JPH02138869A - 抗原検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 （１）発明の分野 本発明は、抗原の含有が疑われる生物学的サンプル中の
抗原の検定法に関する。本発明はとくに、臨床標本中の
グラム陰性菌の検定に応用される。

生物学的液体、すなわち血液、尿素、培養細胞のような
サンプル中の抗原の検出には数多くの方法が知られてい
る。グラム陰性菌、たとえば、存在上迅速かつ正確に検
出できることは、このような細菌に関連する疾患の流行
に対処するために重要である。抗原の検出に用いられる
技術の多くは、細胞培養操作全包含する。このような操
作は、比較的長時間？要し、しかも複雑であって、その
結果は技術者の熟練度に著しく依存する。七の他の技術
、たとえば電気泳動等は、複雑でしかも高価な装置？必
要とし、これらの装置？常に設備し利用することは必ず
しも容易ではない。

検出技術の多くは免疫検定法全包含する。これらの技術
には、問題の抗原に対する抗体？検出するものもある。

しかしながら、抗体は、疾患が治癒したのちもヒト体内
に残存することが多く、このような間接的な技術は不正
確な結果全招きやすい。したがって、抗体よりも抗原全
検定する方が好ましい。抗原全検出するための免疫検定
法では、酵素を連結させた免疫吸着検定、一般にはＥＬ
ＪＳＡと呼ばれている酵素免疫検定法が用いられること
が多い。この検定では通常、抗原を非被覆固体表面また
は抗体のようなタンパク質で予め被覆した表面上は抗原
全被覆させることで、問題の抗原全検出する。支持体の
表面全抗原で被覆したのち、表面全洗浄して非結合抗原
？除去する。ついで、表面上の抗原をその抗原に対する
標識または標識可能抗体と接触させる。表面金再び洗浄
し、支持体の表面に結合した抗体を、標識の検出によっ
て検出する。

上述の操作に必要な何回もの洗浄工程は、検定ｔさらに
時間がかかり、操作の複雑なものとする。

したがって、抗原、とくにグラム陰性菌からの抗原上、
現在公知のまたは使用されている試験法よりも迅速で、
信頼性が高り、シかも安価に検出できる方法が求められ
ている。同時に、現在用いられている試験法よりも操作
の少ないことが重要である。

定方性は、米国特許箱４，４９７，８９９号に開示され
ている。この方法は、標本中のクラミジア細胞全溶解し
て抗原全放出させ、この細胞溶解物で非被覆固体支持体
全被覆し、被覆された支持体上サンプルから分離し、分
離された支持体？抗体で処理して支持体上に抗原−クラ
ミシア抗体複合体全形成させ、非結合抗体から複合体７
分離し、結合複合体を標識抗グロブリンで処理して抗原
−抗体一標識抗グロブリン複合体會支持体上に形成させ
、この複合体？非結合標識抗グロブリンから分離し、サ
ンプル中の抗原の指標として結合標識抗グロブリン會測
定するものである。米国特許箱４．４９７，９００号に
は、米国特許箱４，４９７，８９９号の場合と同様にし
てＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ｆ測
定する方法が開示されている。

液体サンプル中の抗原全測定するための間接的な方法は
、米国特許箱４，０６７，９５９号に開示されている。

この方法は、サンプル抗原と同じ免疫種の抗原全固体支
持体表面に吸着させ、既知量の特異的標識抗体を溶液中
でサンプル抗原および吸着抗原と反応させるものである
。標識抗体は過剰にあるので、標識抗体の一部は溶液中
でサンプル抗原に結合し、過剰の標識抗体は表面上に吸
着された抗体と免疫学的に反応する。表面全洗浄し、つ
いで表面上の反応標識抗体量でサンプル中の抗原の指標
として測定する。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　　の主
外膜タンパク質に対する抗体の生成に基づくクラミジア
感染の存在の検定方法は、米国特許箱４，４２７，７８
２号に開示されている。この方法は、クラミジア感染が
疑われるサンプルを処理してクラミジア外細胞膜タンパ
ク質を可溶化し、生成した抗体上可溶化サンプルと接触
させ、ついで抗体と可溶化サンプルの間の反応全測定す
るものである。ヨーロッパ特許出願第口、１７４，１０
６号には、細胞膜タンパク質とくにＣｈｌａｍｙｄｉａ
　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの主外膜タンパク質を検出す
る方法が開示されている。英国特許出願第２　０４７　
８８９Ａ号には、ホルムアルデヒド安定化抗原上用いた
微量免疫螢光によるＣｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏ
ｍａｔｉｓ抗体に対する血清学的試験が開示されている
。

米国特許第４，１４５，４０６号および第４．２５４．
０８２号には、非特異的吸着物質と測定すべき物質に対
する特異的結合パートナ−の標識型と？用い、液体サン
プル中の特異的結合物質を測定する方法が開示されてい
る。米国特許第４．１８８，３７１号には、免疫放射線
検定法音用いてサンプル中のナイセリア菌を検出する方
法が開示されている。この方法は、試験すべきサンプル
中の細菌？溶解し、この溶解物音放射標識抗血清と接触
させ、生成した混合物？インキュベーションし、ついで
混合物全固相抗原または抗原免疫吸着剤と接触させ、得
られた混合物？インキュベーションし、ついで上清中の
放射龍ケモニタリングするものである。

発明の要約 本発明の方法は、抗原の含有が疑われる生物学的サンプ
ル中の抗原全検出することを目的とするものである。本
発明の方法は、特異的結合タンパク質を実質的に含まな
い固体支持体と、サンプルからの抗原およびその抗原に
対する抗体全音むメジウムとの配合物全準備する。この
配合物を、抗体が抗原に結合した場合、支持体に結合す
るのに十分な条゛件下でインキュベーションする。支持
体上またはメジウム中における抗体の存在または存在量
ケ調べる。これはサンプル中の抗原の存在マたは存在量
に関連する。

本発明の方法は、とくにグラム陰性菌の検定に応用する
ことができる。とくに興味があるのは、ｐａｌｌｉｄｉ
ｕｍ　　についての検定である。

特定の態様の説明 本発明は、生物学的サンプル中の抗原の検出力法に関す
る。この方法は、特異的結合タンパク質を実質的に含ま
ない固体支持体と、サンプルからの抗原およびその抗原
に対する抗体からなるメジウムとの配合物ケ提供するも
のである。

本発明の方法によれば、抗原の含有が疑われるサンプル
全水性メジウム中でその抗原に対する抗体と合し、メジ
ウムヶ支持体と合する。別法として、支持体と抗体を最
初に合し、ついでサンプルを添加してもよい。さらに別
法として、支持体全抗原と接触させ、ついで抗体ケ添加
してもよい。

また、サンプルを前処理してサンプルから抗原全抽出し
、この抗原を上述のように配合することもできる。

次に、この配合物を、抗体が抗原に結合した場合、支持
体に結合するのに十分な条件下でインキュベーションす
る。ついで、支持体上またはメジウム中の抗体の清音測
定すると、この量はサンプル中の抗原の存在またに存在
量に関連する。抗体の量は様々な方法で測定できる。た
とえば、支持体？メジウムから分離し、分離された支持
体會抗原に対する抗体の標識受容体全包含する検出メジ
ウムと接触させ、支持体またはメジウムについて標識の
存在音調べる。

本発明の方法は、生物学的サンプル中の抗原検出の領域
において、広い適用全方する。本発明は、細菌培養また
は標準的免疫化学方法に比べてより便利な方法を提供す
る。本発明の方法は、従来方法に比べて迅速で、必要な
操作が少ない検出方法を提供するものであって、抗原の
含有が疑われるサンプル全支持体（非被覆または捕捉抗
体で予め被覆のいずれか）と反応させ、非結合抗原全除
去し、結合抗原に抗体全添加して支持体上の抗原と抗体
の間で免疫複合体音形成させ、免疫複合体を検出するも
のである。本発明は、従来方法に比べ、抗原に対する抗
体の必要量がきわめて僅かで、この点において予期し難
い経済性葡提供するものである。

本発明の特定の態様についてさらに詳細に説明する前に
、用語について以下に定義する。

「抗原」：検出すべき化合物または組成物、丁なわち興
味のある物質をいう。抗原は１個のエピトープをもつも
のでも多数の工ぎトープ？もつものでもよい。抗原は抗
体に特異的に結合することが可能で、通常、検定メジウ
ムに可溶性であるかまたは可溶化することができる。

抗原は通常、ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプチド
およびタンパク質、多糖、リボ多糖、糖タンパク質、リ
ポタンパク質、リボ核酸タンノ（り質等である。抗原は
、細菌、ウィルス、ミトコンドリア、核、細胞膜等の成
分である場合が多い。

細菌としてはグラム陰性菌を挙げることができる。その
例としては、これらに限定されるものでＭｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、　　ＬａＣｔＯｔ）ａｅ
ｉｌｌｕｓ　　Ｃａ５ｅｉ。

１ｎｆｌｕｅｎｚａ　　等がある。

多糖は少なくとも６個または４個の単糖の組合せで、そ
れらがグリコシド結合で連結されている。

多糖には、たとえば、デンプングリコーゲン、セルロー
スおよびデキストランが包含される。

リボ多糖（ＬＰＳ　）は、リードと多糖残基上含有する
分子で、グラム陰性菌の細胞膜の外層に存在する０ 抗原の正確な性質は、その多数の例とともに、米国特許
第４，２９９，９１６号（Ｌｉｔｍａｎら）とくにその
第１６欄〜第２３欄に開示されている。

本発明で用いられる抗原は、大部公費なくとも約１，０
００、通常は少なくとも約２，５００の分子量全有し、
多くは分子量５，０００以上である。ポリ（アミノ酸ン
のカテゴリーでは、興味あるポリ（アミノ酸〕は一般に
約５，０００〜５，０００，０００の分子量、通常は約
２０，０００〜１，０００，０００の分子量全有する。

広範囲のタンパク質、丁々わち類似の構造特性全方する
クンバク質群、特定の生物学的機能を有するタンパク質
、特定の微生物とくに病原微生物に関連するタンパク質
等が考慮される。

「抗体」：仕分子に特異的に結合し、その特定の空間お
よび極性機構と相補性であると定義される免疫グロブリ
ンである。抗体はモノクローナルでもポリクローナルで
もよく、宿主の免疫感作ついで血清の捕集（ポリクロー
ナル）または連続ハイブリッド細胞系の調製ついで分泌
タンパク質の捕集（モノクローナル〕のような本技術分
野でよく知られた技術によって製造できる。抗体は完全
な免疫グロブリンまたはそのフラグメントであって、免
疫グロブリンはいずれのクラスおよびイソタイプに属す
るものでもよく、たとえばＩｇＡ。

ＩｇＤ、　■ｇＥ、　ＩｇＧ１　、　■ｇＧ２ａ、　Ｉ
ｇＧ２ｂおよび工ｇＧ３．　ＩｇＭ、　ＩｇＧ１　、　
Ｉｇ（）２．　ＩｇＧ５．ＩｇＧ４等がある。そのフラ
グメントにはＦａｂ、ＦｖおよびＦ　（ａｂ’）２　、
　　Ｆａｂ’等が包含される。

「抗原に対する抗体」二本発明の抗原に特異的に結合す
る抗体 「抗体に対する結合パートナ−」：抗体の特定の空間的
または極性的機構全認識する化合物または組成物、たと
えば工ぎトープもしくは抗原決定部位、または抗体に結
合するリガンド。結合ノ（−トナーの例には、天然の受
容体、たとえば特異的免疫グロブリン、リウマトイド因
子抗体、レクチン、プロティンＡ１補体成分Ｃ２ｑ１ア
ビジン等が包含される。

「複合体」：抗体に対する受容体の結合親和性の結果と
して、抗体に対する受容体と抗体の間で形成される合成
物 「免疫複合体」：抗原に対する抗体の結合親和性の結果
として、抗原とその同族抗体の間で形成８れる複合体 「標識」：標識とは、抗体または他の分子に共有結合に
よりまたは非共有結合的に結合する任意の分子であって
よい。標識は、シグナル生成手段全包含するシグナル生
成システムの一要素である。

標識はアイソトープでもアイソトープでなくてもよく、
アイソトープでないことが好ましい。標識の例としては
、触媒たとえば酵素、補酵素、色原体たとえば螢光体、
染料もしくは化学発光体、放射性物質等金挙げることが
できるが、これらに限定されるものではない。

「シグナル生成手段」：標識と相互作用して検出可能な
シグナルを産生できる手段。このような手段には、たと
えば、電磁放射線、熱、化学試薬等が包含される。化学
試薬？使用する場合、一部の化学試薬はデベロッパー溶
液の部分として包含させろことができる。化学試薬には
、基質、補酵素、エンハンサ−第二の酵素、アクティベ
ータ、補因子、インヒビター　スカベンジャー　金属イ
オン、シグナル発生物質の結合に必要な特異的結合物質
等が包含される。化学試薬の一部、たとえば補酵素、酵
素産生物と反応する物質、他の酵素、触媒等は、他分子
または支持体に結合させることができる。

「シグナル生成システム」：シグナル生成システムは１
個または２個以上の要素全方し、少なくとも１つの要素
は標識である。シグナル生成システムは、サンプル中の
抗原の存在または存在量に関連するシグナル全発生する
。シグナル生成システムは、測定可能なシグナルの産生
に必要なすべての試薬全包含する。標識が抗体に抱合し
ない場合は、標識は通常抗体に対する受容体に結合する
。

シグナル生成システムの他の要素としては、基質、エン
ハンサ−アクティベーター　化学発光化合物、補因子、
インヒビター　スカベンジャー　金属イオン、シグナル
発生物質の結合に必要な特異的結合物質等全包含させる
ことができる。シグナル生成システムの他の要素に、補
酵素、酵素産生物と反応する物質、他の酵素、触媒等ケ
使用できる。シグナル生成システムは、外部手段により
、好ましくは電磁放射線の測定によって検出できるシグ
ナル全提供する。多くの場合、シグナル生成システムは
、色原体基質と酵素２包含し、色原体基質が酵素的に、
紫外もしくは可視領域の光？吸収する染料、リン光体、
螢光体または化学発光体に変換される。

シグナル生成システムには触媒、通常は酵素、および基
質を包含させることができ、また２個以上の触媒と複数
個の基質を包含させてもよく、またひとつの酵素の基質
が他の酵素の産生物である酵素の組合せヲ包含させても
よい。シグナル生成システムの操作により、サンプル中
の分析対象の量に関連した検知可能シグナル全厚える生
成物が産生する。

シグナル生成システムに使用できる多数の酵素および補
酵素が、米国特許第４，２７５，１４９号第１９欄〜第
２３欄粘よび米国特許第４，３１８，９８０号第１０欄
〜第１４欄（（示されている。多数の酵素の組合せが米
国特許第４，２７５，１４９号第２６欄〜第２８欄に記
載されていて、これらの組合せは本発明に使用できる。

とくに興味のある酵素は過酸化水素？産生する酵素で、
過酸化水素は染料前駆体全染料に酸化するのに使用され
る。特定の組合せとしては、糖分キシダーゼたとえばグ
ルコースおよびザック）　−スオキシダーゼ、または異
項環オキシダーゼたとえばウリカーゼおよびキサンチン
オキシダーゼと、過酸化水素全使用して染料前駆体を酸
化する酵素すなわちペルオキシダーゼ、たとえば西洋ワ
サぎペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼもしく
は微生物ペルオキシダーゼとの組合せがある。

その他の酵素の組合せは、上に引用した特許の主題中に
みられる。単一の酵素を標識として使用する場合は、他
の酵素たとえばヒドロラーゼ、トランスフェラーゼおよ
びオキシドレダクターゼ、好ましくはヒドロラーゼたと
えばアルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダー
ゼ全使用できる。

また、ルシフェラーゼたとえばホタルルシフェラーゼお
よヒ細菌ルシフェラーゼを用いることもできる。

使用できる補酵素の例には、ＮＡＤＣＨ〕、ＮＡＤＰ［
Ｈ：］、リン酸ピリドキサール、ＦＡＤ［Ｅ（）、ＦＭ
ＮＣＨ］等、通常は循環反応に関与する酵素が包含され
る（とくに米国特許第４，３１８，９８０号参照〕。

酵素反応の産生物は通常、染料または螢光体である。螢
光体の多くの例が米国特許第４．２７５．１４９号第３
０欄〜第３１欄に示されている。

「支持体」：吸水性または非多孔性、水不溶性材料。支
持体は多くの場合、疎水性もしくは陽性荷電性であるか
または疎水性もしくは陽性荷電性とすることができるも
のであって、粒子、一体の固体およびフィルム、マット
状または重合した材料で、とくにポリ（塩化ビニル）、
ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテ
ン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチ
レンテトラフタレート）、ナイロン、ポリ（−二ルブチ
レート）のようなポリマー；ガラスおよびセラミック；
疎水性または荷電性を付与するように改変された天然繊
維たとえばアルキル化またはアシル化セルロース、デキ
ストラン、キチン等するいはポリリジン、プロタミン、
デキストラン硫酸、ポリアクリレートまたは上述の任意
の材料で作られた他のイオン性ポリマーで表面全被覆し
た天然繊維から構成される。支持体は抗体、抗原または
免疫複合体と特異的に結合するタンパク質葡含まず、ま
た多くの場合、タンパク質または他の特異的結合物質を
含まない。

「補助材料」：本発明による検定には様々な補助材料が
用いられることが多い。たとえば、緩衝剤が検定メジウ
ム中に通常加えられ、同様に検定メジウムおよび検定要
素に対する安定化剤が用いられる。これらの添加剤のほ
かに、付加的タンパク質たきえはアルブミン、界面活性
剤とくに陰イオン界面活性剤、結合エンハンサ−たとえ
ばポリアルキレングリコール等がしばしば添加される。

上述のように、本発明は、抗原の含有が疑われる生物学
的サンプル中の抗原？検出する方法に関する。定量丁べ
き抗原は、まず、抗原の含有が疑われるサンプルを界面
活性剤と接触逼せることによって可溶化してもよい。抗
原の含有が疑われるサンプルは水性メジウム中で、界面
活性剤および抗原に対する抗体と同時に接触させること
もできる。たとえば、綿棒のような捕集デバイス上のす
ンプル會バイアル、たとえば界面活性剤と抗原に対する
抗体全含有する試験管中に挿入することができる。好ま
しくは、サンプルを抗原に対する抗体と接触させる前に
界面活性剤と接触させる。綿棒上のサンプル？界面活性
剤含有試験管中に挿入し、ついで界面活性剤の濃度ｔた
とえば希釈によってまず低下させるかまたはそのまま、
抗原に対する抗体奮添加してもよい。

界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性、非イオン性また
は両性のいずれでもよい。本発明の目的においては、陰
イオン性界面活性剤が好ましく、これらに限定されるも
のではないがたとえば、アルキル−アルキルエーテル−
ジアルキルエステル−アルキルアリール−およびα−オ
レフィン−サルフェート、スルホン酸、スルホネート、
スルホスクシメートおよびスルホコハク酸、重合アルキ
ルナフタレンスルホネート、リン酸エステル、複合有機
リン酸エステルの遊離酸、脂肪族ヒドロキシル化リン酸
エステル、硫酸化脂肪酸エステル、硫酸化油たとえばヒ
マシ油、鯨油、大豆油、グリセロールトリオレエート、
牛脚油、獣脂およびオレイン酸の硫酸化物、ｎ−脂肪酸
グルタメートたとえばｎ−ラウロイル、ｎ−ココイル、
ｎ−水添獣脂、ｎ−混合脂肪酸アシルグルタメート、カ
ルボキシル化高分子電解質、不均化樹脂等が使用できる
。陽イオン界面活性剤の例としては、ジメチルまたはト
リメチルアルキルまたはジアルキルのようなアルキル四
級アンモニウムクロリド、たとえばトリメチルンーヤ、
ジメチル脱水素タロトリメチルセチルおよびトリメチル
ココ四級アンモニウム塩がある。非イオン界面活性剤の
例にはＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００、Ｔｗｅｅｎ　２０　
、オクチルグルコシド等がある。両性界面活性剤の例に
は、ベタインの脂肪酸エステル等がある。とくに好筐し
い界面活性剤はたとえば、デオキシコール酸塩たとえば
デオキシコール酸ナトリウムおよびケノデオキシコール
酸ナトリウム、アルキルサルフェートまたはその類縁体
、アルキルグルコシド、ＣＨＡＰＳ（コールアミドプロ
ぎルジメチルアンモニオプロパンサルフエート）等であ
る。以上用いたアルキルの語は０８〜０２０に考慮した
ものである。

界面活性剤の使用による予期し得なかった利点は、抗原
の非存在下には抗体が支持体へ結合すること全防止し、
一方、抗原が存在するときには抗体が支持体に容易に結
合するような界面活性剤全経験的に選択できることであ
る。たとえば、ケノデオキシコール酸塩は、Ｃｈｌａｍ
ｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓからのリボ多糖に対
する抗体がポリスチレンミクロメイタープレートに結合
するのケ、そのリボ多糖が検定メジウム中に存在しない
場合には防止する。

抗原の可溶化に用いられる温度は、通常、約１００〜５
０°Ｃの範囲であり、さらに通常は約１５゜〜１００℃
である。多くの場合、抗原の可溶化に要する時間は比較
的短い。通常、抗原の可溶化は少なくとも約５秒、１時
間ケ越えないで起こる。

さらに通常は約６０秒〜約６０分會要する。この時間は
、抗原の性質、使用する界面活性剤の種類と量および温
度に依存する。

可溶化メジウムは一般に水性で、４０チまでの有機溶媒
全含有させることができる。可溶化メジウムの−は通常
、約２〜１２の範囲、さらに通常は約５〜９の範囲であ
る。−は一般に、抗原の高レベルの可溶化が達成できる
ように選択づれる。

可溶化に際しそのＰＩ（ｗ達成し維持するには、様々の
緩衝剤が使用できる。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン
酸塩、炭酸塩、Ｔｒｉｓ、バルビタール等がある。使用
する緩衝剤は特定なものに限定されることはないが、他
に比べて好ましい緩衝剤がある。

上述のように、特異的結合タンパク買上実質的に含有し
ない支持体を、抗原および抗体からなるメジウムと組合
せて準備する。−態様においては、抗原の含有が疑われ
る生物学的サンプルと抗原に対する抗体全水性メジウム
中で合することができる。このメジウム中で抗原と抗体
の間の免疫複合体の形成が推測される。メジウムを支持
体と接触させることができる。メジウムは上述のように
界面活性剤？含んでいてもよい。サンプルは、抗体の添
加前に界面活性剤と接触嘔セるのが好ましい。

しかしながら、別法として、界面活性剤と抗体會同時に
サンプルに添加することもできるし、また、抗体の添加
後に界面活性剤葡加えることもできる。

別の態様では、抗原に対する抗体と支持体全実質的に同
時に合するか、または抗原もしくは抗体全最初に支持体
に、支持体への結合が起こら々い条件下に添加し、つい
でそれぞれ抗体もしくは抗原を添加する。たとえば、支
持体は、抗原に対する抗体ヶ含有する水性メジウムと接
触させることができる。ついで抗原全メジウムに添加す
ることが′ｃ＠る。複合体？形成しない抗体または抗原
が支持体に結合する前に、免疫複合体がｉｎ　５ｉｔｕ
で形成して支持体に結合すると考えられる。この場合、
界面活性剤は、支持体と抗原および抗体の間の接触前ま
たはそれと実質的に同時に、支持体と合することが好ま
しい。この目的のためには、界面活性剤は抗体または抗
原？含有する水性メジウムの一方または両者に包含させ
ることができる。

支持体と抗原および抗体荀含有するメジウムとの配合物
の生成後、配合物を、抗体が抗原に結合した場合、支持
体に結合するのに十分な条件下にインキュベーションす
る。通常、インキュベーショ／は、約１０°〜５０℃好
ましくは１５°〜４０°Ｃの温度において、約２〜１２
、好ましくは５〜９の−で、約５秒〜１時間好ましくは
約６０秒〜６０分間行う。

配合物のインキュベーション後、支持体上またはメジウ
ム中の抗体の存在または量を、サンプル中の抗原の存在
の指標として調べる。この測定は様々な方法で実施でき
る。以下にそれ葡例示するが、これはその方法全限定す
るものではない。

−態様においては、抗原に対する抗体をリガンド、通常
は分子量１，５０口未満の有機分子に結合させることが
できる。支持体をメジウムから分離し、洗浄して非結合
物買上除去し、有機分子に対する標識受容体と接触させ
、好１しくは洗浄し、ついで標識の存在を調べる。洗浄
メジウムは水性で、界面活性剤、結合？促進もしくは阻
害する物質たとえばポリエチレングリコール、カオトロ
ピンク塩および抗カオトロピック塩、緩衝剤たとえばリ
ン酸塩緩衝食塩溶液、Ｔｒｉｓ、ホウ酸塩等全含有して
もよい。第二の洗浄メジウムには、さらに基質またはシ
グナル生成システムの他の要素全含有させることができ
る。適当なりガントには、たとえば、ビオチン、ハプテ
ンたとえばフルオレセイン、ビタミンＢ工２等が包含逼
れ、この場合、相当する結合パートナ−はそれぞれアビ
ジン、ハプテンに対する抗体、内因子等である。また、
リガンドは化学的に反応性の基たとえばマレイミドもし
くはジスルフィドまたはヒドラジドとすることができ、
結合パートナ−はりがンドと特異的に反応する相当する
反応性の基たとえばスルフヒドリル基２有するかまたは
アルデヒドである。

他の態様においては、抗原に対する抗体は直接、標識好
ましくは酵素または補酵素に結合できる。

インキュベーション後、支持体音メジウムかう分離し、
ついで好ましくは洗浄する。この場合も、洗浄メジウム
は、シグナル生成システムの適当な要素金含有する緩衝
水性メジウムとすることができる。この方法では、支持
体上の標識の存在または量全分析対象の存在の指標とし
て測定できる。

抗原に対する抗体が標識に結合しない場合には、分離し
た支持体全抗原に対する抗体の標識結合パートナ−たと
えばプロティンＡ１補体、リウマトイド因子、抗原に対
する抗体の抗体等と接触させる。結合パートナ−に共有
結合または非共有結合で結合できる標識は任意の標識で
よく、好ましくは酵素または補酵素である。通常、結合
パートナ−は、別の検出メジウム中に包含されるが、１
だ、洗浄溶液の一部として、あるいは支持体に結合しな
いシグナル生成システムの丁べての残りの要素金倉む支
持体に添加される溶液の一部として含有させることもで
きる。支持体上における標識の存在’についで上述のよ
うにして測定することができる。

他の態様においては、抗原に対する抗体はリガンドに対
する受容体で標識され、この場合、リガンドが酵素、螢
光体等のよう々標識であるか、または標識が結合する分
子、たとえば高分子もしくは分子量１５００未満の有機
分子である。メジウムから支持体？分離したのち、支持
体上リガンドと接触感せ、標識ケ直接または必要に応じ
てさらにシグナル生成システムの要素？添加して検出す
る。

洗浄溶液およびシグナル生成システムの要素包含有する
溶液は通常、中等度のＰＨ１一般的には検定の至適感度
？与えるＰＨの水性緩衝メジウムからなる。水性メジウ
ムは水単独でも、また補溶媒Ｏ〜４０容量係ケ含有して
いてもよい。メジウムのＰＨは通常約４〜１１の範囲、
さらに通常では約５〜１０の範囲であり、通常は結合要
素の至適結合と検定の他の試薬たとえばシグナル生成シ
ステムの要素に対し至適なＰＨとの間に設定される。

所望のｐＨ′に達成し、測定時そのＰＩ″１′（＋−維
持するためには、様々な緩衝剤が使用できる。緩衝剤の
例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、Ｔｒｉｓ、バル
ビタール等が包含される。本発明に使用される緩衝剤は
特定なものに限定されるＣとはないが、各検定には他に
比べて好昔しい緩衝剤がある。

検定７行うに際しては中等度の温度が採用され、通常は
測定の間、とくに速度測定の場合には、−定の温度が用
いられる。測定時の温度は一般に約１０°〜５０°Ｃの
範囲であり、通常は約１５°〜４０℃である。

検定すべき抗原の濃度は一般に約１０−４〜１Ｑ−１，
１Ｍの間で、通常は約１０−６〜１０−１４Ｍである。

標識の支持体への非特異的結合量、特定の検出技術およ
び問題の抗原の濃度等全考慮して通常、各種試薬の濃度
が決定される。

検定メジウム中の各種試薬の濃度は抗原の濃度によって
一般的に決定されるが、それぞれの試薬の最終濃度は通
常、検定の感度が至適になるように経験的に決定される
。

丁べての試薬が同時にまたは順次、配合され、形成され
た複合体が支持体に結合したのち、検定すべきサンプル
とシグナル生成システムによって産生じたシグナルを、
抗原包含まないことがわかっているサンプルで産生じた
シグナルと比較し、試験サンプル中の抗原の存在上確認
する。試験サンプルによる有意に高いシグナルの産生は
抗原の存在全意味するものである。

本発明の方法の使用により、検定の感度および／または
特異性は保持されまたは増大し、一方、試験サンプル中
の抗原と複合体全形成するのに必要な抗原に対する抗体
の量は低下する。複合体を溶液中で形成させることによ
ジ、反応が固相上で行われる場合に比較して約１００分
の１の抗体全使用するのみでよい。抗原の典型的なサン
ドインチ法においては、支持体に結合した抗体全インキ
ュベーションし、抗原との複合体上形成させる。

本発明の方法においては、抗原とその抗原に対する抗体
からなる免疫複合体は予め形成されるかまたは溶液中ｉ
ｎ　５ｉｔｕで形成され、ついでその表面に特異的結合
タンパク買上もたない支持体に結合する。免疫複合体は
、サンプル中の抗原の存在に関連するシグナルの産生に
よって検出される。シグナルは、複合体中の標識の存在
に基づいて産生される。抗体が標識全含有していてもよ
いし、また抗体がたとえば抗体の結合パートナ−と結合
することにより標識と合体できるものであってもよい。

検定の実施に際して用いられる標識、抗体および支持体
、ならびに条件の選択により、検出可能なシグナルはメ
ジウム中および／または支持体上に認められる。

クラミジアの検出のための本発明の特定の朝様において
は、クラミジアに対する抗体と界面活性剤、ケノデオキ
シコール酸塩（ｃＤ０Ｃ）　孕ポリスチレンミクロタイ
タープレートのウェルに添加する。クラミジアの含有が
疑われるサンプル會ＣＤ０Ｃと接触させ、同じウェルに
移す。混合物？約３７°Ｃで約９０分間インキュベーシ
ョンし、ついで、好１しくはリン酸塩緩衝溶液で洗浄す
る。

次に、プレートをクラミジアに対する抗体の標識結合パ
ートナ−と接触させる。好ましい結合パートナ−は抗グ
ロブリンであり、酵素好ましくは西洋ワサビペルオキシ
ダーゼのようなペルオキシダーゼで標識する。約６７℃
で６０分間インキュベーションしたのち、支持体音洗浄
し、基質、過酸化水素およびテトラメチルベンジジン（
ＴＭＢ　）の溶液ならびに過酸化水素會加える。約６７
°Ｃで約６０分間インキュベーションしたのち、必要に
応じて硫酸を添加して反応全停止させることができる。

次に、基質溶液の４５０　ｎｍにおける吸収音読み、ク
ラミジア抗原？含まないことがわかっているサンプルに
ついて同様にして生じた吸収と比較する。

免疫複合体が支持体に結合しているので、単純化したプ
ロトコール全採用でき、強い検出可能なシグナルが得ら
れ、サンプル中の抗原の正確な定量が可能になる。複合
体？予めまたはｉｎ　５ｉｔｕで形成することによジ、
検定の感度？犠牲にすることなく抗体の使用量？減ら丁
ことができる。さらに、本発明によれば、従来技術の方
法に比べ、多くの洗浄および分離工程を減らせるという
利点が得られる。

例 本発明ケ、以下の例によりさらに詳細に説明する。

例の記載に先立って、以下の用語の定義全示す。

ｃｆｕ□コロニー形成単位 ＣＤＯＣ−ケノデオキシコール酸塩 ＨＲＰ　−西洋ワサげペルオキシダーゼＰＢＳ　−（リ
ン酸塩緩衝食塩溶液）　０．０１　ＭＮａＨ２ＰＯ４＋
　０．１５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ、　０．０２４　ＮａＮ５Ｂ
ＳＡ□ウシ血清アルブミン ＡＢＴ８−２　、２’−アジノビス（３−エチルベンズ
チアゾリンスルホン酸ン ＴＭＢ□テトラメチルベンジジン ＤＴＴ□ジチオスレイトール 可溶化緩衝液（８ＤＢ　）　−０，０５４ＣＤ０Ｃ。

５ＩｎＭＤＴＴ、ＤＰＢＳ（ＰＨ７，２）工ｇＧ−免疫
グロブリンＧ Ｉ　ｇＧ３−■ｇＧのＩｇＧ３イソタイプＦＢＳ　−０
，０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５および０．２係Ｔ
ｗｅｅｎ　２０中５０係ウシ胎仔血清ＤＰＢＳ−ダルベ
ツコのリン酸塩緩衝食塩溶液ＲαｍＩｇＧ３−ウサギ抗
−マウスＩｇＧ３抗体ＦＢＳ□ウシ胎仔血清 １Ｈ１１−クラミジア抗原のリボ多糖に対して特異的な
マウスモノクローナル抗体（Ｉｇ（）３　）、５ｔｅｐ
ｈｅｎｓ、　　　Ｒ，８，、Ｔａｍ、　　　Ｍ、Ｒ，、
Ｋｕｏ、Ｃ−Ｃ。

Ｎｏｗｉｎｓｋｉ、　　Ｒ，Ｃ，：　　＠Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　　Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　　：　　Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ　　ａｎｄ　
　ａｎｔｉｇｅｎ　　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　　１　２　８　　：　　１
　０　８　３〜１０８９（１９８２）参照 ウサギ抗−クラミシア抗血清□クラミジア抗原（可溶化
、全体）に対して特異的に誘発されたウサギポリクロー
ナル抗血清 抱合体−ウサギエｇＧ、　（ＨおよびＬ＠）ヤギ（ヤギ
抗−ウサギＩｇＧ　）に対する、西洋ワサーベルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ　）標識、アフィニティー精製抗体、お
よびマウスエｇＧ　（ＨおよびＬ鎖）ヤギ（ヤギ抗−マ
ウスエｇＧ　）に対する、ＨＲＰ標識、アフィニティー
精製抗体はＫｉｒｋｅｇｇａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｍａｒｙｌａｎｄ　）か
ら購入した。

例１ クラミジアの含有が疑われるサンプル全綿棒上に捕集し
、この綿棒とＤＩ　Ｄ　４　ＣＤ０Ｃ１、Ｏｍｌ　ｋ約
１５分間合した。綿棒ｒ捨て、混合物１０［３μｌ？ポ
リスチレンミクロタイタープレートに移し、０．１μｙ
の抗−クラミジア抗原含有する０、１チｃＤｏｃ’１０
０μｌと混合し、３７℃でインキュベーションした。９
０分後、プレート會ＰＢＳで洗浄した。５０係ＦＢＳ含
有ＰＢＳ中ヤギ抗−ウサギ−ＨＲＰ（３ｐｍｏｌ　）　
２加えた。３７℃で６０分間インキュベーションしたの
ち、支持体２　Ｔｗｅｅｎ　−２０含有ＰＢＳで洗浄し
た。次に、ＴＢＳ基質（ｃｌ−８ｍｍｏｌ／７　）　０
．１　ＯＮを加えた。支持体′に３７°Ｃで６０分間イ
ンキュベーションした。０．１　ｍｉ　Ｈ２ｓｏ、　（
ＩＮ）で反応全停止嘔せ、反応液の吸収ｋ　４５０　ｎ
ｍで読み取った。結果は第１表にまとめる。

第　　１　　表 ０Ｄ４５゜ 患者サンプル　　　　　抗−クラミジア　抗−クラミジ
ア抗体添加　　　　抗体なしく抱合 体対照〕 １（クラミジア抗原含有）　　　　１．２５０　　　　
　０．０６７２（クラミジア抗原陰性）　　　　　０．
０８４　　　　　０．０８１例２ Ａ）１００μｌの可溶化緩衝液（ＳＤＢ　）またはＰＢ
Ｓ　’ｉｉポリスチレンミクロタイタープレート支持体
に加える。保存クラミジア基本小体（ロットＲＲ０２）
１０μ１１および２０〃ダ／祷ＢＳＡ含有ＰＢＳ中ＩＨ
１１モノクローナル抗−クラミシアＬＰＳ（１００μｇ
／ｍ１）１０μｌｋ支持体に添加した。

３７°Ｃで１時間インキュベーションしたのち、混合物
ｒ２回ＰＢＳ中で洗浄した。２０〜／ＮＢＳＡ含有ＰＢ
Ｓ中ＲｃｔｍＩｇ（）３−ＨＲＰ　　（１：１０００）
’に支持体に添加した。３７℃で１時間インキュベーシ
ョンしたのち、ＡＢＴＳ　（２ｍｍｏｌ　／　／　）　
０．１　ｒｎｌ　ｋ加えた。反応液の吸収ｋ　４１４　
ｎｍで測定した。結果は第２表に壕とめる。

Ｂ）比較のために、本発明の範囲に包含されない旧来の
ＢＬ工ＳＡサンドインチ型検定を実施した。

１００μｌの可溶化緩衝液またはＰＢＳ　全ポリスチレ
ンミクロタイタープレート支持体に添加した。

ついで、保存クラミジア基本小体（０ツトＲＲＤ２）（
１：　５００）’ｔ−支持体に加えた０６７℃で１時間
インキュベーションしたのち、支持体ケ２回ＰＢＳ中で
洗浄した。モノクローナル抗−クラミシア抗体、Ｉ　Ｈ
ｌ　１　（１００μｇ／ｍｌ）　１０ｐｌＪｋ２０１ｎ
９／ｍｔＢＳＡとともにプレートに添加した。

３７°Ｃで１時間インキュベーションＬ７’ｃ（７）ち
、プレート’ｉ　ＰＢＳで洗浄した。２０ｍ９／ｍ１Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ中Ｒａ□ｘｇａ、−ＨＲＰ　（１：　１
０００　）　ｋ支持体に加えた。３７°Ｃで１時間イン
キュベーションしたのちＡＢＴＳ　（２ｍｍｏｌ　／）
、＞０．１ｄ’に加えた。反応液の吸収ｋ　４１４　ｎ
ｍで測定した。結果は第２表にまとめる。

例６ クラミジアの含有が疑われるサンプル全綿棒上に捕集し
、改良テトラデシル硫酸ナトリウム（０，１Ｍ酢酸塩緩
衝液ｐＨ４，５，６ｍＭ　ＤＴＴ　、　５　ｍＭＥＤＴ
Ａおよび５［］ｍＭグルコース中０．１　％　）　ｉ　
ｍｌ中、室温で１５分間インキュベーションした。混合
したのち綿棒欠除いて捨て、溶液５０μ／ｋ、クラミジ
アに対するウサギ抗体２Ｑｎ！９／ｍ／！、０．２ＭＴ
ｒｉｓ緩衝液ＰＨ７，５，０，０１４ＢＳＡオヨヒラテ
”ジスビーズ上に固定化したグルコースオキシダーゼ？
含有する溶液５０μｌと、室温で５分間インキュベーシ
ョンした。次に、この溶液を、ガラス繊維紙切片１１う
シート中の注入口に添加し死。

溶液が吸収されたのち、ＦＢＳ５０μＡｋ加えて紙片に
浸み込マせ、ついでＦＢＳ中西洋ワサビペルオキシダー
ゼ−ヤギ抗つサギエｇ　５０μ／’に加えた。

５分後にさらにＦＢ８５０μｍ部を加え、次にクエン酸
塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ５，５）　１０００μノ１つ
いで色原体ペルオキシダーゼ基質、０．０５Ｍグルコー
スおよび０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５，５に含有丁る溶液
を加えた。この場合、各溶液は、次の溶液の添加前に紙
片中に浸み込ませた。室温で５分間インキュベーション
したのち、注入口部分の紙片上に生成した色を、クラミ
ジア抗原葡含１ないことがわかっているサンプル音用い
た同様の実験で生成した色と比較し、結果音読み取った
。結果は第６表に示す。

第　　３　　表 クラミジア抗原　　　　　　色強度９ 存在 不存在 例４ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　　に対
して陰性であることがわかっている子宮頚管内分泌液サ
ンプル５例音線棒上に捕集し、このサンプルに、　０．
１　％ＣＤ０Ｃ，０，１％チメロサール、ＤＰＢＳ　−
ＰＨ７，２，１ｍｌケ用いて抽出した。抽出液をプール
した。サンプルプールの一部會取り、既知量の ナル抗体ｋＯ−１％　ＣＤ０Ｃ，０−［１１％ｆメＣＩ
サ−ル、ＤＰＢＳ　−ｐＨ７，２に希釈し、この抗体溶
液１００μ！全ミクロタイタープレートの各ウェルに加
えた。

その直後に、抽出サンプル（陰性および補給サンプル）
１００μ！？各ウエルに添加した。３７°Ｃで９０分間
インキュベーションしたのち、混合物全除去し、ウェル
γＤＰＢＳ中０．１チＴｗｅｅｎで洗浄した。次に５０
係ＤＰＢＳ　／　５０チＦＢＳ中に適当に希釈したヤギ
抗−ウサギＩｇＧ　−ＨＲＰ抱合体１００μ！？各ウェ
ルに加えた。６７℃で約６０分間インキュベーションし
たのち、混合物全除去し、ウェル’ｉ　ＤＰＢＳ中０−
１４　Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ついでＴＭＢ溶液１００μ
！？各ウェルに添加した。室温で６０分間インキュベー
ションしたのち１ＮＨ２ＳＯ４１００μＡｋ各ウエルに
加え、反応ｋ　４５０　ｎｍで読んだ。第二の抗体ロッ
トおよび別の患者サンプル抽出液で実験全反復した。結
果は第４表に示す。

第　　４ 表 Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ Ａ４５０　　（ｎ−２） ０　　　　　　　　　０．１３０　　　　　０．１３７
５０　　　　　　　　　０．２１５　　　　　０．３９
４５００　　　　　　　　　０．８９４　　　　　１．
５６０５０００　　　　　　　　　　＞　２．０　　　
　　　＞　２．０例５ Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　　の含有が疑われるサ
ンプルを綿棒上に集め、改良テトラデシル硫酸ナトリウ
ム（０，１Ｍ酢酸塩緩衝液ｐＨ４，５，６ｍＭ　Ｉ）’
ｒ’ｒ、　　５　ｍＭＥＤＴＡ中０．１１１ｍ１中、室
温で１５分間インキュベーションした。混合したのち、
綿棒を除いて捨て、溶液５０μＪｌ、Ｎ、　ｇｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅに対するウサギ抗体４０ｎｇ／ｐｉ、２　
％　Ｈ２Ｏ２，０，２ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７，５およ
びラテックスビーズ上に固定化したグルコースオキシダ
ーゼ？含有する溶液５０μｌとともに、室温で１０分間
インキユペションした。次に、この溶液をガラス繊維紙
片全被覆したシートの注入口に添加した。

溶液が吸収されたのち、ＦＢ８５０μ７！全加え、紙片
中に浸み込ませ、ついでＦＢＳ中西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ−ヤギ抗ウサギＩｇ　　５０μｌ？添加した。５
分後、さらにＦＢ８５０μｍ部を加え、ついでクエン酸
塩緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ５，５）１．０００μ！１
色原体ペルオキシダーゼ基質、０．０５Ｍグルコースお
よび０．１Ｍクエン酸塩、−５，５會含有する溶液？加
えた。この場合、各溶液は、次の溶液の添加前に紙片中
に浸み込ませた。

室温で５分間インキュベーションしたのち、注入口部分
の紙片上に生成した色を、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ
抗原會含まないことがわかっていたサンプル音用いた同
様の実験で生成した色と比較して、結果音読み取った。

結果全第５表に示す。

第　　５　　表 Ｎ−ｇ０ｎ０ｒｒｈ００ａ０色強度８ 抗　　原 存在 不存在 以上の例は、上述の発明によれば、クラミジアおよびＮ
、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　　の正確かつ高感度な検
定が可能であることを示している。

以上、明確に理解させる目的で、本発明上例示および実
施例音用いて詳細に説明してきたが、本発明の範囲から
逸脱することなく、ある種の変換および修飾が可能なこ
とは自明である。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原の含有が疑われる生物学的サンプル中の抗原
   を検定する方法において、（ａ）特異的結合タンパク質
   を実質的に含まない固体支持体と、上記サンプルからの
   抗原およびその抗原に対する抗体からなる水性メジウム
   との配合物を準備し、（ｂ）この配合物を、上記抗体が
   上記抗原に結合した場合、上記支持体に結合するのに十
   分な条件下でインキユベーシヨンし、ついで（ｃ）その
   存在または存在量が上記サンプル中の抗原の存在に関連
   する上記支持体に結合または上記メジウム中に存在する
   抗体を測定することを特徴とする抗原検定法
2. （２）支持体は工程（ｃ）の前にメジウムから分離され
   る特許請求の範囲第１項の抗原検定法
3. （３）抗原はグラム陰性菌からの抗原である特許請求の
   範囲第１項または第２項のいずれか一つの抗原検定法
4. （４）サンプルは工程（ａ）の前またはその工程中に、
   抗原を可溶化するために界面活性剤と接触させる特許請
   求の範囲第１項から第３項までのいずれか一つの抗原検
   定法
5. （５）分離された支持体を工程（ｃ）の前に洗浄する特
   許請求の範囲第２項から第４項までのいずれか一つの抗
   原検定法
6. （６）抗原に対する抗体はそれに結合した標識を有する
   かまたはメジウムがその抗体の標識結合パートナーを包
   含する特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか
   一つの抗原検定法
7. （７）グラム陰性菌の含有が疑われる生物学的サンプル
   中のグラム陰性菌を検定する方法であつて、（ａ）特異
   的結合タンパク質を実質的に含まないプラスチック固体
   支持体と、上記細菌の抗原およびその抗原に対する抗体
   からなる水性メジウムとの配合物を準備し、（ｂ）この
   配合物を、上記抗体が上記抗原に結合した場合、上記支
   持体に結合するのに十分な条件下でインキユベーシヨン
   し、（ｃ）上記支持体を上記メジウムから分離し、つい
   で（ｄ）その存在または存在量が上記サンプル中のグラ
   ム陰性菌の存在に関連する上記支持体上の抗体を測定す
   る特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか一つ
   の抗原検定法
8. （８）生物学的サンプル中の一群のグラム陰性菌を検定
   する方法であつて、（ａ）特異的結合タンパク質を実質
   的に含まない固体支持体と、上記群のグラム陰性菌から
   の抗原の含有が疑われる生物学的サンプルおよびその抗
   原に対する抗体を含む水性メジウムとの配合物を準備し
   、（ｂ）この配合物を、上記抗体が上記抗原に結合した
   場合、上記支持体に結合するのに十分な条件下でインキ
   ユベーシヨンし、ついで（ｃ）その存在または存在量が
   上記サンプル中の上記細菌の存在に関連する上記支持体
   上の抗体を測定する特許請求の範囲第１項から第６項ま
   でのいずれか一つの抗原検定法
9. （９）抗原は、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍ
   ａｔｉｓ￥、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｓｉｔｔａｃｉ
   ￥および￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ￥　￥ｇｏｎｏｒｒｈｏ
   ｅａｅ￥からなる群より選ばれるグラム陰性菌である特
   許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか一つの抗
   原検定法
10. （１０）表面活性剤は、デオキシコール酸塩、アルキル
    サルフェート、アルキルグルコシドおよびＣＨＡＰＳか
    らなる群より選ばれる特許請求の範囲第１項から第９項
    までのいずれか一つの抗原検定法
11. （１１）生物学的サンプル中の一群のグラム陰性菌を検
    定する方法であつて、（ａ）特異的結合タンパク質を実
    質的に含まない、吸水性の固体支持体を、上記サンプル
    からの上記細菌に関連した抗原とその抗原に対する抗体
    からなり予め形成させた免疫複合体と接触させ、（ｂ）
    上記支持体を上記複合体と、その複合体がその支持体に
    結合するのに十分な時間インキユベーシヨンし、ついで
    （ｃ）その存在または存在量が上記サンプル中の上記細
    菌の存在に関連する上記支持体上の上記抗体を測定する
    特許請求の範囲第１項の抗原検定法
12. （１２）一群のグラム陰性菌は、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
    ￥　￥ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ￥、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉ
    ａ　ｐｓｉｔｔａｃｉ￥および￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　
    ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥からなる群より選ばれる特許
    請求の範囲第１１項の抗原検定法
13. （１３）サンプルは工程（ａ）の前またはその工程中に
    、抗原を可溶化するために表面活性剤と接触させる特許
    請求の範囲第１１項または第１２項のいずれか一つの抗
    原検定法
14. （１４）表面活性剤は、デオキシコール酸塩、アルキル
    サルフェート、アルキルグルコシドおよびＣＨＡＰＳか
    らなる群より選ばれる特許請求の範囲第１１項から第１
    ３項までのいずれか一つの抗原検定法
15. （１５）￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
    ｓ￥の含有が疑われる生物学的サンプル中の￥Ｃｈｌａ
    ｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ￥に関連する抗原
    を検定する方法であつて、（ａ）特異的結合タンパク質
    を実質的に含まない固体支持体と、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉ
    ａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ￥の含有が疑われる生物学
    的サンプルおよびその抗原に対する抗体を含む水性メジ
    ウムとの配合物を準備し、（ｂ）この配合物を、上記抗
    体が上記抗原に結合した場合、上記支持体に結合するの
    に十分な条件下でインキユベーシヨンし、ついで（ｃ）
    上記サンプル中の上記抗原の指標として上記支持体上の
    上記抗体量を測定する特許請求の範囲第１項から第１０
    項までのいずれか一つの抗原検定法
16. （１６）支持体はプラスチックである特許請求の範囲第
    １５項の抗原検定法
17. （１７）￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
    ｅ￥の含有が疑われる生物学的サンプル中の￥Ｎｅｉｓ
    ｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥に関連する抗原
    を検定する方法であつて、（ａ）特異的結合タンパク質
    を実質的に含まない固体支持体と、￥Ｎ．ｇｏｎｏｒｒ
    ｈｏｅａｅ￥の含有が疑われる生物学的サンプルおよび
    上記抗原に対する抗体を含有する水性メジウムとの配合
    物を準備し、（ｂ）この配合物を、上記抗体が上記抗原
    に結合した場合、上記支持体に結合するのに十分な条件
    下でインキユベーシヨンし、ついで（ｃ）上記サンプル
    中の上記抗原の指標として上記支持体上の上記抗体量を
    測定する特許請求の範囲第１項から第１０項まで、なら
    びに第１５項および第１６項のいずれか一つの抗原検定
    法