JPH0722514B2 - クラミジア主要外層膜蛋白抗原抽出へのカチオン界面活性剤の使用 - Google Patents
クラミジア主要外層膜蛋白抗原抽出へのカチオン界面活性剤の使用Info
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- JPH0722514B2 JPH0722514B2 JP1260370A JP26037089A JPH0722514B2 JP H0722514 B2 JPH0722514 B2 JP H0722514B2 JP 1260370 A JP1260370 A JP 1260370A JP 26037089 A JP26037089 A JP 26037089A JP H0722514 B2 JPH0722514 B2 JP H0722514B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/295—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Chlamydiales (O)
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- C07K16/125—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Chlamydiales (O)
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クラミジア生菌体からの主要外層膜蛋白の抽
出に関する。また、抽出した抗原を使用する生物学的被
験体中の前記のような生菌体の存在を測定するための診
断アッセイにも関する。
出に関する。また、抽出した抗原を使用する生物学的被
験体中の前記のような生菌体の存在を測定するための診
断アッセイにも関する。
最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。
イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、クラミジアーレス（Chlamydiales）目、
クラミジアセエ（Chlamydiaceae）属の２つの菌種の１
つであるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trach
omatis）（本明細書では、「C.トラコマチス」という）
である。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉
芽腫、非淋病性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数
のヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種に属す
る15以上の菌株が存在する。C.トラコマチスに由来する
感染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性
尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じ
られる。
菌体の１つは、クラミジアーレス（Chlamydiales）目、
クラミジアセエ（Chlamydiaceae）属の２つの菌種の１
つであるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trach
omatis）（本明細書では、「C.トラコマチス」という）
である。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉
芽腫、非淋病性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数
のヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種に属す
る15以上の菌株が存在する。C.トラコマチスに由来する
感染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性
尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じ
られる。
これらの疾病の広く蔓延する性質のため、クラミジア生
菌体の検出について迅速、簡便かつ信頼できる試験を入
手することに相当な興味が存在する。クラミジア生菌体
から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い出すべ
くかなりの研究が行われてきた。
菌体の検出について迅速、簡便かつ信頼できる試験を入
手することに相当な興味が存在する。クラミジア生菌体
から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い出すべ
くかなりの研究が行われてきた。
クラミジア生菌体から抽出することができる２種のクラ
ミジア抗原〔リポポリサッカライドおよび主要外層膜蛋
白（MOMP）〕が存在する。このMOMPは、C.トラコマチス
の会合性外層膜蛋白全体の60％を占め、38,000〜44,000
ダルトンのサイズまたはサブユニット分子量を有する。
さらに、この抗原はすべての血細型（Serotype）に共通
する種特異性を伴って反応することが知られている。従
って、それは、すべてのC.トラコマチス血細型の測定の
ための基礎を提供することができる。
ミジア抗原〔リポポリサッカライドおよび主要外層膜蛋
白（MOMP）〕が存在する。このMOMPは、C.トラコマチス
の会合性外層膜蛋白全体の60％を占め、38,000〜44,000
ダルトンのサイズまたはサブユニット分子量を有する。
さらに、この抗原はすべての血細型（Serotype）に共通
する種特異性を伴って反応することが知られている。従
って、それは、すべてのC.トラコマチス血細型の測定の
ための基礎を提供することができる。
米国特許第4,427,782号明細書は、MOMPの単離および標
準的分析方法を使用するその検出を記載する。その抗原
は、２工程（まず最初に弱アニオン洗剤と混合し、次い
で強アニオン洗剤と混合する）を使用して基本小体から
抽出されている。
準的分析方法を使用するその検出を記載する。その抗原
は、２工程（まず最初に弱アニオン洗剤と混合し、次い
で強アニオン洗剤と混合する）を使用して基本小体から
抽出されている。
既知の方法は長くて退屈であり、多くの診断状況下では
長時間かかりすぎる。MOMP抽出のためのより簡便でかつ
より効率のよい方法が強く望まれるであろう。
長時間かかりすぎる。MOMP抽出のためのより簡便でかつ
より効率のよい方法が強く望まれるであろう。
前記課題は、 A.クラミジア生菌体を含むことが予測される被験体を供
給する工程、および B.前記被験体を、少なくともpH8を有しかつ、少なくと
も0.1mg/mlで存在する、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの
第四級アンモニウム塩又はその混合物であるカチオン界
面活性剤を含む抽出組成物と接触させて、検出を目的と
する前記生菌体由来のクラミジア主要外層膜蛋白抗原を
抽出する工程、を含んでなるクラミジア生菌体から主要
外層膜蛋白抗原を抽出するための改良された方法によっ
て解決される。
給する工程、および B.前記被験体を、少なくともpH8を有しかつ、少なくと
も0.1mg/mlで存在する、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの
第四級アンモニウム塩又はその混合物であるカチオン界
面活性剤を含む抽出組成物と接触させて、検出を目的と
する前記生菌体由来のクラミジア主要外層膜蛋白抗原を
抽出する工程、を含んでなるクラミジア生菌体から主要
外層膜蛋白抗原を抽出するための改良された方法によっ
て解決される。
この発明は、また、 A.少なくともpH8を有しかつ、少なくとも0.1mg/mlで存
在する、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの第四級アンモニ
ウム塩又はその混合物であるカチオン界面活性剤を含む
抽出組成物を用い、クラミジア生菌体を含むことが予測
される被験体からクラミジア主要外層膜蛋白抗原を抽出
する工程、 B.抽出した抗原をクラミジア抗体と接触させて免疫複合
体を形成する工程、および C.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとして
前記複合体を測定する工程、を含んでなるクラミジア生
菌体の測定方法をも提供する。
在する、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの第四級アンモニ
ウム塩又はその混合物であるカチオン界面活性剤を含む
抽出組成物を用い、クラミジア生菌体を含むことが予測
される被験体からクラミジア主要外層膜蛋白抗原を抽出
する工程、 B.抽出した抗原をクラミジア抗体と接触させて免疫複合
体を形成する工程、および C.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとして
前記複合体を測定する工程、を含んでなるクラミジア生
菌体の測定方法をも提供する。
本発明は、いずれかの適当な医療または診断法を使用し
て患者から得られた生物学的被験体中のC.トラコマチス
（C.trachomatis）（または、他のクラミジア種）の存
在を測定するための方法である。このような被験体とし
ては、例えば、患者の頚管、尿道、咽喉または肛門から
得られる綿棒被験体、および滑液または病巣由来の流体
のような体液が挙げられる。こうして得られる生物学的
被験体は、測定の目的たるクラミジアMOMP抗原を含むク
ラミジア生菌体を含むことが予測される。
て患者から得られた生物学的被験体中のC.トラコマチス
（C.trachomatis）（または、他のクラミジア種）の存
在を測定するための方法である。このような被験体とし
ては、例えば、患者の頚管、尿道、咽喉または肛門から
得られる綿棒被験体、および滑液または病巣由来の流体
のような体液が挙げられる。こうして得られる生物学的
被験体は、測定の目的たるクラミジアMOMP抗原を含むク
ラミジア生菌体を含むことが予測される。
このMOMP抗原は、１種以上のカチオン界面活性剤を含有
する緩衝化組成物を使用してクラミジア生菌体から抽出
される。一般に、このような界面活性剤は、第四級アン
モニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級ピリジニウ
ム塩および第四級イミダゾリウム塩からなる群より選ば
れる１種以上のカチオン基を有する。第四級アンモニウ
ム塩が好ましい。概して、カチオン界面活性剤は結合し
た抗原（抽出後の）またはアッセイで形成される免疫複
合体に悪影響を及さない限りどのようなものも本発明で
使用可能である。このような要件に合致する数多くの界
面活性剤が当該技術分野で知られており、定常的な試験
によって評価することができる。McCutcheon′s Emulsi
fiers and Detergents,1986版（McCutcheon Division,P
ublishing Co.,Glen Rock,N.J.1986）に記載の標準的な
供給源と相談すればいくつかの有用なカチオン界面活性
剤を見い出すことが可能である。
する緩衝化組成物を使用してクラミジア生菌体から抽出
される。一般に、このような界面活性剤は、第四級アン
モニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級ピリジニウ
ム塩および第四級イミダゾリウム塩からなる群より選ば
れる１種以上のカチオン基を有する。第四級アンモニウ
ム塩が好ましい。概して、カチオン界面活性剤は結合し
た抗原（抽出後の）またはアッセイで形成される免疫複
合体に悪影響を及さない限りどのようなものも本発明で
使用可能である。このような要件に合致する数多くの界
面活性剤が当該技術分野で知られており、定常的な試験
によって評価することができる。McCutcheon′s Emulsi
fiers and Detergents,1986版（McCutcheon Division,P
ublishing Co.,Glen Rock,N.J.1986）に記載の標準的な
供給源と相談すればいくつかの有用なカチオン界面活性
剤を見い出すことが可能である。
有用なカチオン界面活性剤としては、限定されるもので
ないが、分子量3000未満の非ポリマー系脂肪族化合物、
複素環式化合物または炭素環式化合物が挙げられる。好
ましくは、これらの化合物は脂肪族、複素環式もしくは
炭素環式第四級アンモニウム化合物である。
ないが、分子量3000未満の非ポリマー系脂肪族化合物、
複素環式化合物または炭素環式化合物が挙げられる。好
ましくは、これらの化合物は脂肪族、複素環式もしくは
炭素環式第四級アンモニウム化合物である。
本明細書で使用する「脂肪族」は、正電荷を提供する原
子（例えば、リンまたは窒素）に結合した脂肪族（また
は開環鎖）を含む有機カチオン化合物を称する。これら
の基は炭素原子１〜30個を有し、鎖の途中に位置する酸
素またはイオウ原子を有することができ、各化合物は炭
素原子少なくとも１個を備える。いずれかの脂肪族鎖に
伴う１個以上の水素原子は、フッ化基を提供する目的で
フッ素原子で置換されていてもよい。これらの基はま
た、１個以上の他のハロゲン原子、アリール基、アルコ
キシル基、アミノ基、シクロアルキル基または当業者に
自明な他の基で置換されていてもよい。
子（例えば、リンまたは窒素）に結合した脂肪族（また
は開環鎖）を含む有機カチオン化合物を称する。これら
の基は炭素原子１〜30個を有し、鎖の途中に位置する酸
素またはイオウ原子を有することができ、各化合物は炭
素原子少なくとも１個を備える。いずれかの脂肪族鎖に
伴う１個以上の水素原子は、フッ化基を提供する目的で
フッ素原子で置換されていてもよい。これらの基はま
た、１個以上の他のハロゲン原子、アリール基、アルコ
キシル基、アミノ基、シクロアルキル基または当業者に
自明な他の基で置換されていてもよい。
本明細書で使用する「複素環（式）」とは、カチオン電
荷を提供する原子に結合した少なくとも１個の複素環部
分を有する有機カチオン化合物をいう。カチオン電荷
は、必要により複素環基内またはその分子の他の部分に
あってもよい。それは、芳香族または非芳香族であって
もよく、窒素原子、イオウ原子、酸素原子またはセレン
原子ならびに炭素原子を含みうる。一般に、複素環部分
はその骨核に５〜15個の原子を有し、場合により当業者
に自明な他の有機基１個以上で置換されていてもよい。
荷を提供する原子に結合した少なくとも１個の複素環部
分を有する有機カチオン化合物をいう。カチオン電荷
は、必要により複素環基内またはその分子の他の部分に
あってもよい。それは、芳香族または非芳香族であって
もよく、窒素原子、イオウ原子、酸素原子またはセレン
原子ならびに炭素原子を含みうる。一般に、複素環部分
はその骨核に５〜15個の原子を有し、場合により当業者
に自明な他の有機基１個以上で置換されていてもよい。
「炭素環（式）」の語は、カチオン電荷を提供する原子
に結合した１個以上の炭素環部分を有する有機化合物を
称する。このような部分は、環式環として、一般に炭素
原子５〜20個のシクロアルキル、一般に炭素原子５〜20
個のシクロアルケニルおよび一般に炭素原子６〜14個の
アリールを含む。それらは、当業者に自明な他の有機基
１個以上で置換されているかまたは置換されていなくて
もよい。
に結合した１個以上の炭素環部分を有する有機化合物を
称する。このような部分は、環式環として、一般に炭素
原子５〜20個のシクロアルキル、一般に炭素原子５〜20
個のシクロアルケニルおよび一般に炭素原子６〜14個の
アリールを含む。それらは、当業者に自明な他の有機基
１個以上で置換されているかまたは置換されていなくて
もよい。
代表的な界面活性剤としては、ポリプロポキシ第四級ア
ンモニウムクロライド、アセテートおよびホスフェート
（EmcolTMとして市販されている）、脂肪酸アミドアル
キルジメチルアミン（商品名、Schercodines）、エトキ
シル化脂肪族アミン（商品名、Pegameens）、長鎖アル
キルジエタノールメチル第四級アンモニウムクロライド
（Ｍ−QuatTM）、イミダゾリンの脂肪酸誘導体（商品
名、Monazolines）、ポリオキシエチレン脂肪族アミン
（MazeenTM）および長鎖アルキルヒドロキシエチルイミ
ダゾリン（商品名、Alkazines）が挙げられる。最も有
用な界面活性剤は、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの第四
級アンモニウム塩（例えば、EmcolTMCC−9,CC−36,CC−
55およびCC−57）である。
ンモニウムクロライド、アセテートおよびホスフェート
（EmcolTMとして市販されている）、脂肪酸アミドアル
キルジメチルアミン（商品名、Schercodines）、エトキ
シル化脂肪族アミン（商品名、Pegameens）、長鎖アル
キルジエタノールメチル第四級アンモニウムクロライド
（Ｍ−QuatTM）、イミダゾリンの脂肪酸誘導体（商品
名、Monazolines）、ポリオキシエチレン脂肪族アミン
（MazeenTM）および長鎖アルキルヒドロキシエチルイミ
ダゾリン（商品名、Alkazines）が挙げられる。最も有
用な界面活性剤は、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの第四
級アンモニウム塩（例えば、EmcolTMCC−9,CC−36,CC−
55およびCC−57）である。
限定されるものでないが、その他にノニルトリメチルア
ンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウ
ムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド、ヘキサデシルピリジニウムブロマイド、ベン
ジルトリエチルアンモニウムクロライド、ジドデシルジ
メチルアンモニウムブロマイド、ベンジルジメチルフェ
ニルアンモニウムクロライド、テトラヘキシルアンモニ
ウムクロライド、ステアリルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロライド、ポリプロポキシ第四級アンモニウムク
ロライドおよびペルフルオロアルキルベタイン（例え
ば、商品名Fluorad FC135またはZonylTMFSC）が挙げら
れる。
ンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウ
ムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド、ヘキサデシルピリジニウムブロマイド、ベン
ジルトリエチルアンモニウムクロライド、ジドデシルジ
メチルアンモニウムブロマイド、ベンジルジメチルフェ
ニルアンモニウムクロライド、テトラヘキシルアンモニ
ウムクロライド、ステアリルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロライド、ポリプロポキシ第四級アンモニウムク
ロライドおよびペルフルオロアルキルベタイン（例え
ば、商品名Fluorad FC135またはZonylTMFSC）が挙げら
れる。
溶液中のカチオン界面活性剤量は、一般に、抗原の抽出
に使用される溶液の少なくとも0.1mg/mlである。好まし
くは、１〜10mg/mlの量でそれが存在する。この量は、
最大の結果を得るためにそれぞれの界面活性剤について
調整することができる。特に有用な抽出組成物は、例に
関連して以下に記載する。
に使用される溶液の少なくとも0.1mg/mlである。好まし
くは、１〜10mg/mlの量でそれが存在する。この量は、
最大の結果を得るためにそれぞれの界面活性剤について
調整することができる。特に有用な抽出組成物は、例に
関連して以下に記載する。
抽出組成物は、適当な緩衝剤または強塩基を使用してpH
8〜13を有することが望まれる。塩基を使用してpHを調
節し、次いでそのpHを持続するために１種以上の緩衝剤
で緩衝化することもできる。また、緩衝剤は、pH調節な
らびにそれを持続するのに十分な強度を有するものであ
ってもよい。
8〜13を有することが望まれる。塩基を使用してpHを調
節し、次いでそのpHを持続するために１種以上の緩衝剤
で緩衝化することもできる。また、緩衝剤は、pH調節な
らびにそれを持続するのに十分な強度を有するものであ
ってもよい。
例としては、水酸化アルカリ金属、アルカリ土類金属お
よびアンモニウム（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化カルシウムおよび水酸化アンモニウ
ム）、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウムおよびリン
酸カリウム）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン
酸および関連の生物学的緩衝剤が挙げられる。抽出溶液
中の緩衝剤量は、適切な緩衝能を付与するように選ばれ
る。場合により、緩衝剤混合物を使用してもよい。
よびアンモニウム（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化カルシウムおよび水酸化アンモニウ
ム）、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウムおよびリン
酸カリウム）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン
酸および関連の生物学的緩衝剤が挙げられる。抽出溶液
中の緩衝剤量は、適切な緩衝能を付与するように選ばれ
る。場合により、緩衝剤混合物を使用してもよい。
さらに、抽出組成物は、生菌体の溶解およびMOMP抗原の
抽出を促進する他の試薬１種以上を含めることができ
る。このような試薬の例としては、1,3−ジメルカプト
−２−プロパノール、2,3−ジメルカプト−１−プロパ
ノール、1,2−ジメルカプトエタン、ジチオスレイトー
ル、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノールおよ
びチオグリコールなどのチオールを含むスルフヒドリル
基含有還元剤が挙げられる。他の有用な還元剤には、グ
ルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、チ
オグリコール酸、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−
システインエチルエステルおよびＮ−アセチル−D,L−
イソシステインが包含される。これらの還元剤は、市販
先から一般に入手可能である。
抽出を促進する他の試薬１種以上を含めることができ
る。このような試薬の例としては、1,3−ジメルカプト
−２−プロパノール、2,3−ジメルカプト−１−プロパ
ノール、1,2−ジメルカプトエタン、ジチオスレイトー
ル、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノールおよ
びチオグリコールなどのチオールを含むスルフヒドリル
基含有還元剤が挙げられる。他の有用な還元剤には、グ
ルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、チ
オグリコール酸、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−
システインエチルエステルおよびＮ−アセチル−D,L−
イソシステインが包含される。これらの還元剤は、市販
先から一般に入手可能である。
場合により、好ましい添加剤以外に、エタノールアミ
ン、プロパノールアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミンおよびそれらの塩のようなアルコールア
ミン類を含ませてもよい。
ン、プロパノールアミン、ジエタノールアミン、トリエ
タノールアミンおよびそれらの塩のようなアルコールア
ミン類を含ませてもよい。
抽出は、場合により低いかまたはより高い温度が使用さ
れうるが、一般に室温（すなわち、18〜25℃）で行われ
る。より高い温度は不要であり、特定の被験体にとって
は好ましくないかも知れない。
れうるが、一般に室温（すなわち、18〜25℃）で行われ
る。より高い温度は不要であり、特定の被験体にとって
は好ましくないかも知れない。
必須ではないが、生菌体から抗原が抽出されたとき、次
の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞残屑、微小
粒子または他の不要物を除去することが望ましい。予備
濾過は、ある型のフィルターを備える適当な容器により
実施することができる。
の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞残屑、微小
粒子または他の不要物を除去することが望ましい。予備
濾過は、ある型のフィルターを備える適当な容器により
実施することができる。
抽出はまた、試験管、ビーカー、キュベットまたは当業
者に既知の他の装置などの適当な容器中で行うこともで
きる。特に有用な装置は、米国特許第4,746,614号明細
書に示されるものを含む当該技術分野で既知である。
者に既知の他の装置などの適当な容器中で行うこともで
きる。特に有用な装置は、米国特許第4,746,614号明細
書に示されるものを含む当該技術分野で既知である。
次に、濾過された被験体は、抽出された抗原の存在を測
定するためにいずれかの分析法にかけられる。これらの
方法には、特定の事例にのみ選ばれる可能性があり、好
ましくはないかも知れないが、培養法、カウンター免疫
電気泳動および血清試験が含まれる。
定するためにいずれかの分析法にかけられる。これらの
方法には、特定の事例にのみ選ばれる可能性があり、好
ましくはないかも知れないが、培養法、カウンター免疫
電気泳動および血清試験が含まれる。
好ましくは、抽出された抗原は１種以上の適当な抗体と
それを免疫的に反応させるイムノアッセイを使用して検
出される。得られた免疫複合体は、適当な放射線、比
色、蛍光または酵素標識試薬を使用して検出される。あ
る場合には、試薬は抗原に対する標識抗体であり、また
ある場合には、抗原と反応する未標識抗体に向けられる
標識抗−抗体である。このようなイムノアッセイは、一
般に、塗布されているかまたは塗布されていないある型
の固体支持体上での検出可能な免疫複合体の形成、それ
に続く適当な検出法を含む。別のアッセイは、免疫複合
体の少なくとも１種の反応体（例えば、抗体）が複合体
形成中に一緒に凝集するようなある型の標識または未標
識粒子に付着された場合に免疫複合体の凝集を伴う。
それを免疫的に反応させるイムノアッセイを使用して検
出される。得られた免疫複合体は、適当な放射線、比
色、蛍光または酵素標識試薬を使用して検出される。あ
る場合には、試薬は抗原に対する標識抗体であり、また
ある場合には、抗原と反応する未標識抗体に向けられる
標識抗−抗体である。このようなイムノアッセイは、一
般に、塗布されているかまたは塗布されていないある型
の固体支持体上での検出可能な免疫複合体の形成、それ
に続く適当な検出法を含む。別のアッセイは、免疫複合
体の少なくとも１種の反応体（例えば、抗体）が複合体
形成中に一緒に凝集するようなある型の標識または未標
識粒子に付着された場合に免疫複合体の凝集を伴う。
有用なアッセイの例としては、コンペティティブイムノ
アッセイまたはエンザイム・リンクト・イムノアブソー
ベント・アッセイ（通常、「ELISA」と称される）が挙
げられる。これらのアッセイは、米国特許第4,427,782
号明細書およびSchmeerらにより、J.Clin.Microbiol.,1
5（５）,830−834ページ（1982）に概述されている。
アッセイまたはエンザイム・リンクト・イムノアブソー
ベント・アッセイ（通常、「ELISA」と称される）が挙
げられる。これらのアッセイは、米国特許第4,427,782
号明細書およびSchmeerらにより、J.Clin.Microbiol.,1
5（５）,830−834ページ（1982）に概述されている。
好ましくは、抽出されたMOMP抗原は、それが結合できる
ポリマー固体支持体と接触される。利用可能な支持体材
料としては、ガラス、セルロース系またはポリマービー
ズ、フィルム、チューブ、ゲル、プレートおよび当該技
術分野で既知のものが挙げられる。好ましくは、支持体
材料はより詳細について後述するような微孔質膜であ
る。この膜は、「裸」、すなわち何等かの物質によって
も処理されていないかまたは塗布されていないもの（米
国特許第4,497,899号明細書に示されるような）である
ことができる。しかしながら、それはアッセイ性能を高
めうる物質（例えば、界面活性剤）で好ましくは処理ま
たは塗布される。
ポリマー固体支持体と接触される。利用可能な支持体材
料としては、ガラス、セルロース系またはポリマービー
ズ、フィルム、チューブ、ゲル、プレートおよび当該技
術分野で既知のものが挙げられる。好ましくは、支持体
材料はより詳細について後述するような微孔質膜であ
る。この膜は、「裸」、すなわち何等かの物質によって
も処理されていないかまたは塗布されていないもの（米
国特許第4,497,899号明細書に示されるような）である
ことができる。しかしながら、それはアッセイ性能を高
めうる物質（例えば、界面活性剤）で好ましくは処理ま
たは塗布される。
ある態様では、固体支持体は複数の正荷電基をその表面
に有する。これらの正荷電基は、支持体表面にポジティ
ブな電荷、すなわち広いpH範囲を通じてポジティブなゼ
ータ（Zeta）電位を生じさせる。ゼータ電位は、支持体
とそれに接触する流体との間の電位差として知られてい
る。支持体上に所定のゼータ電位を生じさせるすべての
正荷電化学残基が本発明の実施上利用可能である。
に有する。これらの正荷電基は、支持体表面にポジティ
ブな電荷、すなわち広いpH範囲を通じてポジティブなゼ
ータ（Zeta）電位を生じさせる。ゼータ電位は、支持体
とそれに接触する流体との間の電位差として知られてい
る。支持体上に所定のゼータ電位を生じさせるすべての
正荷電化学残基が本発明の実施上利用可能である。
例えば、この支持体は、抽出抗原とイオン的に結合し得
る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然ま
たは合成ポリマーから構築することができる。利用可能
なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエステ
ル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンイミ
ン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニルモ
ノマーから製造される付加ポリマーならびに当該技術分
野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カチオ
ン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニ
ウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム
塩、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウ
ム塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましいもの
である。さらなる詳細は、引用により本明細書の内容と
なる前述の出願を調査することにより得ることができ
る。
る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然ま
たは合成ポリマーから構築することができる。利用可能
なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエステ
ル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンイミ
ン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニルモ
ノマーから製造される付加ポリマーならびに当該技術分
野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カチオ
ン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニ
ウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム
塩、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウ
ム塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましいもの
である。さらなる詳細は、引用により本明細書の内容と
なる前述の出願を調査することにより得ることができ
る。
ある種の利用可能なポリマー固体支持体は、PosidyneTM
またはBiodyneTM−Ｂ膜のような既知の微孔質膜であ
る。これらの支持体は、細孔に第四級アンモニウム基を
有するポリエステルが塗布されたナイロン膜からなる。
他の利用可能な支持体には、界面活性剤が塗布されたポ
リマー膜が含まれる。
またはBiodyneTM−Ｂ膜のような既知の微孔質膜であ
る。これらの支持体は、細孔に第四級アンモニウム基を
有するポリエステルが塗布されたナイロン膜からなる。
他の利用可能な支持体には、界面活性剤が塗布されたポ
リマー膜が含まれる。
抗原が免疫反応前に固体支持体に結合される前述の態様
と対比して、本発明のアッセイは、抗原が固体支持体に
付着すると同時かまたはその前後で免疫複合体を形成す
ることによっても実施することができる。換言すれば、
溶液中で複合体が形成された後、固体支持体との接触に
よりそれにバインディングすることができる。
と対比して、本発明のアッセイは、抗原が固体支持体に
付着すると同時かまたはその前後で免疫複合体を形成す
ることによっても実施することができる。換言すれば、
溶液中で複合体が形成された後、固体支持体との接触に
よりそれにバインディングすることができる。
本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。利用可能な試験装置の構成は、当該技術
分野で既知である。特に有用な装置は、特開昭63−2235
63号公報（昭和63年９月19日公開）および特願昭63−23
4692号明細書（昭和63年９月18日出願）に記載されてい
る。
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。利用可能な試験装置の構成は、当該技術
分野で既知である。特に有用な装置は、特開昭63−2235
63号公報（昭和63年９月19日公開）および特願昭63−23
4692号明細書（昭和63年９月18日出願）に記載されてい
る。
前記荷電支持体と抗原の接触により、ほとんど瞬間的に
抗原は支持体に結合される。場合により、すべての未結
合抗原はいずれかの適当な洗浄液、好ましくはカチオン
界面活性剤を含む洗浄液で洗浄することによって支持体
から除去してもよい。
抗原は支持体に結合される。場合により、すべての未結
合抗原はいずれかの適当な洗浄液、好ましくはカチオン
界面活性剤を含む洗浄液で洗浄することによって支持体
から除去してもよい。
前記接触の10分以内、好ましくは１〜５分以内に結合抗
原は、クラミジア抗体と接触されることにより支持体上
で免疫複合体を形成する。流体と未結合物質は、同時に
素早く除去することができる。アッセイが使い捨て装置
を使用して実施される場合、その支持体は、非験体中の
流体および複合体化していない物質を通過させ、膜に抗
原が結合するような微孔質膜であってもよい。
原は、クラミジア抗体と接触されることにより支持体上
で免疫複合体を形成する。流体と未結合物質は、同時に
素早く除去することができる。アッセイが使い捨て装置
を使用して実施される場合、その支持体は、非験体中の
流体および複合体化していない物質を通過させ、膜に抗
原が結合するような微孔質膜であってもよい。
このアッセイで使用される抗体は、１種以上のクラミジ
ア種のMOMP抗原と特異的に免疫反応性を有する。それは
ポリクロナルまたはモノクロナルであってよい。ポリク
ロナルの場合、それは市販されているか、または検出さ
れるべき生菌体に共通の抗原を使用する既知法により各
種動物から調製することができる。単一抗体またはそれ
らの混合体が使用されうる。好ましくは、抗体は、市販
されているかまたは標準的なハイブリドーマ法を使用し
て調製されるモノクロナルである。利用可能な抗体調製
方法は、例えば米国特許第4,427,782号明細書（前記）
に記載されている。
ア種のMOMP抗原と特異的に免疫反応性を有する。それは
ポリクロナルまたはモノクロナルであってよい。ポリク
ロナルの場合、それは市販されているか、または検出さ
れるべき生菌体に共通の抗原を使用する既知法により各
種動物から調製することができる。単一抗体またはそれ
らの混合体が使用されうる。好ましくは、抗体は、市販
されているかまたは標準的なハイブリドーマ法を使用し
て調製されるモノクロナルである。利用可能な抗体調製
方法は、例えば米国特許第4,427,782号明細書（前記）
に記載されている。
一の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であり、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するさらなる化学的または特異的なバインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。有用な標識の例としては、放射性同位体、酵素、蛍
光化合物、化学発光化合物、リン光化合物、ビオチンま
たはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フェリチ
ン、磁性粒子、着色粒子および当業者に極めて明らかな
他の物質が挙げられる。放射性同位体または酵素が好ま
しい標識である。標識は、既知の方法を使用して抗体に
付着させることができる。標識が直接検出できない場合
には、検出できる反応または特異的バインディング生成
物を生ずる試薬または化合物がさらに必要である。例え
ば、標識がビオチンであるならば、それは酵素と接合さ
れたアビジンと反応して検出可能な種を提供することが
できる。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホス
ファターゼなどである場合には、基質および色素生成試
薬もまた必要である。アルカリホスファターゼおよびペ
ルオキシダーゼが特に有用な酵素標識である。
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であり、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するさらなる化学的または特異的なバインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。有用な標識の例としては、放射性同位体、酵素、蛍
光化合物、化学発光化合物、リン光化合物、ビオチンま
たはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フェリチ
ン、磁性粒子、着色粒子および当業者に極めて明らかな
他の物質が挙げられる。放射性同位体または酵素が好ま
しい標識である。標識は、既知の方法を使用して抗体に
付着させることができる。標識が直接検出できない場合
には、検出できる反応または特異的バインディング生成
物を生ずる試薬または化合物がさらに必要である。例え
ば、標識がビオチンであるならば、それは酵素と接合さ
れたアビジンと反応して検出可能な種を提供することが
できる。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホス
ファターゼなどである場合には、基質および色素生成試
薬もまた必要である。アルカリホスファターゼおよびペ
ルオキシダーゼが特に有用な酵素標識である。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例え
ば、有用な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾー
ルロイコ染料（米国特許第4,089,747号明細書に記載さ
れるような）またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素
の存在下で反応して色素を提供する他の化合物（すなわ
ち、ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素を
提供する化合物）のようなロイコ染料が含まれる。
り、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例え
ば、有用な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾー
ルロイコ染料（米国特許第4,089,747号明細書に記載さ
れるような）またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素
の存在下で反応して色素を提供する他の化合物（すなわ
ち、ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素を
提供する化合物）のようなロイコ染料が含まれる。
好ましい態様では、クラミジア抗体は標識されておら
ず、そして形成され支持体に結合している抗体−抗原複
合体の検出は、前記未標識（標識されていない）抗体に
特異性を有し、かつ適切に標識されている第二の抗体
（以下に記載する）を使用して行われる。
ず、そして形成され支持体に結合している抗体−抗原複
合体の検出は、前記未標識（標識されていない）抗体に
特異性を有し、かつ適切に標識されている第二の抗体
（以下に記載する）を使用して行われる。
クラミジア抗体（標識または未標識）は、支持体上の非
特異的相互作用を減少させる１種以上の蛋白質の存在下
で前記結合抗原と接触されうる。利用可能な蛋白質は周
知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎仔
血清およびブタガンマ（γ）グロブリンが挙げられる。
特に有用な阻止（blocking）組成物は、非免疫学的蛋白
質と両性界面活性剤を含んでなる。
特異的相互作用を減少させる１種以上の蛋白質の存在下
で前記結合抗原と接触されうる。利用可能な蛋白質は周
知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎仔
血清およびブタガンマ（γ）グロブリンが挙げられる。
特に有用な阻止（blocking）組成物は、非免疫学的蛋白
質と両性界面活性剤を含んでなる。
結合抗原が一度クラミジア抗体と接触してしまうと、支
持体上で結合免疫複合体が形成される。この複合体の形
成を促進するには、一般に、15〜30℃の温度で10分未満
前記抗体と抗原がインキュベーションされる。好ましく
は、インキュベーションは18〜25℃（すなわち）室温）
で１〜５分間行われる。この温和なインキュベーション
条件は、米国特許第4,497,899号明細書で裸の支持体に
対するクラミジア抗原の吸着のための要件として記載さ
れる37℃30分と際立った対照を示す。
持体上で結合免疫複合体が形成される。この複合体の形
成を促進するには、一般に、15〜30℃の温度で10分未満
前記抗体と抗原がインキュベーションされる。好ましく
は、インキュベーションは18〜25℃（すなわち）室温）
で１〜５分間行われる。この温和なインキュベーション
条件は、米国特許第4,497,899号明細書で裸の支持体に
対するクラミジア抗原の吸着のための要件として記載さ
れる37℃30分と際立った対照を示す。
インキュベーション後であって、前記抗体−抗原の接触
10分以内に、前記結合複合体は適当な洗浄液で１度以上
洗浄される。特に有用な洗浄液は、例との関連で以下に
記載される。
10分以内に、前記結合複合体は適当な洗浄液で１度以上
洗浄される。特に有用な洗浄液は、例との関連で以下に
記載される。
前述の態様で、クラミジア抗体が標識されている場合に
は、洗浄後のアッセイ手順は、直接的なその標識の検出
か、または適当な試薬添加後の間接的な検出となる。検
出は、結合複合体の洗浄後、比較的速やかに、すなわ
ち、一般的に10分以内、好ましくは１〜５分以内に行わ
れる。場合により、標識の検出は、試薬が許容するなら
ばインキュベーションにより促進してもよい。次に、標
準的な装置および方法を使用して標識が検出される。
は、洗浄後のアッセイ手順は、直接的なその標識の検出
か、または適当な試薬添加後の間接的な検出となる。検
出は、結合複合体の洗浄後、比較的速やかに、すなわ
ち、一般的に10分以内、好ましくは１〜５分以内に行わ
れる。場合により、標識の検出は、試薬が許容するなら
ばインキュベーションにより促進してもよい。次に、標
準的な装置および方法を使用して標識が検出される。
好ましい態様では、クラミジア抗体は標識されておら
ず、そして結合複合体の洗浄後にそれが、標識されてい
ない抗体に向けられた抗体と接触される。この第二の抗
体（すなわち、抗−抗体）は、前述した標識のいずれか
により適当に標識される。この抗体は、市販または既知
の方法を使用して調製されるモノクロナルまたはポリク
ロナルであることができる。
ず、そして結合複合体の洗浄後にそれが、標識されてい
ない抗体に向けられた抗体と接触される。この第二の抗
体（すなわち、抗−抗体）は、前述した標識のいずれか
により適当に標識される。この抗体は、市販または既知
の方法を使用して調製されるモノクロナルまたはポリク
ロナルであることができる。
この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、15〜30℃の温度で10分未満、好まし
くは18〜25℃で１〜５分間インキュベーションされる。
体−抗体複合体は、15〜30℃の温度で10分未満、好まし
くは18〜25℃で１〜５分間インキュベーションされる。
次に、適当な洗浄液を使用してさらに洗浄することによ
り結合標識複合体から複合体化していない物質を除去
し、次いで適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加
して検出可能な種を提供する。その後、この抗原−抗体
−標識抗体複合体は、標準的な放射線、比色、蛍光また
は他の検出法を使用して支持体上で検出される。
り結合標識複合体から複合体化していない物質を除去
し、次いで適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加
して検出可能な種を提供する。その後、この抗原−抗体
−標識抗体複合体は、標準的な放射線、比色、蛍光また
は他の検出法を使用して支持体上で検出される。
クラミジア生菌体の測定にとって好ましい方法は次の工
程を含んでなる： A.少なくともpH8を有しそして少なくとも0.1mg/mlの量
で存在するカチオン界面活性剤を含む抽出組成物でクラ
ミジア生菌体を含むことが予測される被験体からクラミ
ジア主要外層膜蛋白抗原を抽出する工程、 B.前記抽出された抗原を固体支持体と接触させてその支
持体に抗原を結合する工程、 C.工程Ｂの接触と同時または前後に、その抽出された抗
原を未標識クラミジア抗体と接触させて免疫複合体を形
成する工程、 D.支持体に結合した前記複合体から結合していない物質
を洗い流す工程、 E.前記結合した複合体を、未標識クラミジア抗体に向け
られる標識抗体と接触させて支持体に結合した標識され
た抗原−抗体−抗体複合体を形成する工程、ならびに F.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとして
前記標識された複合体の存在を測定する工程。
程を含んでなる： A.少なくともpH8を有しそして少なくとも0.1mg/mlの量
で存在するカチオン界面活性剤を含む抽出組成物でクラ
ミジア生菌体を含むことが予測される被験体からクラミ
ジア主要外層膜蛋白抗原を抽出する工程、 B.前記抽出された抗原を固体支持体と接触させてその支
持体に抗原を結合する工程、 C.工程Ｂの接触と同時または前後に、その抽出された抗
原を未標識クラミジア抗体と接触させて免疫複合体を形
成する工程、 D.支持体に結合した前記複合体から結合していない物質
を洗い流す工程、 E.前記結合した複合体を、未標識クラミジア抗体に向け
られる標識抗体と接触させて支持体に結合した標識され
た抗原−抗体−抗体複合体を形成する工程、ならびに F.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとして
前記標識された複合体の存在を測定する工程。
以下の例で本発明を具体的に示すが、本発明の範囲を限
定するものでない。
定するものでない。
なお、本明細書で特定の名称に「TM」が付されている場
合には、その名称が商品名または商標であることを意味
する。
合には、その名称が商品名または商標であることを意味
する。
これらの例を実施するに当たり、クラミジア主要外層膜
蛋白抗原に対するマウスモノクロナル抗体（抗MOMP）
は、標準的なハイブリドーマ法およびマウス細胞系を使
用して調製し、アシド0.01重量％含有リン酸緩衝溶液
（PBS）（pH7.4）に保存した。アッセイで使用される抗
体組成物は、阻止剤蛋白質としてカゼイン（0.5重量
％）およびLonzaineTMC両性界面活性剤（0.01重量％、L
onza,Inc.より入手可能）を含有するPBSに前記抗体試薬
（19μ）を添加して調製し（1:800希釈）、次に0.22
μｍのフィルターで濾過して使用液を得た。
蛋白抗原に対するマウスモノクロナル抗体（抗MOMP）
は、標準的なハイブリドーマ法およびマウス細胞系を使
用して調製し、アシド0.01重量％含有リン酸緩衝溶液
（PBS）（pH7.4）に保存した。アッセイで使用される抗
体組成物は、阻止剤蛋白質としてカゼイン（0.5重量
％）およびLonzaineTMC両性界面活性剤（0.01重量％、L
onza,Inc.より入手可能）を含有するPBSに前記抗体試薬
（19μ）を添加して調製し（1:800希釈）、次に0.22
μｍのフィルターで濾過して使用液を得た。
使用される標識ポリクロナル抗体は、BioRad Laborator
iesから得られたワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マ
ウスIgG抗体である。この接合体は、カゼイ0.5重量％お
よびLonzaineTMC両性界面活性剤0.01重量％含有PBSで1:
2000まで希釈し、次いで0.22μｍのフィルターで濾過し
て使用液を得た。
iesから得られたワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マ
ウスIgG抗体である。この接合体は、カゼイ0.5重量％お
よびLonzaineTMC両性界面活性剤0.01重量％含有PBSで1:
2000まで希釈し、次いで0.22μｍのフィルターで濾過し
て使用液を得た。
抗原抽出溶液は、水で以下の成分を溶解することによっ
て調製した：アジ化ナトリウム（15ミリモル濃度）、塩
化ナトリウム（0.15ミリモル濃度）、ジチオスレイトー
ル還元剤（7.5ミリモル濃度）、エタノールアミン（0.2
6ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（25ミリモ
ル濃度）および水酸化ナトリウム（0.1モル濃度、pH12.
5に調節）。この溶液15mlに、メタノール中10重量％のE
mcolTMCC−36−カチオン界面活性剤（ポリプロピル−ｔ
−アミンの第四級アンモニウムクロライド、Witco Chem
icalより入手可能）溶液375μを添加した。
て調製した：アジ化ナトリウム（15ミリモル濃度）、塩
化ナトリウム（0.15ミリモル濃度）、ジチオスレイトー
ル還元剤（7.5ミリモル濃度）、エタノールアミン（0.2
6ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（25ミリモ
ル濃度）および水酸化ナトリウム（0.1モル濃度、pH12.
5に調節）。この溶液15mlに、メタノール中10重量％のE
mcolTMCC−36−カチオン界面活性剤（ポリプロピル−ｔ
−アミンの第四級アンモニウムクロライド、Witco Chem
icalより入手可能）溶液375μを添加した。
例1:クラミジア生菌体からの主要外層膜蛋白の抽出 この例は、C.トラコマチス（C.trachomatis）主要外層
膜蛋白抗原の抽出に関する本発明の実施例である。
膜蛋白抗原の抽出に関する本発明の実施例である。
基本小体蛋白（ウシ血清アルブミン/PBS中81.5μ、最
終濃度1500pg）を、２種の抽出組成物（各1418.5μ）
（１つは、前述のようなEmcolTMCC−36カチオン界面活
性剤を含有しており、もう１つはその界面活性剤が欠失
した対照組成物）に添加し、次いで約５分間室温で混合
保持した。２つの対応する溶液は、抗原を含めないで調
製した。
終濃度1500pg）を、２種の抽出組成物（各1418.5μ）
（１つは、前述のようなEmcolTMCC−36カチオン界面活
性剤を含有しており、もう１つはその界面活性剤が欠失
した対照組成物）に添加し、次いで約５分間室温で混合
保持した。２つの対応する溶液は、抗原を含めないで調
製した。
過酸化水素溶液（８重量％、1500μ）を、各抽出溶液
に加えて内因性カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、および
ミエロペルオキシダーゼを除去した。得られた混合物
を、再び５分間室温で維持した。
に加えて内因性カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、および
ミエロペルオキシダーゼを除去した。得られた混合物
を、再び５分間室温で維持した。
各抽出溶液の一部（120μ）を使い捨て試験装置の個
別のウェルに加え、直ちに流体を排出させた。この装置
は、BiodyneTMB膜として市販されている表面上に第四級
アンモニウム基を有する５μｍの微孔質膜を含ませた。
この膜は使用前にZonylTMFSN（非イオン性フッ化界面活
性剤）で処理した。
別のウェルに加え、直ちに流体を排出させた。この装置
は、BiodyneTMB膜として市販されている表面上に第四級
アンモニウム基を有する５μｍの微孔質膜を含ませた。
この膜は使用前にZonylTMFSN（非イオン性フッ化界面活
性剤）で処理した。
抗MOMP溶液（前記）の一部（120μ）を、流体は排出
させながら前記試験装置の各ウェルに添加した。インキ
ュベーションを約５分間室温で行った。インキュベーシ
ョン後、得られた抗原−抗体複合体を、リン酸緩衝剤と
EmcolTMCC−９カチオン界面活性剤（0.75重量％、前記E
mcolTMCC−36と類似）の緩衝化溶液（pH7.2）で２度洗
浄した。
させながら前記試験装置の各ウェルに添加した。インキ
ュベーションを約５分間室温で行った。インキュベーシ
ョン後、得られた抗原−抗体複合体を、リン酸緩衝剤と
EmcolTMCC−９カチオン界面活性剤（0.75重量％、前記E
mcolTMCC−36と類似）の緩衝化溶液（pH7.2）で２度洗
浄した。
ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス抗体溶液（12
0μ）を、各ウェルに添加し、次いで接触のため膜を
介して流した。室温でのインキュベーションを再び５分
間行って膜にイオン結合した抗原−抗体−標識抗体複合
体を形成させた。
0μ）を、各ウェルに添加し、次いで接触のため膜を
介して流した。室温でのインキュベーションを再び５分
間行って膜にイオン結合した抗原−抗体−標識抗体複合
体を形成させた。
前記の洗浄液で２度洗浄した後、色素生成組成物を各試
験ウェルに添加した。この組成物は、過酸化水素（10ミ
リモル濃度）、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフ
ェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イミダ
ゾールロイコ染料（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロ
リドン）（１重量％）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ミリモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢
酸（10ミリモル濃度）を含む。
験ウェルに添加した。この組成物は、過酸化水素（10ミ
リモル濃度）、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフ
ェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イミダ
ゾールロイコ染料（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロ
リドン）（１重量％）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ミリモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢
酸（10ミリモル濃度）を含む。
約10分以内に、被験体由来のクラミジアMOMP抗原の存在
を示す赤色色素が試験ウェル中で観察された。透過濃度
を測定し、カチオン界面活性剤を含む抽出溶液とそれを
含まない抽出溶液との間の濃度差（ΔDT）として以下の
第Ｉ表に示した。データは、この方法がクラミジア生菌
体からMOMP抗原を抽出する工程で有効であることを示
す。
を示す赤色色素が試験ウェル中で観察された。透過濃度
を測定し、カチオン界面活性剤を含む抽出溶液とそれを
含まない抽出溶液との間の濃度差（ΔDT）として以下の
第Ｉ表に示した。データは、この方法がクラミジア生菌
体からMOMP抗原を抽出する工程で有効であることを示
す。
Claims (2)
- 【請求項１】A.クラミジア生菌体を含むことが予測され
る被験体を供給する工程、および B.前記被験体を、少なくともpH8を有しかつ、少なくと
も0.1mg/mlで存在する、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの
第四級アンモニウム塩又はその混合物であるカチオン界
面活性剤を含む抽出組成物と接触させて、検出を目的と
する前記生菌体由来のクラミジア主要外層膜蛋白抗原を
抽出する工程、を含んでなるクラミジア生菌体からの主
要外層膜蛋白抗原の抽出方法。 - 【請求項２】A.少なくともpH8を有しかつ、少なくとも
0.1mg/mlで存在する、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの第
四級アンモニウム塩又はその混合物であるカチオン界面
活性剤を含む抽出組成物を用い、クラミジア生菌体を含
むことが予測される被験体からクラミジア主要外層膜蛋
白抗原を抽出する工程、 B.抽出した抗原をクラミジア抗体と接触させて免疫複合
体を形成する工程、および C.被験体中のクラミジア生菌体の存在を示すものとして
前記複合体を測定する工程、を含んでなるクラミジア生
菌体の測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25592688A | 1988-10-07 | 1988-10-07 | |
| US255926 | 1988-10-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02211893A JPH02211893A (ja) | 1990-08-23 |
| JPH0722514B2 true JPH0722514B2 (ja) | 1995-03-15 |
Family
ID=22970422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1260370A Expired - Lifetime JPH0722514B2 (ja) | 1988-10-07 | 1989-10-06 | クラミジア主要外層膜蛋白抗原抽出へのカチオン界面活性剤の使用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0363106B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0722514B2 (ja) |
| DE (1) | DE68922888T2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5212062A (en) * | 1991-09-06 | 1993-05-18 | Kansas State University | Method and composition to direct Chlamydia psittaci or Chlamydia trachomatis infection |
| US5725863A (en) * | 1991-09-06 | 1998-03-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Polypeptides useful in prevention of chlamydia infection |
| IL107628A0 (en) * | 1992-11-18 | 1994-02-27 | Calypte Inc | Immunoassays for microorganisms associated with sexually transmitted diseases |
| AU697218B2 (en) * | 1995-03-28 | 1998-10-01 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Chlamydia pneumoniae antigens, method for production of the antigens, method and reagents for measurement of anti-chlamydia pneumoniae antibodies using the antigens |
| US6492501B1 (en) | 1996-12-16 | 2002-12-10 | Jean-Luc Popot | Water soluble acrylic membrane-polymer protein amphiphilic complex and application to diagnosis methods |
| WO2024056508A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Cube Biotech Gmbh | In vitro diagnostic method for detecting the presence of a target by using stabilized membrane proteins |
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| US4497899A (en) * | 1982-04-12 | 1985-02-05 | Abbott Laboratories | Immunoassay for Chlamydia trachomatis antigens |
| US4681761A (en) * | 1985-10-24 | 1987-07-21 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Major iron-regulated protein of Neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine |
| US4789526A (en) * | 1986-12-15 | 1988-12-06 | Pall Corporation | Vacuum diagnostic device |
| US4833087A (en) * | 1987-02-27 | 1989-05-23 | Eastman Kodak Company | Disposable container configured to produce uniform signal |
| SE460803B (sv) * | 1987-04-15 | 1989-11-20 | Pharmacia Ab | Saett att immunkemiskt bestaemma klamydia-infektion |
| US4746614A (en) * | 1987-09-18 | 1988-05-24 | Eastman Kodak Company | Extraction device |
| US4959303A (en) * | 1987-12-21 | 1990-09-25 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Assay for antigens by binding immune complexes to solid supports free of protein and non-ionic binders |
-
1989
- 1989-09-29 EP EP19890310005 patent/EP0363106B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-29 DE DE1989622888 patent/DE68922888T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-06 JP JP1260370A patent/JPH0722514B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0363106A2 (en) | 1990-04-11 |
| EP0363106B1 (en) | 1995-05-31 |
| JPH02211893A (ja) | 1990-08-23 |
| DE68922888D1 (de) | 1995-07-06 |
| DE68922888T2 (de) | 1995-11-30 |
| EP0363106A3 (en) | 1991-07-17 |
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