JPH02211893A - クラミジア主要外層膜蛋白抗原抽出へのカチオン界面活性剤の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、クラミジア生菌体からの主要外層膜蛋白の抽
出に関する。また、抽出した抗原を使用する生物学的被
験体中の前記のような生菌体の存在を測定するための診
断アッセイにも関する。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信転性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、クラミジア−レス（Ｃｈｌａａ＋　ｄｉ
ａｌｅｓ）目、タラミジアセエ孤紅Ｕ対り並記）属の２
つの菌種の１つであるクラミジア・トラコマチスー４　
　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（本明細書では、「Ｃ，ト
ラコマチス」という）である、トラコーマ、包入体性結
膜炎、性病性リンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸
肛門炎を包含する多数のヒトの眼および性器の疾病の原
因となるこの種に属する１５以上の菌株が存在する。

Ｃ，トラコマチスに由来する感染症は、普通の人々の間
で蔓延し、そのため非淋菌性尿道炎だけをとっても各年
毎に数百万人存在すると信じられる。

これらの膚病の広く蔓延する性質のため、クラミジア生
菌体の検出について迅速、簡便かつ信頼できる試験を入
手することに相当な興味が存在する。クラミジア生菌体
から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い出すべ
くかなりの研究が行われてきた。

クラミジア生菌体から抽出することができる２種のクラ
ミジア抗原〔リポポリサンカライドおよび主要外層膜蛋
白（ＭＯＭＰ）　）が存在する。このＭＯＭＰは、Ｃ，
）ラコマチスの会合性外層膜蛋白全体の６０％を占め、
３８，０００〜４４，０００ダルトンノサイズまたはサ
ブユニット分子量を有する。さらに、この抗原はすべて
の血細型（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ）に共通する種特異性を伴
って反応することが知られている。従って、それは、す
べてのＣ，トラコマチス血細型の測定のための基礎を提
供することができる。

米国特許第４，４２７，７８２号明細書は、？ＩＯＭＰ
（７）単離および標準的分析方法を使用するその検出を
記載する。その抗原は、２工程（まず最初に弱アニオン
洗剤と混合し、次いで強アニオン洗剤と混合する）を使
用して基本小体から抽出されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

既知の方法は長くて退屈であり、多くの診断状況下では
長時間かかりすぎる。ＭＯＭＰ抽出のためのより簡便で
かつより効率のよい方法が強く望まれるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、（Ａ）クラミジア生菌体を含むことが予測
される被験体を供給する工程；および（Ｂ）前記被験体
を、少なくともｐ）＋８を有しそしテ少すくとも０．１
■／Ｉ１１で存在するカチオン界面活性剤を含む抽出組
成物と接触させて、検出を目的とする前記生菌体由来の
クラミジア主要外層膜蛋白抗原を抽出する工程、を含ん
でなるクラミジア生菌体から主要外層膜蛋白抗原を抽出
するための改良された方法によって解決される。

この発明は、また、（Ａ）少なくともｐＨ８を有しそし
て少なくとも０．１■／ｍｌで存在するカチオン界面活
性剤を含む抽出組成物を用い、クラミジア生菌体を含む
ことが予測される被験体からクラミジア主要外層膜蛋白
抗原を抽出する工程；（Ｂ）抽出した抗原をクラミジア
抗体と接触させて免疫複合体を形成する工程；および（
Ｃ）被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとし
て前記複合体を測定する工程、を含んでなるクラミジア
生菌体の測定方法をも提供する。

〔実施の態様〕

本発明は、いずれかの適当な医療または診断法を使用し
て愚者から得られた生物学的被験体中のＣ，）ラコマチ
ス（Ｃ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　（または、他のク
ラミジア種）の存在を測定するための方法である。この
ような被験体としては、例えば、患者の頚管、尿道、咽
喉または肛門から得られる綿棒被験体、および滑液また
は病巣由来の流体のような体液が挙げられる。こうして
得られる生物学的被験体は、測定の目的たるクラミジア
ＭＯＭＰ抗原を含むクラミジア生菌体を含むことが予測
される。

このＭＯＭＰ抗原は、１種以上のカチオン界面活性剤を
含有する緩衝化組成物を使用してクラミジア生菌体から
抽出される。一般に、このような界面活性剤は、第四級
アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級ピリジ
ニウム塩および第四級イミダゾリウム塩からなる群より
選ばれる１種以上のカチオン基を有する。第四級アンモ
ニウム塩が好ましい。概して、カチオン界面活性剤は結
合した抗原（抽出後の）またはアッセイで形成される免
疫複合体に悪影響を及さない限りどのようなものも本発
明で使用可能である。このような要件に合致する数多く
の界面活性剤が当該技術分野で知られており、定常的な
試験によって評価することができる。ＭｃＣｕｔｃｈｅ
ｏｎ’ｓ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　ａｎｄ厘圏」堕旦
＋　１９８６版（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ。

Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｇｌｅｎ　Ｒｏｃｋ
、Ｎ、Ｊ、１９８６）に記載の標準的な供給源と相談す
ればいくつかの有用なカチオン界面活性剤を見い出すこ
とが可能である。

有用なカチオン界面活性剤としては、限定されるもので
ないが、分子量３０００未満の非ポリマー系脂肪族化合
物、複素環式化合物または炭素環式化合物が挙げられる
。好ましくは、これらの化合物は脂肪族、複素環式もし
くは炭素環式第四級アンモニウム化合物である。

本明細書で使用する「脂肪族」は、正電荷を提供する原
子（例えば、リンまたは窒素）に結合した脂肪族（また
は開環類）を含む有機カチオン化合物を称する。これら
の基は炭素原子１〜３０個を有し、鎖の途中に位置する
酸素またはイオウ・原子を有することができ、各化合物
は炭素原子少なくとも１個を備える。いずれかの脂肪族
鎖に伴う１個以上の水素原子は、フン化基を提供する目
的でフッ素原子で置換されていてもよい。これらの基は
また、１個以上の他のハロゲン原子、アリール基、アル
コキシル基、アミノ基、シクロアルキル基または当業者
に自明な他の基で置換されていてもよい。

本明細書で使用する「複素環（式）」とは、カチオン電
荷を提供する原子に結合した少なくとも１個の複素環部
分を有する有機カチオン化合物をいう。カチオン電荷は
、必要により複素環基内またはその分子の他の部分にあ
ってもよい。それは、芳香族または非芳香族であっても
よく、窒素原子、イオウ原子、酸素原子またはセレン原
子ならびに炭素原子を含みうる。一般に、複素環部分は
その骨核に５〜１５個の原子を有し、場合により当業者
に自明な他の有機基１個以上で置換されていてもよい。

「炭素環（式）」の語は、カチオン電荷を提供する原子
に結合した１個以上の炭素環部分を有する有機化合物を
称する。このような部分は、環式環として、一般に炭素
原子５〜２０個のシクロアルキル、一般に炭素原子５〜
２０個のシクロアルケニルおよび一般に炭素原子６〜１
４個のアリールを含む。それらは、当業者に自明な他の
有機基１個以上で置換されているかまたは置換されてい
なくてもよい。

代表的な界面活性剤としては、ポリプロポキシ第四級ア
ンモニウムクロライド、アセテートおよびホスフェート
（Ｅｍｃｏｌ”として市販されている）、脂肪酸アミド
アルキルジメチルアミン（商品名、５ｃｈｅｒｃｏｄｉ
ｎｅｓ）　、エトキシル化脂肪族アミン（商品名、Ｐｅ
ｇａｍｅｅｎｓ）、長鎖アルキルジェタノールメチル第
四級アンモニウムクロライド（Ｍ−Ｑｕａ　ｔ”）、イ
ミダプリンの脂肪酸誘導体（商品名、Ｍｏｎａｚｏ　ｌ
　１ｎｅｓ）、ポリオキシエチレン脂肪族アミン（Ｍａ
ｚｅｅｎ”）および長鎖アルキルヒドロキシエチルイミ
ダシリン（商品名、Ａｌｋａｚｉｎｅｓ）が挙げられる
。最も有用な界面活性剤は、ポリプロポキシ−も−アミ
ンの第四級アンモニウム塩（例えば、Ｅ＋ｃｏｌＴ′４
ＣＣ−９、ＣＣ−３６、ＣＣ−５５およびＣＧ−５７）
である。

限定されるものでないが、その他にノニルトリメチルア
ンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウ
ムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド、ヘキサデシルピリジニウムブロマイド、ベン
ジルトリエチルアンモニウムクロライド、ジドデシルジ
メチルアンモニウムブロマイド、ベンジルジメチルフェ
ニルアンモニウムクロライド、テトラヘキシルアンモニ
ウムクロライド、ステアリルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロライド、ポリプロポキシ第四級アンモニウムク
ロライドおよびペルフルオロアルキルベタイン（例えば
、商品名Ｆｌｕｏｒａｄ　ＦＣ１３５またはＺｏｎｙｌ
”ＦＳＣ）が挙げられる。

溶液中のカチオン界面活性剤量は、一般に、抗原の抽出
に使用される溶液の少なくともｏ、ｔｇ／ｉである。好
ましくは、１〜１０１ｇ／Ｉ１１の量でそれが存在する
。この量は、最大の結果を得るためにそれぞれの界面活
性剤について調整することができる。特に有用な抽出組
成物は、例に関連して以下に記載する。

抽出組成物は、適当な緩衝剤または強塩基を使用してｐ
Ｈ８〜１３を有することが望まれる。塩基を使用してｐ
Ｈを調節し、次いでそのｐＨを持続するために１種以上
の緩衝剤で緩衝化することもできる。

また、緩衝剤は、ｐＨ調節ならびにそれを持続するのに
十分な強度を有するものであってもよい。

例としては、水酸化アルカリ金属、アルカリ土類金属お
よびアンモニウム（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化カルシうムおよび水酸化アンモニウム
）、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウムおよびリン酸
カリウム）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸
および関連の生物学的緩衝剤が挙げられる。抽出溶液中
の緩衝剤量は、適切な緩衝能を付与するように選ばれる
。場合により、緩衝剤混合物を使用してもよい。

さらに、抽出組成物は、生菌体の溶解およびＭＯＭＰ抗
原の抽出を促進する他の試薬１種以上を含めることがで
きる。このような試薬の例としては、１．３−ジメルカ
プト−２−プロパツール、２゜３−ジメルカプト−１−
プロパツール、１，２−ジメルカプトエタン、ジチオス
レイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノ
ールおよびチオグリコールなどのチオールを含むスルフ
ヒドリル基含有還元剤が挙げられる。他の有用な還元剤
には、グルタチオン、Ｎ−アセチルシスティン、システ
ィン、チオグリコール酸、Ｌ−システィンメチルエステ
ル、Ｌ−システィンメチルエステルおよびＮ−アセチル
−Ｄ、Ｌ−イソシスティンが包含される。これらの還元
剤は、市販光から一般に入手可能である。

場合により、好ましい添加剤以外に、エタノールアミン
、プロパツールアミン、ジェタノールアミン、トリエタ
ノールアミンおよびそれらの塩のようなアルコールアミ
ン類を含ませてもよい。

抽出は、場合により低いかまたはより高い温度が使用さ
れうるが、一般に室温（すなわち、１８〜２５°Ｃ）で
行われる。より高い温度は不要であり、特定の被験体に
とっては好ましくないかも知れない。

必須ではないが、生菌体から抗原が抽出されたとき、次
の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞残層、微小
粒子または他の不要物を除去することが望ましい、予備
濾過は、ある型のフィルターを備える適当な容器により
実施することができる。

抽出はまた、試験管、ビーカー、キュベツトまたは当業
者に既知の他の装置などの適当な容器中で行うこともで
きる。特に有用な装置は、米国特許第４，７４６．６１
４号明細書に示されるものを含む当該技術分野で既知で
ある。

次に、濾過された被験体は、抽出された抗原の存在を測
定するためにいずれかの分析法にかけられる。これらの
方法には、特定の事例にのみ選ばれる可能性があり、好
ましくはないかも知れないが、培養法、カウンター免疫
電気泳動および血清試験が含まれる。

好ましくは、抽出された抗原は１種以上の適当な抗体と
それを免疫的に反応させるイムノアッセイを使用して検
出される。得られた免疫複合体は、適当な放射線、比色
、蛍光または酵素標識試薬を使用して検出される。ある
場合には、試薬は抗原に対する標識抗体であり、またあ
る場合には、抗原と反応する未標識抗体に向けられる標
識抗−抗体である。このようなイムノアッセイは、一般
に、塗布されているかまたは塗布されていないある型の
固体支持体上での検出可能な免疫複合体の形成、それに
続く適当な検出法を含む。別のアッセイは、免疫複合体
の少なくとも１１ａの反応体（例えば、抗体）が複合体
形成中に一緒に凝集するようなある型の標識または未標
識粒子に付着された場合に免疫複合体の凝集を伴う。

有用なアッセイの例としては、コンペティティブイムノ
アッセイまたはエンザイム・リンクド・イムノアブソー
ベント・アッセイ（通常、ｒＥＬＩｓＡＪと称される）
が挙げられる。これらのアッセイは、米国特許第４，４
２７．７８２号明細書およびＳｃｈｍｅｅｒらにより、
Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１５（５）、　
８３０−８３４ページ（１９８２）に機運されている。

好ましくは、抽出されたＭＯＭＰ抗原は、それが結合で
きるポリマー固体支持体と接触される。利用可能な支持
体材料としては、ガラス、セルロース系またはポリマー
ビーズ、フィルム、チューブ、ゲル、プレートおよび当
該技術分野で既知のものが挙げられる。好ましくは、支
持体材料はより詳細について後述するような微孔質膜で
ある。この膜は、「裸」、すなわち何等かの物質によっ
ても処理されていないかまたは塗布されていないもの（
米国特許第４，４９７，８９９号明細書に示されるよう
な）であることができる、しかしながら、それはアッセ
イ性能を高めうる物質（例えば、界面活性剤）で好まし
くは処理または塗布される。

あるｔｑ様では、固体支持体は複数の正荷電基をその表
面に有する。これらの正荷電基は、支持体表面にポジテ
ィブな電荷、すなわち広いｐＨ範囲を通じてポジティブ
なゼータ（Ｚｅｔａ）電位を生じさせる。ゼータ電位は
、支持体とそれに接触する流体との間の電位差として知
られている。支持体上に所定のゼータ電位を生じさせる
すべての正荷電化学残基が本発明の実施上利用可能であ
る。

例えば、この支持体は、抽出抗原とイオン的に結合し得
る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然ま
たは合成ポリマーから構築することができる。利用可能
なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエステ
ル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンイミ
ン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニル七
ツマ−から製造される付加ポリマーならびに当該技術分
野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カチオ
ン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニ
ウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム塩
、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウム
塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましいもので
ある。さらなる詳細は、引用により本明細書の内容とな
る前述の出願を調査することにより得ることができる。

ある種の利用可能なポリマー固体支持体は、Ｐｏｓｉｄ
ｙｎｅｉＭまたはＢｉｏｄｙｎｅＴ′４−　Ｂ膜のよう
な既知の微孔質膜である。これらの支持体は、細孔に第
四級アンモニウム基を有するポリエステルが塗布された
ナイロン膜からなる。他の利用可能な支持体には、界面
活性剤が塗布されたポリマー膜が含まれる。

抗原が免疫反応前に固体支持体に結合される前述の態様
と対比して、本発明のアッセイは、抗原が固体支持体に
付着すると同時かまたはその前後で免疫複合体を形成す
ることによっても実施することができる。換言すれば、
溶液中で複合体が形成された後、固体支持体との接触に
よりそれにパインディングすることができる。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。

利用可能な試験装置の構成は、当該技術分野で既知であ
る。特に有用な装置は、特開昭６３−２２３５６３号公
報（昭和６３年９月１９日公開）および特願昭６３−２
３４６９２号明細書（昭和６３年９月１８日出願）に記
載されている。

前記荷電支持体と抗原の接触により、はとんど瞬間的に
抗原は支持体に結合される。場合により、すべての未結
合抗原はいずれかの適当な洗浄液、好ましくはカチオン
界面活性剤を含む洗浄液で洗浄することによって支持体
から除去してもよい。

前記接触の１０分以内、好ましくは１〜５分以内に結合
抗原は、クラミジア抗体と接触されることにより支持体
上で免疫複合体を形成する。流体と未結合物質は、同時
に素早く除去することができる。アッセイが使い捨て装
置を使用して実施される場合、その支持体は、被験体中
の流体および複合体化していない物質を通過させ、膜に
抗原が結合するような微孔質膜であってもよい。

このアッセイで使用される抗体は、１種以上のクラミジ
ア種のＭＯＭＰ抗原と特異的に免疫反応性を有する。そ
れはポリクロナルまたはモノクロナルであってよい。ポ
リクロナルの場合、それは市販されているか、または検
出されるべき生菌体に共通の抗原を使用する既知法によ
り各種動物から調製することができる。単一抗体または
それらの混合体が使用されうる。好ましくは、抗体は、
市販されているかまたは標準的なハイブリドーマ法を使
用して調製されるモノクロナルである。利用可能な抗体
調製方法は、例えば米国特許筒４，４２７．７８２号明
細書（前記）に記載されている。

−の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であり、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するさらなる化学的または特異的なパインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。有用な標識の例としては、放射性同位体、酵素、蛍
光化合物、化学発光化合物、リン光化合物、ビオチンま
たはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フェリチ
ン、磁性粒子、着色粒子および当業者に極めて明らかな
他の物質が挙げられる。放射性同位体または酵素が好ま
しい標識である。標識は、既知の方法を使用して抗体に
付着させるご七ができる。標識が直接検出できない場合
には、検出できる反応または特異的パインディング生成
物を生ずる試薬または化合物がさらに必要である。

例えば、標識がビオチンであるならば、それは酵素と接
合されたアビジンと反応して検出可能な種を提供するこ
とができる。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダ
ーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホ
スファターゼなどである場合には、基質および色素生成
試薬もまた必要である。アルカリホスファターゼおよび
ペルオキシダーゼが特に有用な酵素標識である。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであり
、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素生
成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例えば、
有用な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾールロ
イコ染料（米国特許筒４，０８９，７４７号明細書に記
載されるような）またはペルオキシダーゼおよび過酸化
水素の存在下で反応して色素を提供する他の化合物（す
なわち、ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色
素を提供する化合物）のようなロイコ染料が含まれる。

好ましい態様では、クラミジア抗体は標識されておらず
、そして形成され支持体に結合している抗体−抗原複合
体の検出は、前記未標識（標識されていない）抗体に特
異性を有し、かつ適切に標識されている第二の抗体（以
下に記載する）を使用して行われる。

クラミジア抗体（標識または未標識）は、支持体上の非
特異的相互作用を減少させる１種以上の蛋白質の存在下
で前記結合抗原と接触されうる。

利用可能な蛋白質は周知であり、例えば、カゼイン、α
−カゼイン、ウシ胎仔血清およびブタガンマ（Ｔ）グロ
ブリンが挙げられる。特に有用な阻止（ｂｌｏｃｋｉｎ
ｇ）組成物は、非免疫学的蛋白質と両性界面活性剤を含
んでなる。

結合抗原が一度りラミシア抗体と接触してしまうと、支
持体上で結合免疫複合体が形成される。

この複合体の形成を促進するには、一般に、１５〜３０
℃の温度で１０分未満前記抗体と抗原がインキュベーシ
ョンさ゛れる。好ましくは、インキュベーションは１８
〜２５℃（すなわち、室温）で１〜５分間行われる。こ
の温和なインキュベーション条件は、米国特許筒４，４
９７，８９９号明細書で裸の支持体に対するクラミジア
抗原の吸着のための要件として記載される３７°Ｃ３０
分と際立った対照を示す。

インキュベーション後であって、前記抗体〜抗原の接触
１０分以内に、前記結合複合体は適当な洗浄液で１度以
上洗浄される。特に有用な洗浄液は、例との関連で以下
に記載される。

前述の態様で、クラミジア抗体が標識されている場合に
は、洗浄後のアッセイ手順は、直接的なその標識の検出
か、または適当な試薬添加後の間接的な検出となる。検
出は、結合複合体の洗浄後、比較的速やかに、すなわち
、−船釣に１０分以内、好ましくは１〜５分以内に行わ
れる。場合により、標識の検出は、試薬が許容するなら
ばインキュベーションにより促進してもよい。次に、標
準的な装置および方法を使用して標識が検出される。

好ましい態様では、クラミジア抗体は標識されておらず
、そして結合複合体の洗浄後にそれが、標識されていな
い抗体に向けられた抗体と接触される。この第二の抗体
（すなわち、抗−抗体）は、前述した標識のいずれかに
より適当に標識される。

この抗体は、市販または既知の方法を使用して調製され
るモノクロナルまたはポリクロナルであることができる
。

この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、１５〜３０°Ｃの温度で１０分未満
、好ましくは１８〜２５℃で１〜５分間インキュベーシ
ョンされる。

次に、適当な洗浄液を使用してさらに洗浄することによ
り結合標識複合体から複合体化していない物質を除去し
、次いで適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加し
て検出可能な種を提供する。

その後、この抗原−抗体−標識抗体複合体は、標準的な
放射線、比色、蛍光または他の検出法を使用して支持体
上で検出される。

クラミジア生菌体の測定にとって好ましい方法は次の工
程を含んでなる： Ａ、少なくともｐＨ８を有しそして少なくとも０．１ｍ
ｇ／ＩＩｄ１．の量で存在するカチオン界面活性剤を含
む抽出組成物でクラミジア生菌体を含むことが予測され
る被験体からクラミジア主要外層膜蛋白抗原を抽出する
工程、 Ｂ、前記抽出された抗原を固体支持体と接触させてその
支持体に抗原を結合する工程、Ｃ５工程Ｂの接触と同時
または前後に、その抽出された抗原を未標識クラミジア
抗体と接触させて免疫複合体を形成する工程、 Ｄ、支持体に結合した前記複合体から結合していない物
質を洗い流す工程、 Ｅ、前記結合した複合体を、未標識クラミジア抗体に向
けられる標識抗体と接触させて支持体に結合した標識さ
れた抗原−抗体−抗体複合体を形成する工程、ならびに Ｆ、被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとし
て前記標識された複合体の存在を測定する工程。

〔実施例］ 以下の例で本発明を具体的に示すが、本発明の範囲を限
定するものでない。

なお、本明細書で特定の名称にｒＴＭ、が付されている
場合には、その名称が商品名または商標であることを意
味する。

これらの例を実施するに当たり、クラミジア主要外層膜
蛋白抗原に対するマウスモノクロナル抗体（抗ＭＯＭＰ
）は、標準的なハイブリドーマ法およびマウス細胞系を
使用して調製し、アシド０．０１重量％含有リン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ）　（ｐＨ７，４）に保存した。アッセイ
で使用される抗体組成物は、阻止剤蛋白質としてカゼイ
ン（０，５重量％）およびＬｏｎｚａｉｎｅ”Ｃ両性界
面活性剤（０，０１重量％、ＬＯｎＺａ＋Ｉｎｃ、より
入手可能）を含有するＰＢＳに前記抗体試薬（１９μり
を添加して調製しく１：８００希釈）、次に０．２２Ｊ
Ｍのフィルターで濾過して使用液を得た。

使用される標識ポリクロナル抗体は、ＢｉｏＲａｄＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られたワサビペルオキシダ
ーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体である。この接合体は
、カゼイ０．５重量％およびＬｏｎｚａｉｎｅＴＭＣ両
性界面活性剤０．Ｏ１重量％含有ＰＢＳで１：２０００
まで希釈し、次いで０，２２ｎのフィルターで濾過して
使用液を得た。

抗原抽出溶液は、水で以下の成分を溶解することによっ
て調製した：アジ化ナトリウム（１５ミリモル濃度）、
塩化ナトリウム（０，１５ミリモル濃度）、ジチオスレ
イトール還元剤（７，５ミリモル濃度）、エタノールア
ミン（０，２６ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢
酸（２５ミリモル濃度）および水酸化ナトリウム（０，
１モル濃度、ｐＨ１２，５に調節）。

この溶液１５−に、メタノール中１０重量％のＥｍｃｏ
ｌ”ＣＣ−３６−カチオン界面活性剤（ポリプロピルー
む−アミンの第四級アンモニウムクロライド、Ｗｉｔｃ
ｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手可能）溶液３７５　ｐｌ
を添加した。

例Ｉ：クーミジア　　　　゛の　　　　　　の拍拙− この例は、Ｃ，トラコマチス（Ｃ，ｔｒａｃｈｏｓａｔ
ｉｓ）主要外層膜蛋白抗原の抽出に関する本発明の実施
例である。

基本小体蛋白（ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ中８Ｌ５ｔ
１１、最終濃度１５００ｐｇ）を、２種の抽出組成物（
各１４１８．５μ７）　（１つは、前述のようなＥ＋＋
ｃｏｌ”ＣＣ３６力チオン界面活性剤を含有しており、
もう１つはその界面活性剤が欠失した対照組成物）に添
加し、次いで約５分間室温で混合保持した。２つの対応
する溶液は、抗原を含めないで調製した。

過酸化水素溶液（８重量％、１５００Ｉ１１）を、各抽
出溶液に加えて内因性カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、
およびミエロペルオキシダーゼを除去した。

得られた混合物を、再び５分間室温で維持した。

各抽出溶液の一部（１２０１１１）を使い捨て試験装置
の個別のウェルに加え、直ちに流体を排出させた。

この装置は、Ｂｉｏｄｙｎｅ”　Ｂ膜として市販されて
いる表面上に第四級アンモニウム基を有する５４の微孔
質膜を含ませた。この膜は使用前にＺｏｎｙｌ”ＦＳＸ
　（非イオン性フッ化界面活性剤）で処理した。

抗ＭＯＭＰ溶液（前記）の一部（１２０ｍ）を、流体は
排出させながら前記試験装置の各ウェルに添加した。イ
ンキュベーションを約５分間室温で行った。

インキュベーション後、得られた抗原−抗体複合体を、
リン酸緩衝剤とＥｍｃｏｌ”ＣＣＱカチオン界面活性剤
（０，７５重量％、前記Ｅｍｃｏｌ”ＣＣ−３６と類似
）の緩衝化溶液（ｐＨ７，２）で２度洗浄した。

ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス抗体溶液（１
２０ｔｄ　）を、各ウェルに添加し、次いで接触のため
膜を介して流した。室温でのインキュベーションを再び
５分間行って膜にイオン結合した抗原−抗体−標識抗体
複合体を形成させた。

前記の洗浄液で２度洗浄した後、色素生成組成物を各試
験ウェルに添加した。この組成物は、過酸化水素（１０
ミリモル濃度）、２−（４−ヒドロキシ−３〜メトキシ
フエニル）　−４、５−ビス（４−メトキシフェニル）
イミダゾールロイコ染料（０，００５重量％）、ポリ（
ビニルピロリドン）（１ｆｆｉ１％）、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチレン
トリアミン五酢酸（１０ミリモル濃度）を含む。

約１０分以内に、被験体由来のクラミジアＭＯＭＰ抗原
の存在を示す赤色色素が試験ウェル中で観察された。透
過濃度を測定し、カチオン界面活性剤を含む抽出溶液と
それを含まない抽出溶液との間の濃度差（ΔＤ、）とし
て以下の第１表に示した。

データは、この方法がクラミジア生菌体からＭＯＭＰ抗
原を抽出する工程で有効であることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、クラミジア生菌体を含むことが予測される被験
   体を供給する工程、および Ｂ、前記被験体を、少なくともｐＨ８を有しそして少な
   くとも０．１ｍｇ／ｍｌで存在するカチオン界面活性剤
   を含む抽出組成物と接触させて、検出を目的とする前記
   生菌体由来のクラミジア主要外層膜蛋白抗原を抽出する
   工程、を含んでなるクラミジア生菌体からの主要外層膜
   蛋白抗原の抽出方法。 ２、Ａ、少なくともｐＨ８を有しそして少なくとも０．
   １ｍｇ／ｍｌで存在するカチオン界面活性剤を含む抽出
   組成物を用い、クラミジア生菌体を含むことが予測され
   る被験体からクラミジア主要外層膜蛋白抗原を抽出する
   工程、 Ｂ、抽出した抗原をクラミジア抗体と接触 させて免疫複合体を形成する工程、および Ｃ、被験体中のクラミジア生菌体の存在を 示すものとして前記複合体を測定する工程、を含んでな
   るクラミジア生菌体の測定方法。