NO884705L - Enzym assay metode. - Google Patents

Description

Enzymassaymetode

Konkurranseassays, såsom immunoassays og immunometriske assays blir mye brukt i klinisk kjemi. De gir et spesifisi-tetsnivå og en sensitivitet som det er vanskelig eller umulig å nærme seg med andre analytisk metoder. Det er imidlertid et behov for å øke følsomheten av slike assays ytterligere av to grunner. For det første er enkelte analytter av interesse tilstede i ekstremt lave konsentrasjoner. For det andre kan mer sensitive assays vanligvis brukes for å påvise høyere konsentrasjoner av analytter raskere. Det har blitt foretatt forsøk på å maksimere assayfølsomheten ved å anvende radiomerkede fluorescente eller kjemiluminescente reagenser, men ideelle kombinasjoner av følsomhet, reproduserbarhet og egnethet har ikke blitt oppnådd for alle anvendelser.

En alternativ strategi for å forbedre assayfølsomheten er å anvende et forsterkningstrinn, slik at et produkt som kan dannes i ikke mer enn støkiometriske mengder i forhold til analytten, fremmer dannelsen av en signifikant høyere konsentrasjon av et andre produkt, som så blir observert. Bruken av enzymer for dette formål har blitt beskrevet i literaturen. Ved gjentatte ganger å virke som katalysato-rer, kan enzymer oppnå forsterkning med faktorer på hundreder eller tusener.

I prinsipp er det mulig å oppnå ytterligere forsterknings-grader ved bruken av to enzymsystemer i sekvens. I praksis er dette imidlertid ikke lett å oppnå. A. Johannsson et al.

(Journal of Immunological Methods, 87 (1986) 7 til 11) beskriver et assay for TSH. Et første katalytisk trinn innbefatter defosforylering av NADP for å danne NAD, som katalytisk aktiverer en spesifik redox syklus for å danne en intenst farget forbindelse som blir observert. Metoden har den ulempe at den bruker esoteriske ustabile enzymer og at

den innbefatter NADP/NAD, slik at den ikke kan brukes ved prøver inneholdende disse materialer.

Yolken R.H. (Rev. Infec. Dis., 4 (1982) 35-68) beskriver et immunoassay med komplementoverført forsterkning. Metoden er avhengig av ikke-spesifike komplement-kaskadeaktiverings-trinn, og komplementene er vanskelige å isolere.

EPA 75379 (Syva) og EPA 152254 (Du Pont) beskriver begge immunoassays som innbefatter å binde to enzymer til en fast base, ett i forhold til analyttkonsentrasjonen hvor produktet av ett enzym er substratet for det andre.

EPA 180327 (Amoco) beskriver et immunoassaysystem som innbefatter enzymer hvor et reaksjonsprodukt kan eksistere i en (væske)fase forskjellig fra substratet.

Assaymetoden ifølge foreliggende oppginnelse anvender minst ett, og i dens foretrukne former, to eller flere enzymfor-sterkningstrinn. I dens foretrukne former krever metoden også anvendelse av reagenser som lett kan erholdes eller fremstilles og som er stabile over egnede tidsperioder.

Oppfinnelsen fremskaffer en fremgangsmåte for å undersøke en analytt i en prøve ved bruken av et første enzym og et første substrat på hvilket det første enzym kan virke for å danne et første produkt, hvilken metode omfatter trinnene: a) å underkaste en prøve en assayfremgangsmåte ved å føre det første enzym til en på forhånd bestemt tilstand i en mengde som står i forhold til konsentrasjonen av analytt i prøven, b) å sette det først enzym i den på forhånd bestemte tilstand i kontakt med et første substrat under betingelser for å danne et første produkt i en mengde som står i forhold til konsentrasjonen av analytt i prøven, c) å bestemme mengden eller tilstedeværelsen av første produkt ved å sette første produkt dannet i trinn b) i kontakt med et spesifikt bindemiddel for første produkt under betingelser som forårsaker at disse blir bundet til hverandre, og d) å bruke resultatet fra c) til å bestemme konsentrasjonen eller tilstedeværelsen av analytt i prøven.

Analyttypen er ikke kritisk. Analytten kan f.eks. være et hapten eller et antigen eller et antistoff, såsom et hormon, et steroid, et legemiddel eller metabolitt av legemiddel, et protein, en nukleinsyre, et vitamin eller et polysakkarid.

Typen prøve er heller ikke kritisk. Prøven kan være en biologisk væske, såsom serum, plasma, urin eller melk.

Funksjonen av første enzym er å virke på det første substrat for å danne et distinkt første produkt. Eksempler kan i prinsipp bli funnet i alle hovedklasser av enzymer. Således kan det første enzym være oksidoreduktase, en transferase, en lyase, en isomerase, en ligase eller en hydrolase. Innen denne siste klasse enzymer kan slike av spesiell potensiell viktighet finnes, slik som glykosidaser, fosfotaser, sulfa-taser, esteraser og lipaser.

Funksjonen av det første substrat er å bli påvirket av det første enzym for å danne et særpreget første produkt. Følgelig er valget av første substrat avhengig av valget av første enzym.

Et hovedtrekk ifølge oppfinnelsen er virkningen av det første enzym på det første substrat for å påvise et første produkt med antigene determinanter (eller andre bindingsdom-ener) for å binde til et antistoff (eller annen spesifik binder) som kan være merket med (en komponent av) et signal-dannende system.

En hovedfunksjon til det merkede spesifike bindemiddel er å binde spesifikt til det første produkt. Det første produkt og den spesifike binder kan danne et immunpar hvor den ene er antigenet og det andre antistoffet, eller disse to kan omfatte et eller annet annet spesifikt bindingssystem, såsom avidin- eller streptavidin-biotinsystemet. Det er viktig at den merkede spesifike binder ikke reagerer i vesentlig grad eller fortrinnsvis ikke i det hele tatt, med det første substrat. Således må det første produkt være særpreget i den forstand at det blir gjenkjent for bindingsformål av den spesifike binder, til forskjell fra det første substrat.

Merkingen av den spesifike binder kan være enhver merking som vanligvis blir brukt for påvisning i kokurranseassays. For eksempel kan merkingen være en radioisotop, et fluore-scent materiale eller en del av et enzymsystem for å danne et luminescent eller elektrokjemisk eller kolorimetrisk signal. Fortrinnsvis er merkingen imidlertid et andre enzym som kan være det samme som, eller mer foretrukket, forskjellig fra det første enzym, slik at et andre forsterkningstrinn på denne måte kan innføres i assayet, slik som det vil bli beskrevet i større detalj nedenfor.

Det første trinn av metoden innbefatter å underkaste prøven en assayfremgangsmåte for å danne det første enzym i en på forhånd bestemt tilstand i en konsentrasjon i samsvar med konsentrasjonen av analytt i prøven. For dette formål festes enzymet til selve analytten eller til et av assay-reagensene, generelt enten en analog til analytten eller et spesifikt bindemiddel (f.eks. et antistoff) til analytten. Festingen av enzymer til reagenser av dette slag uten tap av enzymatiske egenskaper, er godt beskrevet i litteraturen. Den på forhånd bestemte tilstand i hvilken enzymet dannes kan passende være i oppløsing (i hvilken tilstand det lett kan separeres fra enzym bundet til en fast overflate) eller alternativt bundet til en fast overflate (i hvilket tilstand den lett kan skilles fra enzym i oppløsning).

Flere assaymetoder for trinn a) ifølge metoden til oppfinnelsen skal nå beskrives som eksempler. Em fagmann vil ikke ha noen vanskelighet med å finne andre. I disse eksempler vil det for enkelthets skyld bli antatt at analytten er antigenisk og at dens spesifike binder er et antistoff, selv om oppfinnelsen ikke er begrenset til dette, som forklart ovenfor.

A. Reagensene er en analytt-analog i matrisebundet form og et antistoff til analytten merket med et enzym, i oppløs-ning. I et første trinn settes det enzymmerkede antistoff i oppløsning i kontakt med den matrisebundne analyttanalog, til hvilken den blir bundet. Overskytende oppløsning fjernes ved vask. Derpå blir den flytende prøven inkubert med det matrisebundne analyttanalog/antistoff-kompleks. Analytten i prøven konkurrerer med den matrisebundne analyttanalog om binding til antistoffet. Som resultat blir det frigjort i oppløsning et analytt/enzymmerket antistoffkompleks i en konsentrasjon som er direkte proposjonal med konsentrasjonen av analytt i prøven. Denne oppløsning blir så brukt i neste trinn i metoden. Det gjenstår et matrisebundet analyttanalog/merket antistoffkompleks i en konsentrasjon som er invers proposjonal med konsentrasjonen av analytt i prøven. Alternativt er det mulig å kaste opp-løsingen som stammer fra inkuberingen og bruke for trinn b) dette matrisebundne materiale istedet.

B. Reagensene er et matrisebundet antistoff til analytten og en enzymmerket analyttanalog i oppløsning. I et første trinn settes den enzymmerkede analyttanalog i oppløsning i kontakt med det matrisebundne antistoff og blir bundet til dette. Overskytende oppløsning fjernes ved vask. Derpå inkuberes prøven med det matrisebundne antistoff/merket analyttanalog-kompleks. Analytten i prøven konkurrerer med den merkede analyttanalog om binding til antistoffet og erstatter noe av den merkede analyttanalog i oppløsning. Den resulterende oppløsning som inneholder enzymmerket analyttanalog i en konsentrasjon som er direkte proposjonal med analyttkonsentrasjonen i prøven, blir brukt for trinn

b) .

Alternativt , som i A, kan oppløsningen kastes og den faste fase brukes i stedet. C. Reagensene er de samme som i A, men rekkefølge for reaksjonen er forskjellig. I et første trinn inkuberes prøven med oppløsning av enzymmerket antistoff. I et andre trinn settes den resulterende blanding i kontakt med den matrisebundne analyttanalog.

Alternativt kunne prøven og den enzymmerkede antistoffopp-løsning bli tilsatt til den matrisebundne analyttanalog sam-tidig, og hele fremgangsmåten utført i en enkelt inkubering. D. Reagensense er de samme som i B, men reaksjonsrekkeføl-gen er forskjellig. I et første trinn inkuberes prøven med den enzymmerkede analyttanalog-oppløsning. I et etterføl-gende trinn settes den resulterende blanding i kontakt med det matrisebundne antistoff.

Alternativt kunne prøven og den enzymmerkede analyttanalog-oppløsning ha blitt tilsatt det matrisebundne antistoff sam-tidig og hele fremgangsmåten blitt utført i en enkel inkubering.

E. Dette alternativ er mulig bare når analytten er polyepi-topisk med flere seter tilgjengelige for immunbinding. Reagensene er et matrisebundet første antistoff til analytten og et enzymmerket andre antistoff til analytten i oppløsning. Metoden innbefatter å inkubere disse to reagenser med prøven i ett eller to trinn og med enhver blandingsrekkefølge. Resultatet er en lagvis fordeling av matrise-(første antistoff)-(analytt)-(enzymmerket andre antistoff). Mengden enzymmerket andre antistoff på den faste fase er direkte proposjonal med mengden av analytt i prøven. Mengden av enzymmerket andre antistoff i oppløsning er omvendt proposjonal med mengden analytt i prøven. Enten oppløsningen eller den faste fase kan brukes for trinn b). En funksjon av fremgangsmåten i trinn a) er å skille det enzymmerkede reagens i to fraksjoner. Imidlertid er det ikke nødvendig at en av disse er i flytende fase mens den andre er matrisebundet. Faktisk er fysisk adskillelse av de to fraksjoner ikke alltid nødvendig. Det er mulig å fremskaffe et system hvor enzymet i en fraksjon, men ikke i den andre, har blitt inaktivert. Andre systemer innbefatter følgende: F. Påvisning av mikroorganismer, hvor mikroorganismene er fanget i en matrise og enzymmerket antistoff tilføres.

G. Dyppe-lignende fremgangsmåte, hvor et enzymmerket antistoff eller antigen beveges til en annen sone som svar på tilstedeværelsen av en analytt.

Trinn b) av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter å sette første enzym i den på forhånd bestemte tilstand, dvs. den utvalgte reaksjon av det enzymmerkede reagens, i kontakt med en mengde av et første substrat under betingelse for å danne et første produkt. Når det første enzym er i oppløs-ning og for å lette de påfølgende trinn av metoden, vil det vanligvis være passende å tilføre substratet i en form bundet til en fast matrise eller et annet materiale ved hjelp av hvilket det lett kan bli adskilt fra supernatantvæsken. Det første substrat kan omfatte det første produkt maskert med en gruppe som fjernes ved aktivering av enzymet for å blottlegge det første produkt.

Immobiliserte og immobiliserbare substrater for dette formål kan fremstilles i henhold til vel etablerte kjemiske metoder. Den generelle struktur av slike substrater kan bli representert som følger:

hvor X er glukosyl, fosfat, difosfat, sulfat eller et annet residium valgt i samsvar med enzymet som blir brukt;

0 er vanligvis, men ikke nødvendigvis, en hydroksylfunksjon, men kan også f.eks. være en amino, karboksyl eller sul-fudryl-gruppe;

A kan f.eks. være en aromatisk kjerne, en del av et hetero-cyklisk sentrum, peptid eller steroid, blottlagt ved fjerning av X med enzymet;

L er en kjemisk bro formet av et bifunksjonelt koblingsmid-del, såsom glutaraldehyd, dihydrasid, aminosyre, 6-amino-heksansyre, diimidat, og

M kan være en makromolekylær bærer, såsom et bæreprotein oppløselig polysakkarid eller enzym eller en fast bærer såsom en glass-, plast-, polymer-, keramisk eller papirover-flate eller et partikulært støttemiddel, såsom polysakkarid eller polymer eller en kjemisk substans såsom et hapten eller en antigendeterminant.

Det refereres til de medfølgende tegninger hvor figurene la, lb og lc er eksempler på substrater i henhold til oven-fornevnte nomenklatur.

1 figur la er:

X galaktose

A fluoresin

L fra glutaraldehyd

M bæreprotein, f.eks. bovin serum albumin

I figur lb er:

X galaktose

A 7-hydroksy-4-mety1-cumarin-3-eddiksyre

L 6-amino capronsyre

M bæreprotein, f.eks. bovin serum albumin.

I figur lc er:

X galaktose

A oesteron

L n-(O-karboksymetyl)oksim

M bæreprotein, f.eks. bovin serum albumin.

Innføringen av glykosidiske residier i hydroksylfunksjonene av A-strukturene kan utføres i henhold til de generelle prinsipper av Koenigs-Knorr-reaksjonen. Tetra-O-acetyl-cx-D-galaktopyranosylbromid kan omsettes med hydroksyl-A under passende betingelser. Isolering av det endelige produkt kan utføres ved standard kjemiske fremgangsmåter ved å bruke sure/alkaliske ekstraksjonstrinn såvel som kollonnekromato-grafi på silikagel. Fremstillingen av første substrat, både i oppløsning og i matrisebundet form, er beskrevet nedenfor i eksemplene 1-3, og EPA 28332 gir også relevant informa-sjon.

En fordel ved å fremskaffe første substrat i en matrisebundet form er at trinnene a) og b) av assaymetoden kan utføres i et enkelt kammer uten behov for dekantering eller vask.

En ulempe er at de kinetiske trekk av reaksjonen mellom det matrisebundne substrat og det første enzym kan være noe langsomme. I tilfeller hvor dette viser seg å være et problem, kan det bli foretrukket å fremskaffe første substrat i oppløsning. I dette tilfelle kan det første enzym bli dannet enten i oppløsning eller i matrisebundet form. Det er ofte mere praktisk å danne det første enzym i matrisebundet form.

Det første enzym i den på forhånd bestemte tilstand inkuberes med første substrat for å gi det første produkt. Dette er det første forsterkningstrinn av metoden. Mengden av første substrat og tiden samt andre inkuberingsbetingel-ser må velges sammen for å sikre at det første produkt fremskaffes med en konsentrasjon som ikke bare blir forsterket, men som også er relatert til konsentrasjonen av analytt i utgangsprøven. Med andre ord må reaksjonen mellom første enzym og første substrat ikke bli tillatt å gå til avslutning, slik at det mot slutten av trinnet er tilbake en blanding av det første substrat og det første produkt.

I trinn c) av metoden settes det første produkt i kontakt med en merket spesifik binder under betingelser for å forårsake disse å bli bundet til hverandre, og på denne måte blir mengden eller tilstedeværelsen av første produkt bestemt. Hvordan dette foretas er ikke kritisk for oppfinnelsen. Mange forskjellige teknikker er tilgjengelige og beskrevet i litteraturen. Når det første substrat har blitt fremskaffet i matrisebundet form, innbefatter dette trinn vanligvis å inkubere den merkede spesifike binder med en blanding av første produkt og uomsatt gjenværende første substrat. Som bemerket ovenfor, er det viktig for at metoden skal lykkes at den merkede spesifike binder ikke bør binde seg signifikant eller fortrinnsvis ikke i det hele tatt til første substrat. Form av første produkt og første substrat for dette formål er til en viss grad et spørsmål om prøving og feiling, men riktignok i samsvar med kjente prinsipper. Ved å bruke et polyklonalt antistoff som spesifik binder har det blitt oppnådd kryssreaktiviteter under 0,018%, og det er ventet at dette tall vil kunne reduseres kraftig ved bruk av et monoklonalt antistoff.

Når første substrat foreligger i oppløsning med det resultat at første produkt dannes i oppløsning, er det foretrukket å skille de to før man fortsetter til trinn c). Dette kan gjøres ved bruk av overskudd av et matrisebundet antistoff (eller annen spesifik binder) for å binde seg til de antigene determinanter (eller andre bindingsseter) av første produkt som har blitt blottlagt under virkning av første enzym på første substrat. Supernatantvæsken omfattende gjenværende første substrat dekanteres, og den faste fase vaskes. Derpå blir, fortrinnsvis ved bruk av et annet antistoff (eller annen spesifik binder) og merket med en (bestanddel av et) signalgenererende system, et merket reagens bundet til det matrisebundne første produkt.

Etter inkuberingstrinn c) er det normalt nødvendig å adskille den del av den merkede spesifike binding som har blitt bundet til første produkt fra den del som ikke er slik bundet. Dersom første produkt immobiliseres på en fast matrise, oppnås slik adskillelse lett ved dekantering og vask. Dersom første produkt blir dannet i oppløsning, kan det være nødvendig å finne en annen form for adskillelse. Alternativt behøver for enkelte merkesystemer fysisk adskillelse ikke å være nødvendig, f.eks. kan markør bundet (eller ikke bundet) til første produkt være maskert eller inaktivert på en eller annen måte.

Det er nødvendig å bestemme bundet eller ikke bundet markør til første produkt. For et kvantitativt assay innebærer dette bestemmelse av konsentrasjonen av bundet eller ikke-bundet markør. Teknikker for å gjøre dette er velkjent i faget, avhengig av egenskapene til den anvendte markør, og vil ikke bli beskrevet her. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen når markøren er et andre enzym (som er forskjellig fra første enzym og ikke reaktiv med første substrat) , innbefatter denne bestemmelse et andre forsterkningstrinn. Således virker et molekyl av bundet andre enzym på mange molekyler av et andre substrat i oppløsningen for å danne mange molekyler av et andre produkt som obser-veres f.eks. ved luminescens, fluorescens eller farge-forandring. Under disse forhold behøver det andre substrat å bli tilsatt i overskudd og inkubering med det bundne enzym må bli fortsatt under på forhånd bestemte betingelser over en på forhånd bestemt tid.

Trinn d) av metoden innbefatter å bruke resultatet fra trinn c) for å bestemme konsentrasjnen eller tilstedeværelsen av analytt i prøven. Dette foretas generelt ved hjelp av en standardkurve. Standardprøver inneholdende kjente konsentrasjoner av analytt som dekker det ventede område av de ukjente substanser, underkastes metoden. Resultatene blir brukt til å tegne en kurve over signalinten-sitet mot analyttkonsentrasjon. Etter at signalintensiteten til en ukjent prøve har blitt bestemt, kan analyttkonsentrasjonen i denne prøve enkelt bli lest av kurven.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling og egenskaper av di-galaktosyl fluorescein amin-hemisuccinat

Fluoresceinamin (lg, 2,8 mmol) og succinsyreanhydrid (400 mg, 4 mmol) ble kokt under tilbakeløp i 50 ml THF i 4 timer. Etter fjerning av oppløsningsmidlet ble 100 ml 0,5M HC1 tilsatt residiet. Etter 1 time på is ble 200 ml etylacetat tilsatt for å oppløse den tunge utfelling.

Det organiske lag ble vasket med syre, med vann, tørket over Na2S04og redusert i volum inntil fluorescein amin-hemi-succinatet (FAHS) begynte å felles ut. Utfellingen fikk fortsette i kulde, hvorpå produktet ble vasket med kald etylacetat og tørket under vakuum.

Fluorescein-amin-hemisukkinat (500 mg, 1,1 mmol) og acetobrom-cx-D-galaktose (2 g, 4,9 mmol) ble kokt under tilbakeløp i 24 timer i en blanding av tørr aceton (50 ml) og metanol (5 ml) i nærvær av 4 g vannfri K2CC>3. Reaksjonen ble overvåket ved TLC i etylacetat: MeOH (80:20).

Etter reaksjonen ble blandingen avkjølt, filtrert og

oppløsningsmidlene ble fjernet. Det gjenværende ble vasket med tørr etylacetat: dietyleterblanding (50:50) for å fjerne overskytende bromsukker. Residiet ble tatt opp i kald 0,1M NaC03, vasket med etylacetat, surgjort mens det var på is, ekstrahert i etylacetat og vasket med vann. Det organiske lag ble så tørket og etter at oppløsningsmidlene hadde blitt fjernet ble blandingen oppbevart i en desikator under vakuum over natten. Til det resulterende oljeaktige residium oppløst i 15 ml metanol A.R. avkjølt på is ble det tilsatt 200 pl IM natriummetoksyd, og etter 1 time 100 ml etylacetat : dietyleter (50:50)-blanding. Dette ble oppbevart kaldt over natten for at produktet skulle felles ut. Utfellingen ble vasket flere ganger med kald eter og etylacetat, og så tørket. Dette materiale var nesten rent substrat. Spor av fluorescein ble fjernet ved ekstraksjon av en

surgjort vandig oppløsning av substratet med etylacetat. Det rensede produkt ble nøytralisert og derpå frysetørket.

Før dets bekreftelse som et P-galactosidasesubstrat, ble di-galactosyl-fluorescein-aminhemisukkinatet undersøkt med scanning spektrofotometri for å klarlegge bølgelengden for dets maksimale absorbens. Ved å bruke stamløsninger med kjent konsentrasjon ble en preliminær molar ekstingsjonsko-effisient for aglyconet ved 49 bestemt til å være ca. 38.000. Undersøkelse under UV-belysning viste en meget uttalt forskjell mellom fluorescensen av aglyconet og det mye mindre fluorescente di-galactosid.

For å vise hydrolysen av substratet ble et tidsforsøk utført ved å bruke P-galaktosidase ved pH 7,3 og en endelig sub-stratkonsentrasjon på 2,7 mM. Økningen i absorbens ved 490 nm ble overvåket for å måle aglycondannelse.

Substrat (200pl), 4 mM i 50 mM Tris buffer pH 7,3, 0,1M NaCL, ImM MgCl2) og E. coli 3-galactosidase (100 pl, 0,28 U) ble inkubert ved 37°C i forskjellige tidsperioder. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av iskald 0,5M CI3/HCO3buffer pH 9,5 (0,5 ml) og absorbensen til reaksjonsblandin-gen avlest ved 490 nm. Stigningen av den dannede linje indikerte at 74 pmol av produktet var dannet pr. minutt under disse betingelser.

Siden di-galactosyl-FAHS viste klar aktivitet som et p-galactosidasesubstrat, ble kryss-reaktiviteten av dette substrat med hensyn til dets aglycon undersøkt ved å bruke<3>H-fluorescein-sporeren. Resultatetene viste at mens anti-fluorescein antiserumet lett var istand til å gjenkjenne og binde aglyconet, var det mindre lett i stand til å gjenkjenne og binde det intakte substrat.

Et 45 ganger molart overskudd av FAHS krevdes for å hemme virkningen av<3>H-sporeren med et egnet fortynnet anti-fluorescein antiserum med 50%, mens over det undersøkte område var di-galactosyl-FAHS ute av stand til å hemme denne binding. Kryssreaktiviteten av substratet var derfor mindre enn 0,45% i forhold til hva som ble oppvist av aglyconet.

Eksempel 2

Kobling av di-galactosyl-fluoresceinamin-HS til AH-sefarose Ett gram AH-sefarose 4B ble svellet, vasket og suspendert i 10 ml 0,01M fosfatbuffer, pH 6,8. Til suspensjonen ble det tilsatt 209 mg substrat fra eksempel 1 og 400 mg CMC, og blandingen ble blandet ved rulling i 24 timer. Ytterligere 2 00 mg CMC ble tilsatt og reaksjonen fikk fortsette i ytterligere 24 timer. Gelen ble vasket ved å bruke vanlige betingelser med lav og høy pH og derpå lagret i PBS. Den hadde en uttalt gul farge. For å undersøke hvorvidt substratet på sefarosen var tilgjengelig for enzymatisk hydrolyse, ble en serie på 20 pl deler av en 50% suspensjon av substrat-sefarose inkubert med eller uten P-galactosidase over natten. RIA utført i samme rør viste at forsøksprøvene ga en 27% binding av sporeren, mens kontroll-prøvene bandt 45% av sporeren. Dette resultat indikerte tydelig at substratet på AH-sefarose var tilgjengelig for hydrolyse av enzymet.

Eksempel 3

Mono-galactosid-fluoresceinsubstrater

Nitro-fluorescein ble fremstilt i henhold til standard metoder. Metylesteren ble fremstilt ved å koke nitro-fluorescein ved tilbakeløp i metanol i overskudd i nærvær av 1% konsentrert H2S04.

Galaktosen ble innført i den gjenværende fri hydroksyfunk-sjon av nitrofluorescein-metylester ved å bruke tetra-acetyl-bromgalactose i nærvær av sølvkarbonat (katalysator) og kalsiumsulfat (intern desikator) i benzen-tetrahydro-furanblanding.

Metoksyderivatet av nitrofluorescein-metylester ble fremstilt ved å bruke dimetylsulfat og 0,1N NaOH i henhold til standard metyleringsprosedyre. Fjerning av esteren ga monometoksynitrofluorescein. Galactose ble innført som angitt ovenfor.

Tre mulige mono-galactosid-nitrofluoresceinderivater kan resultere fra de angitte trinn, (A), (B) og (C). (Se figur 2) .

Reduksjon av nitrofunksjonen tillater ytterligere modifise-ring via den resulterende aminogruppe.

Eksempel 4

Fremstilling av et ouabain-fetuinkonjugat

Et ouabain-fetuinkonjugat ble fremstilt ved å bruke periodatoksydering/Schiffs base-fremgangsmåten. Ouabain (2 00 mg) inneholdende 10,8 pCi<3>H-digoksin ble oksydert med natriummetaperiodat i 2 timer ved romtemperatur og derpå omsatt med 110 mg Fetuin ved pH 9-9,5 i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsproduktet ble stabilisert ved reaksjon med 137 mg natriumborhydrid i 4 timer, dialysert mot vann i 6 dager (5 skift, 5 liter), frysetørket for å redusere volumet og endelig underkastet gelfiltrering på Sephadex G50 for å fjerne alle gjenværende spor av ukonju-gert ouabain.

Eksempel 5

Oppvisning av fullstendig fremgangsmåte for et forsterket immunoassay

Et ELISA format ble valgt for å vise den fullstendige sekvens av reaksjoner basert på forsterkningsfremgangsmåten. Syntesen av ouabain-fetuin-konjugat anvendt nedenfor ble beskrevet i eksempel 4.

For forberedelse av assayet ble to PVC ELISA plater belagt på forhånd. I den første (plate 1) ble brønnen til platen belagt over natten ved 4°C med enten ouabain-fetuin eller fetuin alene (10 pg i 100 pl belegningsbuffer). Platen ble så vasket tre ganger med vaskebuffer, og til hver brønn ble det tilsatt P-galactosidasekonjugert anti-digoksin IgG

(100 pl; konjugater fra ovenfor fortynnet 1+1 med vaskebuffer). Etter 2 timer ved 37°C ble overskytende antistoff-enzymkonjugat vasket fra platen (3 vaskinger med vaskebuffer).

Brønnene av den andre plate (plate 2) ble belagt over natten ved 4°C med enten BSA alene (100pl; 1 mg/ml i belegnings-buf f er) eller BSA-cumarin-P-galactosid (100pl, lmg/ml i belegingsbuffer). Umiddelbart før bruk ble platen vasket tre ganger i belegningsbuffer og ytterligere én gang med 3-galactosidaseassay (0,1M natriumfosfatbuffer pH 7,1, 0,IM NaCl, 10 mM MgCl2).

Assayet ble utført som følger. Til hver brønn av plate 1 inneholdende oabain-fetuin antigen ble det tilsatt digok-sinoppløsning (1 ng/ml - 1 mg/ml i 150 pl PBS). Etter 1 time ved 3 7'C ble innholdet i hver enkelt brønn blandet, og en prøve av supernatanten fra hver (100 pl) overført til en brønn på plate 2 inneholdende immobilisert BSA-coumarin-3-galactosid (og 50 pl P-galactosidase assaybuffer). PBS (100 pl) ble plassert i brønner av plate 2 inneholdende immobilisert BSA (og 50 pl 3-galactosidase assaybuffer).

Etter 2 timer ved 37°C ble plate 2 vasket to ganger med vaskebuffer og alkalisk fosfatasekonjugert anticoumarin IgG (100pl, 1 i 4 fortynnet med vaskebuffer) ble tilsatt hver brønn. Platen ble inkubert i 1,5 time ved 37°C, hvorpå det ubundne antistoff enzymkonjugat ble fjernet fra plate-brønnene ved vask (3 ganger) med vaskebuffer. Alkalisk fosfatasesubstrat-oppløsning (100 pl, 6mM pNp-fosfat i 0,1M glycinbuffer pH 10,4, 1 mM ZnCl2, 1 mM MgCl2) ble tilsatt hver brønn og platen ble inkubert ved romtemperatur. Etter 15 minutter og derpå 3 0 minutter ble platen avlest ved 410 nm i en ELISA plateavleser (fig. 3).

Figur 3 viser aktiviteten av bundet alkalisk fosfatase konjugert anti-coumarin IgG til immobiliserte coumarin-residier etter deres eksponering ved hydrolyse av immobilisert coumarin-P-galactosid ved erstattet e-galactosidasekonjugert anti-digoksin IgG. Bindingen av alkalisk fosfatase-anti-coumarin til BSA alene var mindre enn 5% av maksimal binding til BSA-coumarin. Bindingen av konjugatet til uhydrolysert substrat var ca. 29% av maksimal binding. Denne verdi ble trukket fra alle andre før nedtegning. Assayene ble foretatt dobbelt.

Disse resultater utgjør nå basis for et assay for digoksin hvori signalet er direkte proposjonalt med konsentrasjonen av tilført analytt over området 10 ng/ml til 1 mg/ml.

Eksempel 6

Eksperimentell metode

1. Fremstiling av et fastfase innfangingssystem Til hver brønn av PVC ELISA platen ble det tilsatt ca. 10 pg affinitetsrenset anti-coumarin IgG i 100 pl belegningsbuffer, og platen ble inkubert i en fuktig atmosfære over natten ved 4°C. Den følgende dag ble ubundet IgG vasket fra platen med vaskebuffer (4 vaskecykler). 2. Coumarinsubstrat-estradiol dobbelkonjugat på dekstran-6-aminoheksan.

Dekstran T40 ble oksydert med natriumperiodat for å danne aldehydfunksjoner, diaminoheksan ble tilført, fulgt av reduksjon med natriumborhydrid for å stabilisere bindingen. Coumarin-galactose og estradiol ble tilført i dekstran-6-amino-heksanet via aktive estere av deres derivater. De aktive estere ble derpå tilsatt dekstranet til et forhold på 5:1 substrat til estradiol. Reaksjonen er vist i fig. 4.

Det doble konjugat ble dialysert og kromatografert på Sephadex G50. Fraksjonene inneholdende dekstranet viste fluorenscens (svak, noe som indikerte coumarinsubstratet). 3. Fremstilling av dekstran-substratoppløsning En oppløsning ev det resulterende dekstran-substrat (1 mg/ml) i p<->galactosidase-assaybuffer ble fremstilt og til dette ble det tilsatt anti-coumarin IgG(12 pl passende fortynnet anti-coumarin IgG i vaskebuffer pr. 120 pl dekstran-substrat) for å blokkere ethvert eksponert sete som kan være tilstede som urenheter. (Dette trinn er ikke nødvendig for metoden). Blandingen ble inkubert i 1 time ved 37°C. 4. Fremstilling av fastfase ouabain-anti-digoksin-e-galactosidasekonjugat

Til hver brønn av PVC ELISA platen ble det tilsatt ca. 10 pg av fetuin-ouabain (eksempel 4) i 100 pl belegningsbuffer, og platen ble inkubert i en fuktig atmosfære over natten ved 4"C. Ubundet konjugat ble vasket fra platen med vaskebuffer (4 vaskecykler). Til hver brønn ble det så tilsatt 3-galactosidasekonjugert affinitetsrenset sau anti-digoksin IgG (4 pg konjugat i 100 pl PBS 3 mg/ml BSA) vask (anti-digoksinkonjugat).

Platen ble så inkubert ved romtemperatur i 2 timer og overflødig konjugat ble fjernet fra brønnene ved vask som ovenfor. 5. Standard og forsterkede assay som anvender galac-tosidaseaktivitet generert ved erstatning med digoksin i oppløsning.

Digoksinoppløsninger (lng-1 pg/ml i PBS) eller PBS alene ble fremstilt, og 100 pl av hver ble tilsatt brønnene på en ELISA plate som har fastfase ouabain-anti-digoksinkonjugat. Etter 60 minutter ved romtemperatur under omrøring ble 1000 pl fra hver brønn undersøkt ved å bruke onp-galactosid i et standard referanseassay eller tilsatt 100 pl dekstran-substrat.

Etter 2 0 minutter ble 100 pl av hver reaksjonsblanding overført til brønnene av ELISA platen med anti-coumarin-belagte brønner og denne plate ble så inkubert i ytterligere 2 0 minutter. Ubundet reksjonsprodukt ble så vasket fra brønnene med vaskebuffer (4 vaskecykler) og alkalisk fosfase-konjugert affinitetsrenset anti-estradiol IgG

(199 pl ved 5 g/ml) ble tilsatt hver brønn.

Etter ytterligere 20 minutter ble ubundet konjugat vasket fra brønnene som ovenfor og alkalisk fosfatase substratopp-løsning (100 pl, 5 mM pnp-fosfatase i fosfataseassaybuffer) ble tilsatt hver brønn.

Absorbensen til produktoppløsningene ble avlest etter 5, 10 og 15 minutter mot substrat blindoppløsning (100 pl allkalisk fosfatasesubstratoppløsning inkubert i løpet av samme periode).

Resultatene er vist i figur 5. Det bør bemerkes at i standard referanse onp-assayet ble inkubering fortsatt i 90 minutter. Forutsatt at inkuberingstiden for signaldannelse var minst 10 minutter, var assayet ifølge oppfinnelsen mer følsom enn standard referanseassayet.

Eksempel 7

Beregning av kryssreaksjon av coumarin-galactosylsubstratet Galactosyl-coumarin-3-eddiksyre ble fremstilt i henhold til standard kjemisk fremgangsmåte. Kryssreaksjonen ble beregnet ved radioinnumoassay ved å bruke 3H-merket 7-hydroksy coumarin-3-eddiksyrederivat og kanin anti-7-hydroksy coumarin-3-eddiksyre.

Standard dekstranbelagt trekullmetode ble anvendt, og den vanlig brukte 50% inhiberings-fremgangsmåte var å regne ut kryssreaksjonstallet = 0,008 - 0,018 %. Den lave kryssreaksjon indikerer stor forskjell i affiniteter av coumarin og galactosylcoumarin for anti-coumarin-antistoffene.

Eksempel 8

Fremstilling og egenskaper av coumarin-galactosylsubstrat estradiol (haptenisk type)-konjugater

Konjugater av coumarin-3-eddiksyre og 17P-estradiol 3-karboksymetyleter med 1,8-diaminooktan som arm ble fremstilt og renset ved standard fremgangsmåte i organisk kjemi. En oppløselig type av konjugatet ble også fremstilt (se fig. 6). Galaktose ble innført på 7-hydroksyfunksjonen av coumarinet i konjugatet ved standard metoder.

Immunaktivitetene av konjugatet og substratkonjugatet ble analysert ved standard ELISA fremgangsmåte.

Mikrotiterplater ble belagt med kanin anti-coumarin. Et konsentrasjonsområde av konjugatet og substratet ble tilsatt de belagte brønner, fikk reagere, og etter vask ble anti-estradiol-antistoff merket med alkalisk fosfatase tilsatt brønnene og tillatt å reagere.

Etter vask ble aktivitetene av alkalisk fosfatase holdt tilbake av brønnene målt ved å bruke pNP fosfat.

Resultatene viste en markert forskjell mellom reaktivi-tetene av substrat og produkt. Den meget lavere affinitet av substratet Sl for anti-coumarin-antistoff beror på maske-ring av den antigene determinant (coumarindelen). Eksponering av den antigene determinant ved fjerning av galactosen ( S± >P1) økte affiniteten med en faktor på ca. 1000. Reaktiviteten av den mer oppløselige versjon av konjugatet (S2-P2) var noe bedre. Figurene ble bekreftet av kryssreaksjonsdata.

Eksempel 9

Assay av P-galactosidase ved å bruke standard fremgangsmåte og forsterkningsmetode

Et område med fortynninger av E. coli-p<->galactosidase ble fremstilt fra en stamløsning (ca. 1 mg/ml av et kommersielt preparat).

Standardassayet ble utført som følger:

I mikrotiterplatebrønnene ble 10 pl av 3-galactosidase tilsatt 100 pl pNP-galactosid og etter 90 minutter ble reaksjonen avsluttet med 100 pl stoppbuffer og absorbensnivåene ble avlest.

Det forsterkede assay ble utført som følger:

I mikrotiterplate-brønnene ble 10 pl av enzymet tilsatt 100 pl av 50 pg/ml galactosyl-coumarin diamino oktan-estradiol 3 CME-konjugat. Etter 2 0 minutters inkubering ble reaksjons-produktene fortynnet 1/2 56 og 100 pl ble overført til mikro-titerplatebrønner belagt med anti-coumarin. Etter 2 0 minutter ble platen vasket og anti-estradiol alkalisk fosfatase ble tilsatt og tillatt å reagere i 20 minutter før vasking og fosfataseaktivitetsmålinger ved fra 10 til 3 0 minutter.

Kurven (fig. 7) viser absorbensene mot 3-gal fortynninger. Det forsterkede assay er ca. 1000 ganger mere følsomt enn standard assay (se ovenfor). (Uten å ta i betraktning for-tynningsfaktoren av produktet før tilføringen i de anti-coumarin-antistoffbelagte brønner).

Eksempel 10

Enzym-immunoassay av 17oc-hydroksyprogesteron

(konkurrerende assay fremgangsmåte)

Sammenligning mellom en standard assay fremgangsmåte og den forsterkede metode.

Reagenser og trinn:

Sau anti 17-OH-Progesteron ble koblet til partikler ved standard CNBr aktiveringsmetoden.

17-OH-Progesteron-3-karboksymetyloksim ble fremstilt og konjugert til E. coli P-galactosidase (kommersielt preparat) ved standard metoder.

Et konkurrerende enzym immunoassay ble etablert (fri standard analytt konkurrerer med enzymmerket analytt om antistoff på magnetiserbare partikler). Aktiviteten av den bundne fraksjon av sporer ble målt ved å bruke standard pNP-galactosid- eller forsterkningsfremgangsmåten ved å brue galactosylcoumarin-diamino octan-estradiol 3CME som et første substrat og magnetiserbare partikler koblet til anti-coumarinpreparat for å fange inn produkt 1 (eller en fraksjon av dette). Nivåene av innfanget produkt 1 ble beregnet ved bruk av anti-estradiol alkalisk fosfatase og konjugat og en fosfataseaktivitetsmåling ved å bruke pNP-fosfat.

Et eksempel på de erholdte resultater er vist i figur 8. Den forsterkede fremgangsmåte gir en meget stor økning i signalet, selv om kun en liten fraksjon av Pl ble ført gjennom til andre trinn av assayet.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for påvisning av en analytt i en prøve ved bruk av et første enzym og et første substrat på hvilket det første enzym kan virke for å danne et første produkt, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: a) å underkaste prøven en assay fremgangsmåte for å danne det første enzym i en på forhånd bestemt tilstand i en mengde som står i forhold til konsentrasjonen av analytt i prøven, b) å sette første enzym i den på forhånd bestemte tilstand i kontakt med første substrat under betingelser for å danne første produkt i en mengde som står i forhold til konsentrasjonen av analytt i prøven, c) å bestemme mengden eller tilstedeværelsen av første produkt ved å sette første produkt dannet i trinn b) i kontakt med et spesifikt bindebiddel for første produkt under betingelser for å forårsake disse å bli bundet sammen og d) å bruke resultatet fra c) til å bestemme konsentrasjonen eller tilstedeværelsen av analytt i prøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at første substrat er fremskaffet i matrisebundet form, hvorved første produkt dannes i trinn b) i matrisebundet form.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at første substrat foreligger i oppløsning, hvorved første produkt dannes i trinn b) i oppløsning.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at første enzym dannes i trinn a) i matrisebundet form.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 4, karakterisert ved at første produkt dannet i trinn b) konverteres fra oppløsning til matrisebundet form før utføring av trinn c).

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at trinn c) utføres ved å sette det første produkt i kontakt med et merket spesifikt bindemiddel for første produkt under betingelser som forårsaker disse å bli bundet sammen, og bestemme den bundne eller ubundne markør til første produkt.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det spesifike bindemiddel er merket med et enzym.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at første enzym er 3-galactosidase.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at første substrat er di-galactosyl-fluorescein aminhemisukkinat eller et mono-galactosid-fluoresceinsubstrat.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at første substrat er et galactosyl-coumarin-estradiolsubstrat.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at det fremskaffes en analyttanalog i matrisebundet form og et enzymmerket analytt-antistoff i oppløsning, og at assay-fremgangsmåten i trinn a) innbefatter å forårsake at analytten i prøven konkurrerer med matrisebundet analyttanalog om å binde til det enzymmerkede antistoff.