭＤＰ・Ｎａ塩）Ｃ＝０ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＮａを４０μ閂となるように溶解して試液とした。

（操作法）上記の試液を褐色ガラス容器に入れて密栓し、５℃又は
２５℃で所定日数遮光保存した後、水を対照として６６
６０−での吸光度を測定した。

（結果）結果を表１−１及び１−２に示す。

比較例１゜（試薬）２５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−Ｎａ０１１緩衝液（ｐＨ６，７
５）にＣＭＤＰ−Ｎａ塩を４０μ門となるように溶解し
て試液とした。

（操作法）実施例１と同様に行った。

（結果）結果を表１−１及び１−２に実施例１の結果と併せて示
す。

表１−１表１−２表１−１及び１−２から明らかな如く、保存日数の経過
にともなう各試料の６６６ｒｖに於ける吸光度の上昇の
程度は、比較例１での結果に比べて実施例１ての結果の
ほうが明らかに小さいことから、本発明に係わる一般式
［Ｉ［］で示される被酸化性呈色試薬の一種であるＣＭ
ＤＰ−Ｎａ塩は、水溶液中に於いて、ＣＤの添加により
酸化されにくくなること、即ち、安定化されることが判
る。

実施例２゜（試薬） α−９β−，７−ＣＤ各々を０．５＄含む２５ｍＭ　Ｐ
ＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，７５）にピントシ
ェルトラ−グリーンロイコ体（Ｂｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅ
ｒ’ｓ　Ｇｒｅｅｎ　Ｌｅｕｃｏ　Ｂａ５ｅ又は、Ｎ−
（４−ジメチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ−（
４’−ジエチルアミノ−２′−メチルフェニル）−Ｎ’
−（４−メチルフェニルスルホニル）尿素（ＤＭＵ）を
５０μ門となるように溶解して試液とした。

（操作法）上記の試液を褐色ガラス容器に入れて密栓し、５℃又は
２５℃で所定日数遮光保存した後、水を対竪として、Ｂ
Ｇを用いた場合には？２５ｎｍでの吸光度を、ＤＭＵを
用いた場合には７４０ｒ＋ｍでの吸光度を夫々測定した
。

（結果）結果を表２−１及び２−２に示す。

比較例２゜（試薬）２５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，７５
）にＢＧ又はＤＭＵを５０μ門となるように溶解して試
液とした。

（操作法）実施例２と同様に行った。

（結果）結果を表２−１及び２−２に実施例２の結果と併せて示
す。

表２−１表２−２表２−１及び２−２から明らかな如く、保存日数の経過
にともなう各試料の所定波長に於ける吸光度の上昇の程
度は、比較例２ての結果に比べて実施例２ての結果のほ
うが明らかに小さいことから、本発明に係わる一般式［
Ｉ］で示される被酸化性呈色試薬の一種であるＢＧ及び
ＤＭＵは、水溶液中に於いて、ＣＤの添加により酸化さ
れにくくなること、即ち、安定化されることが判る。

実施例３゜（試薬）ヘプタキス（６−０−２−ヒドロキシプロピル）−β−
シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）　、ヘプタキス
（２゜６−ジー０−メチル）−β−シクロデキストリン
（ＤＭ−β−ＣＤ）、　　）リス（６−０−スルホプロ
ピル）−β−′シクロデキストリン（ＳＰ−β−ＣＤ）
、β−シクロデキストリン−エビクロルヒトリン縮合体
（β−ＣＤ−Ｅｌ）を各々】Ｉ含む２５ｍＭ　ＰＩＰＥ
Ｓ−ＮａＯＨ緩衝Ｍ（ｐＨ６，７５）にＣＭＤＰ・Ｎａ
塩をｌＯμ門となるように溶解して試液とした。

（操作法）上記の試液を褐色ガラス容器に入れて密栓し、５℃又は
２５℃で所定日数遮光保存した後、水を対照として６７
５ｎｍでの吸光度を測定した。

（結果）結果を表３−１及び３−２に示す。

比較例３゜（試薬）２５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＩＩ緩衝液（ｐｉ（６，
７５）に側叶・Ｎａ塩を１０μ門となるように溶解して
試液とした。

（操作法）実施例３と同様に行った。

（結果）結果を表３−１及び３−２に実施例３の結果と併せて示
す。

表３−１表３−２表３−１及び３−２から明らかな如く、保存日数の経過
にともなう各試料の６７５ｎＩ１１に於ける吸光度の上
昇の程度は、比較例３ての結果に比べて実施例３での結
果のほうが明らかに小さいことから、本発明に係わる一
般式［Ｉ［］で示される被酸化性呈色試薬の一種である
ＣＭＤＰ−Ｎａ塩は、水溶液中に於いて、ＣＤ誘導体の
添加により酸化されにくくなること、即ち、安定化され
ることが判る。

実施例４．尿酸の定量（発色試液）５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝Ｍ（ｐＨ６，４）
に下記物質を下記濃度となるように溶解して発色試液と
した。

ウリカーゼ　　　　　　　　　　　　　２Ｕ／ｍｌペル
オキシダーゼ　　　　　　　　　ＩＵ／ｍｌＣＭＤＰ−
Ｎａ塩　　　　　　　　　　　　　　　５μ閃ＨＰ−β
−ＣＤ　　　　　　　　　　　　　０．５Ｗ／Ｖ％（試
料）尿酸標準液（１０ｍｇ／ｄ　ｌ　）及び人血清１０検体
を試料とした。

（操作法）試料２０μｍをとり、発色試液３．０ｍｌを加えてよく
混合し、３７℃で５分間反応させた後、６７５ｎｍに於
ける吸光度Ｅ、を測定した。

試料の代りに、精製水及び尿酸標準液を用いて同様の操
作を行い、試薬盲検ＥＢＩ及び標準液吸光度Ｅｓ１ｄを
測定した。

得られた吸光度を用いて次式により試料中の尿酸濃度（
ｍｇ／ｄ　Ｉ　）を算出した。

尿酸濃度（ｎ＋ｇ／旧）＝（（Ｅ、　−ＥＢ　ｌ　）÷
（ＥＳ＋ａ−ＦＢＩ））ＸＩＯ（結果）得られた結果を表４に示す。

比較例４゜発色試液として、実施例４の発色試液より１１Ｐ−β−
ＣＤを除いたものを使用した以外は、実施例４と全く同
様の操作により、実施例４で用いたものと同じ試料につ
いて尿酸の測定を行った。

（結果）得られた結果を表４に併せて示す。

比較例５゜市販の尿酸測定試薬［尿酸Ｃ−テストワコー（和光純薬
工業（株）製）］を用い、実施例４で用いたと同じ試料
について尿酸の測定を行った。尚、操作法は、同測定試
薬の現品説明書に記載の標準操作法により行った。

（結果）得られた結果を表４に併せて示す。

表４ｉ）（Ｘ）と（Ｙ）の測定値の比較相関係数；γ＝＝　０．９９７８回帰直線式；　Ｙ　＝　１．０２５　Ｘ　−０，０５ｉ
ｉ）（Ｘ）と（Ｚ）の測定値の比較相関係数；γ：０．９９９５回帰直線式；　Ｙ　＝　１．００１　Ｘ　−０，０２表
４の結果によれば、各測定法は互いに良い相関を示した
が、実施例４及び比較例５で得られた値に比べて、比較
例４て得られた結果はやや高めの傾向を示した。

実施例５．モノアミンオキシダーゼの定量（発色試液）５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯ）Ｉ緩衝液（ＰＨ６，７
５）に下記物質を下記濃度となるように溶解して発色試
液とした。

アリルアミン　　　　　　　　　　　３０ｍＭペルオキ
シダーゼ　　　　　　　　　２ｔ３／ｍｌＣＭＤＰ−Ｎ
ａ塩　　　　　　　　　　　　　２０μ門）　１）　）
　ンＸ　−４０５０，ＩＷ／Ｖ＄１１Ｐ−β−ＣＤ　　
　　　　　　　　　　　　Ｏ，５Ｗ／Ｖ＄（試料）モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）活性既知の標準血清
（５５Ｕ）及び人血清１０検体を試料とした。

（操作法）試料１００μｍをとり、発色試液２ｍｌを加えてよく混
合し、３７℃で２分間加温した後、６６６ｎｍに於ける
１分間当りの吸光度変化率（ΔＥｓ）を測定した。

試料の代りに、精製水及び標準血清を用いて同様の操作
を行い、試薬盲検の吸光度変化率（ΔＥ８１）及び標準
血清の吸光度変化率（ΔＥ＝＋ｄ）を測定した。

得られた吸光度変化率を用いて次式により試料中のＭＡ
Ｏｆｉ度（Ｕ）を算出した。

ＭＡＯｍ度（Ｕ）＝（（ΔＥｓ−ΔＥｅ＋）÷（ΔＥ＆
ｌｄ−ΔＥＢｔ））ＸＩＯ（結果）測定結果を表５に示す。

比較例６゜市販のＭＡＯ測定試薬［ＭＡＯ−テストワコー（和光純
薬工業（株）製）］を用い、実施例４て用いたと同じ試
料についてＭＡＯの測定を行った。

尚、操作法は、同測定試薬の現品説明書に記載の標準操
作法により行った。

（結果）得られた結果を表５に併せて示す。

表５相関係数；γ＝　０．９９３５回帰直線式；　Ｙ　＝　１．００５Ｘ　−０，１０表５
の結果から明らかな如く、本発明に係わる安定化法によ
りえられた発色試液を用いた実施例５て得られた結果と
従来法である比較例６により得られた結果とは良好な相
関を示した。

実験例１゜（発色試液）５０ｍＭ　リン酸緩？＃ｊ液（ｐＨ７，０）に下記物質
を下記濃度となるように溶解して発色試液とした。

Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００１ｍｇ／ｍｌペルオキシダー
ゼ　　　　　　　　　　３１Ｊ／ｍｌＣＭＤＰ・Ｎａ塩
　　　　　　　　　　　　　　　２５μ門所定のＣＤ又
はＣＤ誘導体　　　　　　Ｉ　Ｗ／Ｖχ（試料）５ｍＭの過酸化水素水溶液を試料とした。

（操作法）試料２０μｍをとり、発色試液３ｙＯｍｌを加えてよく
混合し、３７℃で６分間反応させた後、６６６ｎｍに於
ける吸光度Ｅ、を測定した。

試料の代りに、精製水を用いて同様の操作を行い、試薬
盲検Ｅ［ｌ＋を測定した。

（結果）得られた結果（Ｅｓ−Ｅａｔ）を表６に示す。

表６表６の結果から明らかな如く、本発明に係わる発色試液
に於いて、安定化剤としてβ−ＣＤ又は／及びβ−ＣＤ
誘導体を用いた場合の被酸化性呈色試薬の分子吸光係数
（ε）は、α−２γ−ＣＤ又は／及びα−９γ−ＣＤ誘
導体を使用した場合、或はＣＤ又はＣＤ誘導体を全く添
加していない場合のそれよりも約１０％程度大きくなっ
ており、より高呈色感度の発色試液となっていることが
判る。

［発明の効果］以上述べた如く、本発明は、試薬安定性が悪いために発
色試液調製後の使用可能期間が短く、しかも盲検値の著
しい上昇により測定値に誤差が生しやすかった、高呈色
感度の被酸化性呈色試薬を発色成分として含む発色試液
の新規で且つ効果的な安定化方法を提供するものであり
、本発明の方法□により安定化された発色試液を用いる
ことにより、生体試料中の極微量成分をより高い精度で
、且つより経済的に測定することができるようになった
点に顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献すると
ころ大なる発明である。

特許出願人　相光純薬工業株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式［ I ］又は［II］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［II］［式中、Ｚはアミノ基、置換アミノ基又はヒドロキシ基
を示し、Ｒ＾１は水素原子、アミノ基、置換アミノ基、
ヒドロキシ基、アルコキシ基、アルキル基又はアルケニ
ル基を示し、Ｒ＾２〜Ｒ＾５は夫々独立して水素原子、
アルキル基、アルケニル基、アシル基、ハロゲン原子、
ニトロ基、スルホン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基
又はアルコキシ基を示し、Ｒ＾６は水素原子又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｙは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ＾７は水
素原子、アルキル基、アミノ基、置換アミノ基、アルケ
ニル基又はアリール基を示す。）で表わされる基を示す。また、一般式［II］中のＪは酸
素原子、硫黄原子、−ＣＨ＿２−又は−ＮＨ−を表わす
。］で示される被酸化性呈色試薬を発色成分として含有する
発色試液にシクロデキストリン又は／及びその誘導体を
共存させることを特徴とする該発色試液の安定化方法。