JPH0257200A - パーオキシダーゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特定成分の測定方法に関し、特にツク−オキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法に関する
。

〔発明の背景〕

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開発
されて来ているが、それらの方法の中量も精度の高い方
法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合しう
る物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗
体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プ
ロティンＡとＩｇＧ１ホルモンとレセプタ、酵素と基質
等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている。

−収約には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変化
した該標識のシグナルを検出することにより特定成分の
測定が行われる。

特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固
定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを
検出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲル
からニトロセルローズ膜上に転写担持し、標識体たとえ
ば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、ＴＬ
Ｃプレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体を反
応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮＡと該ＤＮ
Ａに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応させシグナル
を検出する方法或は免疫組織化学染色法などである。

これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報をう
ろことができる。例えば電気泳動後膜上に転写、担持さ
れた蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開した脂質成分
等の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを結
合させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては特
定成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分子
量、等電点或は極性等の情報かえられる。

また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とする
特定成分の存在場所、状態等の情報かえられる。

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた複
合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検
出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量で
あるため標識が高感度に検出されること、また特定成分
に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高い
分解能をもったものであることが必須である。

この要求を満たすために、従来から特異結合物質の標識
としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素
等が用いられている。

しかしながら、これらのうち放射性同位元素を用いた場
合は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費に巨費を要す
る等の問題があり、更に支持体に担持させた標識体上に
シグナルを検出する際には写真感光材料の感光、現像な
ど長い時間と煩雑な操作を要する欠点がある。

また、蛍光物質もしくは発光物質を用いる場合は特殊な
装置、設備が必要である。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標識
酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ＝３ 等が用いられてきた。支持体上に担持せしめた複合結合
体上に酵素反応により色素を生成、沈着させる方法にお
いて、標識酵素としてノく−オキシダーゼが主として用
いられ、その際、基質として、従来ジアミノベンジジン
、０−ジアニシジン、４−クロル−１−ナフトール等が
使用されてきＩこ。

しかしながら、ジアミノベンジジンやＯ−ジアニシジン
は毒性が強くバックグランドが出やすし１欠点がある。

４−クロル−１−ナフトールは地番こ比べやや感度が高
いが、より微量の特定成分を測定するため、もしくは、
特定成分に対するより多くの情報を明確に得るには、感
度は充分とは言えない。

本発明者は、すでに簡易に且つ高感度、高分解であり、
しかも迅速な特定成分の測定方法を開発し、特開昭６１
−１５０７２３号に開示した。すなわち、測定対象の特
定成分と、パーオキシダーゼを標識として有する標識体
とからなる複合結合体を支持体上に担持せしめ、該複合
結合体上にノく−オキシダーゼの酵素反応によって色素
を形成、沈着せしめる測定方法において、該酵素反応の
基質として過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及び
フェノール化合物の三者を用いる測定方法である。

測定対象の特定成分とパーオキシダーゼを標識として有
する標識体とからなる複合結合体を支持体上に担持せし
め、該複合結合体上にパーオキシダーゼの酵素反応によ
って色素を形成、沈着せしめる特定成分の測定方法にお
いて、一般に使用させる支持体は膜状支持体である。膜
状支持体のうちでも親水性であるニトロセルロースの膜
が最も広く用いられている。

しかしながら、パーオキシダーゼの酵素反応の基質とし
て、過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及びフェノ
ール化合物の三者を用いる上記特定成分の高感度測定方
法においては、支持体としてニトロセルロース膜を用い
た場合には、膜上に形成、沈着された色素が長期保存に
おいて特に光による影響で経時的に分解される事が明ら
かとなった。このような色素分解は、特定成分の測定の
正確さや、記録の長期保存の面で大きな問題となる。

〔発明の目的〕

前記の状況に照し、本発明の目的は生成色素の分解が抑
制された安定なかつ高感度な特定成分の測定方法の提供
にある。

〔発明の構成〕

前記した本発明の目的は、測定対象の特定成分と、パー
オキシダーゼを標識として有する標識体とから成る複合
結合体を支持体上に担持せしめ、該複合結合体上に、パ
ーオキシダーゼの酵素反応によって色素を形成、沈着せ
しめる特定成分の測定方法において、該酵素反応の基質
として過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及びフェ
ノール化合物の三者を用い、かつ支持体として疎水性の
膜を用いる事を特徴とする特定成分の測定方法により達
せられる。

本発明に使用し得る支持体である疎水性の膜とは、疎水
性の高分子材料で作られた膜である。疎水性の高分子材
料とは、水に対し親和性を持たず、水を吸収しにくい性
質を持つ材料であり、ＡｓＴＭ規格ＤＳ７０の試験法に
より吸水率が０．５％以下のものが好ましい。更に０．
１％のものがより好ましく、０．０２％以下のものが特
に好ましい。

疎水性の高分子材料の例としては、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリアセタール、ポリスチレン、エポキシ
樹脂、ポリカーボネート、弗素樹脂、ポリ塩化ビニリデ
ン等が挙げられる。より好ましい例としては弗素樹脂で
あり、特に好ましい例としては、ポリ弗化ビニリデンで
ある。

疎水性の膜は、水との親和性が乏しく、水を反撥するた
め、使用に際してはウェッティング操作により、水とな
じませる事が必要とされる場合がある。ウェッティング
操作は、メタノール等、水と相溶性のある適当な有機溶
剤中に膜を充分浸漬した後、水又は目的とする緩衝液中
に浸漬する事により行われる。

特性成分、特異結合物質、複合結合体等の任意の物質の
膜への担持は水になじませた膜と接触させる事により行
われる。

本発明において、特定成分は支持体である疎水性の膜に
物理的吸着もしくは共有結合のような化学的結合等によ
り直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異結合物質
を介して間接的に担持されてもよい。又、特定成分を膜
上に直接もくくは間接的に担持せしめた後、前記標識体
を反応させ前記複合結合体を形成させてもよいし、或は
複合結合体を形成せしめた後に該複合結合体を膜上に直
接もしくは間接的に担持せしめてもよい。更に標識体は
該特定成分と複合結合体を形成し、膜に担持されるが、
特定成分と標識体は直接結合してもよく、１つ以上の他
の特異結合物質を介して結合してもよい。なおここで、
膜上に担持せしめるとは、膜の表面又は内部に固定化し
支持体から脱離できない状態にすることを意味する。

また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗パーオ
キシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識したも
のであってもよい。

複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反応には、過酸
化水素、芳香族第一級アミン化合物、フェノール化合物
の三者が用いられる。パーオキシダーゼと過酸化水素の
作用により芳香族第一級アミン化合物は酸化され、次い
でフェノール化合物とカップリングして色素が生成、沈
着する。

本発明において、対象とする特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は物
質群である。

たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。たとえば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類
、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロティン
Ａ１アビジン、ビオチン、レセプタ、補酵素、酵素の基
質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられる。

本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−アミノフェノール系化合物及び〇
−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの塩
が挙げられる。

好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合物であり下記
一般式ＣＩ）で示されるものである。

一般式ＣＩ） Ａ＼／Ｂ Ｈ２ 式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル基を表し、Ａ
とＢは窒素原子と共に複素環を形成してもよ＜、Ｄ、Ｅ
、Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、
アミノ基、アルコキシ基、アシルアミド基、アリールス
ルホンアミド基、アルキルスルホンアミド基またはアル
キル基を表す。

Ａ及びＢで表されるアルキル基としては、炭素原子数１
乃至６のものが好ましく、特にｌ乃至４のものが好まし
い。例えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げること
ができる。これらのアルキル基は置換基を有していても
よく、その場合の置換基としては、例えばヒドロキシル
基、ウレイド基、テトラヒドロフリル基、カルボキシル
基、メタンスルホンアミド基、スルホ基、メトキシ基、
エトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシエ
トキシ基、メトキシテトラエトキシ基が挙げられる。更
に好ましくはヒドロキシル基、メタンスルホンアミド基
である。

Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキシ基及びアル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が好
ましく、さらに好ましくは水素原子である。Ｅとしては
水素原子、アルキル基、アシルアミド基が好ましく、よ
り好ましくは炭素原子数１〜３のアルキル基特にメチル
基である。また、一般式（Ｉ）で示される化合物の塩と
してはｐ−トルエンスルホン酸、スルホン酸、スルフィ
ン酸、硫酸エステル、スルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−エ
ステル、カルボン酸、燐酸エステル、アミド燐酸、燐酸
、亜燐酸エステル、有機硼素化合物、塩酸及び硫酸等の
有機酸又は無機酸の塩を挙げるコトカでき、特にｐ−ト
ルエンスルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。

以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

例示化合物 （１−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４＝アミノ
アニリン （１−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン （１−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル４−アミ
ノアニリン （１−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−４−ア ミノアニリン （１−５）Ｎ−エチル−Ｎ−力ルポキシメチル３−メチ
ル−４−アミノアニリン （１−６）　　Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル３−
メチル−４−アミノアニリン （１７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−３
−メチル−４−アミノフェノ ール （１８）　　３−アセチルアミノ−４−アミノジメチル
アニリン Ｎ　−ｊ−−）　ルー　Ｎ−βメタンスルホンアミドエ
チル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホン アミドエチル−３−メチル−４−アミ ノアニリン Ｎ−メチル−Ｎ−βスルホエチル−ｐ フェニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル ３−メチル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（２−メトキ シエトキシ）エチルシー３−メチルー イ ４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−Ｃ２−＜２−メトキシエトキシ
）エトキシ〕エチル）−３−メチル−４−アミノアニリ
ン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（２−（２ （２−（２−メトキシエトキシエトキ シ）エトキシ〕エトキシ〕エトキシ）エチル〕−３−メ
チル−４−アミノアニ リン （１−１６）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンア
ミドエチル−４−アミノアニリン。

般式［Ｉ）で示される化合物の塩は、−収約に水溶性で
あり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事ができる
。

本発明において使用し得るフェノール化合物は、芳香族
第一級アミン化合物の酸化体とカップリングして色素を
生成する化合物であり、該生成色素の水に対する溶解性
を減するため、ベンゼン環上に適当な置換基を置換した
フェノール化合物である。

該フェノール化合物の中でも好ましいのは、４位が置換
されていない又は芳香族第一級アミン化合物の酸化体と
カップリング反応する際に離脱しうる基（以下、離脱基
と称する）もしくは原子（以下離脱原子と称する）で置
換されているフェノール化合物である。

本発明において有利に用いられるフェノール化合物は次
の一般式（Ｉ［）で示される。

一般式［ＩＩ） ０■ 式中Ｒ１は一価の有機基又は原子を表し、２は水素原子
、離脱基又は離脱原子を表し、ｋはｌ乃至４の整数を表
す。

Ｚで表される離脱原子としては、ハロゲン原子例えば、
塩素原子、臭素原子が挙げられる。

Ｚで表される離脱基としては、例えば−０Ｒ２゜０ＣＯ
Ｒ２、−０３Ｏ２Ｒ２，−３Ｒ２、−０ＣＯＮＨＲ２、
−０５ＯｚＮＨＲ２゜れる。ここにＲ２及びＲ８は水素
原子、脂肪族炭化水素残基、脂環式化合物残基、アリー
ル基又はヘテロ環残基を表す。

Ｒ１で表される原子としてはハロゲン原子例えば塩素原
子、臭素原子が挙げられる。好ましくは、塩素原子であ
る。

Ｒ，で表される一価の有機基としては、例えば脂肪族炭
化水素残基、脂環式化合物残基、ヘテロ環残基、アリー
ル基、　−５ＣＮ　、−０Ｒａ　、　−０ＣＯＲ４、−
０５ＯｓＲａ　、　−５Ｒａ　。

／ Ｒｓ　　　　　　　　Ｒｓ　　　　　　　　ＲｓＲ，Ｒ
。

びＲ６は水素原子、脂肪族炭化水素残基、脂環式化合物
残基、アリール基又はヘテロ環残基を表す。

Ｒ＋　、Ｒ２、Ｒ３，Ｒ４及びＲ６で表される脂肪族炭
化水素残基としては飽和のもの不飽和のもののいずれで
もよく、また直鎖のもの、分岐のもののいずれでもよい
。そして好ましくはアルキル基（例えばメチル基、エチ
ル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブ
チル基、イソブチル基、ドデシル基、オクタデシル基の
各基）アルケニル基（例えばアリル基、オクテニル基等
の各基）である。

Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，及びＲ５で表される脂環式化合
物残基としては５乃至６員のもの、例えばシクロペンチ
ル基、シクロヘキシル基が挙げられるみＲ＋、Ｒｚ、Ｒ
３，Ｒ４及びＲ６で表されるヘテロ環残基としてはピリ
ジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、キノリル基
、ピロリジル基、フラリル基、チエニル基、ピペリジル
基、ピロリル基　ピロリニル基、テトラゾリル基、チア
ゾニル基、イミダゾリル基、モルホリル基、フリル基、
オキサシリル基、チアゾリル基、ベンツイミダゾリル基
、ベンツオキサシリル基、ベンツチアゾリル基等の各基
が代表的例として挙げることができる。

Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４及びＲ５で表されるアリール基
としてはフェニル基、ナフチル基を代表例として挙げる
ことができる。

前述の２つのＲ□が結合して形成するベンゼン環に融合
する非芳香族環としては５乃至６員のもの例エバシクロ
ペンクン環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環が挙
げられる。

前述の２つのＲい特に５位と６位のＲ１が結合して形成
するベンゼン環と融合する芳香族環としては、５乃至６
員のものたとえば、フェニル基、ピリジニル基、ピラジ
ニル基、ピペリジル基、ピロリジル基、フラリル基、チ
エニル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリニル基、
チアジニル基、イミダゾリル基、フリル基、オキサシリ
ル基、チアゾリル基等が挙げられる。

以上のＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４及びＲ６で表される脂肪
族炭化水素残基、脂環式化合物残基、アリール基、ヘテ
ロ環残基、並びに前述の２つのＲ，が結合して形成する
非芳香族環、芳香族環は置換基を有していてもよい。

かかる置換基としては、例えばハロゲン原子（例えば塩
素原子、弗素原子）、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ
基、ケト基、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基（例
えば、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ア
ニリノ、Ｎ−アルキルアニリノ）、アルキル基（例えば
、メチル、プロピル、イソプロピル、ｔブチル、オクタ
デシル、シアノアルキル、ハロアルキル、アルアルキル
）、アルケニル基、アリール基（例えば、フェニル、ト
リル、アセチルアミノフェニル、４−ラウロイルアミノ
フェニル、エトキシフェニル）へテロ環残基、アルコキ
シ基（例えば、エトキシ、フェノキシ、メトキシ、テト
ラデシルオキシ）、アリ・−ルオキシ基（例えば、フェ
ノキシ、２，４−ジ−ｔ−アミルフェノキシ、ｐ−ｔ−
ブチルフェノキシ、４−ドデシルオキシフェノキシ、４
−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルフェノキシ、４−ヒドロ
キシ−３−ブチルフェノキシ）、アリールチオ基、アミ
ド基（例えば、アセトアミド、メタンスルホンアミド、
ｐ−ドデシルベンゼンスルホンアミド）、カルバモイル
基（例えば、Ｎ−ｐ−カルボキシナトキシフェニルカル
バモイル、Ｎ、Ｎ−ジヘキシル力ルバモイル、Ｎ−ベン
ジルカルバモイル、Ｎ−エチルカルバモイル、Ｎ−メト
キシエチルカルバモイル）、スルファモイル基（例えば
、Ｎ、Ｎ−ジエチルスルファモイル）、アルキルスルホ
ニル基、アリールスルホニル基（例えば、ベンゼンスル
ホニル、ｍ−クロルベンゼンスルホニル）、アシル基（
例えば、アセチル、ｐ−クロロベンゾイル、ベンゾイル
）、アシルオキシ基（例えば、アセチルオキシ、ｍ−ク
ロルベンゾイルオキシ）、アシルオキシカルボニル基及
びアルコキシ力ルポニル基（例えば、Ｎ−メトキシカル
ボルノ（モイルメトキシカルボニル、エトキシカルボニ
ル、メトキシカルボニル、トリエトキシカルボニル）、
アリールオキシカルボニル基（例えばフェノキシカルボ
ニル、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル）、アリールチ
オカルボニル基（例えば、フェニルチオカルボニル）、
イミド基（例えば、サクシンイミド、オクタデシルサク
シンイミド）が挙げられる。

以下に本発明のフェノール化合物の代表的具体例を示す
が、本発明に用いられる化合物はこれに限定されるもの
ではない。

例示化合物 （２−１）　　２−ベンジル−４−クロルフェノール（
２−２）　　Ｎ−ベンゾイル−４，６−ジクロル−５−
メチル２−アミノフェノール （２−３）　　　２−ベンゾイルアミノ−５−アセトア
ミノ−４−クロルフェノール （２−４）　　４−クロル−１−ナフトール（２−５）
　　　４−メトキシ−１−ナフトール（２−６）　　２
．４−ジクロル−１−ナフトール１−ヒドロキシ−４−
ブロム−Ｎ−エチル−２ナフトアミド ｌ−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｎ−プロピル２−ナフ
トアミ　ド ２．６−ジプロムー１．５−ジヒドロキシナフタレン ■−ヒドロキシー５−フェニルスルホンアミドナフトー
ル ｌ−ヒドロキシ−２，４−ジクロル−５−ニトロナフト
ール ４−ブロム−１−ナフトール ４−エトキシ−１−ナフトール ４−ブトキシ−１−す７トール ４−スルホ−■−ナフトール ４−（２−メトキシエトキシ）−１−ナフトール４−メ
チルチオ−１−ナフトール ４−７エニルチオー１−ナフトール ４−７エニルアゾー１−ナフトール ４．５−ジメトキシ−１−ナフトール ４−コンタスルホンアミド−１−ナフトール（２−２２
）　　４−（２−アミノフェニルアゾ）−２−プロピル
ｌ−ナフトール （２−２３）　　４．７−シメトキシー２−メトキシメ
チル−１−ナフトール （２−２４）　　４−クロル−２−ジメチルカルバモイ
ル−１−す７トール （２−２５）　　４−（１−カルボキシブトキシ）−１
−ナフトール （２−２６）　　４−クロル−２−アセチルアミノ−１
−ナフトール 膜に担持された特定成分とパーオキシダーゼ標識体との
複合結合体上に色素を生成沈着せしめるには発色用基質
試液中に膜を浸漬させれば良い。

発色用基質試液は、適当なｐｏの緩衝液中に過酸化水素
、芳香族第一級アミン化合物、フェノール化合物の三者
を溶解して調製される。フェノール化合物は、少量の親
水性の有機溶剤たとえばメタノール、エタノール、ＤＭ
Ｆ等に溶解して加えても良い。芳香族第一級アミン化合
物とフェノール化合物とのモル比は１対１００から１０
０対ｌが適当であり、１対１０からのｌθ対１が好まし
い。

酵素反応により膜上に色素が充分生成沈着した後、未反
応物質を洗い流し、反応を停止する。

生成色素についての情報は、目視にて、もしくは技術的
に公知な方法たとえば分光度計を用いて読み取ることが
できる。

疎水性の膜を支持体として用いた本発明の測定方法は、
ニトロセルロースの膜を支持体として用いた場合と比較
し、光の影響による生成色素の分解や黄色のバックグラ
ンドの上昇が抑制され、検出感度が低下する事なく、色
素シグナルの長期間の保存及び正確な情報の解析が可能
となった。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。

実施例−１ 膜上での蛋白抗原の測定 本発明に係る疎水性の瞑であるポリ弗化ビニリデンの膜
はメチノールに２０秒間浸漬した後、燐酸緩衝生理食塩
水（ｐＨ７，４；以下ＰＢＳと称す）中に１時間浸漬し
た。比較例として用いるニトロセルロースの膜はＰＢＳ
中に５分間浸漬した。

各々の膜上に、プロッティング装置（バイオラッド社）
を用い、ＰＢＳにて段階希釈したモノクローナルマウス
ＩｇＭの４０μａを抗原としてドツトプロットした。抗
原が担持した膜を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−Ｐ
ＢＳ溶液により４°Ｃにて１晩ブロツキングを行い、次
いでパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（カ
ッペル社製；１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて２００倍希釈
したもの）と室温にて２時間反応させた。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビクンモノラ
ウレート：和光紬薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し
発色用基質試液中に浸漬し発色反応を行った。発色用基
質試液は４−クロル−１−ナフトール３０ｍｇを含むメ
タノール１０ｍｆｆにＮ−エチル−Ｎ−β−メタンスル
ホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン３
／２硫酸ｌ水塩１０ｍｇを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，４；２００ｍＭ塩化ナトリウム含有）　
５０ｍ１２を加え、さらに、３％過酸化水素水２００μ
ａを加え調製した。１５分後に膜を発色用基質試液から
取り出し、充分水洗する事により発色反応を停止した。

乾燥後膜を１８ｗの蛍光灯から７ｃｍ離れた位置に静置
し経時的に色素スポット及びバックグランドの反射濃度
を６５０ｎｍの波長にて測定した。また、バックグラン
ドは４５０ｎｍの波長にても測定した。結果を表１に示
す。

表１ ニトロセルロース膜を用いた場合、青色の色素スポット
は経時的に灰色に分解し、バックグランドは黄色に変化
し、検出感度は０゜２ｎｇから２２時間方、本発明の弗
化ビニリデン膜を用いた場合は青色の色素スポットは安
定であり、バックグランドも上昇せず、検出感度も２２
時間後も発色停止直後と変わらず０．２ｎｇであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼを標識
   として有している標識体とからなる複合結合体を支持体
   上に担持せしめ、該複合結合体上に、パーオキシダーゼ
   の酵素反応によって色素を形成、沈着せしめる特定成分
   の測定方法において、該酵素反応の基質として過酸化水
   素、芳香族第一級アミン化合物及びフェノール化合物の
   三者を用い、支持体として疎水性の膜を用いる事を特徴
   とする特定成分の測定方法。