JPS6258718B2 - - Google Patents

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JPS6258718B2
JPS6258718B2 JP55008850A JP885080A JPS6258718B2 JP S6258718 B2 JPS6258718 B2 JP S6258718B2 JP 55008850 A JP55008850 A JP 55008850A JP 885080 A JP885080 A JP 885080A JP S6258718 B2 JPS6258718 B2 JP S6258718B2
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JP
Japan
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aminoantipyrine
hydrogen peroxide
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dye
alkyl
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Teii Nitsukusu Hooru
Emu Fuiiruzu Supensaa
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EMD Millipore Corp
Original Assignee
Millipore Corp
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Publication date
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Publication of JPS6258718B2 publication Critical patent/JPS6258718B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、過酸化水素の定量分析に有用な試薬
及び方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
過酸化水素の酵素的定量分析用の新規な色原体試
薬、及び過酸化水素の酵素的定量分析における該
試薬の使用法に関する。 過酸化水素の定量分析法として既に種々の方法
が知られている。このような方法の中には、過酸
化酵素を使用して基質と過酸化水素との反応を触
媒することによつて基質を酸化させ且つ水を形成
することを含む種類の方法がある。この種の酵素
的定量法は、血液のような体液中の種々の物質、
たとえばコレステロール、グルコース及び尿酸の
分析に特に有用であつた。このような方法におい
ては体液が、定量すべき物質の酸化を触媒し且つ
同時に過酸化水素を生成することのできる酵素と
混合される。体液はまた、過酸化酵素及び酸化さ
れた時に色の変化を生ずるような過酸化酵素に対
する基質と混合される。色の変化度は過酸化水素
生成量の尺度となり、この過酸化水素量はまた測
定すべき物質の尺度となる。 たとえば、ホール（Hall）らは、「グルコース
酸化酵素及びフエロシアン化カリウムを用いるグ
ルコースの自動定量法（Automated
Determination of Glucose Using Glucose
Oxidase and Potassium Ferrocyanide）」，
Analyt.Biochem.，26，12―17（1968）におい
て、グルコースをグルコース酸化酵素で酸化して
グルコン酸及び過酸化水素を生成し、次いでこの
過酸化水素を過酸化酵素の存在下においてフエロ
シアン化カリウムで還元してフエリシアン化物を
生成することによる、グルコースの定量方法を述
べている。トリンダー（Trinder）は、「選択的
酵素受容体を有するグルコース酸化酵素を用いる
血液中グルコースの定量法（Determination of
Glucose in Blood Using Glucose Oxidase
With an Alternative Oxygen Acceptor）」，
Ann.Clin.Biochem.，６，24―27（1969）におい
て、フエロシアン化カリウムの代わりに発色系と
してフエノール及び４―アミノフエナゾーン（４
―アミノアンチピリン）を使用することを述べ
た。この系においては、フエノールが酸化され、
次いでそれが４―アミノフエナゾーンと反応して
キノンイミン染料を生成すると考えられている。
この反応はその前にエマーソン（Emerson）に
よつて「アミノアンチピリンの縮合。フエノー
ル系化合物用の新規な変色試験（The
Condensation of Aminoantipyrine．Ａ New
Color Test for Phenolic Compounds）」，J.Org.
Chem.，８，417―28（1943）及び米国特許第
2194201号（1940年３月19日に許可）にすでに記
載されていた。さらに最近、1975年５月27日に許
可された米国特許第3866045号（1977年12月20日
に許可された再発行特許第29498号）においてマ
イアツテイニ（Meiattini）は、エマーソンによ
つて述べられた反応体を前記トリンダー反応に適
用した。 この種の操作は、グルコース酸化酵素の代わり
に別の成分の酸化を触媒できる酵素、たとえば、
コレステロール酸化酵素もしくは尿酸酸化酵素
（尿酸分解酵素）を用いることによつて、過酸化
水素を同時に発生させながら、血液もしくはその
他の体液の別の成分を測定するのに使用すること
ができる。たとえば、この操作の血清中尿酸の定
量への応用については、トリベテイ（Trivedi）
らによつて「500nmにおける血清中尿酸のための
新規な酵素的方法（New Enzymatic Method
for Serum Uric Acid at 500nm）」，Clin.Chem.
，24，(11)，1908―11（1978）に記載されている。
しかしながら、通常血液中に極めて低濃度、たと
えば、４乃至９mg／100ml血液のオーダーで存在
する尿酸（これに対し、グルコースは80〜100
mg／100ml、コレステロールは150〜250mg／100ml
の濃度で存在する）のような代謝産物の定量に必
要とされる感度よりも、トリングー型発色団の感
度は低い。 この種の分析操作において過酸化水素検出体と
してこれまで用いられてきた、別の種類の色原体
―発色団系としては、３―メチル―２―ベンゾチ
アゾリノンヒドラゾン／Ｎ，Ｎ―ジメチルアニリ
ン系がある。この２つの試薬は酸化的にカツプリ
ングして、共有結合されたインダミン染料を形成
する。尿酸及びグルコース分析へのこの操作の応
用については、ゴツホマン（Gochman）らによ
つて、「尿酸分解酵素―過酸化酵素系の使用によ
る尿酸の自動定量（Automated Determination
of Uric Acid，With Use of ａ Uricase―
Peroxidase System）」，Clin.Chem.，17，(12)，
1154―59（1971）及び「グルコース酸化酵素によ
るグルコースの特異的自動定量への、新規過酸化
物反応の応用（Application of ａ New
Peroxide Indicator Reaction to the Specific，
Automated Determination of Glucose with
Glucose Oxidase）」，Clin.Chem.，18，(9)，943
―50（1972）中に報告された。 本発明は、過酸化水素の酵素的定量のための新
規な色原体―発色団系に関する。さらに詳しく
は、本発明は、過酸化水素の中間生成を経て血液
成分の酵素的定量をするのに使用可能である新規
な色原体―発色団系に関する。この系は、発色団
の吸光係数が著しく大きいため、通常低濃度で存
在する尿酸のような成分を定量するのに必要とさ
れる感度を有する。 従つて、本発明の目的は、過酸化水素定量用の
新規な試薬及び方法を提供することにある。 本発明の別の目的は、過酸化水素の酵素的定量
用の新規な試薬及び方法を提供することにある。 本発明のさらに別の目的は、過酸化水素を中間
体として酵素的に生成し、次いで得られた過酸化
水素を酵素的に定量することによる、体液成分定
量の新規な試薬及び方法を提供することにある。 本発明の前記及びその他の目的は、この明細書
及び特許請求の範囲から明らかであろう。これら
の目的は、新規な着色染料、すなわち、発色団を
形成するのに充分な条件下において、色原体とし
ての３―アミノ芳香族酸（後述の通り）と４―ア
ミノアンチピリン（後述の通り）との混合物に過
酸化水素を接触せしめることによつて達成するこ
とができる。 本発明に従つて使用されるアミノ芳香族酸は３
―アミノ安息香酸または３―アミノベンゼンスル
ホン酸である。かかる酸は、構造式（）： 〔式中、Ｘはモノ―もしくはジアルキルアミノ
基であり、ZHはカルボキシル（―CO2H）もしく
はスルホ（―SO3H）基である〕によつて表わす
ことができる。アルキルアミノ基のアルキル基の
種類、望ましい染料が形成されさえすれば、重大
な問題ではない。従つて、第三アルキルまたはシ
クロアルキル基のような嵩高い基を用いるべきで
はないことは本明細書中の検討から明白となるで
あろう。第一アルキル基が好ましい。アルキル基
の長さは、アミノ芳香族酸及び生成される染料が
水性媒体中に可溶性でありさえすれば、アルキル
基の長さは重大な問題ではない。しかしながら、
低級アルキル基、すなわち、炭素数約１乃至約６
のアルキル基（たとえば、メチル、エチル、プロ
ピル、ブチル、ペンチル及びヘキシル）が好まし
い。ジアルキルアミノ基が好ましく、中でも特に
ジメチルアミノ基が好ましい。置換基が染料の形
成を妨害しないのであれば、アミノ芳香族酸は芳
香族炭化水素（すなわち、ベンゼン環）上に置換
基を有していてもよい。たとえば、１もしくはそ
れ以上のハロゲン原子、たとえば、塩素もしくは
臭素原子が存在することができる。しかしなが
ら、アルキルのような不活性置換基は、アミノ基
に対してパラ位に存在すべきでないと考えられ
る。 本発明の試薬の第二成分は一般式： （式中、Ｒ及びR1は各々独立してアルキルで
あり；R2は芳香族基であり；R3及びR4は各々独
立して水素もしくはアルキルであり；そしてＹは
酸素もしくは硫黄である）で表わされる４―アミ
ノアンチピリンである。アミノ芳香族酸の場合と
同様に、アミノアンチピリンのアルキル基（すな
わち、Ｒ，R1，R3及びR4置換基）は第三アルキ
ルのような嵩高い基であるべきでなく、それらの
鎖の長さはアミノアンチピリン及び生成する染料
の溶解性によつて限定される。低級アルキル基、
中でも特にメチル基が好ましい。４―アミノ基が
第一アミノ基であること、すなわち、R3及びR4
が共に水素であることが望ましい。これは、かか
る化合物を使用することによつてより急速な反応
がもたらされ且つより濃い色が生ずるからであ
る。R2によつて表わされる芳香族基はフエニル
もしくは置換されたフエニルであることが好まし
い。フエニル置換基は低級アルキルもしくはハロ
ゲンであることが望ましい。好ましい４―アミノ
アンチピリン試薬は、４―アミノアンチピリンで
ある。 アミノ芳香族酸（）とアミノアンチピリン
（）との混合物を過酸化水素と接触せしめるこ
とによつて形成される染料は、トリンダー、エマ
ーソン及びマイアツテイニに従つて形成される型
のキノンイミン型ではない。これらの引用文に記
載の染料は、アミノアンチピリン上に未置換４―
アミノ基を必要とし、下記式： に従つて共有結合された染料が形成される。 エマーソンもまた、彼の米国特許第2194201号
及び彼の初期の論文（Eisenstaedt）、，「酸化剤存
在下におけるアミノアンチピリンと芳香族アミン
との縮合（The Coudensation of
Aminoantipyrine With Aromatic Amines in
the Presence of Oxidizing Agents）」，J.Org.
Chem.，３，153〜65（1938）中において、アミ
ノベンゼン（たとえば、アニリン及びジメチルア
ニリン）と４―アミノアンチピリンとの反応につ
いて述べた。ここでもまた、共有結合された染料
が形成され、４―アミノアンチピリンの４―アミ
ノ基は未置換でなければならない。 これに対し、本発明の染料は、アミノアンチピ
リンの４―アミノ基が置換されている場合でも形
成される。たとえば、過酸化水素及び過酸化酵素
の存在下において３―（ジメチルアミノ）安息香
酸を４―アミノアンチピリンもしくは４―（ジメ
チルアミノ）アンチピリンと反応せしめると、
550nmに吸収極大を有する青色の染料が形成され
る。３―（ジメチルアミノ）安息香酸の代わりに
フエノールもしくはｐ―ヒドロキシ安息香酸ナト
リウムを用いると、４―アミノアンチピリンによ
つて500nmに吸収極大を有する赤色の染料が形成
されるが、４―（ジメチルアミノ）アンチピリン
とは実質的に反応がおこらない。エマーソン
（Eisenstaedt）によれば、Ｎ，Ｎ―ジメチルアニ
リンと４―アミノアンチピリンとの反応によつて
イミノ染料が形成されるのに対し、４―アミノア
ンチピリンの代わりに４―（Ｎ，Ｎ―ジメチルア
ミノ）アンチピリンを用いると青色の酸化された
４―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）アンチピリンし
か形成されない。 本発明に従つて３―（ジメチルアミノ）安息香
酸によつて形成される染料生成物は、フエノー
ル、ｐ―ヒドロキシ安息香酸ナトリウムもしくは
ジメチルアニリンから形成される、共有結合され
たイミン染料よりも水によく溶解する。他方、本
発明に係る染料生成物は、イミン型染料よりも、
クロロホルムもしくはシクロヘキサンのような有
機溶媒に溶解しにくい。 このことから、本発明に従つて形成された染料
は、各々一般式（―Ａ）及び（―Ａ）： （式中、X′はアルキルイミノもしくはジアル
キルイミノ基であり；Ｚはカルボキシルもしくは
形成される残基であり；そしてＹ，Ｒ，R1，R3
及びR4は前述の通りである）によつて表わされ
るアミノ芳香族酸遊離基と４―アミノアンチピリ
ン遊離基との電荷移動錯体であると考えられる。
この錯体の正確な構造ははつきりと立証されてい
ないが、４―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）アンチ
ピリン及び３―（ジメチルアミノ）安息香酸から
形成される錯体によつて説明されるように、以下
の構造が考えられる。 前述の理論が正しいのならば、いずれの部分に
おいても嵩高い置換基は電荷移動錯体の形成を妨
害できるし、その形成を止めることさえもあり得
ることがわかるであろう。嵩高い置換基が望まし
くないのはこのためである。理論にかかわらず、
本発明に従つて形成される染料は、先行技術のイ
ミン型染料ではないことが明白である。 この型の電荷移動錯体は、エマーソン
（Eisenstaedt）によつて述べられたＮ，Ｎ―ジメ
チルアニリンと４―アミノアンチピリンとの反応
において中間体として形成されると考えられる。
また、Eisenstaedtによつて報告された４―
（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）アンチピリンの青色
は、中間体のためだつたのかもしれない。しかし
ながら、Ｎ，Ｎ―ジメチルアニリンは分析試薬系
に使用するには適当ではない。まず第一に、Ｎ，
Ｎ―ジメチルアニリンの反応速度は、本発明に従
つて使用されるアミノ安息香酸よりも遅い。さら
に、ジメチルアニリンは水もしくは水性媒体とそ
れほど混和性のない油状液体である。従つて、染
料形成速度は非直線的であり、このためにジメチ
ルアニリンは事実上、分析系に用いることができ
ない。 アミノ芳香族酸（）及びアミノアンチピリン
（）の反応によつて形成される染料は一般に、
概ね450〜650nmの範囲に吸収極大を有する。こ
れらはまた、吸光係数が高いことを特徴とする。
たとえば、３―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）安息
香酸及び４―アミノアンチピリンから得られる染
料は550nmに吸収極大を有し、吸光係数が1.72×
104mole-1cm-1である。この極めて強い吸収の
ために、これらの染料は低濃度の過酸化水素を検
出するための分析にも用いることができる。たと
えば、通常は少量で存在する（たとえば、血液中
の尿酸）かあるいは分析前に体液が稀釈されるた
めに低濃度で存在する体液成分を分析するのにこ
れらの染料を用いることができる。 本発明の染料は、トリンダー，エマーソン及び
マイアツテイニの教示に従つて形成されるイミン
染料よりも安定性が低い。先行技術の染料は、染
料として使用可能な、極めて安定性のある共有結
合性化合物である。これに対し、本発明の染料
は、分析操作に有用な程度には充分に安定性があ
る一方、比較的に短時間で分解する。 染料の寿命が比較的に短かいため、反応混合物
中の染料の濃度は時間と共に変化する。最初にそ
の濃度は最大濃度まで増大し、次いで減少する。
染料の形成及び分解速度ならびに染料が最大濃度
に達する時間は、反応条件、特に酸（）のアン
チピリン（）に対する割合、これらの反応体の
絶対濃度及び反応温度に依存する。たとえば、こ
れらの各変数は、所定の時間内に定量分析に必要
な染料の濃度が達成されるように調整しなければ
ならない。さらに、染料を検出し且つ所定の分析
を行なうために有効な時間幅を達成するために、
染料濃度が最大濃度もしくはそれに近い濃度であ
る時間を変化させることができる。 染料を形成するために反応に使用されるアミノ
芳香族酸（）と４―アミノアンチピリン（）
との比率は、所望の染料が形成されさえすればそ
れほど重大な問題ではない。しかしながら、一般
に、使用可能な比率は、アミノアンチピリン
（）１モルあたりアミノ芳香族酸（）約0.1乃
至約25モルの範囲内にあろう。最適比は主とし
て、望ましい染料形成速度の関数である。酸
（）のアンチピリン（）に対する比が増加す
るにつれて、染料の形成速度も増加する。しかし
ながら、反応に関わると考えられる遊離基の種類
によつては、酸（）の比率の増加が生成染料の
寿命の短縮につながる。たとえば、反応速度を最
適化するために、そして適当な時間内に定量をす
ることができるようにそして／または有効な寿命
を有する最大染料濃度を形成するために、２成分
の比率を調整する必要がある。最適比は、４―ア
ミノアンチピリンのアミノ基が置換されるか否か
によつて変化するであろう。４―アミノ基が第一
アミン基である場合には、酸（）のアンチピリ
ン（）に対する比率は約10：１、すなわち、約
８：１乃至約12：１が好ましい。しかしながら、
アミノ基が第三アミノ基である場合には、酸
（）のアンチピリン（）に対する最適比は
１：１以下、好ましくは約0.25：１（すなわち、
約0.2：１乃至約0.3：１）である。 二種の色原体の濃度は測定可能な量の染料を形
成するのに充分なものである。一般に、アミノア
ンチピリンの濃度は、約0.01乃至約1000ミリモ
ル／の範囲、特に約0.1乃至約５ミリモル／
の範囲であることができる。中でも、約0.35乃至
約0.5ミリモル／の範囲のアミノアンチピリン
濃度が好ましい。アミノ酸の濃度は、所定の時間
内に染料を形成するのに必要な濃度であり、0.1
ミリモル／から溶解限界（すなわち、約50ミリ
モル／）まで変化可能である。 前述のように、２種の色原体と過酸化水素との
反応は過酸化酵素によつて触媒される。周知の通
り、この酵素は西洋わさび、肝臓、パセリ及びあ
る種の細菌を含む種々の源から得られる。異なる
源から得られる過酸化酵素の性質は異なるが、本
発明に特定の過酸化酵素源が限定されることはな
い。しかしながら、西洋わさびの過酸化酵素が最
も普通の形の過酸化酵素であり、そのために西洋
わさびの過酸化酵素が好ましい。過酸化酵素の使
用量は本発明の特徴ではなく、先行技術において
用いられた量を使用することができる。しかしな
がら、過酸化酵素は一般には溶液１あたり少な
くとも50単位、好ましくは少なくとも500単位／
で用いられる。原則的には最大量はないが、約
2500単位／以上の過酸化水素量は不必要であ
り、約1200乃至約1600単位／の範囲の量が好ま
しい。 反応がおこる温度及び反応混合物のPHは共に、
染料形成速度及び染料の安定性に影響を与える。
一般に、反応速度は温度の上昇に伴つて増加し、
染料の安定性は温度が上昇するにつれて低減す
る。一般に有効な温度は、概ね室温（すなわち約
20乃至45℃、好ましくは25乃至約30℃）である。
さらに、周知の通り、過酸化酵素の活性はPH約
6.8、すなわち、約6.5乃至約7.0において最適であ
る。 しかしながら、発明を体液成分の酵素的分析の
一部分として使用する場合には、全反応系を最適
化するために温度及びPHを調整する必要があるか
もしれない。たとえば、コレステロールを分析す
る場合には、温度約30℃及びPH約7.5が好まし
く；グルコースを分析する場合には、温度約25℃
及びPH約7.0が好ましく；尿酸を分析する場合に
は、温度約25℃及びPH約8.0が好ましい。 酵素的反応にはPHが重要であるため、分析に必
要な時間の間望ましいPH値を保持できるように作
られた緩衝液を用いるのが望ましい。このような
緩衝液としては、リン酸塩、ピロリン酸塩、硼酸
塩及びその他の公知の緩衝液、たとえば、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔「トリス
（tris）」〕、Ｎ，Ｎ，Ｎ―トリス（２―ヒドロキシ
エチル）メチル―２―アミノメタンスルホン酸
〔「テス（TES）」〕、Ｎ―（２―ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン―N′―２―エタンスルホン酸
〔「ヘペス（HEPES）」〕、Ｎ，Ｎ―ビス（２―ヒド
ロキシエチル）グリシン〔「ビシン（bicine）」〕、
Ｎ，Ｎ，Ｎ―トリス（２―ヒドロキシエチル）メ
チルグリシン〔「トリシン（tricine）」〕、ピペラジ
ン―Ｎ，Ｎ―ビス（２―エタンスルホン酸）〔「ピ
ペスPIPES）」〕、Ｎ，Ｎ―ビス（２―ヒドロキシ
エチル）―２―アミノエタンスルホン酸〔「ベス
（BES）」〕等が挙げられる。 本発明を体液の特定の成分の分析に用いる場合
にはまた、その成分の酸化による過酸化水素の形
成を触媒できる酵素を用いる。このような酵素は
一般に「酸化酵素」として知られており、グルコ
ース酸化酵素、コレステロール酸化酵素及び尿酸
酸化酵素を含む。このような酸化酵素の量は公知
であるため、本発明の新規な特徴ではない。 本発明の一実施態様においては、所望の成分を
所定の比率で含む分析キツトもしくは系が提供さ
れる。これらの成分は別々に包装してもよいし、
２またはそれ以上の成分を混合してもよい。アミ
ノ芳香族酸（）及びアミノアンチピリン（）
が共に安定な固体であることは、本発明の利点で
ある。このようなキツトにおいては、酵素は乾燥
固体として包装するのが望ましい。 キツトが過酸化水素分析用である場合には、キ
ツトは過酸化酵素、アミノアンチピリン及びアミ
ノ芳香族酸を含んでいなければならない。このよ
うなキツトにおいて、アミノアンチピリン及びア
ミノ芳香族酸は別々に包装するのが望ましい。過
酸化酵素は別々に包装してもよいし、これらの成
分のいずれか一方もしくは両方と混合してもよ
い。同様に、キツトが血液成分の分析用である場
合には、追加の酵素（望ましくは、乾燥形態）が
追加の成分として含まれる。これらは別々に包装
してもよいし、その他の１もしくはそれ以上の成
分との混合物であつてもよい。また、キツトは緩
衝液を含むことが望ましい。これは別々に包装し
てもよいし、あるいはアンチピリン、アミノ芳香
族酸及び過酸化酵素の１もしくはそれ以上と混合
してもよい。あるいは、固体成分全てを単一の混
合物として包装してもよい。これに比べて望まし
くないことではあるが、１もしくはそれ以上の成
分を濃縮物としてまたは概ね使用濃度において水
溶液の形態で包装することができる。 キツトを分析に使用する場合には、成分は合わ
せて混合し、必要に応じて水に溶解せしめるかま
たは水で稀釈し、そして一般に知られている手法
によつて目的とする分析を行なうのに用いる。す
なわち、分析すべき溶液と種々の成分とを混合
し、そして得られた混合物を所定の温度に保持し
て本発明の染料を形成せしめる。然る後に、従来
の光度分析によつて染料の濃度を測定する。この
ような分析は、すでに公知の装置及び手法を用い
て手動でまたは自動的に実施することができる。
従つて、手法についてはここでさらに論じないも
のとする。 以下の例は、本発明、特に体液成分の定量への
本発明の使用を説明するものである。 例 尿酸の分析（手動） 尿酸分析酵素200単位／、過酸化酵素1400単
位／、４―アミノアンチピリン0.35ミリモル／
、トリス緩衝剤100ミリモル／及び３―
（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）安息香酸5.0ミリモ
ル／を含むPH８の水溶液を調製した。25℃にお
いてこの試薬2.0mlに50μの尿酸含有検体を加
えた。検体を試薬に添加後直ちに、550nmにおけ
る吸光度を測定した。６分後に再び吸光度を測定
した。以下の式： Ｃua＝ΔＡ（ＭＷｕａ）（１０３）（ＴＶ）／（ε）
（ＬＰ）（１０）（ＳＶ） によつて尿酸濃度を計算した。 上記式において、 Ｃua＝尿酸の濃度（mg／dl） ΔＡ＝吸光度の変化、すなわち、最初の吸光度
と６分後の吸光度との差 MWua＝尿酸の分子量（168.11ダルトン） TV＝全反応容積（ml） LP＝光路（cm） ε＝染料生成物のモル吸光係数 （1.72×104 1mole-1cm-1） SV＝試料容積（ml） である。 使用した系において、前記式はＣua＝40.0ΔＡ
となつた。 ９種の異なる尿酸標準検体を用いて前記操作を
くり返した。各検体に対し、「スタツトザイム尿
酸」試薬（“Statzyme Uric Acid”Reagent）
〔ミリポア社のワシントン ダイアグノステイツ
クス デイビジヨン（Worthington Diagnostics
Division of Millipore Corp.）から尿酸分析用と
して市販されている入手可能な試薬〕を用い且
つ、比較のために293nmにおける吸光度を測定す
ることによつて、二重反復測定を行なつた。種々
の分析の結果を以下の第１表に示す。
【表】 前記第１表から、本発明に係る試薬を用いて得
られた分析結果は先行技術に係る試薬を用いて得
られた分析結果に匹敵することがわかる。 この例に用いた試薬濃度は、ここで使用した化
学薬品に対して最適のものである。しかしなが
ら、以下の濃度： 尿酸分解酵素 〓10単位／ 過酸化酵素 〓50単位／ ４―アミノアンチピリン
0.01乃至1000ミリモル／ トリス緩衝剤 10乃至1000ミリモル／ ３―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）安息香酸 0.1乃至50ミリモル／ PH 6.2―9.5. によつても有効な結果を得ることができる。この
分析は、20乃至45℃において約１乃至約30分間
（好ましくは約５乃至約10分間）の反応時間を用
いて450〜650nmの範囲内で吸光度を測定するこ
とによつて行なえばよい。これらの条件下におい
て分析の感度は0.01乃至0.04吸光度単位／ミリグ
ラム％であり、ここに示した例においては0.025
吸光度単位／ミリグラム％であつた。 例 グルコースの分析（手動） グルコース酸化酵素14042単位／、過酸化酵
素766単位／、４―アミノアンチピリン0.35ミ
リモル／、リン酸塩緩衝剤109ミリモル／及
び３―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）安息香酸1.0
ミリモル／を含むPH７の水溶液を調製した。25
℃においてこの試薬3.5mlに10μのグルコース
含有検体を加えた。検体を試薬に添加後直ちに
550nmにおける吸光度を測定し、６分後に再び吸
光度を測定した。グルコース濃度を以下の式： Ｃg＝ΔＡ（ＭＷｇ）（１０３）（ＴＶ）／（ε）（
ＬＰ）（１０）（ＳＶ） によつて計算した。 上式において、 Ｃg＝グルコースの濃度（mg／dl） ΔＡ＝吸光度の変化、すなわち、最初の吸光度
と６分後の吸光度との差 MWg＝グルコースの分子量（180.16ダルト
ン） TV＝全反応容積（ml） LP＝光路（cm） ε＝染料生成物のモル吸光係数 （1.72×1041mol-1cm-1） SV＝試料容積（ml） である。 使用した系において、前記式はＣg＝367.6ΔＡ
となつた。分析の感度は0.213吸光度単位／mg％
であつた。 ９種の異なるグルコース標準検体を用いて前記
操作をくり返した。各検体に対し、「スタツトザ
イムグルコース500（Statzyme Glucose500）」
〔ミリポア社のワシントン ダイアグノステイツ
クスデイビジヨンから市販されている、ｐ―ヒド
ロキシ安息香酸ナトリウム及び４―アミノアンチ
ピリンを含む入手可能な試薬〕を用い且つ比較の
ために500nmにおける吸光度を測定することによ
つて、二重反復測定を行なつた。種々の分析の結
果を以下の第２表に要約する。
【表】
【表】 検 体 先行技術 本 発 明

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 水性媒体中の過酸化水素を検出するにあた
    り、 (a) 該水性媒体に、(1)過酸化酵素、(2)一般式
    （） （式中、Ｘはモノ―もしくはジアルキルアミ
    ノ基であり、ZHはカルボキシル基もしくはス
    ルホ基である）で表わされるアミノ芳香族酸及
    び(3)一般式（） （式中、Ｒ及びR1は各々独立してアルキル
    であり；R2は芳香族基であり；R3及びR4は
    各々独立して水素もしくはアルキルであり；そ
    してＹは酸素もしくは硫黄である）で表わされ
    る４―アミノアンチピリンを加え；次いで (b) 生じた色の変化を光度測定することを含んで
    なる水性媒体中過酸化水素の検出方法。 ２ 体液と(a)該体液中の成分の酸化を促進し且つ
    過酸化水素を形成することのできる酵素；(b)過酸
    化酵素及び(c)過酸化酵素で触媒される過酸化水素
    との反応によつて酸化されて発色団を形成するこ
    とができる色原体とを混合し、その結果生じた色
    の変化を測定することによつて体液中の該成分量
    を酵素的に定量する方法において、 該色原体が(1)一般式（） （式中、Ｘはモノ―もしくはジアルキルアミノ
    基であり、ZHはカルボニルもしくはスルホ基で
    ある）で表わされるアミノ芳香族酸と(2)一般式
    （） （式中、Ｒ及びR1は各々独立してアルキルで
    あり；R2は芳香族基であり；R3及びR4は各々独
    立して水素もしくはアルキルであり；そしてＹは
    酸素もしくは硫黄である）で表わされる４―アミ
    ノアンチピリンとの混合物であることを特徴とす
    る体液中成分量の酵素的定量方法。 ３ (1)過酸化酵素、(2)一般式（） （式中、Ｘはモノ―もしくはジアルキルアミノ
    基であり、ZHはカルボキシルもしくはスルホ基
    である）で表わされるアミノ芳香族酸及び(3)一般
    式（） （式中、Ｒ及びR1は各々独立してアルキルで
    あり；R2は芳香族基であり；R3及びR4は各々独
    立して水素もしくはアルキルであり；そしてＹは
    酸素もしくは硫黄である）で表わされる４―アミ
    ノアンチピリンを含んでなる、水性媒体中の過酸
    化水素を検出するための試薬系。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4291121A (en) * 1979-04-13 1981-09-22 Miles Laboratories, Inc. Bilirubin-resistant determination of uric acid and cholesterol
DE3037342A1 (de) * 1980-01-09 1981-07-16 Dojindo Laboratories, Kumamotoshi N-sulfoalkylanilinderivate und ihre verwendung
IT1130252B (it) * 1980-02-04 1986-06-11 Elvi Spa Metodo per l'eliminazione dell'interferenza da biliribuna nel dosaggio di perossido di idrigeno mediante una reazione di trinder modificata
US4394512A (en) * 1980-02-05 1983-07-19 Boehringer Mannheim Gmbh 1-(Substituted phenyl) aminoantipyrin compounds
JPS57174099A (en) * 1981-04-17 1982-10-26 Fuji Photo Film Co Ltd Color indicator composition for detecting hydrogen peroxide and quantitative analytical film having reagent layer containing the same
IT1137075B (it) * 1981-05-28 1986-09-03 Chemical Lab S R L Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione
DE3124594A1 (de) * 1981-06-23 1983-01-05 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Mittel und verfahren zum nachweis von wasserstoffperoxid
DE3125667C2 (de) * 1981-06-30 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Mittel zum Nachweis von Wasserstoffperoxid
IT1168043B (it) * 1981-10-22 1987-05-20 Sclavo Inst Sieroterapeut Cromogeno per la determinazione colorimetrica dei perossidi e metodo impiegante lo stesso
JPS58124771A (ja) * 1982-01-18 1983-07-25 Fuji Photo Film Co Ltd ４−アミノ−２，３−ジ置換−１−（モノまたはトリクロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オン
US5047327A (en) * 1982-04-02 1991-09-10 Ivan E. Modrovich Time-stable liquid cholesterol assay compositions
US4427770A (en) 1982-06-14 1984-01-24 Miles Laboratories, Inc. High glucose-determining analytical element
JPS5954962A (ja) * 1982-09-22 1984-03-29 Fuji Photo Film Co Ltd 多層分析材料
EP0108526A3 (en) * 1982-11-01 1984-07-11 Beckman Instruments, Inc. Method and reagent for the determination of peroxide and precursors thereof
DE3433946A1 (de) * 1984-09-15 1986-03-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Mittel und verfahren zum nachweis von wasserstoffperoxid
US4672029A (en) * 1984-12-06 1987-06-09 Eastman Kodak Company Color-forming couplers and their use in the analytical determination of hydrogen peroxide or other analytes
EP0196743A3 (en) * 1985-01-31 1988-10-19 Savyon Diagnostics Ltd. Stable chemical compositions containing chromogenic materials and peroxides, and method for obtaining them
IL74205A (en) * 1985-01-31 1990-01-18 Savyon Diagnostics Ltd Method for carrying out enzyme assays utilizing stable chemical compositions containing hydrogen peroxide and a chromogen
CA1322326C (en) * 1987-09-16 1993-09-21 Josefina Tecson Baker Test for fecal occult blood
US5310680A (en) * 1987-09-16 1994-05-10 Smithkline Diagnostics, Inc. Test for fecal occult blood
JPH0257200A (ja) * 1988-08-22 1990-02-26 Konica Corp パーオキシダーゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法
US5518891A (en) * 1993-03-25 1996-05-21 Actimed Laboratories, Inc. Dye forming composition and detection of hydrogen peroxide therewith
US5447868A (en) 1993-09-14 1995-09-05 Propper Manufacturing Co. Inc. Method, reagent and kit for the detection of fecal occult blood
JPH07155196A (ja) * 1993-12-10 1995-06-20 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 生体成分の測定法
US5776719A (en) * 1997-07-07 1998-07-07 Mercury Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions and devices utilizing same
US5989845A (en) * 1996-04-05 1999-11-23 Mercury Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions and devices utilizing same
US6040151A (en) * 1998-03-10 2000-03-21 Mercury Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions and devices utilizing same
US6251083B1 (en) 1999-09-07 2001-06-26 Amira Medical Interstitial fluid methods and devices for determination of an analyte in the body
WO2019216406A1 (ja) * 2018-05-10 2019-11-14 東洋紡株式会社 生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2194201A (en) * 1938-06-11 1940-03-19 Edgar I Emerson Organic compound and method of producing the same
GB1385320A (en) * 1971-09-22 1975-02-26 Nat Res Dev Cholesterol assay
GB1385319A (en) * 1971-09-22 1975-02-26 Nat Res Dev Enzyme preparations
USRE29498E (en) 1972-05-12 1977-12-20 Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano "SCLAVO", S.p.A. Process for the enzymatic determination of glucose with a glucose-oxydazed/peroxidazed enzyme system
US4089747A (en) * 1976-08-09 1978-05-16 Eastman Kodak Company Compositions for the detection of hydrogen peroxide
IT1077056B (it) * 1976-10-06 1985-04-27 Sclavo Inst Sieroterapeut Composizione adatta alla determinazione di perossidi e metodo impiegante la stessa
FR2383443A1 (fr) * 1977-03-07 1978-10-06 Bretaudiere Jean Pierre Procede de dosage enzymatique de l'acide urique

Also Published As

Publication number Publication date
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FR2476129B1 (ja) 1983-12-30
FR2476129A1 (fr) 1981-08-21
GB2043891B (en) 1983-06-15
CA1125770A (en) 1982-06-15
JPS55131400A (en) 1980-10-13
DE3003490C2 (ja) 1990-08-30
DE3003490A1 (de) 1980-08-14
US4247631A (en) 1981-01-27

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