JPH01295165A - 免疫学的検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的検定方法に関する。

免疫学的検定法及び免疫学的定量検定法のような競合検
定法は臨床医化学において広く用いられている。これら
の方法は、他の分析法によって達成するのが困難ないし
不可能であるようなある水準の特異性及び感度を与える
。しかしながら、＝つの理由によってそれらの競合検定
法の感度を向上させる必要がある。その第１の理由は、
目的とするある種の被検体が極めて低濃度で存在するか
らである。第２に、よシ高感度の検定法が高濃度の被検
体類を一層迅速に検出するのに共通して使用できるから
である。放射線標認付き試薬、螢光試薬または化学発光
試薬を用いて検定感度を可及的に高くすること試みがな
されてきているが、感度、再現性及び便宜性の理想的な
組合せは、すべての応用にとって達成されているわけで
はない。

検定感度を向上させるための別の一手段は、増幅工程を
用いて、被検体に対して化学量論量よυも少ない量で発
生されうる産生物が、著しく高濃度の第２の産生物の産
生をもたらすようにし、次いでその第２の産生物を測定
（または検出）することである。この目的のために酵素
を採用することは先行文献に広く記載されてきている。

触媒として繰返し作用することにょシ、酵素は数百倍な
いし数千倍の増幅を達成しうる。

一般原則として、ニクの酵素系を順次に使用することに
より、さらに高度の増幅を達成することが可能である。

しかし、実際にはこれを行なうことは簡単ではない。Ａ
、ジョハンソン （Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ　）等は「ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メンッズＪ　８７Ｃ１９Ｂ６）、Ｐ７
〜１１においてＴＳＨについての検定法を開示しており
、第１の接触工程ではＮＡＤＰを脱ポスボリル化してＮ
ＡＤを生成させ、後者が特異レドックス・サイクルを触
媒作用により活性化して強く着色した化合物を発生させ
、この化合物が観察される。この方法は、秘義的な不安
定酵素を用い、そしてＮＡＤＰ／ＮＡＤが関与し、従っ
てこれらの物質を含む試料については使用できないとい
う諸欠点を有する。

Ｒ，Ｈ，Ｅ／ｌ／ケン（Ｙｏｌｋｅｎ　）はｒＲｅｖ、
　Ｉｎｆｅｃ。

Ｄｉｓ、Ｊ　４（１９８２）、Ｐ６５〜６８において一
補体媒介増幅による免疫学的検定法を開示しておシ、こ
の方法は、非特異性補体連続（カスケード）活性化工程
に依存するものであり、各成分の分離は困難である。

欧州特許第７５３７９号（シバ：５ｙｖａ）　　及び同
第１５２２５４号（デュ・ボン）両明細書には。

二つの酵素を固相へ結合させることからなる免疫学的検
定法が記載されておシ、その際に一方の酵素が被検体濃
度に比例して結合し、そして一方の酵素が他方の酵素の
基質である。

欧州特許第１８０３２７号（アモコ：Ａｍｏｃｏ）明細
書には、酵素を使用する免疫学的検定法が記載されてお
り、この方法では反応生成物が基質と異なる（流体）相
中に存在しうる。

本発明の検定方法は、少なくとも一つの酵素増幅工程を
用い、そして本発明の好ましい態様では二つ捷だはそれ
以上の酵素増幅工程を用いる。また本発明の好ましい態
様においては、容易に得られるか調製されそして有用な
時間にわたり安定である試薬の使用が必要とされること
がある。

本発明は一層１の酵素と−その酵素が作用して第１の産
生物を発生させることができる第１の基質とを用いるこ
とにより試料中の被検体を検定する方法であって： （ａ）　　所定の状態の第１の酵素を試料中の被検体の
濃度に相関した量で発生させるための検定操作に、試料
を付し。

（ｂ）その所定の状態の第１の酵素と第１の基質とを、
試料中の被検体の濃度に相関した量で第１の産生物を発
生させる条件下で、接触させ、（ｃ）　　工程（６）で
発生された第１の産生物と、第１の産生物のための特異
バインダーとを、それらを一体に結合させる条件下で接
触させることにより第１の産生物の量または存在を測定
し、そして（ｄ）　　工程（ｃ）の結果を用いて試料中
の被検体の濃度または存在を決定する、 各工程からなる上記検定方法を提供する。

本発明方法における被検体の種類は要件ではない。被検
体は−例えばハプテン、抗原、抗体（例：ホルモン、ス
テロイド、薬物もしくは薬物代射物、タンパク、核酸、
ビタミン、多糖類等〕であシうる。

試料の種類も要件ではなく、生体液、例えば廂清、匍漿
、尿または乳等であってよい。

第１の酵素の機能は、第１の基質に作用して別異ないし
独特な第１の産生物を生じさせることである。一般原則
的に、その例はすべての主な種類の酵素に見出すことが
できる。従って第１の酵素は、オキシドレダクターゼ、
トランスフェラーゼ類、リアーゼ類、イソメラーゼ類、
リガーゼ類またはヒドロラーゼ類でありうる。これらの
中で最後の種数の酵素の中で、例えばグリコシターゼ、
ホスファターゼ、エステラーゼ及びリパーゼ等の殊に潜
在的重要性を有するものが見出される。

第１の基質の機能は、第１の酵素による作用を受けて別
異ない独特な第１の産生物を発生させることである。従
って、第１の基質の選定は、第１の酵素の選定によって
左右される。

本発明の基本的特徴は、このように第１の酵素が第１の
基質に作用して、抗体（もしくはその他の特異バインダ
ー）へ結合するための抗原決定基（またはその他の結合
領域）を有する第１の産生物を出現させることである。

その抗体（または特異バインダー）は信号発生系（捷た
けその成分）により標識が付けられていてもよい。

標識付き特異バインダーの主要機能は、第１の産生物に
対して特異的に結合することである。その第１の産生物
及び特異バインダーは免疫対をなしていてよく、その対
の一方は抗原であシ、他方が抗体である。あるいは第１
の産生物及び特異バインダーは、アビジン−もしくはス
トレプトアビジン−ビオチン系のようなその他の特異結
合系を構成するものでもよい。標識付き特異バインダー
が第１の基質と、著しくは反応しないこと（好ましくは
全く反応しないこと）が重要である。従って第１の産生
物は、第１の基質と異なり特異バインダーによる結合の
ために意図されている点において、他のものと区別され
うろことが必要である。

標識付き特異バインダーの標識は、競合検定法において
検出のために慣用されているいずれの標識であってよい
。例えば標識は、放射性同位元素。

螢光物質、あるいは、螢光信号、電気化学的信号もしく
は比色信号を発生する酵素系の一員、等であシうる。し
かし、好ましくは、標識は第２の酵素であシ、このもの
は、第１の酵素と同一であってもよいが、より好ましく
は第１の酵素と相異なるものである（なんとなれば、第
１の酵素と相異なる第２の酵素を用いることによって、
第２の増幅段階を検定に導入できるからである。この点
については以下でさらに詳しく記載する。）本発明方法
の第１段階では、所定の状態の第１の酵素を試料中の被
検体の濃度に相関した濃度で発生させるような検定操作
に、試料を付す。この目的のために、酵素は被検体自体
に対し、または検定試薬の一つ（−船釣には、被検体の
類似体、まだは被検体への特異バインダー、例えば抗体
のいずれか〕に対し、結合される。この種の試薬に対し
て（酵素の特性の損失を起こさずに）結合させることは
、先行技術文献において周知である。

酵素が発生される所与の（！！たけ所定の）状態は、溶
液（状）であるのが好適である（かかる状態においては
、酵素は固体表面へ結合された酵素から容易に分離でき
る）；あるいは固体の表面へ結合された状態であるのが
好適である（かかる状態ではそれは溶液状の酵素から容
易に分離できる）。

本発明方法の工程（ａ）のためのいくつかの検定操作を
例として以下に述べる。当業者であれば−その他の操作
を仕組むことは容易であろう。これらの例において、簡
明のだめ、被検体が抗原性のものであること、及び特異
バインダーが抗体であること、を仮定するが、上述のよ
うに本発明がそれに限定されるものではない。

Ａ、試薬は、被検体類似体（マトリックスに結合された
形体）及び被検体の抗体で酵素で標識されたもの（溶液
状）、である。第１の工程で、その溶液状の酵素標識付
き抗体を、マ）　ＩＪソックス結合された被検体類似体
と接触させ、それがマトリックス接合被検体類似体に結
合されるようにする。過剰の溶液は洗浄で取り去る。液
体試料をマトリックスに結合された被検体類似体／抗体
錯体と共にインキュベートする。試料中の被検体は。

抗体への結合に関して−マトリックスに結合された被検
体類似体と競合する。その結果として−「被検体／酵素
標識付き抗体」錯体が、試料中の被検体の濃度に正比例
する濃度で溶液中へ放出される。この溶液の本発明方法
の次の工程のために使用する。

「マ）　ＩＪンクスに結合された被検体類似体／酵素標
識付き抗体」錯体が、試料中の被検体の濃度に逆比例す
る濃度で残留する。別法として、このインキュベーショ
ンから得られる溶液を捨て、上記のマトリックス結合さ
れたものを工程（旬のために用いることも可能である。

Ｂ、試薬は、被検体の抗体であってこれが７トリソクス
に結合されたもの：及び酵素標識例き被検体類似体、で
ある。第１の工程で一酵素標識付き被検体類似体（溶液
状）を−マトリックスに結合された抗体と接触させ、そ
れに結合されるようにする。過剰の溶液を洗浄で取り去
る。次いで、試料を「マトリンクス結合抗体／標識伺き
被検体類似体」錯体と共にインキュベートする。試料中
の被検体は抗体への結合に関して、標識付き被検体類似
体と競合し、標識付き被検体類似体のうちのいく分かを
溶液中へ（置換）押し出す。得られる溶液は、酵素標識
付き被検体類似体を、試料中の被検体濃度に正比例する
濃度で含み、このものは工程（６）のために使用できる
。

別法として、Ａのように一溶液を捨て、固相をその代り
に用いることができる。

Ｃ１試薬は、Ａと同じであるが、反応の順序が異なる。

第１の工程において、試料を酵素標識付き抗体の溶液と
共にインキュベートする。第２工程において、上記で得
られる混合物を、マトリックスに結合された被検体類似
体と接触させる。

別法として、試料及び酵素標識付き抗体溶液を、マ）　
ＩＪソクスに結合された被検体類似体に対して同時に添
加し、操作全体を単一のインキュベーションで行なうこ
ともできる。

Ｄ、試薬はＢと同一であるが、反応の順序が異なる。第
１工程において、試料を、酵素標識付き被検体類似体溶
液と一緒にインキュベートする。

次の工程において、上記で得られる混合物を、マトリッ
クスに結合された抗体と接触させる。

別法として、試料及び酵素標識付き被検体類似体溶液を
、７トリツクスに結合された抗体に対して同時に添加し
、操作全体を単一のインキュベーションにより実施する
こともできる。

Ｅ、この方式は、被検体が免疫結合のために有効ないく
つかの部位を有するポリエピトープ物質である場合にの
み可能である。試薬は、被検体についての第１の抗体が
マトリックスに結合されたもの；及び被検体についての
第２の抗体が酵素標識を付けられ、溶液状とされている
もの；である。

この方法では、これら二つの試薬を試料と共にインキュ
ベートすることからなり、このインキュベートは１段ま
たは多段でそしていずれかの混合順序で実施される。結
果として、（マトリックス）−（第１抗体）−（被検体
）−（酵素標識付き第２抗体）のサンドインチ状物がで
きる。同相上の酵素標識付き第２抗体の量は、試料中の
被検体の量に正比例する。溶液中の酵素標識付き第抗体
の量は一試料中の被検体の量に反比例する。溶液または
固相のいずれかを工程（６）のために使用できる。

工程（ａ）の操作の機能は酵素標識付き試薬を二つのフ
ラクション（部分）に分離することである。

しかし、それらの一方が液相であると共に他方がマトリ
ックスに結合されたものであること（は、必要ではない
。実際には、二つのフラクションの物理的分離は必ずし
も必要ではない。一方のフラクション中の酵素が不活性
化されてしまっているが他方のフラクション中の酵素は
不活性化されていないような一つの系を作り出すことも
可能である。

その他の系としては、下記のものがある。

Ｆ、微生物の検出：微生物をマトリックス中に捕捉し、
酵素標識付き抗体をこれに対して適用する。

Ｇ、デイツプスチック（計深器）様操作：この場合には
酵素標識付きの抗体または抗原を、被検体の存在に応答
しである異なる帯域へ移行させる。

本発明の方法の工程（ｂ）では、ある所定の状態にある
第１の酵素（すなわち−酵素標識付き試薬の選定された
フラクション）を、ある量の第１の基質と、第１の産生
物を発生させるような条件下で接触させることからなる
。第１の酵素が溶液状であるとき、そして本発明方法の
後続工程を促進すべきときには、基質を、固体マトリツ
クスに結合された形で、あるいは上澄液から容易に分離
されうるような何か別の物質に結合された形で、使用す
るのが普通好適である。第１の基質は、第１の産生物を
発生させるための酵素の作用によって除かれた基でマス
クされた第１の産生物を含んでいてもよい。

この目的のための固定化されたーまたは固定化可能基質
は、周知の化学的方法に従って調製することができる。

そのような基質の一般構造式は下記のように表わすこと
ができる。

ＸＸ−０−Ａ−Ｌ− ここにＸはグリコンル、ホスフェート、ジホスフェート
、ザルフエーＩｔたはその他の残基であり一使用酵累と
の関係で選定されるものであり、０は普通（必ずしもで
はない）ヒドロキシ機能であるが、また例えばアミン、
カルホキノルまたはサルフイトリル基であってもよく、 Ａは、例えば酵素によるＸの除去によって生じる芳香族
核：複素環センター、ペプチドまたはステロイドの部分
：であってよく、 Ｌは、グルタルアルデヒド、ジヒドラジド、アミノ酸、
６−アミノヘキサン酸、ジイミデートのような二官能性
カプリング剤によって形成される化学架橋であり−そし
て Ｍは、キャリヤーたん白、可溶性多糖類捷たけ酵素のよ
うな巨大分子キャリヤー；ガラス、プラスチック、高分
子、セラミックまたは紙表面のような固体担体；あるい
はハプテ／または抗原決定基のような化学物質、であり
うる。

添付図面を参照すると、第１ａ、、　１４及び１０図は
一上記定義による基質の実例の構造を示すものである。

第１ａ図において： Ｘは、ガラクトースであり、 Ａは、フルオレセインであシ。

Ｌは、グルタルアルデヒド残基でアシ、Ｍは、キャリヤ
ーたん白、例えばウシ面清アルブミンである。

第１君図において： Ｘは、ガラクトースであり、 Ａは、７−ヒドロキシ−４−メチル−クマリン−６−酢
酸であシ。

ＩＪｔ、、６−アミノカプロン酸でアリ、Ｍは、キャリ
ヤーたん白、例えばウシ面清アルブミンである。

第１ｃ図において： Ｘは、ガラクトースであシ、 Ａは、エストロンであり、 Ｌは、Ｎ−（０−カルボキシメキル）オキシムであり、 Ｍは−キャリャーたん白−例えばウシｄｒｈ清アルブミ
ンである。

Ａ構造のヒドロキシ機能へのグリコシド残基の導入は、
ケーニッヒス・クノル反応の一般原理に従って行なうこ
とができる。テトラ−０−アセチル−アルファーローガ
ラクトピラノシルプロミドを、ヒドロキシル−Ａと適当
な条件下で反応させる。最終生成物の単離は、酸／アル
カリ抽出工程を用いる標準的化学操作ならびにシリカゲ
ルでのカラムクロマトグラフィによって行なうことがで
きる。第１の基質（溶液状及びマ）　ＩＪソックス結合
状もの両者）の調製は、下記の実施例１〜乙に記載され
ており、また欧州特許第２８３３２号明細書にも関連情
報が与えられている。

第１の基質をマトリックスに結合された形で用いること
の一利点は、検定法の工程（ａ）及び（６）が単一の容
器中で、しかもデカンテーションや洗浄の必要なく、実
施できることである。またその欠点は、マトリックス結
合基質と第１の酵素との間の反応がどちらかといえば遅
いことである。これが問題となるような場合には、第１
の基質を溶液状で使用するのが好ましいであろう。かか
る場合に、第１の酵素は、溶液中に、捷たけマトリック
スに結合された形のいずれかで発生されうる。第１の酵
素をマ）　ＩＪソックス結合形発生させるのが一層好都
合であることが多い。

予め定められた状態の第１の酵素は第１の基質と一緒に
インキュベートされて、第１の産生物を発生させる。こ
れは、本発明方法の第１増幅段階である。第１の基質の
量、及びインキュベーションの時間及びその他の条件は
、−緒に選定される必要があり、捷たそれらは、第１の
産生物が、増幅されたのみならず出発試料中の被検体の
濃度に相関した濃度で発生されるのを確保するように選
定される必要がある。換言すれば、第１の酵素と第１の
基質との間の反応は完結されてはならず、従ってこの工
程の終了時点で第１の基質と第１の産生物との混合物が
残されるようでなければならない。

本発明方法の工程（ｃ）においては、第１の産生物と標
識付き特異バインダーとは、それらが−緒に結合される
ような条件下で接触され、このようにして、第１の産生
物の量（またはその存在）が決定される。これをどのよ
うに行なうかは１本発明にとって要件事項ではない。多
様な技法が文献に記載され公知であシ、適宜に利用でき
る。第１の基質がマトリックスに結合されてしまった状
態で供給使用されるときには、この工程は、普通、標識
付き特異バインダーを、第１の産生物と未反応残留第１
基質との混合物と共にインキュベートすることによって
なされる。前述のように、本発明方法を首尾よ〈実施す
るには、標識付き特異バインダーが第１の基質に対して
著しくなく（好ましくは全部ではなく）結合することで
ある。この目的のための第１の産生物及び第１の基質の
設計（設定）は、公知原理によって行なわれるとはいえ
、ある程度まで試行錯誤法で行なわれる。特異バインダ
ーとして多クローン抗体を用いて、我々は０．０１８％
以下の交差反応性を達成しており、従ってモノクローン
担体の使用によりこの値はさらに低減されることが予期
される。

第１の基質が浴液状で供給使用され、従って第１の産生
物が溶液中で発生されることになる場合、両者を工程（
ｃ）へ移行する前に分離するのがこのましい。この分離
は、過剰のマ）　ＩＪソックス合抗体（またはその他の
特異バインダー）を使用して一層１の基質への第１の酵
素の作用によって発生された状態にある第１の産生物の
抗原決定基（またはその他の結合部位）へ結合させるこ
とにより行ないうる。残留第１基質を含む上澄液をデカ
ンテーション処理し、同相を洗浄する。次いで好ましく
は、信号発生系またはその一成分により標識された別の
抗体（または他の特異バインダー）を使用することによ
り、標識付き試薬が、マトリックス結合第１産生物に対
して結合されるようにさせる。

工程（ｃ）のインキュベーション後、通常は、標識伺き
特異バインダーの部分であって第１の産生物に結合され
た部分を、そのような結合していない部分から分離する
ことが必要である。第１の産生物が固体マトリックスに
固定化されているならば、そのような分離はデカンテー
ション及び洗浄によって容易に行なうことができる。第
１の産生物が溶液中に発生されるならば、何か別の分離
方法を選択する必要があろう。別法として、ある種の標
織糸については、物理的分離が不要であることがあり一
例えば、第１の産生物に結合された（または結合されて
いない）標識は、ある種の方法で、マスクをし−あるい
は不活性化することができる。

第１の産生物に結合された（または結合されていない）
標識を測定することが必要である。定量検定については
、これは、結合または未結合標識の濃度の測定によりな
される。これを行なう技法は、使用標識に応じて、当業
界において周知であるので、ここではその説明を省略す
る。本発明の好ましい実施態様においては、標識が第２
の酵素（第１の酵素とは異なり、そして第１の基質と反
応性でない）である場合、この決定（測定）は第２の増
幅段階を包含する。従って、結合された第２の酵素１分
子は、溶液中の第２の基質の多数の分子に作用して、第
２の産生物の多くの分子を発生させ、これらの第２の産
生物の分子が、例えば発光、螢光または変色により観測
される。このような状況下で一第２の基質は過剰に供給
使用される必要があシ、また結合酵素でのインキュベー
ションは予め定められた条件下で予め定められた時間に
わたシ継続される必要がある。

本発明方法の工程（ｄ）では、工程（ｃ）の結果を用い
て、試料中の被検体の濃度またはその存在を決定（測定
）する。これは、−船釣には標準曲線を用いて実施され
る。予期される未知濃度範囲にまたがるいくつかの既知
濃度の被検体を含む標準試料をこの発明方法に付す。結
果をプロットして、「信号強度」対「被検体濃度」との
グラフを作る。

ある未知試料の信号強度が決定されると、その試料中の
被検体濃度はそのグラフから簡単に読み取ることができ
る。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ （ジガラクトシルフルオレセインアミン・ヘミスクシネ
ートの調製及び特性） フルオレセインアミン（１ｆ；２．９ミリモル）及び無
水スクンン酸（４００〜；４ミリモル）を５０ｍｇのＴ
ＨＦ中で４時間還流させた。その溶媒を除去後、１００
ｍＪの０．５　Ｍ　−ＨＣｌ　　をその残渣に添加した
。氷上で１時間後、２００ｍｇの酢酸エチルを添加して
、それまでに現れていた重質沈澱物を溶解した。

その有機層を、酸で洗浄し、水で洗浄し、１・Ｎａ、Ｓ
ｏ、　　上で乾燥し、そしてフルオレセインアミン・ヘ
ミスクシネート（ＦＡＨ８）が沈澱し始めるまで容積を
減少させた（濃縮した）。冷所で沈澱を継続させ、次に
生成物を冷酢酸エチルで洗浄し、減圧下で乾燥した。

フルオレセインアミン・ヘミスクシネート（５００ｍ９
；１．１ミリモル）及びアセトブロモ−アルファーＤ−
ガラクトース（２５’；４．９ミリモル）を、乾燥アセ
トン（５０ｍＪ）及びメタノール（５ｍｌ）の混合物中
で４１の無水に、ＣＯ３の存在下に２４時間還流させた
。この反応を、酢酸エチル：ＭｅＯＨ（８０：２０）で
のＴＬＣにより監視した。

反応後に、混合物を冷却し、濾過し、溶媒を除去した。

次いで残留物を乾燥酢酸エチル：ジエチルエーテル（５
０：５０）混合物で洗浄して、過剰の臭化糖を除去した
。残留物を冷０．１　Ｍ・ＮａＨＣＯｇ　　中へ取シ、
酢酸エチルで洗浄し、氷上に置いて酸性化し、酢酸エチ
ル中へ抽出し、そして水で洗浄した。次いで有機層を乾
燥させ、そして、溶媒が除去されてしまった後に、混合
物を減圧デシケータ−中に一晩放置した。得られた油状
残留物を１５＋ｎｇのメタノールＡ−Ｒ，に溶解し、氷
上で冷却して、これに対して２００μｌの１Ｍ・ナトリ
ウムメトキシドを添加し、１時間後１００ｍ１ｌの酢酸
エチル：ジエチルエーテル（５０：５０）混合物を加え
た。この混合物を冷所に一晩放置して生成物を沈澱させ
た。沈澱物を冷たいエタノール及び酢酸エチルで数回洗
浄し、次いで乾燥した。

このものは、はとんど純粋な基質であった。痕跡量のフ
ルオレセイを、その基質の酸性化水溶液を酢酸エチルで
抽出することにより除去した。この精製生成物を中和し
、次いで凍結乾燥させた。

ベータ・ガラクトシダーゼ基質としてのその評定の前に
、そのジガラクトシルフルオレセインアミン・ヘミスク
シネートを走査分光分析により試験して、その最大吸光
の波長を同定した。既知濃度の保存溶液を用いて、４９
０　ｎｒｎにおけるアグリコンについての予備モル吸光
係は、約３８，０００であると決定された。ＵＶ先光下
の検査は、このアグリコンの螢光とはるかに少ない螢光
ジガラクトサイドとの間の非常に強調された差異を示し
た。

基質（２００μ／　；　５ｍＭ　）リス緩衝液ｐＨ７、
３、０，１Ｍ−ＮａＣ１ｌ−１ｍＭ　１ＭｇＣ１２中４
ｒｎＭ）及びＥ、　ｃｏｌｉ　　ベータｅガラクトシダ
ーゼ（１００μ７；０．２８Ｕ）を６７°Ｃで種々の時
間にわたりインユニベートした。水冷の０．５Ｍ・Ｃ０
３／ＨＣＯ３緩衝液ｐＨ９，５（０，５ｍＡ）（７）添
加により反応を停止させ、反応混合物の吸光度を４９０
　ｎｍ　　で測定した。得られた直線の傾斜は、これら
の条件下で毎分７５ｐモルの生成物が生成されたことを
示した。

ジガラクトシルＦＡＨ８はベータガラクトシダーゼ基質
としての明かな活性を示したので、この基質のそのアグ
リコンに関しての交差反応性は６Ｈ−７／ｌ／オＶ、＋
、イア６　ｐＬ／−’ｊ−一をえい工評平した。その結
果は、アンチフルオレセイン抗面清は容易にアグリコン
を認識し、それに結合することができるが、完全無欠の
基質を認識しそれに結合することは余り容易ではないこ
とを示した。

４５倍モル過剰のＦ　Ａ　ＨＳが、適当に稀釈されたア
ノチフルオレセイン抗面清による　Ｈトレーサーの結合
を５０％だけ抑制するのに必要とされたが、試験した範
囲にわたってジガラクトシルーＦＡＨ８はこの結合を抑
制することができなかった。この基質の交差反応性は−
従ってアグリコンによって示される交差反応性の０．４
５％よシ低かった。

実施例２ １７のＡＨ−セファ０−ス４Ｂを膨潤させ、洗浄し一〇
、０１Ｍホスフェート緩衝液ｐＨ６，８中に懸濁させた
。この懸濁液に実施例１の基質２０９ｍｇ及び４ＱＱｍ
ｇのＣＭＣを添加し、混合物を２４時間ロールにより混
合し１こ。さらに２００　ｍ９のＣＭＣを添加し、反応
をさらに２４時時間桁させた。このゲルを通常の低ｐＨ
及び高ｐＨの条件を用いて洗浄し、次いでＰＢＳ中に貯
蔵した。それは濃い黄色であっ友。セファロース上でこ
の基質が酵素作用による加入分解に利用されうるが否か
を試験するため、基質・セフ了ロースの５０係懸濁液の
一連の試料（各２０μｌ）を、ベータ・ガラクトシダー
ゼと共に（！、だはこれを用いずに）−晩インキユベー
トした。同じ試験管で実施しだＲＩＡは、試験試料は２
７％のトレーサー結合を与えたが、対照試料はトレーサ
ーの４５係を結合したことを、示した。この結果は、Ａ
Ｈ−セファロース上の基質は酵素による加水分解に利用
されうろことを示した。

実施例６ モノガラクトシド−フルオレセイン基質ニトロフルオレ
セインを標準的な方法により調製シた。ニトロフルオレ
セインを過剰メタノール中で１％濃度Ｈ２ＳＯ，の存在
下に還流させることにより、そのメチルエステルヲ作っ
た。

ベンゼン・テトラヒドロフラン混合物中で炭酸銀（触媒
）及び硫酸カルシウム（内部乾燥剤）の存在下にテトラ
アセチルブロモガラクトースを用いて、ニトロフルオレ
セインメチルエステルの残留遊離ヒドロキシ機能へガラ
クトースを導入した。

照準的な方法により硫酸ジメチル及び０．１Ｎ・ＮａＯ
Ｈを用いて、ニトロフルオレセインメチルエステルのメ
トキシ誘導体を作った。前述のようにして、ガラクトー
スを導入した。

第２図の（５）、（Ｂ）及び（ｃ）に示しだ工程により
、三つのモノガラクトシドニトロフルオレセイン誘導体
が得られうる。

ニトロ機能の反応は、得られるアミン基によりさらに変
性を可能とする。

実施例４ ウアベインー７エツイン接合体の調製 パーアイオデート酸化／シッフ塩基反応法を用いてウア
ベインーフエツイン結合体を作った。

１０．８μＣ１の６Ｈ−ジゴキシンを含むウアベイン（
２００■）を、ナトリウム・メタバーアイオデートで、
室温において２時間酸化させ、次いでｐＨ９〜９．５で
室温においてさらに２時間１１０ｍ？のフェツインと反
応させた。この反応生成物を１３７ｍｐのホウ水素化ナ
トリウムと反応させることにより安定化させ、水に対し
て６日間透析しく５１：５回変更）、凍結乾燥して容積
を減少させ、そして最後に「セファデクス（５ｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ５０Ｊ（商標）でのゲル濾過に付して残留痕
跡量の未結合ウアバインを除去した。

実施例５ 増幅プロトコルに基く諸反応の順序すべてを示すために
ＥＬＩＳＡ方式を選定した。以下に用いられるウアバイ
ン−フェツイン接合体の合成法は実施例４に記載の通り
である。

検定のための準備において、二つのＰＶＣ製ＥＬＩＳＡ
平板をプレコートした。第１の平板（平板１）において
、平板のウェル（くぼみ穴）を５ウアバイン−フェツイ
ンまたはフェツイン単独（１０口μβ　コーティング緩
衝液中１０μ７）のいずれかで４℃において一晩被覆し
た。次いでこの平板を三回洗浄用緩衝液で洗浄し、各ウ
ェルに対してβ−ガラクトシダーゼ結合アンチジゴキシ
ン１１ｉ’Ｇ（１００μｌ、洗浄用緩衝液で１＋１稀釈
したものから結合させた）を加えた。６７℃で２時間後
、過剰の抗体−酵素接合体を平板から洗い出した（洗浄
用緩衝液で６回洗浄）。

第２の平板（平板２）のウェルをＢＳＡ単独（１００μ
４；コーティング用緩衝液中１ｍｇ／ｒｕｌ）まだはＢ
ＳＡ−クマリン−β−ガラクトシド（１００μ７；＝＋
−ティン用緩衝液中１りｎ’；／／ｍ１）（Ｄいずれか
で、４℃で一晩被覆した。使用直前に、平板をコーティ
ング用緩衝液で６回洗浄し、そしてさらにβ−ガラクト
シダーゼ検定緩衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７，１，０，１Ｍ・Ｎ’Ｃ１，１０ｍＭ−ＭｇＣＪ
？ｚ　）で１回洗浄した。

下記のようにして検定を行なった。ウアバイン−フェツ
イン抗原を含む平板１の各ウェルに対して、ジゴキシン
溶液（１５０μ１ＰＢｓ中１ｎＳ’／ｍ１４〜１〜９７
　ｍｌ）を加えた。６７°Ｃで１時間後、各個ウェルの
内容物を混合し、それぞれからの上澄液の試料（１００
μｌ）を−固定化ＢＳＡＳクーリンーβ−ガラクトシド
（及び５０μｌ　のβ−ガラクトシダーゼ検定緩衝液）
を含む平板２のウェルへ移した。ＰＢＳ（１００μｌ）
を固定化ＢＳＡ（及び５０μｌ　のβ−ガラクトシダー
ゼ検定緩衝液〕を含む平板２のウェルへ入れた。

６７°Ｃで２時間後、平板２を洗浄用緩衝液で２回洗浄
し、各ウェルにアルカリ性ホスファターゼ接合アンチク
マリンＩｆＧ（１００μｌ；洗浄用緩衝液で１：４稀釈
〕を加えた。この平板を６７℃で１．５時間インキュベ
ートし、次いで未結合の抗体−酵素接合体を、洗浄用緩
衝液で６回洗浄することにより平板のウェルから除去し
た。アルカリ性ホスファターゼ基質宕液（１００μｌ；
０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ１０，４中の６ｍＭ・１）
ＮＰホスフェート、１ｍＭ−ＺｎＣ１２，１ｍＭ−Ｍグ
Ｃｌ２）を各ウェルに加えて、この平板を室温でインキ
ュベートした。１５分後及び６０分後、平板をＥＬＩＳ
Ａプレートリーダーで４１０　ｎｍにおいて吸光試験し
た。

第６図は、放出されだβ−ガラクトシダーゼ接合アンチ
ジゴキシンＩｇＧによる固定化クマリン−β−ガラクト
シドの加水分解により露出された後の固定化クマリン残
基に対する結合アルカリ性ホスファターゼ接合されたア
ンチクマリンＩｆＧの活性を示す。ＢＳＡ単独に対する
アルカリ性ホスファターゼ・アンチクマリンの結合は、
ＢＳＡ−クマリンへの最大結合の５％以下であった。未
加水分解基質に対する上記接合体の結合は最大結合の約
２９％であった。この値はプロットする前に他のすべて
の結果値から差し引かれた。検定は二回繰り返して実施
した。

°　これらの結果は、ジゴキシについての検定の基礎を
なすもので、この検定における信号は、１０ｎグ／ｍｌ
ないし１　ｍ９’／　ｍｌの範囲にわたって被検体の濃
度に正比例する。

実施例６ 実験方法 １、固相捕捉系の調製 ＰＶＣ製ＥＬＩＳＡ平板の各ウェルに対して、１００μ
ｌ　コーティング用緩衝液中の親和性精製したアンチク
マリ：／ＩｆＧ（１０μ７）を加え、平板を湿った雰囲
気中で４°Ｃにおいて一晩インキユベートした。次の日
に、未結合ＩｆＧを洗浄用緩衝液で４回洗浄することに
より洗い出しだ。

７、テキストラン−６−アミンへキサン上のクマリン基
質−エストラジオール二重接合体デキストランＴ４０を
ナトリウムパーアイオデートにより酸化してアルデヒド
機能を生じさせ、ジアミノヘキサンを導入し、次いでホ
ウ水素化ナトリウムでの還元により結合を安定化させた
。クマリン−ガラクトース及びエストラジオールを、そ
れらの誘導体の活性エステルを介して、デキストラン−
６−アミンへキサン中へ導入した。活性エステルは５：
１の基質ニーエストラジオールの比となるまでデキスト
ラン中へ逐次に添加した。この反応を第４図に示す。二
重接合体を透析し、セファデクスＧ５０でクロマトグラ
フ処理した。デキストラン含有フラクションは螢光（ク
マリン基質）を示した。

ろ、　デキストラン基質溶液の調製 β−ガラクトシダーゼ検定緩衝液中のデキストラン基質
の溶液（１ｍｇ／１ｍＡ）を作り、これに対してアンチ
クマリンＩｇＧ（１２μｌ　；適当に洗浄用緩衝液中に
稀釈されたアンチクマリンＩｆＧ／１２０μβデキスト
ラン基質）を添加し一不純物として存在しうる露出され
た部位をブロックした（この工程は、本発明にとって必
須ではない）。

この混合物を６７°Ｃで１時間インキュベートした。

４、固相ウアベインーアンチジゴキシンーβ−ガラクト
／ダーゼ接合体の調製 ＰｖＣ製ＥＬＩＳＡ平板の各ウェルに一１００μ６のコ
ーティング用緩衝液中の約１０μグのフエツインーウア
ベイン（実施例４）を加え−その平板を４°Ｃの高湿雰
囲気中で一晩インキユベートした。

未結合の接合体（コンジュゲート）を、洗浄用緩衝液で
４回洗浄することにより平板から洗い出した。次いで各
ウェルに対してβ−ガラクトシダーゼ接合親和性精製し
たヤギのアンチジゴキシンＩｆＧ　（１００μのＰＢ８
３ｍｇ／ｍＡＢＳＡ中の４μｇの接合体；アンチジゴキ
シン接合体）ヲ加えた。

次いで、この平板を室温で２時間インキュベートし、過
剰結合体を前述のように洗浄することによりウェルから
除去した。

５、溶液状のジゴキシンでの押出により発生したガラク
トシダーゼ活性を用いての標準的検定及び増幅検定 ジゴキシン溶液ＣＰＢＳ中に１　ｎｓ’　〜ｉ　μｆ）
またはＰＢＳ単独を準備し、各１００μｌを、固相ウア
ベインーアンチジゴキシン接合体を表示しているＥＬＩ
ＳＡ平板のウェルに加えた。かきまぜながら室温で６０
分後、各反応混合物の１００μｅを、標準参照検定でｏ
Ｎｐ　　−ガラクトシドを用いて検定するか、あるいは
１００μｌ　のデキストラン基質へ添加した。

２０分後、各反応混合物の１００μｌ　を、アンチクマ
リン被覆ウェルをもつＥＬＩＳＡ平板のウェルに移し、
この平板をさらに２０分間インキュベートした。結合し
なかった反応生成物を、洗浄用緩衝液で４回洗浄するこ
とにより平板から洗い出した。そしてアルカリ性ホスフ
ァターゼ接合した親和性精製アンチエストラジオールｌ
７Ｇ（５μｆ　／ｒｕｇにおいて１００μｌ）を各ウェ
ルに加えた。

さらに２０分後、結合されなかった接合体を前述のよう
にウェルから洗い出した。そしてアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質溶液（１００μｌ：ホスファターゼ検定緩衝液
中の６ｍＭのｐＮｐホスフフターゼ）を各ウェルへ添加
した。

これらの生成溶液の吸光度を、基質ブランク１００μｌ
のアルカリ性ホスファターゼ基質溶液であって同時間イ
ンキュベートされたもの）に対して、５分、１０分及び
１５分後に読み取った。

結果は第５図に示されている。標準参照ｏＮｐ検定にお
いてインキュベーションは９０分間継続したことを銘記
すべきである。信号発生のためのインキュベーション時
間が少なくとも１０分てあることを条件として本発明の
検定は標準参照検定よりも一層高感度であった。

実施例７ （クマリンカラクトシル基質の交差反応の推定）標準的
な化学方法により、ガラクトシルクマリン−６−酢酸を
調製した。交差反応は、３Ｈ標識付き７−ヒトロキシク
マリンー６−酢酸誘導体及びラビットのアンチ−７−ビ
トロキシクマリン−６酢酸を用いての放射免疫測定法（
ラジオイムノアッセイ）により推定した。

標準的なデキストラン被覆付きチャコール法を採用し、
また−船釣に用いられる５０％抑制式を交差反応値を計
算するのに使用した。その値は０．００８−０．０１８
％であった。この低い交差反応は、アンチクマリン抗体
についてのクマリンとガラクトシル−クマリンとの親和
性における大幅な差を示している。

実施例８ クマリン−ガラクトシル基質エストラジオール（ハプテ
ン構成部）接合体 クマリン−６−酢酸と１７−β−エストラジオール６−
カルボキンメチルエーテル（及び腕状部としての１，８
−ジアミノオクタン）の接合体を、標準的な化学方法で
調製し、精製した。その接合体の可溶性物も製造した（
第６図参照）。ガラクトースを標準的な方法によって、
接合体中のクマリンの７−ヒドロキシ機能に対して導入
した。

接合体及び基質接合体の免疫活性を、標準的なＥＬＩＳ
Ａ法により分析した。

マイクロタイター板をラビットのアンチクマリンで被覆
した。接合体及び基質をある範囲にわたる濃度でその被
覆付きウェルに加え、反応させ、そして洗浄後に、アル
カリ性ホスファクーゼ標識付きアンチエストラジオール
抗体をウエルニ加工て反応させた。

洗浄後、各ウェルによって保持されたアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性をｐＮｐホスフェートを用いて測定した。

結果は、基質の反応性と生成物の反応性との著しい差を
示した。アンチクマリン抗体に関しての基質Ｓ１のはる
かに低い親和性は、抗原決定基（クマリン構成部）のマ
スキングによるものである。ガラクトースの除去（Ｓ１
→Ｐ１）による抗原決定基の露出は、親和性を約１０．
００倍増大させた。

結合体（Ｓ２−Ｐ２）の−層可溶性物の反応性は、比較
してわずかに良好であった。数値は交差反応データによ
り確認された。

実施例９ Ｅ、　ｃｏｌｉ−β−ガラクトシダーゼのある範囲にわ
たる稀釈液を、原液（約１ｍｇ／ｍＡ！の市販調製品〕
から作った。

標準的な検定は下記のように実施した。

マイクロタイクー板の各ウェルにおいて、β−ガラクト
シダーゼ１０μｌ　を、５０μｆ／ｍｌｌのガラクトシ
ル−クマリン−ジアミノオクタン−エストラジオール３
０ＭＥ接合体１００μｌ　に加え、９０分後に１００μ
ｌ　の停止用緩衝液によって反応を停止させ、吸光度を
測定した。

増幅検定は下記のように実施しだ。

マイクロタイター板の各ウェルにおいて、１０μｌの酵
素を、５０μ？／ｍｉｌのガラクトシルクマリンジアミ
ノオクタンエマトランジオール６０ＭＥ接合体１００μ
ｌに加えた。２０分のインキュベーション後、反応生成
物を１／２５乙に稀釈し、１００μｌを、アンチクマリ
ンで被覆したマイクロタイター平板のウェルに移した。

２０分後、平板を洗浄し、アンチエストラジオールアル
カリ性ホスファターゼを加え、２０分間反応させ、その
後に洗浄し、１０分から６０分の時点でホスファターゼ
活性の測定を行なった。

第７図のグラフはβ−ガル。稀釈度に対して吸光度をプ
ロットしたものである。増幅検定は、上記枦準検定よシ
も約１０００倍以上高い感度である（アンチクマリン抗
体被覆ウェルへの導入前の生成物の稀釈率を考慮しない
）。

実施例１０ 標準的ＣＮ　Ｂ　ｒ　　活性化法により、ヤギのアンチ
１７−０Ｈ−プロゲステロンを粒子へカップリングした
。

標準的な方法で１７−ＯＢ−プロゲステロン−６−カル
ボキシメチルオキシムを調製し、Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ　β−ガラクトシダーゼ（市販調製品）へ接
合した。

競合酵素免疫学的検定を確立した（遊離標準級検体が、
磁化性粒子上の抗体に関して、酵素標識付き被検体と競
合）。トレーサーの結合フラクションの活性を、標準的
ｐＮｐ　−ガラクトシドを用いて測定するか、または第
１の基質としてガラクトシルクマリン−ジアミノオクタ
ン−エストラジオール３　ＣＭＥ用い、そして磁化性粒
子がアンチクマリン調製品を捕捉生成物１（またはその
フラクション）へカプリングする増幅法を用いて活性を
測定した。捕捉生成物１の濃度はアンチエストラジオー
ルアルカリ性ホスファターゼ接合体ヲ用い−まだｐＮｐ
　−ホスフェ−１・を用いてのホスファターゼ活性測定
により、推定した。

得られた結果の一例を第８図に示す。増幅操作は、Ｐｌ
の少量部分が検定の第２段へ同伴されるにすぎないけれ
ども、信号の非常に大きな増大を与える。

【図面の簡単な説明】

第１ａ〜１ｃは本発明による基質の化学構造式％式％ Ｍ２図は、実施例６に例示の基質の化学構造式の例であ
る。 第３図は一実施例５の検定結果を示すグラフである。 第４図は、実施例乙の合成反応式である。 第５図は、実施例乙の検定結果を示すグラフである。 第６図は、実施例８の合成反応例示式である。 第７図は、実施例９の検定結果のグラフである。 第８図は、実施例１０の検定結果の一例のグラフである
。 （外４名） 一つ ｌｆ４．ｌＬ　−［ｕ＋ｕ　　ｏｔｂ＋　ｉ￥考ンｂ（
ｂｕ　ｏｎ）　Ｖ　４１１ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１の酵素と、その酵素が作用して第１の産生物を
   発生させることができる第１の基質とを用いることによ
   り試料中の被検体を検定する方法であって： （ａ）所定の状態の第１の酵素を試料中の被検体の濃度
   に相関した量で発生させるための検定操作に、試料を付
   し、 （ｂ）その所定の状態の第１の酵素と第１の基質とを、
   試料中の被検体の濃度に相関した量で第１の産生物を発
   生させる条件下で、接触させ、（ｃ）工程（ｂ）で発生
   された第１の産生物と、第１の産生物のための特異バイ
   ンダーとを、それらを一体に結合させる条件下で接触さ
   せることにより第１の産生物の量または存在を測定し、
   そして（ｄ）工程（ｃ）の結果を用いて試料中の被検体
   の濃度または存在を決定する、 各工程からなる上記検定方法。 ２、第１の基質をマトリックスに結合された形態で使用
   し、かくして工程（ｂ）において第１の産生物がマトリ
   ックスに結合された形態で発生される請求項１記載の方
   法。 ３、第１の基質を溶液中で使用し、かくして工程（ｂ）
   において第１の産生物が溶液中に発生される請求項１記
   載の方法。 ４、工程（ａ）において第１の酵素がマトリックスに結
   合された状態で発生する請求項３記載の方法。 ５、工程（ｂ）において発生される第１の産生物を溶液
   からマトリックスに結合された状態へ変えた後に、工程
   （ｃ）を行なう請求項３または４に記載の方法。 ６、第１の産生物と、その第１の産生物に対して特異的
   な標識付きバインダーとをそれらが一体に結合される条
   件下で接触させ、第１の産生物に対して結合された標識
   または結合されない標準を測定することにより、工程（
   ｃ）を実施する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７、特異バインダーは酵素により標識を付けられたもの
   である請求項６記載の方法。 ８、第１の酵素はベータ・ガラクトシダーゼである請求
   項１〜７項のいずれかに記載の方法。 ９、第１の基質はジガラクトシル−フルオレスセインア
   ミンヘミスクシネートまたはモノガラクトサイド−フル
   オレスセイン基質である請求項８記載の方法。 １０、第１の基質はガラクトシル−クマリン−エストラ
   ジオール基質である請求項８記載の方法。 １１、マトリックスに結合された形態の被検体類似体及
   び溶液状の酵素標識付きの被検体−抗体を用い、工程（
   ａ）の検定操作において、試料中の被検体を、酵素標識
   付き抗体への結合に関してマトリックス結合被検体類似
   体と競合させる請求項１〜１０のいずれかに記載の方法
   。