JPH0783926A - パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法 - Google Patents
パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法Info
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- JPH0783926A JPH0783926A JP23048193A JP23048193A JPH0783926A JP H0783926 A JPH0783926 A JP H0783926A JP 23048193 A JP23048193 A JP 23048193A JP 23048193 A JP23048193 A JP 23048193A JP H0783926 A JPH0783926 A JP H0783926A
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- peroxidase
- hydroxy compound
- solution
- coupling
- aromatic hydroxy
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡易に且つ高感度、高分解能でありしかも迅
速な特定成分の測定方法を提供することであり、パーオ
キシダーゼ免疫染色法で使用される芳香族ヒドロキシ化
合物溶液の長期安定化方法の提供。 【構成】 パーオキシダーゼ免疫染色法における芳香族
第一級アミン化合物溶液とのカップリング若しくは芳香
族ヒドロキシ化合物の自己カップリングによる色素形成
反応において、色原体として使用される芳香族ヒドロキ
シ化合物の溶液を酸性にすることを特徴とするパーオキ
シダーゼ免疫染色法。
速な特定成分の測定方法を提供することであり、パーオ
キシダーゼ免疫染色法で使用される芳香族ヒドロキシ化
合物溶液の長期安定化方法の提供。 【構成】 パーオキシダーゼ免疫染色法における芳香族
第一級アミン化合物溶液とのカップリング若しくは芳香
族ヒドロキシ化合物の自己カップリングによる色素形成
反応において、色原体として使用される芳香族ヒドロキ
シ化合物の溶液を酸性にすることを特徴とするパーオキ
シダーゼ免疫染色法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はパーオキシダーゼ免疫染
色法に関し、特に芳香族第一級アミン化合物溶液とのカ
ップリングによる色素形成反応に用いる色原体の芳香族
ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法に関する。
色法に関し、特に芳香族第一級アミン化合物溶液とのカ
ップリングによる色素形成反応に用いる色原体の芳香族
ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体成分などの特定成分を検出する各種
の分析法が開発されて来ているが、それらの方法の中最
も精度の高い方法として、該特定成分とこれに対して特
異的に結合しうる物質(以後特異結合物質と称する)、例
えば抗原と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンと
アビジン、プロテインＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプ
タ、酵素と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が
知られている。
の分析法が開発されて来ているが、それらの方法の中最
も精度の高い方法として、該特定成分とこれに対して特
異的に結合しうる物質(以後特異結合物質と称する)、例
えば抗原と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンと
アビジン、プロテインＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプ
タ、酵素と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が
知られている。
【０００３】一般的には何らかの標識(ラベル)を付した
特異結合物質(以後標識体と称する)を用い特定成分に応
じて変化した該標識のシグナルを検出することにより特
定成分の測定が行われる。
特異結合物質(以後標識体と称する)を用い特定成分に応
じて変化した該標識のシグナルを検出することにより特
定成分の測定が行われる。
【０００４】特に支持体に直接的にまたは間接的に担持
させた特定成分を標識体と反応させ、両者の複合体とし
て標識体を固定し、実質的に特定成分に応じた標識から
のシグナルを検出する方法が適宜用いられる。
させた特定成分を標識体と反応させ、両者の複合体とし
て標識体を固定し、実質的に特定成分に応じた標識から
のシグナルを検出する方法が適宜用いられる。
【０００５】例えば電気泳動した蛋白質生体成分(特定
成分)をゲルからニトロセルローズ膜上に転写担持し、
標識体たとえば抗体標識体と反応させシグナルを検出す
る方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分
に標識体を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤ
ＮＡと該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応
させシグナルを検出する方法或は免疫組織化学染色法な
どである。
成分)をゲルからニトロセルローズ膜上に転写担持し、
標識体たとえば抗体標識体と反応させシグナルを検出す
る方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分
に標識体を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤ
ＮＡと該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応
させシグナルを検出する方法或は免疫組織化学染色法な
どである。
【０００６】これらの方法により、特定成分の定量や特
定成分の特異結合物質との反応性だけでなく、特定成分
もしくは特異結合物質の性質、存在状態などに対する多
大な情報をうることができる。例えば電気泳動後膜上に
転写、担持された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開
した脂質成分等の生体の特定成分と該特定成分に対する
標識体とを結合させた複合体上にシグナルを検出する方
法に於ては特定成分のシグナルの位置、移動度から該特
定成分の分子量、等電点或は極性等の情報がえられる。
定成分の特異結合物質との反応性だけでなく、特定成分
もしくは特異結合物質の性質、存在状態などに対する多
大な情報をうることができる。例えば電気泳動後膜上に
転写、担持された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開
した脂質成分等の生体の特定成分と該特定成分に対する
標識体とを結合させた複合体上にシグナルを検出する方
法に於ては特定成分のシグナルの位置、移動度から該特
定成分の分子量、等電点或は極性等の情報がえられる。
【０００７】また免疫組織化学染色法に於ては、組織上
の目的とする特定成分の存在場所、状態等の情報がえら
れる。
の目的とする特定成分の存在場所、状態等の情報がえら
れる。
【０００８】
【発明が解決しようとする問題点】前記した、支持体上
に直接または間接的に担持させた複合結合体上に実質的
に特定成分量に応じてシグナルを検出する特定成分の測
定では対象とする特定成分が微量であるため標識が高感
度に検出されること、また特定成分に対するより多くの
情報をうるため標識の検出法が高い分解能をもったもの
であることが必須である。
に直接または間接的に担持させた複合結合体上に実質的
に特定成分量に応じてシグナルを検出する特定成分の測
定では対象とする特定成分が微量であるため標識が高感
度に検出されること、また特定成分に対するより多くの
情報をうるため標識の検出法が高い分解能をもったもの
であることが必須である。
【０００９】特異結合物質の標識としては、放射性同位
元素、蛍光物質、発光物質、酵素等が用いられている。
放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など長い時間と煩雑な操作を要する欠点があ
る。蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必
要である。
元素、蛍光物質、発光物質、酵素等が用いられている。
放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など長い時間と煩雑な操作を要する欠点があ
る。蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必
要である。
【００１０】一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡
単で生成色素はたやすく可視化でき、定量も可能であ
る。従来、標識酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ
てきた。支持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反
応により色素を生成、沈着させる方法において、標識酵
素としてパーオキシダーゼが主として用いられ、その
際、定量的に発生する過酸化水素に応じて、色素を生成
せしめて定量する方法が知られている。そして、色素生
成反応として、芳香族ヒドロキシ化合物と芳香族第一級
アミン化合物をカップリングする方法や芳香族ヒドロキ
シ化合物の自己カップリングする方法がよく知られてい
る。特に、色原体として４−クロロ−１−ナフトールや
４−アルコキシ−１−ナフトールを用いる方法やフェノ
ール誘導体を色原体とし芳香族第一級アミン化合物をカ
ップリングする方法が特開昭63-6462、特開昭63-209600
などに記載されている。しかし、前記カップリング反応
を行う際、従来芳香族ヒドロキシ化合物の溶液は、不安
定であるので使用の都度その粉末を直前に適当な溶媒に
溶解し調製していた。
単で生成色素はたやすく可視化でき、定量も可能であ
る。従来、標識酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ
てきた。支持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反
応により色素を生成、沈着させる方法において、標識酵
素としてパーオキシダーゼが主として用いられ、その
際、定量的に発生する過酸化水素に応じて、色素を生成
せしめて定量する方法が知られている。そして、色素生
成反応として、芳香族ヒドロキシ化合物と芳香族第一級
アミン化合物をカップリングする方法や芳香族ヒドロキ
シ化合物の自己カップリングする方法がよく知られてい
る。特に、色原体として４−クロロ−１−ナフトールや
４−アルコキシ−１−ナフトールを用いる方法やフェノ
ール誘導体を色原体とし芳香族第一級アミン化合物をカ
ップリングする方法が特開昭63-6462、特開昭63-209600
などに記載されている。しかし、前記カップリング反応
を行う際、従来芳香族ヒドロキシ化合物の溶液は、不安
定であるので使用の都度その粉末を直前に適当な溶媒に
溶解し調製していた。
【００１１】従って本発明の目的は、簡易に且つ高感
度、高分解能でありしかも迅速な特定成分の測定方法を
提供することであり、パーオキシダーゼ免疫染色法で使
用される芳香族ヒドロキシ化合物溶液の長期安定化方法
の提供にある。
度、高分解能でありしかも迅速な特定成分の測定方法を
提供することであり、パーオキシダーゼ免疫染色法で使
用される芳香族ヒドロキシ化合物溶液の長期安定化方法
の提供にある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、パ
ーオキシダーゼ免疫染色法における芳香族第一級アミン
化合物溶液とのカップリング若しくは芳香族ヒドロキシ
化合物の自己カップリングによる色素形成反応におい
て、色原体として使用される芳香族ヒドロキシ化合物の
溶液を酸性にすることを特徴とするパーオキシダーゼ免
疫染色法により達成される。
ーオキシダーゼ免疫染色法における芳香族第一級アミン
化合物溶液とのカップリング若しくは芳香族ヒドロキシ
化合物の自己カップリングによる色素形成反応におい
て、色原体として使用される芳香族ヒドロキシ化合物の
溶液を酸性にすることを特徴とするパーオキシダーゼ免
疫染色法により達成される。
【００１３】次に本発明を詳細に説明する。
【００１４】本発明において使用し得る芳香族ヒドロキ
シ化合物としては、自己カップリング可能なもの、もし
くは芳香族第１級アミン化合物と酸化カップリング可能
なものであり、α−ナフトール又はフェノール系化合物
が挙げられる。特に自己カップリングの可能な芳香族ヒ
ドロキシ化合物としては、4-クロロ-1-ナフトール、4-
メトキシ-1-ナフトール、4-エトキシ-1-ナフトールなど
が挙げられる。
シ化合物としては、自己カップリング可能なもの、もし
くは芳香族第１級アミン化合物と酸化カップリング可能
なものであり、α−ナフトール又はフェノール系化合物
が挙げられる。特に自己カップリングの可能な芳香族ヒ
ドロキシ化合物としては、4-クロロ-1-ナフトール、4-
メトキシ-1-ナフトール、4-エトキシ-1-ナフトールなど
が挙げられる。
【００１５】本発明で好ましく用いられる芳香族第１級
アミン化合物と酸化カップリング可能な芳香族ヒドロキ
シ化合物は、下記一般式で示されるものである。
アミン化合物と酸化カップリング可能な芳香族ヒドロキ
シ化合物は、下記一般式で示されるものである。
【００１６】
【化１】
【００１７】式中、Ａは水素原子、アルキル基、ハロゲ
ン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、アルコキシ基、アシ
ルアミド基、アリールスルホンアミド基、アルキルスル
ホンアミド基またはアリル基を表わし、ｎは１〜５の正
の整数を表す。但し、ｎが２以上の場合Ａは同じであっ
ても、異なっていてもよい。
ン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、アルコキシ基、アシ
ルアミド基、アリールスルホンアミド基、アルキルスル
ホンアミド基またはアリル基を表わし、ｎは１〜５の正
の整数を表す。但し、ｎが２以上の場合Ａは同じであっ
ても、異なっていてもよい。
【００１８】以下に本発明に係る芳香族ヒドロキシ化合
物の代表的具体例を示すが、本発明はこれに限定される
ものではない。
物の代表的具体例を示すが、本発明はこれに限定される
ものではない。
【００１９】例示化合物 Ｃ−１ 2-ベンジル-4-クロロフェノール Ｃ−２ N-ベンゾイル-4,6-ジクロロ-5-メチル-2-
アミノフェノール Ｃ−３ 2-ベンゾイルアミノ-5-アセトアミノ-4-ク
ロロフェノール Ｃ−４ 4-クロロ-1-ナフトール Ｃ−５ 4-メトキシ-1-ナフトール Ｃ−６ 4-エトキシ-1-ナフトール Ｃ−７ 2,4-ジクロロ-1-ナフトール Ｃ−８ 1-ヒドロキシ-4-ブロモ-N-エチル-2-ナフ
トアミド Ｃ−９ 1-ヒドロキシ-4-メトキシ-N-プロピル-2-
ナフトアミド Ｃ−10 2,6-ジブロモ-1,5-ジヒドロキシ-ナフタレ
ン Ｃ−11 1-ヒドロキシ-5-フェニルスルホンアミド
ナフトール Ｃ−12 1-ヒドロキシ-2,4-ジクロロ-5-ニトロ-ナ
フトール 本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸着、化学的結
合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異
結合物質を介して間接的に担持されてもよい。又、特定
成分を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめた
後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成させて
もよいし、或は複合結合体を形成せしめた後に該複合結
合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめても
よい。更に標識体は該特定成分と複合結合体を形成し、
支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結合し
てもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介して結合し
てもよい。
アミノフェノール Ｃ−３ 2-ベンゾイルアミノ-5-アセトアミノ-4-ク
ロロフェノール Ｃ−４ 4-クロロ-1-ナフトール Ｃ−５ 4-メトキシ-1-ナフトール Ｃ−６ 4-エトキシ-1-ナフトール Ｃ−７ 2,4-ジクロロ-1-ナフトール Ｃ−８ 1-ヒドロキシ-4-ブロモ-N-エチル-2-ナフ
トアミド Ｃ−９ 1-ヒドロキシ-4-メトキシ-N-プロピル-2-
ナフトアミド Ｃ−10 2,6-ジブロモ-1,5-ジヒドロキシ-ナフタレ
ン Ｃ−11 1-ヒドロキシ-5-フェニルスルホンアミド
ナフトール Ｃ−12 1-ヒドロキシ-2,4-ジクロロ-5-ニトロ-ナ
フトール 本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸着、化学的結
合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異
結合物質を介して間接的に担持されてもよい。又、特定
成分を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめた
後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成させて
もよいし、或は複合結合体を形成せしめた後に該複合結
合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめても
よい。更に標識体は該特定成分と複合結合体を形成し、
支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結合し
てもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介して結合し
てもよい。
【００２０】また本発明に於て標識体はパーオキシダー
ゼと抗パーオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複し
て標識したものであってもよい。
ゼと抗パーオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複し
て標識したものであってもよい。
【００２１】従来、複合結合体中のパーオキシダーゼの
酵素反応の基質としては、過酸化水素、芳香族第一級ア
ミン化合物及び芳香族ヒドロキシ化合物もしくは活性メ
チレン化合物(特開昭63-6462)が用いられてきた。ま
た、基質として、過酸化水素及びアルコキシフェノール
(特開昭63-209600)が用いられてきた。パーオキシダー
ゼと過酸化水素の作用により芳香族第一級アミン化合物
は酸化され、次いで芳香族ヒドロキシ化合物もしくは活
性メチレン化合物とカップリングして色素が生成、沈着
する。これらの方法は、過酸化水素及び４−クロロ−１
−ナフトールを基質として用いるアナリティカルバイオ
ケミストリー(Analytical Biochemistry)119、142−147
(1982)に記載の方法と比べ、発色時間が短縮され、スポ
ットは鮮明で感度は10倍以上上昇した。また、その結
果、パーオキシダーゼ標識体の量を低減する事ができコ
スト的にも有利である。特に、芳香族第１級アミン化合
物とカップリング可能な芳香族ヒドロキシ化合物を色原
体として用いる方法は、得られる色素が長波であり、副
反応として生成する短波の色素と明確に識別できるの
で、感度も高く繁用されてきた。
酵素反応の基質としては、過酸化水素、芳香族第一級ア
ミン化合物及び芳香族ヒドロキシ化合物もしくは活性メ
チレン化合物(特開昭63-6462)が用いられてきた。ま
た、基質として、過酸化水素及びアルコキシフェノール
(特開昭63-209600)が用いられてきた。パーオキシダー
ゼと過酸化水素の作用により芳香族第一級アミン化合物
は酸化され、次いで芳香族ヒドロキシ化合物もしくは活
性メチレン化合物とカップリングして色素が生成、沈着
する。これらの方法は、過酸化水素及び４−クロロ−１
−ナフトールを基質として用いるアナリティカルバイオ
ケミストリー(Analytical Biochemistry)119、142−147
(1982)に記載の方法と比べ、発色時間が短縮され、スポ
ットは鮮明で感度は10倍以上上昇した。また、その結
果、パーオキシダーゼ標識体の量を低減する事ができコ
スト的にも有利である。特に、芳香族第１級アミン化合
物とカップリング可能な芳香族ヒドロキシ化合物を色原
体として用いる方法は、得られる色素が長波であり、副
反応として生成する短波の色素と明確に識別できるの
で、感度も高く繁用されてきた。
【００２２】本発明において、対象とする特定成分は、
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。
【００２３】たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、
複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗
体等が挙げられる。
複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗
体等が挙げられる。
【００２４】また本発明に使用し得る特異結合物質は、
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。た
とえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。本発明に使用し得る支持体としては、セ
ルロースアセテート、ニトロセルロース等の膜、ポリア
クリルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシ
リカゲル担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、
ガラス、金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色
においては、組織そのものも支持体として使用できる。
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。た
とえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。本発明に使用し得る支持体としては、セ
ルロースアセテート、ニトロセルロース等の膜、ポリア
クリルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシ
リカゲル担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、
ガラス、金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色
においては、組織そのものも支持体として使用できる。
【００２５】支持体に担持された特定成分とパーオキシ
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめ
るには発色液中に支持体を浸漬させれば良い。発色液
は、適当なpHの緩衝液中に、基質、例えば、過酸化水
素、芳香族第一級アミン化合物及び芳香族ヒドロキシ化
合物若しくは、過酸化水素及び自己カップリング可能な
芳香族ヒドロキシ化合物を溶解し、調製される。芳香族
ヒドロキシ化合物は、少量の親水性の有機溶剤たとえば
メタノール、エタノール、DMF等に溶解して加えられる。
芳香族第一級アミン化合物と芳香族ヒドロキシ化合物と
のモル比は1対100から100対1が適当であり、1対10から1
0対1が好ましい。
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめ
るには発色液中に支持体を浸漬させれば良い。発色液
は、適当なpHの緩衝液中に、基質、例えば、過酸化水
素、芳香族第一級アミン化合物及び芳香族ヒドロキシ化
合物若しくは、過酸化水素及び自己カップリング可能な
芳香族ヒドロキシ化合物を溶解し、調製される。芳香族
ヒドロキシ化合物は、少量の親水性の有機溶剤たとえば
メタノール、エタノール、DMF等に溶解して加えられる。
芳香族第一級アミン化合物と芳香族ヒドロキシ化合物と
のモル比は1対100から100対1が適当であり、1対10から1
0対1が好ましい。
【００２６】酵素反応により支持体上に色素が充分生成
沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。
沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。
【００２７】生成色素についての情報は、目視にて、も
しくは技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて
読み取る事ができる。
しくは技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて
読み取る事ができる。
【００２８】
【実施例】 実施例１ （１）芳香族ヒドロキシ化合物の保存溶液の調製 ４−クロロ−１−ナフトール（Ｃ−４）の３０ｍｇを１
０ｍｌのメタノールに溶解し、これに0.01mMから5mMに
なるよう塩酸または水酸化ナトリウムを加えｐＨを調整
した。調整した各溶液を４２℃にて保存し、その経時的
変化を目視上及び発色性能上で確認した。
０ｍｌのメタノールに溶解し、これに0.01mMから5mMに
なるよう塩酸または水酸化ナトリウムを加えｐＨを調整
した。調整した各溶液を４２℃にて保存し、その経時的
変化を目視上及び発色性能上で確認した。
【００２９】（２）発色性能の確認 ａ）発色液の調製 （１）で調製した溶液に５０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有；以下
ＴＢＳと称す）を加える。さらにＮ−エチル−Ｎ−β−
メタンスルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノ
アニリン３／２硫酸１水塩１０ｍｇ溶解した水溶液４０
０μｌを加え、さらに３％過酸化水素４００μｌを加え
発色液を調製した。
緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有；以下
ＴＢＳと称す）を加える。さらにＮ−エチル−Ｎ−β−
メタンスルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノ
アニリン３／２硫酸１水塩１０ｍｇ溶解した水溶液４０
０μｌを加え、さらに３％過酸化水素４００μｌを加え
発色液を調製した。
【００３０】ｂ）発色性能の確認 メタノールに１０分間浸漬した後に純水に１時間以上浸
漬したＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に燐酸緩衝食塩水
（ｐＨ７．４；以下ＰＢＳと称す）にて段階希釈したヤ
ギＩｇＧをブロッティング装置（バイオラッド社製）を
用いてドットブロットした。このＰＶＤＦ膜に対し、１
％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称す）−ＰＢＳ溶液
にて４゜Ｃにて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社
製：１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したも
の）と４゜Ｃにて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し、発
色液中に浸漬し発色させた。１０分後に取り出し、水洗
後に乾燥させ、目視にてヤギＩｇＧ検出限界を確認し
た。
漬したＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に燐酸緩衝食塩水
（ｐＨ７．４；以下ＰＢＳと称す）にて段階希釈したヤ
ギＩｇＧをブロッティング装置（バイオラッド社製）を
用いてドットブロットした。このＰＶＤＦ膜に対し、１
％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称す）−ＰＢＳ溶液
にて４゜Ｃにて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社
製：１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したも
の）と４゜Ｃにて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し、発
色液中に浸漬し発色させた。１０分後に取り出し、水洗
後に乾燥させ、目視にてヤギＩｇＧ検出限界を確認し
た。
【００３１】（３）結果 保存液の着色及び発色性能を検討した結果を表１に示
す。
す。
【００３２】
【表１】
【００３３】表１から明らかなように、本発明の芳香族
ヒドロキシ化合物の溶液は長期に亙り安定に保存でき
る。
ヒドロキシ化合物の溶液は長期に亙り安定に保存でき
る。
【００３４】実施例２ 実施例１のＮ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミド
エチル−３−メチル−４−アミノアニリン３／２硫酸１
水塩の代わりにＮ，Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−ア
ミノアニリン塩酸塩を用いた場合も同様の発色性能の結
果を得た。
エチル−３−メチル−４−アミノアニリン３／２硫酸１
水塩の代わりにＮ，Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−ア
ミノアニリン塩酸塩を用いた場合も同様の発色性能の結
果を得た。
【００３５】実施例３ 実施例１の４−クロロ−１−ナフトール（Ｃ−４）の代
わりに４−メトキシ−１−ナフトール（Ｃ−５）を用い
同様の実験を行った場合、保存溶液は茶色に着色するか
わりに青色に着色した。その発色性能は４−クロロ−１
−ナフトール（Ｃ−４）と同様の結果を示した。
わりに４−メトキシ−１−ナフトール（Ｃ−５）を用い
同様の実験を行った場合、保存溶液は茶色に着色するか
わりに青色に着色した。その発色性能は４−クロロ−１
−ナフトール（Ｃ−４）と同様の結果を示した。
【００３６】実施例４ 実施例１の４−クロロ−１−ナフトール（Ｃ−４）の代
わりに４−エトキシ−１−ナフトール（Ｃ−６）を用い
発色液の調製に際して、Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンス
ルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン
３／２硫酸１水塩を溶解した水溶液は添加せずに、発色
液を調製した。以下発色性能の確認は実施例１と同様の
実験を行い、結果は表２に示す。
わりに４−エトキシ−１−ナフトール（Ｃ−６）を用い
発色液の調製に際して、Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンス
ルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン
３／２硫酸１水塩を溶解した水溶液は添加せずに、発色
液を調製した。以下発色性能の確認は実施例１と同様の
実験を行い、結果は表２に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】表２から、自己カップリング発色反応で
も、本発明の方法により、芳香族ヒドロキシ化合物の溶
液が長期に亙り安定に保存できることが解る。
も、本発明の方法により、芳香族ヒドロキシ化合物の溶
液が長期に亙り安定に保存できることが解る。
【００３９】
【発明の効果】簡易に且つ高感度、高分解能でありしか
も迅速な特定成分の測定方法が得られ、パーオキシダー
ゼ免疫染色法で使用される芳香族ヒドロキシ化合物溶液
の長期安定化方法が得られた。
も迅速な特定成分の測定方法が得られ、パーオキシダー
ゼ免疫染色法で使用される芳香族ヒドロキシ化合物溶液
の長期安定化方法が得られた。
Claims (4)
- 【請求項１】 パーオキシダーゼ免疫染色法における芳
香族第一級アミン化合物とのカップリングによる色素形
成反応において、色原体として使用される芳香族ヒドロ
キシ化合物の溶液を酸性にすることを特徴とするパーオ
キシダーゼ免疫染色法。 - 【請求項２】 パーオキシダーゼ免疫染色法における芳
香族第一級アミン化合物とのカップリングによる色素形
成反応において、色原体として使用される芳香族ヒドロ
キシ化合物の溶液を酸性にすることを特徴とする該溶液
の安定化方法。 - 【請求項３】 パーオキシダーゼ免疫染色法における芳
香族ヒドロキシ化合物の自己カップリングによる色素形
成反応において、色原体として使用される芳香族ヒドロ
キシ化合物の溶液を酸性にすることを特徴とするパーオ
キシダーゼ免疫染色法。 - 【請求項４】 パーオキシダーゼ免疫染色法における芳
香族ヒドロキシ化合物の自己カップリングによる色素形
成反応において、色原体として使用される芳香族ヒドロ
キシ化合物の溶液を酸性にすることを特徴とする該溶液
の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23048193A JPH0783926A (ja) | 1993-09-16 | 1993-09-16 | パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23048193A JPH0783926A (ja) | 1993-09-16 | 1993-09-16 | パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0783926A true JPH0783926A (ja) | 1995-03-31 |
Family
ID=16908477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23048193A Pending JPH0783926A (ja) | 1993-09-16 | 1993-09-16 | パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族ヒドロキシ化合物溶液の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0783926A (ja) |
-
1993
- 1993-09-16 JP JP23048193A patent/JPH0783926A/ja active Pending
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