CN1034273A - 酶检测方法 - Google Patents

Abstract

一种免疫检测方法，包括使用一种或更好是两种 酶放大步骤以提高检测速度或灵敏度。在第一步中， 以与样品中分析物浓度相关的量产生第一酶。在第 二步中，第一酶作用于第一底物以暴露第一产物的抗 原决定基。在第三步中，使第一产物与抗体反应。测 定此免疫反应的程度，最好是通过酶信号系统进行测 定。描述了用β—半乳糖苷酶作为第一酶检测异羟 基毛地黄毒苷的两种方法和检测17α—羟基黄体酮 的一种方法。

Description

竞争性检测方法，例如免疫检测法和免疫测量检测法在临床化学中应用广泛。这些方法所达到的专一性和灵敏度是其他分析方法很难或不可能与之比拟的。但仍有两条理由需进一步提高这种检测法的专一性。首先，某些感兴趣的分析物是以极低的浓度存在的。其次，更灵敏的检测法能用来更迅速地测试浓度更高的分析物。人们已经作出了一些努力，企图通过使用放射性标记试剂、荧光或化学发光试剂等最大限度地提高检测灵敏度。但迄今为止，都没能使灵敏度、重复性和简易性理想地结合起来。

提高检测灵敏度的一种可选择的策略是采用放大步骤，即使所产生的在化学计量上不多于分析物的产物去产生浓度显著升高的第二产物，然后观察第二产物。文献中广泛描述了将酶用于此目的的情况。使酶反复作为催化剂作用，能使放大作用达到成百上千倍。

从原理上说，使用连续的双酶体系能够达到进一步的放大效果，但实际上这是很难达到的。A.Johannsson等人（Journal    of    Immunological    Methods，87（1986）7-11）描述了TSH的检测法，第一催化步骤是NADP脱磷酸而产生NAD，NAD通过催化作用活化一个专一的氧化还原循环，从而产生一种可以观察的、色彩浓重的化合物。此方法的缺点是使用了体内发生的不稳定酶，并涉及到NADP/NAD，因此样品中含有这些物质时不能被采用。

Yolken    R.H.（Rev.Infec.Dis，4，（1982）35-68）描述了一种用补体进行放大的免疫检测法，该方法依赖于非特异的补体逐级活化系统，而且其组分很难于分离。

EPA75379（Syva）和EPA152254（Du    Pont）描述的免疫检测法都涉及在固相上结合两种酶，其中之一与分析物的浓度成比例，一种酶的产物是另一酶的底物。

EPA180327（Amoco）描述的免疫检测系统涉及这样的酶，其反应产物能以不同于底物的（液）相存在。

本发明的检测法至少使用一种，在其优选方案中是使用两种或更多种酶放大步骤。而且，在其优选方案中，本方法所需要的试剂很容易得到或制备，而且它们在使用期间内保持稳定。

本发明提供了检测样品中分析物的方法，即通过使用第一酶及与该酶能够作用的第一底物从而产生第一产物，该方法包括下述步骤：

a）使样品进入检测程序，从而以预定状态和相关于样品中分析物浓度的量产生第一酶，

b）使预定状态中的第一酶在合适条件下与第一底物接触，以产生其数量相关于样品中分析物浓度的第一产物。

c）使步骤b）产生的第一产物在合适条件下与第一产物的特异性结合剂接触，从而使二者结合在一起，以确定第一产物的存在或其量。

d）利用C的结果确定样品中分析物的存在或浓度。

分析物的本质并不重要。分析物可以例如是半抗原或抗原或抗体，例如激素、类固醇、药物或药物代谢物、蛋白质、核酸、维生素或多糖。

样品的本质也不重要，样品可以是生物液体，例如血清、血浆，尿或奶。

第一酶的功能是作用于第一底物，以产生具有特性的第一产物，从原理上说，此酶的例子可以在酶的所有主要类型中找到。因此，第一酶可以是氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶、连接酶或水解酶。在最后一类酶中，有一些是特别重要的，例如糖苷酶、磷酸酶、硫酸酯酶、酯酶和脂酶。

第一底物的功能是被第一酶作用以产生具有特性的第一产物，因此，第一底物的选择受第一酶选择的支配。

本发明的一个重要特征即第一酶对第一底物的这种作用所产生的第一产物具有与抗体（或其它专一性结合剂）结合的抗原决定簇（或其它结合域），该决定簇可用信号发生系统（或其组分）进行标记。

标记的专一性结合剂的主要功能是与第一产物专一性结合。第一产物和专一性结合剂可形成一个免疫对，其中一个是抗原，另一个则是抗体，或两者可形成某些其它的专一性结合系统，例如抗生素蛋白或抗生蛋白链菌素-生物素系统。重要的是，标记的专一性结合剂与第一底物不发生显著反应。最好是完全不反应。因此，第一产物应当具有自己的特性，它能够被专一性结合剂从与之不同的第一底物中识别出来并与之结合。

标记的专一性结合剂的标记物可以是常用于竞争性检测的任一种标记物。例如，标记物可以是放射性同位素、荧光物质或能够发光、产生电化学或色度信号的酶系统中的一员。但标记物最好是第二酶，它可与第一酶相同，或最好是不同的。这样就能在检测系统中引入第二步放大作用，这一点下面将予以详述。

本方法的第一步骤涉及使样品进入检测程序，从而以预定状态和相关于样品中分析物浓度的浓度产生第一酶。为此目的，使酶附着于分析物本身或一种检测试剂，一般是分析物的类似物或该分析物的专一性结合剂（例如抗体）现有文献详述了酶与这种试剂的结合，同时不损害酶的性质。产生酶的预定状态可以很方便地是溶液（在此状态，可将它容易地从与固体表面结合的酶中分离出来），或使它结合于固体表面（在此状态，可将它容易地与溶液中的酶分离开来）。

现在，通过实例来描述本发明方法中步骤a的几种检测程序。一个专业读者将会容易地设计出其他程序，在这些实例中，为了简明起见，假设分析物是抗原，而其专一性结合剂是抗体，但正如上述，本发明并不受此限制。

A.试剂是与基质结合形成的分析物类似物，用酶标记的分析物的抗体存在于溶液中。在第一步中，使溶液中的酶标抗体与结合于基质上的分析物类似物接触，使其与之结合。通过洗涤去除多余的溶液。然后，使液体样品与结合在基质上的分析物类似物/抗体复合物保温。样品中的分析物与基质上的分析物类似物为结合在抗体上竞争。其结果是，分析物/酶标抗体复合物被释放至溶液中，其浓度与样品中分析物浓度成正比。此溶液然后用于本方法的下一步骤。

还残留有与基质结合的分析物类似物/标记抗体复合物，其浓度与样品中分析物浓度成反比。可以选择的另一途径是，弃去保温后产生的溶液，而在步骤b中代之使用与基质结合的物质。

B.试剂是与基质结合的针对分析物的抗体，酶标记的分析物类似物存在于溶液中。在第一步中，使溶液中的酶标记分析物类似物与基质结合的抗体接触，使其与之结合，通过洗涤去除多余的溶液。然后，使样品与基质结合的抗体/标记的分析物类似物复合物保温。样品中的分析物与标记的分析物类似物竞争与抗体的结合，从而将一部分标记的分析物类似物释放至溶液中。产生的溶液可用于步骤b，其中含有的酶标分析物类似物浓度与样品中分析物浓度成正比。

与A中所述相似，也可弃去溶液而代之使用固相。

C.试剂与A中的相同，但反应顺序不同，在第一步，使样品与酶标抗体的溶液保温，第二步使得到的混合物与基质结合的分析物类似物接触。

另外，也可同时在与基质结合的分析物类似物中加入样品和酶标记抗体溶液，从而通过一次保温完成全过程。

D.试剂与B中的相同，但反应顺序不同。在第一步，使样品与酶标分析物类似物溶液保温。在第二步，使产生的混合物与基质上的抗体接触。

另外，也可同时在与基质结合的抗体中加入样品和酶标的分析物类似物溶液，从而通过一次保温完成全过程。

E.此方案的选择只有在分析物具有多决定簇，即有几个位点可进行免疫结合时才有可能。试剂是与基质结合的针对分析物的第一抗体;针对分析物的酶标记的第二抗体存在于溶液中。本方法涉及使这两种试剂与样品保温，采用一步或任意顺序的两步都行。结果产生基质-（第一抗体）-（分析物）-（酶标记的第二抗体）的夹层结构。固相上酶标第二抗体的量与样品中分析物的量成正比。溶液中酶标第二抗体的量与样品中的分析物量成反比。溶液或者固相都可用于步骤b。

步骤a的功能之一是将酶标记的试剂分成两个部分。然而，并不是一定要使其中之一在液相中，而另一个与固相结合。实际上，对该两个部分的物理分离并不是总是必须的。有可能设计这样一个系统，其中使某一部分的酶钝化，而另一部分则不。下面列出了其它一些系统。

F.检测捕获于基质中的微生物，并且使用酶标记的抗体。

G.量杆似方法，其中，使酶标抗体或抗原作为对分析物存在的应答而移至另一区带。

本发明方法的步骤b包括在产生第一产物的条件下，使预定状态的第一酶（即所选择的酶标试剂部分）与一定量的第一底物接触产生第一产物。如果第一酶在溶液中，则通常最好以与固体基质或其它物质结合的形式提供底物。这样能使其方便地从上清液中分离出来，以利于本方法的后续步骤。第一底物可包括由某基团掩蔽的第一产物，通过酶的作用去除该基团后产生第一产物。

根据已经完全确立的化学方法，可为此目的制备固定化的和可固定底物。这种底物的一般结构可由下式表示：

X-O-A-L-M

其中X是根据所用的酶选择的糖基、磷酸酯、二磷酸酯、硫酸酯或其它残基;

O通常是，但不一定是羟基功能团，但也可以是例如氨基、羧基或巯基;

A可以是例如芳香核、杂环中心的一部分、肽或类固醇，由酶去掉X后产生;

L是一种化学桥键，通过双功能偶联剂例如戊二醛、二酰肼、氨基酸、6-氨基己酸、二酰亚胺酯而形成;以及

M可以是大分子载体如载体蛋白可溶性多糖或酶、或固体基质如玻璃、塑料、多聚物陶瓷或纸表面，或颗粒基质如多糖或多聚物，或化学物质如半抗原或抗原决定簇。

参见附图，图1a，1b和1c是根据上述命名法给出的底物实例。

在图1a中：

X是半乳糖;

A是荧光素

L是来自戊二醛

M是载体蛋白如牛血清清蛋白

在图1b中：

X是半乳糖

A是7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸

L是6-氨基己酸

M是载体蛋白如牛血清清蛋白

在图1c中：

X是半乳糖

A是雌酮

L是N-（O-羧甲基）肟

M是载体蛋白如牛血清清蛋白

将糖苷残基导入结构A的羟基时，可根据Koenigs-Knorr反应的一般原理进行。可在合适条件下，使四-O-乙酰基-α-D-半乳糖吡喃糖基溴化物与羟基-A反应。可通过标准的化学方法利用酸/碱萃取步骤及硅胶柱层折分离最终产物。下面的实例1-3描述了以溶液的和与基质结合的两种形式制备第一底物，EPA    28332也提供了有关信息。

以与基质结合的形式提供第一底物的优点是本检测法中的步骤a和b可以在一个容器中完成而无需倾倒或洗涤。缺点是基质上的底物与第一酶的反应动力学可能很慢。在此缺点确成问题的情况下，可以推荐在溶液中提供第一底物的方式。在这种情况下，第一酶可以在溶液中或以与基质结合的形式产生。馔扔牖式岷系男问讲谝幻父奖恪?

将预定状态中的第一酶与第一底物一起保温以产生第一产物。这是本方法的第一步放大作用。必须同时考虑第一底物的量、保温的时间和其他条件，以确保所产生的第一产物的浓度不仅被放大而且还与起始样品中分析物的浓度相关。换句话说，不能使第一酶和第一底物间的反应进行完全，以便在此步结束时得到的是第一底物和第一产物的混合物。

在本方法的步骤c中，使第一产物在合适条件下与标记的专一性结合剂接触，从而使二者结合在一起，以这种方式测定第一产物的存在或数量。如何测定不是本发明的主题，现有文献中描述了多种不同的技术。如果第一底物是以与基质结合的形式提供的，这一步通常包括使标记的专一性结合剂与第一产物和未反应的残留的第一底物的混合物保温。如上面所指出的，本方法成功的关键是标记的专一性结合剂与第一底物不应有显著反应，最好是根本不发生反应。为此目的对第一产物和第一底物进行的设计，在某种程度上说是反复试验的结果，当然，试验是根据已知的原理进行的，利用多克隆抗体作为专一性结合剂，我们已使交义反应活性降到0.018%以下，而且如果使用单克隆抗体，期望此数据将进一步显著下降。

如果在溶液中提供第一底物，因而导致在溶液中产生第一产物，那么最好在步骤c之前就使二者分离。这一点可通过使用过量的与基质结合的抗体（或其他专一性结合剂）完成，即使基质上的抗体与第一产物（通过第一酶作用于单一底物产生）上的抗原决定簇（或其他结合位点）结合。倾出含有残留的第一底物的上清液并洗涤固相。然后，最好是通过使用标记有信号发生系统（或其组分）的另一抗体（或其他的专一性结合剂），使一标记试剂与基质上的第一产物结合。

在步骤c的保温之后，通常有必要将与第一产物结合的标记的专一性结合剂从未结合的部分分离出来。如果第一产物固定在固定基质上，通过倾倒和洗涤就可容易地完成这种分离作用。如果第一产物产生于溶液中，则可能需要某种其他的分离技术，另外，对于某些标记系统无需进行物理分离，例如，可通过某种途经使结合（或未结合）于第一产物的标记物掩蔽起来或钝化。

必须测定结合或未结合于第一产物的标记物。对于定量检测来说，这一步包括测定结合或未结合标记物的浓度。根据所用标记物的性质，进行这种测定的技术在本领域内是已知的，本文不拟描述。在实施本发明的一个优选方案中，如果标记物是第二酶（不同于第一酶，且不与第一底物反应），此测定过程包括第二步放大作用。因此，一分子结合的第二酶作用于第二底物的许多分子，在溶液中产生许多分子的第二产物，然后通过例如发光、荧光或色度变化观察第二产物，在这些情况下，必须提供过量的第二底物，并应当在预定条件下以预定时间与结合的酶进行保温。

本方法的步骤d包括使用步骤c的结果确定样品中分析物的存在或浓度。这通常是通过标准曲线完成的。用本方法测定含有已知浓度分析物的标准样品，这些浓度覆盖预期的未知分析物的范围。用此结果作出信号强度对分析物浓度的曲线图。测定了一个未知样品的信号强度后，可简单地从图上读出该样品中的分析物浓度。

下列实施例说明本发明

实施例1    二-半乳糖    基荧光素胺-半琥珀酸的制备与性质

荧光素胺（1g，2.9毫摩尔）和琥珀酸酐（400mg，4毫摩尔）在50mlTHF中回流4小时。去掉溶剂以后，在残留物中加入100ml0.5MHCl。冰上放置1小时，然后加入200ml乙酸乙酯，以溶解所出现的大量沉淀物。

用酸和水洗涤有机层，在Na₂SO₄上干燥，使体积降至荧光素胺-半琥珀酸（FAHS）开始沉淀为止。使沉淀过程在低温下继续进行，然后用冷乙酸乙酯洗涤产物并进行真空干燥。

使荧光素胺半琥珀酸（500mg，1.1毫摩尔）和乙酰溴-α-D-半乳糖（2g，4.9毫摩尔）在4g无水K₂CO₄存在的条件下与干丙酮（50ml）和甲醇（5ml）的混合物回流24小时，通过乙酸乙酯∶甲醇（80∶20）的TLC监测反应。

反应后使混合物冷却，过滤并去除溶剂。然后用无水乙酸乙酯∶二乙基醚混合物（50∶50）洗涤残留物，以除去多余的溴糖，将残渣置入冷的0.1MNaHCO₃中，用乙酸乙酯洗涤，置于冰上酸化，萃取入乙酸乙酯中，用水洗涤。然后使有机层干燥，去除溶剂以后，混合物在干燥器中在真空下放置过夜。得到的油状残留物溶于15ml分析纯甲醇中并置于冰上冷却，加入200μl1M的甲氧化钠，1小时后加入100ml乙酸乙酯∶二乙基醚（50∶50）的混合物。将其置于低温中过夜以使产物沉淀。沉淀用冷乙醚和乙酸乙酯洗涤多次，然后干燥。此物质是几乎纯的底物。通过用乙酸乙酯萃取此底物的酸化水溶液而除去微量的荧光素。中和提纯的产物后进行冰冻干燥。

在评价其作为β-半乳糖苷酶底物的性能之前，用扫描分光光度计观测二-半乳糖苷基荧光素胺-半琥珀酸，以鉴别其最大吸收的波长。利用已知浓度的基本液，测定糖苷配基在490nm处的初级摩尔消光系数大约为38000。用紫外光检测表明，在糖苷配基和荧光弱得多的二-半乳糖苷的荧光之间存在非常显著的差别。

为了证实底物的水解作用，利用β-半乳糖糖苷酶在PH7.3进行时间进程实验，最终的底物浓度为2.7mM。在490nm处监测光吸收的上升以测定糖苷配基的形成。

底物（200μl，浓度为4mM，在50mM Tris缓冲液PH7.3，0.1M NaCl，1mM MgCl₂中）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶（100μl，0.28单位）于37℃以不同时间保温。加入0.5ml冰冷却的0.5M CO₃/HCO₃缓冲液PH9.5终止反应，在490nm处读取反应混合物的吸光度。得到的曲线斜率表明，在此条件下每分钟产生74微微摩尔产物。

由于二-半乳糖苷基-FAHS作为β-半乳糖苷酶底物表现出明显的活性，因此，利用³H-荧光素示踪物评价此底物与其糖苷配基的交叉反应活性。结果表明，虽然抗荧光素的抗血清能很容易地识别糖苷配基并与之结合，但却不容易识别完整底物并与之结合。

为了抑制50%的³H-示踪物与适当稀释的抗荧光素抗血清的结合，需要加入45倍摩尔过量的FAHS，因此在所测试的范围内，二-半乳糖苷基-FAHS不能抑制这种结合。此底物的交叉反应活性因此低于糖苷配基的0.45%

实例2    二-半乳糖    基-荧光素胺-HS与AH-琼脂糖的偶联。

将1gAH-琼脂糖4B经溶胀洗涤后悬浮于10ml0.01M磷酸缓冲液PH6.8中。悬浮液中加入209mg实例1的底物和400mg    CMC，滚动24小时以使其混合，再加入200mgCMC，使反应进一步进行24小时。利用常规的低和高PH条件洗涤该凝胶，然后保存于PBS中。它具有明显的黄色。为了测试琼脂糖上的底物是否能受到酶的水解作用，用一系列20μl50%的底物-琼脂糖悬浮液的等分试样与或不与β-半乳糖苷酶保温过夜。在同样的试管中进行的RIA表明，测试样品与示踪物的结合达27%，而对照样品与示踪物的结合为45%。此结果清楚表明，AH-琼脂糖上的底物能够受到酶的水解作用。

实例3    单-半乳糖苷-荧光素底物

根据标准方法制备硝基荧光素。通过在过量甲醇中和存在有1%浓H₂SO₄的条件下回流硝基荧光素而制备甲基酯

在苯-四氢呋喃混合物中和存在有碳酸银（催化剂）和硫酸钙（内部干燥剂）的条件下，利用四乙酰基溴代半乳糖将半乳糖导入硝基荧光素-甲基酯的剩余的游离的功能羟基上。

根据标准的甲基化方法，利用二甲基硫酸酯和0.1N    NaOH制备硝基荧光素甲基酯的甲氧基衍生物。去掉酯后产生单甲氧基-硝基荧光素。如上述方法导入半乳糖。

由上述步骤能够产生三种可能的单半乳糖苷硝基荧光素衍生物：（A）、（B）和（C）。（参见图2）。

使功能硝基还原的话，则所通过产生的氨基进一步修饰。

实例4    乌本苷-胎球蛋白结合物的制备

利用高碘酸氧化/Schiffs碱法制备乌本苷-胎球蛋白的结合物。含有10.8μCi³H-异羟基毛地黄毒苷的乌本苷（200mg）用偏高碘酸钠于室温下氧?小时，然后与110mg胎球蛋白在PH9-9.5于室温下进一步反应2小时。反应产物与137mg氢硼化钠反应4小时而稳定化，在水中透析6天（换5次水，每次5升），冷冻干燥以减少体积，最后在Sephadex G50上进行凝胶过滤，以去除残留的未结合的微量乌本苷。

实例5    放大式免疫检测法完整程序的演示

选择ELISA法来说明以放大作用为基础的完整的反应顺序。下面所用的乌本苷-胎球蛋白合成法见于实例4。

在进行检测的准备工作时，首先预包膜两块PVC ELISA平板。对于第一块平板（平板1），平板的孔用乌本苷-胎球蛋白或单用胎球蛋白（10μg，在100μl包膜缓冲液中）于4℃包膜过夜。然后用洗涤缓冲液洗涤平板3次，每孔中加入β-半乳糖苷酶结合的抗异羟基毛地黄毒苷I_gG（100μl;来自上述的结合物以1+1进行洗涤缓冲液稀释）。37℃下2小时后，从平板上洗去多余的抗体-酶结合物（用洗涤缓冲液洗3次）。

第二块平板（平板2）的孔单用BSA（100μl 1mg/ml在包膜缓冲液中）或BSA-香豆素-β-半乳糖苷（100μl;1mg/ml在包膜缓冲液中）于4℃包膜过夜。在既将使用时，平板用包膜缓冲液洗涤3次，然后用β-半乳糖苷酶检测缓冲液（0.1M磷酸钠缓冲液PH7.1，0.1MNaCl，10mM MgCl₂）再洗一次。

如下述进行检测，在平板1的每个含有乌本苷-胎球蛋白抗原的孔中加入异羟基毛地黄毒苷溶液（1ng/ml-1mg/ml，在150μl    PBS中）。37℃下1小时后搅拌每一个孔中的内容物，每孔的上清样品（100μl）转移至平板2的含有固定化BSA-香豆素-β-半乳糖苷（和50μl    β-半乳糖苷酶检测缓冲液）的孔中。在含有固定化BSA（和50μl    β-半乳糖苷酶检测缓冲液）的平板2的孔中加入100μl    PBS。

37℃下2小时后，平板2用洗涤缓冲液洗涤2次，每孔中加入碱性磷酯酶结合的抗香豆素I_gG（100μl，用洗涤缓冲液以1∶4稀释）。平板于37℃保温1.5小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次，以从平板的孔中去除未结合的抗体-酶结合物。在每一孔中加入碱性磷酯酶底物溶液（100μl;6mM_pN_p-磷酸酯，在0.1M甘氨酸缓冲液pH10.4，1mM ZnCl₂，1mM MgCl₂中），平板于室温下保温。在15分钟和30分钟时，用ELISA平板测定仪测定平板在410nm处的读数（图3）。

图3表明碱性磷酯酶联的抗香豆素I_gG对通过水解而暴露的香豆素残基的结合活性，所谓水解是通过取代的β-半乳糖苷酶联的抗异羟基毛地黄毒苷I_gG作用于固定化香豆素-β-半乳糖苷进行的。碱性磷酯酶-抗香豆素与单独的BSA的结合少于与BSA-香豆素的最大结合的5%，结合物与未水解底物的结合大约为最大结合的29%。用此数据减除所有其它数据后作图。检测以平行样品进行。

此结果构成了检测异羟基毛地黄毒苷的基础，其信号在10ng/ml-1mg/ml的范围内与所提供分析物的浓度成正比。

实例6    实验方法

1.固相捕获系统的制备

在PVC ELISA平板的每个孔中加入大约10μg亲和纯化的抗香豆素I_gG（在100μl包膜缓冲液中），平板在潮湿环境中于4℃保温过夜。第二天，用洗涤缓冲液从平板上洗去未结合的I_gG（洗4次）。

2.在葡聚糖-6-氨基己烷上的香豆素底物-雌二醇的双结合物

用高碘酸钠氧化葡聚糖（Dextran    T40）以产生醛基功能团;引入二氨基己烷，然后用氢硼化钠还原使连接稳定化。香豆素-半乳糖和雌二醇通过其衍生物的活性酯键接在葡聚糖-6-氨基己烷上。将活性酯依次加到葡聚糖上，底物与雌二醇的比例为5∶1、反应示于图4中。

双结合物透析后在Sephadex    G50上层析。含有葡聚糖的组分表现出荧光（微弱，表明香豆素底物的存在）。

3.葡聚糖-底物溶液的制备

把得到的葡聚糖-底物（1mg/ml）用β-半乳糖苷酶检测缓冲液制备成溶液，在其中加入抗香豆素I_gG（12μl用洗涤缓冲液适当稀释的抗香豆素I_gG/120μl葡聚糖-底物），以阻断所有能作为杂质存在的暴露位点（此步并不是本方法所必需的）。混合物于37℃保温1小时。

4.固相乌本苷-抗异羟基毛地黄毒苷-β-半乳糖苷酶结合物的制备

在PVC    ELISA平板的每个孔中加入大约10μg胎球蛋白-乌本苷（实例4）（在100μl包膜缓冲液中），平板在潮湿环境中于4℃保温过夜。用洗涤缓冲液从平板上洗去游离的结合物（洗4次）。然后每孔中加入β-半乳糖苷酶联的亲和纯 的羊抗异羟基毛地黄毒苷I_gG（4μg结合物，在100μl PBS中，3mg/ml BSA）（抗异羟基毛地黄毒苷结合物）。

平板然后于室温下保温2小时，如上述从孔中洗去多余的结合物。

5.利用由溶液中异羟基毛地黄毒苷的置换而产生的半乳苷酶活性的标准放大式检测法。

制备异羟基毛地黄毒苷溶液（1ng-1μg/ml，在PBS中）或单独的PBS，每种100μl加入铺有固相乌本苷-抗异羟基毛地黄毒苷结合物的ELISA平板的孔中。室温下60分钟后，在搅拌下从每孔中取出100μl，或者通过标准的参考检测法用oNp-半乳糖苷检测，或者加入100μl葡聚糖-底物中。

20分钟以后，每种反应混合物取100μl转移至ELISA平板的用抗-香豆素包膜的孔中，然后此平板进一步保温20分钟。用洗涤缓冲液从孔中洗去未结合的反应产物（洗4次），在每孔中加入碱性磷酯酶联的亲和纯化的抗雌二醇I_gG（100μl，5μg/ml）。

20分钟后，如上述从孔中洗去游离的结合物，在每孔中加入碱性磷酯酶底物溶液（100μl;6mM    pNp-磷酯酶，在磷酯酶检测缓冲液中）。

在5、10和15分钟后读取产物溶液的光吸收，扣除底物空白（100μl碱性磷酯酶底物保温同样的时间）。

结果示于图5中。应当注意，在标准的参考oNp检测中，保温时间为90分钟。假如产生信号的保温时间至少为10分钟，则本发明的检测法比标准的参考检测法更为灵敏。

实例7    香豆素-半乳糖    基底物交叉反应的测定

根据标准的化学法制备半乳糖 基-香豆素-3-乙酸。通过放射性免疫分析、利用³H标记的7-羟基香豆素-3-乙酸衍生物和兔抗7-羟基香豆素-3-乙酸测定交叉反应。

采用标准的葡聚糖包膜的木炭法，并用常规的50%抑制公式去计算交叉反应数据，结果是0.008-0.018%。很低的交叉反应表明，香豆素和半乳糖    基香豆素对香豆素抗体的亲和性有很大的差别。

实例8    香豆素-半乳糖    基底物雌二醇（半抗原部分）结合物的制备和性质

根据标准的有机化学方法制备和纯化香豆素-3-乙酸和17β-雌二醇3-羟甲基醚的结合物，并接上1，8-二氨基辛烷作为臂。还制备一种可溶形式的结合物（见图6）。通过标准方法将半乳糖接在结合物中香豆素的7-羟基功能团上。

通过标准的ELISA法，分析结合物和底物结合物的免疫活性。

用兔抗香豆素包膜微量滴定板。在包膜孔中加入一系列浓度的结合物和底物，使其反应，洗涤后在孔中加入用碱性磷酯酶标记的抗雌二醇抗体，并使其反应。

洗涤以后，用pNp磷酸酯测量孔中保留的碱性磷酯酶活性。

结果表明底物和产物的反应活性显著不同。底物S1对抗香豆素抗体的亲和性低得多，这是由于抗原决定簇（香豆素部分）掩蔽所至。去掉半乳糖（S1→P1）而使抗原决定簇暴露出来，能使亲和性提高大约1000倍。溶解性更好的结合物（S2-P2）的反应活性稍好一些，交叉反应的数据证实了这些结果。

实例9    利用标准方法和放大式方法检测β-半乳糖苷酶

由贮备液（商业制剂，大约1mg/ml）制备一系列稀释的大肠杆菌β-半乳糖苷酶。

标准检测法如下述进行：

在微量滴定板的孔中，把10μlβ-半乳糖苷酶加入100μlpNp-半乳糖苷中，90分钟后加入100μl终止缓冲液停止反应，读取光吸收。

放大式检测法如下述进行

在微量滴定板的孔中，把10μl酶加到100μl    50μg/ml半乳糖    基-香豆素二氨基辛烷-雌二醇3CME结合物中。保温20分钟后，反应产物稀释至1/256，取100μl转移至用抗香豆素包膜的微量滴定板孔中。20分钟后洗涤平板，加入抗雌二醇-碱性磷酯酶，使其反应20分钟后洗涤，在10-30分钟起测量磷酯酶活性。

图7表明了对β-半乳糖苷酶稀释度作图的光吸收。放大式检测法的灵敏度比标准检测法大约高1000倍（见上）。（没有考虑在加入抗香豆素抗体包膜的孔中之前产物的稀释因素）。

实例10    17α-羟基黄体酮的酶免疫检测法（竞争性检测法）

标准检测法和放大式方法之间的比较

试剂和步骤：

通过标准的溴化氰活化法，将羊抗17-羟基黄体酮偶联在颗粒上。

通过标准方法制备17-羟基-黄体酮-3-羟甲基肟，并与大肠杆菌β-半乳糖苷酶（商业制剂）结合。

建立竞争性酶免疫检测法（游离的标准分析物与酶标记的分析物竞争磁性颗粒上的抗体）。利用标准的pNp-半乳糖苷测量结合部分的示踪物的活性，而在放大式方法中，则利用半乳糖苷基-香豆素-二氨基辛烷-雌二醇3CME作为第一底物进行测量，用偶联在磁性颗粒上的抗香豆素制剂捕获产物1（或其中的一部分）。利用抗雌二醇碱性磷酯酶和结合物测量捕获的产物1的水平，并用pNp-磷酸酯测量磷酯酶活性。

图8给出了所得结果的一个例子。即使只有一小部分P1进入检测法的第二步，放大式方法也使产生的信号大大加强。

Claims (11)

1、一种检测样品中分析物的方法，它是通过使用第一酶及能够与其作用产生第一产物的第一底物，该方法包括以下步骤：

a)使样品进入检测程序，从而以预定状态和与样品中分析物浓度有关的量产生第一酶，

b)使预定状态的第一酶在合适条件下与第一底物接触，以产生其数量与样品中分析物浓度有关的第一产物，

c)使步骤b产生的第一产物在合适条件下与第一产物的特异性结合剂接触，从而使二者结合在一起，来确定该第一产物的存在或含量，

d)利用c的结果确定样品中分析物的存在或浓度。

2、如权利要求1所述的方法，其中的第一底物是以与基质结合的形式提供的，而步骤b中的第一产物是以与基质结合的形式产生的。

3、如权利要求1所述的方法，其中的第一底物是以溶液形式提供的，而步骤b的第一产物产生于该溶液中。

4、如权利要求3所述的方法，其中步骤a的第一酶是以与基质结合的形式产生的。

5、如权利要求3或4所述的方法，其中步骤b产生的第一产物在进行步骤c之前由溶液转化成与基质结合的形式。

6、如权利要求1至5中任何一个所述的方法，其中的步骤c按下述进行：使第一产物在合适条件下与第一产物的标记的特异性结合剂接触，从而使二者结合在一起，然后测定与第一产物结合或未结合的标记物。

7、如权利要求6所述的方法，其中的特异性结合剂是用酶标记的。

8、如权利要求1至7中任何一个所述的方法，其中的第一酶是β-半乳糖苷酶。

9、如权利要求8所述的方法，其中的第一底物是二-半乳糖基-荧光素胺-半琥珀酸或单一半乳糖苷-荧光素底物。

10、如权利要求8所述的方法，其中的第一底物是半乳糖基-香豆素一雌二醇底物。

11、如权利要求1至10中任何一个所述的方法，其中提供了一种与基质结合形式的分析物类似物和在溶液中的酶标记的分析物-抗体，步骤a的检测程序包括使样品中的分析物与基质上的分析物类似物竞争性地与酶标记的抗体结合。

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