JP2549550B2 - パーオキシダーゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法、更に該
反応における形成色素の安定化に関する。

〔発明の背景〕

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開
発されて来ているが、それらの方法の中最も精度の高い
方法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合し
うる物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と
抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアジピン、
プロテインＡとIgG、ホルモンとレセプタ、酵素と基質
等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている。

一般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合
物質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変
化した該標識のシグナルを検出することにより特定成分
の測定が行われる。

特に支持体の直接的にまたは間接的に担持させた特定
成分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を
固定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナル
を検出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲ
ルからニトロセルローズ膜上に転写担持し、標識体たと
えば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、TL
Cプレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体を反
応させシグナルを検出する方法、膜上でDNAと該DNAに対
する標識した相補的DNAとを反応させシグナルを検出す
る方法或は免疫組織化学染色法などである。

これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特
異結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特
異結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報を
うることができる。例えば電気泳動後膜上に転写、担持
された蛋白質や核酸、またはTLC上に展開した脂質成分
等の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを結
合させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては特
定成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分子
量、等電点或は極性等の情報がえられる。

また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とす
る特定成分の存在場所、状態等の情報がえられる。

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた
複合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを
検出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量
であるため標識が高感度に検出されること、また特定成
分に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高
い分解能をもったものであることが必須である。

この要求を満たすために、従来から特異結合物質の標
識としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵
素等が用いられている。

しかしながら、これらのうち放射性同位元素を用いた
場合は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費に巨費を要
する等の問題があり、更に支持体に担持させた標識体上
にシグナルを検出する際には写真感光材料の感光、現像
など長い時間と煩雑な操作を要する欠点がある。

また、蛍光物質もしくは発光物質を用いる場合は特殊
な装置、設備が必要である。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色
素はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標
識酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。支持
体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により色素
を生成、沈着させる方法において、標識酵素としてパー
オキシダーゼが主として用いられ、その際、基質とし
て、従来ジアミノベンジジン、ｏ−ジアニジジン、４−
クロル−１−ナフトール等が使用されてきた。

しかしながら、ジアミノベンジジンやｏ−ジアニジジ
ンは毒性が強くバックグラウンドが出やすい欠点があ
る。４−クロル−１−ナフトールは他に比べやや感度が
高いが、より微量の特定成分を測定するため、もしく
は、特定成分に対するより多くの情報を明確に得るに
は、感度は充分とは言えない。

本発明者は、すでに簡易に且つ高感度、高分解であ
り、しかも迅速な特定成分の測定方法を開発し、特開昭
61−150723号、同61−216299号に開示した。すなわち、
測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼを標識として
有する標識体とからなる複合結合体を支持体上に担持せ
しめ、該複合結合体上にパーオキシダーゼの酵素反応に
よって色素を形成、沈着せしめる測定方法において、該
酵素反応の基質として、前者は過酸化水素、芳香族第一
級アミン化合物及びフェノール化合物の三者を用いる測
定方法であり、後者は過酸化水素、芳香族第一級アミン
化合物及び活性メチレン化合物の三者を用いる測定方法
である。

測定対象の特定成分とパーオキシダーゼを標識として
有する標識体とからなる複合結合体を支持体上に担持せ
しめ、該複合結合体上にパーオキシダーゼの酵素反応に
よって色素を形成、沈着せしめる特定成分の測定方法に
おいて、特にパーオキシダーゼの酵素反応の基質とし
て、過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及びフェノ
ール化合物の三者を用いる上記特定成分の高感度測定方
法においては、膜上に形成、沈着された色素が長期保存
において特に光による影響で経時的に分解される事が明
らかとなった。このような色素分解は、特定成分の測定
の正確さや、記録の長期保存の面で大きな問題となる。

〔発明の目的〕

前記の状況に照し、本発明の目的は生成色素の分解が
抑制された安定なかつ高感度な特定成分の測定方法の提
供にある。

〔発明の構成〕

前記した本発明の目的は、測定対象の特定成分と、パ
ーオキシダーゼを標識として有する標識体とから成る複
合結合体を支持体上に担持せしめ、該複合結合体上に、
パーオキシダーゼの酵素反応によって色素を形成、沈着
せしめる特定成分の測定方法において、該酵素反応後に
支持体をポリビニルピロリドンに接触させる過程を含む
ことを特徴とする特定成分の測定方法により達せされ
る。

本発明に使用し得るポリビニルピロリドンはビニルピ
ロリドンのホモポリマーであることが望ましいが、例え
ば酢酸ビニルやスチレン等その他のモノマーとのコポリ
マーであっても良い。その分子量は特に限定されないが
10,000から1,000,000が好ましい。

ポリビニルピロリドンは本発明の使用に際しては溶液
状態で使用されることが望ましい。溶媒としては生成色
素が溶解しない溶剤であれば有機溶媒或いは水との混合
溶媒であっても良いが、水系溶媒が好ましい。溶液中の
ポリビニルピロリドンの濃度は0.01％〜50％が好まし
く、0.1％〜20％が特に好ましい。

本発明において、特定成分は支持体に物理的吸着、イ
オン結合や共有結合のような化学的結合等により直接的
に担持されてもよく、１つ以上の特異結合物質を介して
間接的に担持されてもよい。又、特定成分を支持体上に
直接もしくは間接的に担持せしめた後、前記標識体を反
応させ前記複合結合体を形成させてもよいし、或は複合
結合体を形成せしめた後に該複合結合体を支持体上に直
接もしくは間接的に担持せしめてもよい。更に標識体は
該特定成分と複合結合体を形成し、支持体に担持される
が、この場合、特定成分と標識体は直接結合してもよ
く、１つ以上の他の特異結合物質を介して結合してもよ
い。

尚ここで支持体に担持せしめるとは、支持体の表面又
は内部に固定化し支持体から離脱できない状態にするこ
とを意味する。

また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗パー
オキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識した
ものであってもよい。

本発明において、対象とする特定成分は、その特定成
分に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は
物質群である。

例えば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又
は他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、
特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。例えば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖
類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵素
の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられ
る。

本発明に使用し得る支持体としては、セルロースアセ
テート、ニトロセルロース、ポリ弗化ビニリデン等の
膜；ポリアクリルアミド等のゲル状支持体;TLCプレート
等のシリカゲル担体；デキストラン、アガロース等の多
糖類及びその誘導体；プレート状、ビーズ状のプラスチ
ック、ガラス、金属、繊維、活性炭等が挙げられる。ま
た組織化学染色においては、組織そのものも支持体とし
て使用できる。

本発明に係るパーオキシダーゼの酵素反応は、過酸化
水素とパーオキシダーゼの作用により、色原体である基
質を酸化し、色素を生成させるものである。

本発明に使用し得るパーオキシダーゼの基質は、酸化
されることにより不溶性の色素を生成し得る化合物であ
れば良い。一般に酵素免疫染色法や組織染色法に用いら
れる基質が使用可能であり、その例としては、ジアミノ
ベンジジン、ｏ−ジアニジジン、テトラメチルベンジジ
ン、４−クロル−１−ナフトール、３−アミノ−９−エ
チルカルバゾール等が挙げられ、又、特開昭61−150723
号で開示した芳香族第一級アミン化合物とフェノール化
合物の組合せ、又、特開昭61−216299号で開示した芳香
族第一級アミン化合物と活性メチレン化合物の組合せが
挙げられる。特に芳香族第一級アミン化合物とフェノー
ル化合物を基質として用いる測定方法に本発明はより有
効である。支持体上に担持された特定成分とパーオキシ
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめ
るためには、発色用基質知試液中に支持体を浸漬させれ
ばよい。発色用基質試液は適当なpHの緩衝液中に基質で
ある過酸化水素及び色原体を溶解し調製される。

酵素反応により支持体上に色素が充分生成沈着した
後、未反応物質を洗流し、反応を停止する。

支持体とポリビニルピロリドンとの接触は、ポリビニ
ルピロリドン溶液中に浸漬する、或いはスプレーにして
吹きつける等により行われる。発色後の洗浄時に洗浄剤
としてポリビニルピロリドン溶液を用いても良く、又、
洗浄後にポリビニルピロリドン溶液に浸漬或いはポリビ
ニルピロリドン溶液を吹きつけても良い。ポリビニルピ
ロリドンと接触した支持体は、湿った状態のままで保存
しても良いが、乾燥して保存した方が有利である。

生成色素についての情報は、目視にて、もしくは技術
的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読取る事がで
きる。

ポリビニルピロリドンと接触する事を特徴とする本発
明の測定方法は、該操作を行わない従来法と比較し、生
成色素の分解、特に光による分解が制御され、検出感度
が低下する事なく、色素シグナルの長期間の保存及び正
確な情報の解析が可能となった。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本
発明はその実施例によりその範囲を限定されるものでは
ない。

実施例１ 燐酸緩衝生理食塩水（pH7.4:以下PBSと称す）に５分
間浸漬したニトロセルロース膜を、ブロックティング装
置（バイオラッド社）に装着した後、膜上に抗原とし
て、PBSに溶解したマウスモノクローナルIgM抗体30ngを
ドットブロットした。抗原が担持した膜を１％牛血清ア
ルブミン（BSA）−PBS溶液により４℃にて１晩ブロッキ
ングを行い、次いでパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
IgM抗体（カッペル社製;1％BJA−PBS溶液にて2000倍希
釈）と室温にて２時間反応させた。0.05％Tween−20
（和光純薬社製）−PBS溶液にて洗浄後、発色用基質試
液中に浸漬し、発色反応を行った。発色用基質試液は４
−クロル−１−ナフトール30mgを含むメタノール10mlに
Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエチル−３
−メチル−４−アミノアニリン3/2硫酸１水塩を含む50m
Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4;200mM塩化ナトリウム含有）
50mlを加え、更に、３％過酸化水素200μを加え調製
した。15分後に膜を発色用基質試液から取り出し、純水
にて５分間ずつ３回洗浄後、各種濃度のポリビニルピロ
リドン（以下PVPと称す）水溶液に30分間浸漬した後乾
燥した。安定性の評価は、膜を18Wの蛍光灯から7cm離れ
た位置に静置し経時的に色素スポットの反射濃度を650n
mにて測定することにより行った。結果を表１に示す。

実施例２ 実施例１と同様に発色し、純水にて５分間ずつ３回洗
浄後３％PVP水溶液に一定時間浸漬した後乾燥した。評
価は実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。

実施例３ 実施例１と同様に発色した後、以下の種々の洗浄操作
を行った後乾燥し、実施例１と同様に評価した。

洗浄操作１ 純水にて５分間ずつ３回洗浄 〃 ２ 純水にて５分間ずつ２回洗浄後３％ 〃 ３ ３％PVPにて５分間１回洗浄後純水にて５
分間ずつ洗浄 〃 ４ ３％PVPにて５分間ずつ３回洗浄 結果を表３に示す。

水洗によるPVPの除去は、乾燥後の安定性効果を減ず
る傾向が示され、乾燥直前のPVPとの接触が有利である
事が確認された。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼ
   を標識として有している標識体とからなる複合結合体を
   支持体上に担持せしめ、該複合結合体上に、パーオキシ
   ダーゼの酵素反応によって色素を形成、沈着せしめる特
   定成分の測定方法において、該酵素反応後に支持体をポ
   リビニルピロリドンに接触させる過程を含むことを特徴
   とする特定成分の測定方法。
2. 【請求項２】パーオキシダーゼの酵素反応の基質として
   過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及びフェノール
   化合物の三者を用いることを特徴とする請求項１記載の
   特定成分の測定方法。
3. 【請求項３】パーオキシダーゼの酵素反応により支持体
   上に形成された色素のポリビニルピロリドンとの接触に
   よる安定化方法。