JP3097370B2 - 過酸化水素の測定方法 - Google Patents
過酸化水素の測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、過酸化水素の測定方法
に関する。更に詳しくは、パーオキシダーゼ（以下ＰＯ
Ｄという）及び一般式
に関する。更に詳しくは、パーオキシダーゼ（以下ＰＯ
Ｄという）及び一般式
【化２】 （式中、Ｒ1 及びＲ3 は、水素原子、炭素数１〜４のア
ルキル基又はスルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアル
カリ金属塩基の置換基を有する炭素数１〜４の置換アル
キル基、Ｒ2 及びＲ4 は、スルホ基、水酸基もしくはス
ルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有する炭素数１〜
４の置換アルキル基、Ｒ5 は、水素原子、塩素原子、臭
素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は−
Ｎ（Ｒ9 ）Ｒ10で表わされる基であり、Ｒ9 は水素原
子、炭素数１〜４のアルキル基又は、スルホ基、水酸基
もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有する
炭素数１〜４の置換アルキル基、Ｒ10はスルホ基、水酸
基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有す
る炭素数１〜４の置換アルキル基、Ｒ6 ，Ｒ7 及びＲ8
は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１
〜３のアルコキシ基である）。で表わされるトリフェニ
ルメタン誘導体を用いる過酸化水素の測定方法におい
て、スパーオキシドジスムターゼ（以下ＳＯＤという）
の存在下行う過酸化水素の測定方法に関する。
ルキル基又はスルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアル
カリ金属塩基の置換基を有する炭素数１〜４の置換アル
キル基、Ｒ2 及びＲ4 は、スルホ基、水酸基もしくはス
ルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有する炭素数１〜
４の置換アルキル基、Ｒ5 は、水素原子、塩素原子、臭
素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は−
Ｎ（Ｒ9 ）Ｒ10で表わされる基であり、Ｒ9 は水素原
子、炭素数１〜４のアルキル基又は、スルホ基、水酸基
もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有する
炭素数１〜４の置換アルキル基、Ｒ10はスルホ基、水酸
基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有す
る炭素数１〜４の置換アルキル基、Ｒ6 ，Ｒ7 及びＲ8
は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１
〜３のアルコキシ基である）。で表わされるトリフェニ
ルメタン誘導体を用いる過酸化水素の測定方法におい
て、スパーオキシドジスムターゼ（以下ＳＯＤという）
の存在下行う過酸化水素の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、過酸化水素を測定する方法とし
て、ＰＯＤの存在下トリンダー試薬と４−アミノアソチ
ピリンとを反応させて、生成する酸化縮合色素を測定す
る方法が知られている（Ｋ．Ｔａｍａｏｋｕ；Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．；１３６，１２１−１２７
（１９８２））。このトリンダー試薬を用いる方法で
は、過酸化水素の濃度が１μＭ程度までの試料しか測定
することができず高感度測定試薬の出現が望まれてい
た。この問題点を解決するため、ＰＯＤと発色試薬とし
てトリフェニルメタン誘導体とを用いる方法が見い出さ
れ、過酸化水素の測定に用いられている（特開平３−２
０６８９６号及び特願平３−３５１１９９号参照）。
て、ＰＯＤの存在下トリンダー試薬と４−アミノアソチ
ピリンとを反応させて、生成する酸化縮合色素を測定す
る方法が知られている（Ｋ．Ｔａｍａｏｋｕ；Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．；１３６，１２１−１２７
（１９８２））。このトリンダー試薬を用いる方法で
は、過酸化水素の濃度が１μＭ程度までの試料しか測定
することができず高感度測定試薬の出現が望まれてい
た。この問題点を解決するため、ＰＯＤと発色試薬とし
てトリフェニルメタン誘導体とを用いる方法が見い出さ
れ、過酸化水素の測定に用いられている（特開平３−２
０６８９６号及び特願平３−３５１１９９号参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、トリフェニル
メタン誘導体を用いることにより過酸化水素の濃度が
０．３μＭ程度までの測定が可能となったものの、臨床
検査の分野の分析においては更なる高感度化が要求され
ているのが現状である。そして有効な測定方法の出現が
久しく期待されていた。
メタン誘導体を用いることにより過酸化水素の濃度が
０．３μＭ程度までの測定が可能となったものの、臨床
検査の分野の分析においては更なる高感度化が要求され
ているのが現状である。そして有効な測定方法の出現が
久しく期待されていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、更なる高
感度過酸化水素の測定方法を見い出すべく鋭意研究した
結果、過酸化水素を含む溶液に、ＰＯＤと前記一般式
（Ｉ）で表わされるトリフェニルメタン誘導体を用いる
方法において、更にＳＯＤを加えて行う測定方法を見い
出し本発明を完成した。
感度過酸化水素の測定方法を見い出すべく鋭意研究した
結果、過酸化水素を含む溶液に、ＰＯＤと前記一般式
（Ｉ）で表わされるトリフェニルメタン誘導体を用いる
方法において、更にＳＯＤを加えて行う測定方法を見い
出し本発明を完成した。
【０００５】本発明の測定方法は、まず過酸化水素を含
む検体に溶液中で発色試薬として前記一般式（Ｉ）で表
わされるトリフェニルメタン誘導体、ＰＯＤ及びＳＯＤ
とを加えて反応させ、生成する色素を測定することによ
り行うことができる。測定に用いる前記一般式（Ｉ）で
表わされるトリフェニルメタン誘導体は、１０〜５００
μＭであればよく、好ましくは１００〜２００μＭ用い
ることができる。またＰＯＤの添加量は、１００〜１
０，０００Ｕ／Ｌであり、好ましくは１，０００〜３，
０００Ｕ／Ｌである。ＳＯＤの添加量は、１０，０００
〜１，０００，０００Ｕ／Ｌであるが、効率よく行うた
めには６０，０００〜２００，０００Ｕ／Ｌである。
む検体に溶液中で発色試薬として前記一般式（Ｉ）で表
わされるトリフェニルメタン誘導体、ＰＯＤ及びＳＯＤ
とを加えて反応させ、生成する色素を測定することによ
り行うことができる。測定に用いる前記一般式（Ｉ）で
表わされるトリフェニルメタン誘導体は、１０〜５００
μＭであればよく、好ましくは１００〜２００μＭ用い
ることができる。またＰＯＤの添加量は、１００〜１
０，０００Ｕ／Ｌであり、好ましくは１，０００〜３，
０００Ｕ／Ｌである。ＳＯＤの添加量は、１０，０００
〜１，０００，０００Ｕ／Ｌであるが、効率よく行うた
めには６０，０００〜２００，０００Ｕ／Ｌである。
【０００６】反応は、ｐＨが５〜８の緩衝液中で行うこ
とが好ましく、用いる緩衝液としては、例えばトリス−
コハク酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等を挙げることが
できる。反応は、１０〜５０℃で行うことができるが、
通常３７℃付近で行うことが好ましい。反応後の色素の
測定は、反応溶液を一定時間反応させた後、吸光度を測
定するか又は、反応停止液を加えた後吸光度を測定する
方法により行うことができる。さらに吸光度の変化率を
測定するレート法を用いて測定を行うこともできる。ま
た、さらに本発明の測定対象物である過酸化水素の代り
にＰＯＤの活性測定も行うことができる。
とが好ましく、用いる緩衝液としては、例えばトリス−
コハク酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等を挙げることが
できる。反応は、１０〜５０℃で行うことができるが、
通常３７℃付近で行うことが好ましい。反応後の色素の
測定は、反応溶液を一定時間反応させた後、吸光度を測
定するか又は、反応停止液を加えた後吸光度を測定する
方法により行うことができる。さらに吸光度の変化率を
測定するレート法を用いて測定を行うこともできる。ま
た、さらに本発明の測定対象物である過酸化水素の代り
にＰＯＤの活性測定も行うことができる。
【０００７】本発明の測定物質である過酸化水素は、検
体中に含まれる過酸化水素の他、例えば酵素反応等によ
り生成する過酸化水素も測定対象とすることができる。
この過酸化水素の生成反応としては、基質と酸化酵素と
の反応を挙げることができ、例えばグルコースとグルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールとコレステロールオ
キシダーゼ、尿酸とウリカーゼ、ガラクトースとガラク
トースオキシダーゼ、乳酸と乳酸オキシダーゼ等の反応
である。すなわち、酵素反応により生成する過酸化水素
を測定することにより、基質量の測定又は酸化酵素活性
の測定を行うことができる。
体中に含まれる過酸化水素の他、例えば酵素反応等によ
り生成する過酸化水素も測定対象とすることができる。
この過酸化水素の生成反応としては、基質と酸化酵素と
の反応を挙げることができ、例えばグルコースとグルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールとコレステロールオ
キシダーゼ、尿酸とウリカーゼ、ガラクトースとガラク
トースオキシダーゼ、乳酸と乳酸オキシダーゼ等の反応
である。すなわち、酵素反応により生成する過酸化水素
を測定することにより、基質量の測定又は酸化酵素活性
の測定を行うことができる。
【０００８】本発明で用いるＳＯＤとしては、市販又は
容易に入手可能なＳＯＤを用いることができ、例えばＣ
ｕ−ＳＯＤ，Ｚｎ−ＳＯＤ，ＥＣ−ＳＯＤ（Ｅｘｔｒａ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ），Ｍｎ−ＳＯＤ，Ｆｅ−ＳＯＤ等
を挙げることができる。
容易に入手可能なＳＯＤを用いることができ、例えばＣ
ｕ−ＳＯＤ，Ｚｎ−ＳＯＤ，ＥＣ−ＳＯＤ（Ｅｘｔｒａ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ），Ｍｎ−ＳＯＤ，Ｆｅ−ＳＯＤ等
を挙げることができる。
【０００９】また前記一般式（Ｉ）で表わされるトリフ
ェニルメタン誘導体は、市販されているトリフェニルメ
タン骨格を有する化合物のほか、特願平３−３５１１９
９号に示されるトリフェニルメタン誘導体等を挙げるこ
とができる。このトリフェニルメタン誘導体としては、
例えば４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホ
プロピル）アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノ−２−メトキシフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミ
ノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム塩、ビス〔４−
（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）アミノ−２−メチルフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノ−２−メトキシフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム塩、ビス〔４−
（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）アミノ−２−メチルフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノフェニル）〕（４−クロロフェニル）メタン
二ナトリウム塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）アミノフェニル）〕（４−ヒドロキ
シフェニル）メタン 二ナトリウム塩、ビス〔４−（Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノフェニ
ル）〕（２−スルホフェニル）メタン 三ナトリウム塩
等を挙げることができる。
ェニルメタン誘導体は、市販されているトリフェニルメ
タン骨格を有する化合物のほか、特願平３−３５１１９
９号に示されるトリフェニルメタン誘導体等を挙げるこ
とができる。このトリフェニルメタン誘導体としては、
例えば４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホ
プロピル）アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノ−２−メトキシフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミ
ノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム塩、ビス〔４−
（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）アミノ−２−メチルフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノ−２−メトキシフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム塩、ビス〔４−
（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）アミノ−２−メチルフェニル）〕〔４−（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピ
ル）アミノフェニル）〕（４−クロロフェニル）メタン
二ナトリウム塩、ビス〔４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）アミノフェニル）〕（４−ヒドロキ
シフェニル）メタン 二ナトリウム塩、ビス〔４−（Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノフェニ
ル）〕（２−スルホフェニル）メタン 三ナトリウム塩
等を挙げることができる。
【００１０】
【実施例】本発明を以下に示す実施例によりさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【００１１】実施例１ 過酸化水素の測定 ＳＯＤ １２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ１，５００Ｕ／
Ｌ及び４，４，′４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホ
プロピル）アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム
塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝
６．５，５０ｍＭ）の試液２ｍｌに過酸化水素（０〜２
５０μＭ）を含む被検液１０μｌを加え３７℃で１０分
間放置した。放置後、波長５９５ｎｍにて過酸化水素を
含まない被検液を対照に吸光光度計により吸光度を測定
した。同様にして前記試液からＳＯＤを除いて測定した
ものと比較し、その結果を図１に示す。
Ｌ及び４，４，′４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホ
プロピル）アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム
塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝
６．５，５０ｍＭ）の試液２ｍｌに過酸化水素（０〜２
５０μＭ）を含む被検液１０μｌを加え３７℃で１０分
間放置した。放置後、波長５９５ｎｍにて過酸化水素を
含まない被検液を対照に吸光光度計により吸光度を測定
した。同様にして前記試液からＳＯＤを除いて測定した
ものと比較し、その結果を図１に示す。
【００１２】実施例２ グルコースの測定（１） グルコースオキシダーゼ（アスペルギウス由来、天野製
薬社製）５０，０００Ｕ／Ｌ、ムタロターゼ（ブタ腎臓
由来、天野製薬社製）１０，０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２
０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ１，５００Ｕ／Ｌ、４，
４，′４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）
アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム塩１５０μ
Ｍを含むトリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝６．５、５０
ｍＭ）の試液２mlにグルコース（０〜７mg／dl）を含む
被検液１０μｌを加え、３７℃で１０分間放置した。放
置後、波長、５９５ｎｍにて０mg／dlグルコースを対照
に吸光度を測定した。同様にして前記試液からＳＯＤを
除いて測定したものと比較し、その結果を図２に示す。
薬社製）５０，０００Ｕ／Ｌ、ムタロターゼ（ブタ腎臓
由来、天野製薬社製）１０，０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２
０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ１，５００Ｕ／Ｌ、４，
４，′４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）
アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム塩１５０μ
Ｍを含むトリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝６．５、５０
ｍＭ）の試液２mlにグルコース（０〜７mg／dl）を含む
被検液１０μｌを加え、３７℃で１０分間放置した。放
置後、波長、５９５ｎｍにて０mg／dlグルコースを対照
に吸光度を測定した。同様にして前記試液からＳＯＤを
除いて測定したものと比較し、その結果を図２に示す。
【００１３】実施例３ グルコースの測定（２） 実施例２で用いた４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ
（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩の代りにビス〔４−〔（Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕〔４−
（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナト
リウム塩を用いた試液を用い実施例２と同様にグルコー
スを測定し吸光度を測定した。その結果を図３に示す。
（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩の代りにビス〔４−〔（Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕〔４−
（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン 二ナト
リウム塩を用いた試液を用い実施例２と同様にグルコー
スを測定し吸光度を測定した。その結果を図３に示す。
【００１４】実施例４ グルコースの測定（３） 実施例２で用いた４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ
（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩の代りにビス〔４−〔（Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕（４−クロロフ
ェニル）メタン二ナトリウム塩を用いた試液を用い、実
施例２と同様にグルコースを測定し吸光度を測定した。
その結果を図４に示す。
（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩の代りにビス〔４−〔（Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕（４−クロロフ
ェニル）メタン二ナトリウム塩を用いた試液を用い、実
施例２と同様にグルコースを測定し吸光度を測定した。
その結果を図４に示す。
【００１５】実施例５ コレステロールの測定 コレステロールオキシダーゼ（ストレプトマイセス属由
来、旭化成社製）５０，０００Ｕ／Ｌ、コレステロール
エステラーゼ（シュードモナス属由来、旭化成社製）１
０，０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯ
Ｄ１，５００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−
ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩
衝液（ｐＨ＝６．５，５０ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０ ０．１％を含む）の試液２mlにコレステロール（０
〜１０mg／dl）を含む被検液１０μｌを加え、３７℃で
５分間放置した。放置後波長５９５ｎｍにて０mg／dlコ
レステロールを対照に吸光度を測定した。同様にして前
記試液からＳＯＤを除いて測定したものと比較し、その
結果を図５に示す。
来、旭化成社製）５０，０００Ｕ／Ｌ、コレステロール
エステラーゼ（シュードモナス属由来、旭化成社製）１
０，０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯ
Ｄ１，５００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−
ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩
衝液（ｐＨ＝６．５，５０ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０ ０．１％を含む）の試液２mlにコレステロール（０
〜１０mg／dl）を含む被検液１０μｌを加え、３７℃で
５分間放置した。放置後波長５９５ｎｍにて０mg／dlコ
レステロールを対照に吸光度を測定した。同様にして前
記試液からＳＯＤを除いて測定したものと比較し、その
結果を図５に示す。
【００１６】実施例６ 尿酸の測定 ウリカーゼ（酵母由来、東洋紡績社製）５０，０００Ｕ
／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ１，５００
Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スル
ホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウ
ム塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝
８．５，５０ｍＭ）の試液２mlに尿酸（０〜５mg／dl）
を含む被検液１０μｌを加え、３７℃で５分間放置し
た。放置後、波長５９５ｎｍにて０mg／dl尿酸を対照に
吸光度を測定した。同様にして前記試液からＳＯＤを除
いて測定したものと比較し、その結果を図６に示す。
／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ１，５００
Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スル
ホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウ
ム塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩衝液（ｐＨ＝
８．５，５０ｍＭ）の試液２mlに尿酸（０〜５mg／dl）
を含む被検液１０μｌを加え、３７℃で５分間放置し
た。放置後、波長５９５ｎｍにて０mg／dl尿酸を対照に
吸光度を測定した。同様にして前記試液からＳＯＤを除
いて測定したものと比較し、その結果を図６に示す。
【００１７】実施例７ ガラクトースの測定 ガラクトースオキシダーゼ（ダクチリウム由来、東洋紡
績社製）１０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／
Ｌ、ＰＯＤ１，５００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ
〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェ
ニルメタン 六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−
コハク酸緩衝液（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）の試液２ml
にガラクトース（０〜５mg／dl）を含む被検液１０μｌ
を加え、３７℃で５分間放置した。放置後波長５９５ｎ
ｍにて０mg／dlガラクトースを対照に吸光度を測定し
た。同様にして前記試液からＳＯＤを除いて測定したも
のと比較し、その結果を図７に示す。
績社製）１０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／
Ｌ、ＰＯＤ１，５００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ
〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェ
ニルメタン 六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−
コハク酸緩衝液（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）の試液２ml
にガラクトース（０〜５mg／dl）を含む被検液１０μｌ
を加え、３７℃で５分間放置した。放置後波長５９５ｎ
ｍにて０mg／dlガラクトースを対照に吸光度を測定し
た。同様にして前記試液からＳＯＤを除いて測定したも
のと比較し、その結果を図７に示す。
【００１８】実施例８ 乳酸の測定 乳酸オキシダーゼ（ダクチリウム由来、旭化成社製）１
０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ
１，５００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ
（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩衝
液（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）の試液２mlに乳酸（０〜
５mg／dl）を含む被検液１０μｌを加え、３７℃で５分
間放置した。放置後波長５９５ｎｍにて０mg／dl乳酸を
対照に吸光度を測定した。同様にして前記試液からＳＯ
Ｄを除いて測定したものと比較し、その結果を図８に示
す。
０００Ｕ／Ｌ、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、ＰＯＤ
１，５００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ
（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−コハク酸緩衝
液（ｐＨ＝７．０，５０ｍＭ）の試液２mlに乳酸（０〜
５mg／dl）を含む被検液１０μｌを加え、３７℃で５分
間放置した。放置後波長５９５ｎｍにて０mg／dl乳酸を
対照に吸光度を測定した。同様にして前記試液からＳＯ
Ｄを除いて測定したものと比較し、その結果を図８に示
す。
【００１９】実施例９ グルコースオキシダーゼの活性測定 １４０ｍＭグルコース、ＳＯＤ１２０，０００Ｕ／Ｌ、
ＰＯＤ２，０００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，
Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメ
タン 六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−コハク
酸緩衝液（ｐＨ＝５．５，５０ｍＭ）３mlを３７℃の恒
温セル（１cm角）に入れ、２０分間放置する。セル内の
温度が一定になったならばグルコースオキシダーゼ（０
〜２００Ｕ／Ｌ）を含む被検液５０μｌを添加して、波
長５９５ｎｍにて吸光度の増加量を測定した。同様にし
てＳＯＤを含まない試液にて測定したものと比較し、そ
の結果を図９に示す。
ＰＯＤ２，０００Ｕ／Ｌ、４，４′，４″−トリ〔Ｎ，
Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリフェニルメ
タン 六ナトリウム塩１５０μＭを含むトリス−コハク
酸緩衝液（ｐＨ＝５．５，５０ｍＭ）３mlを３７℃の恒
温セル（１cm角）に入れ、２０分間放置する。セル内の
温度が一定になったならばグルコースオキシダーゼ（０
〜２００Ｕ／Ｌ）を含む被検液５０μｌを添加して、波
長５９５ｎｍにて吸光度の増加量を測定した。同様にし
てＳＯＤを含まない試液にて測定したものと比較し、そ
の結果を図９に示す。
【００２０】
【発明の効果】本発明の方法は、実施例に示された通り
ＰＯＤと前記一般式（Ｉ）で表わされるトリフェニルメ
タン誘導体を用い、ＳＯＤの存在下に行うことにより過
酸化水素濃度として０．１μＭ程度までの測定が可能で
ある。従来の方法に比べ２〜４倍の感度で行うことがで
きる。
ＰＯＤと前記一般式（Ｉ）で表わされるトリフェニルメ
タン誘導体を用い、ＳＯＤの存在下に行うことにより過
酸化水素濃度として０．１μＭ程度までの測定が可能で
ある。従来の方法に比べ２〜４倍の感度で行うことがで
きる。
【図１】本発明による過酸化水素の測定図である。
【図２】本発明による発色試薬として４，４′，４″−
トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリ
フェニルメタン 六ナトリウム塩を用いたグルコースの
測定図である。
トリ〔Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）アミノ〕トリ
フェニルメタン 六ナトリウム塩を用いたグルコースの
測定図である。
【図３】本発明による発色試薬としてビス〔４−〔（Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕
〔４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン
二ナトリウム塩を用いたグルコースの測定図である。
−エチル−Ｎ−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕
〔４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル〕メタン
二ナトリウム塩を用いたグルコースの測定図である。
【図４】本発明による発色試薬としてビス〔４−〔（Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕
（４−クロロフェニル）メタン 二ナトリウム塩を用い
たグルコースの測定図である。
−エチル−Ｎ−スルホプロピル）アミノ〕フェニル〕
（４−クロロフェニル）メタン 二ナトリウム塩を用い
たグルコースの測定図である。
【図５】本発明によりコレステロールを測定した時の測
定図である。
定図である。
【図６】本発明により尿酸を測定した時の測定図であ
る。
る。
【図７】本発明によりガラクトースを測定した時の測定
図である。
図である。
【図８】本発明により乳酸を測定した時の測定図であ
る。
る。
【図９】本発明によりグルコースオキシダーゼの活性を
測定した時の測定図である。
測定した時の測定図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 パーオキシダーゼ及び一般式 【化１】 で表わされるトリフェニルメタン誘導体を用いる過酸化
水素の測定方法において、スパーオキシドジスムターゼ
の存在下行うことを特徴とする該測定方法。（式中、Ｒ
1 及びＲ3 は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又
はスルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩
基の置換基を有する炭素数１〜４の置換アルキル基、 Ｒ2 及びＲ4 は、スルホ基、水酸基もしくはスルホ基の
アルカリ金属塩基の置換基を有する炭素数１〜４の置換
アルキル基、 Ｒ5 は、水素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、
炭素数１〜４のアルキル基又は−Ｎ（Ｒ9 ）Ｒ10で表わ
される基であり、 Ｒ9 は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は、スル
ホ基、水酸基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置
換基を有する炭素数１〜４の置換アルキル基、Ｒ10はス
ルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の
置換基を有する炭素数１〜４の置換アルキル基、Ｒ6 ，
Ｒ7 及びＲ8 は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基
又は炭素数１〜３のアルコキシ基である）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04358749A JP3097370B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 過酸化水素の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04358749A JP3097370B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 過酸化水素の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197795A JPH06197795A (ja) | 1994-07-19 |
| JP3097370B2 true JP3097370B2 (ja) | 2000-10-10 |
Family
ID=18460919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04358749A Expired - Fee Related JP3097370B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 過酸化水素の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3097370B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4489400B2 (ja) * | 2003-10-02 | 2010-06-23 | アークレイ株式会社 | 試薬の安定化方法 |
| BR112013009797A2 (pt) * | 2010-10-23 | 2020-06-09 | Pop Test LLC | método de produção de um dispositivo para condução de uma análise não invasiva e dispositivo para conduzir uma análise não invasiva |
| CN103760160B (zh) * | 2014-01-25 | 2015-10-14 | 福州大学 | 一种过氧化氢的比色检测方法 |
-
1992
- 1992-12-28 JP JP04358749A patent/JP3097370B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06197795A (ja) | 1994-07-19 |
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