JPS63127161A - 化学阻止剤およびこれを使用するイムノアッセイ法並びにイムノアッセイ用キット - Google Patents
化学阻止剤およびこれを使用するイムノアッセイ法並びにイムノアッセイ用キットInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的標本内のターミナル デオキシヌクレ
オシドル トランスフェラーゼ(TdT) に対し特
異的な抗体の、蛍光イムノアッセイ (imnuno−
fluorent assay)またはイムノペルオキ
シダーゼアッセイ (immunoperoxidas
e assay) の操作中における非特異的な染色ま
たは結合を有意に阻止する新規な薬剤(以下「化学阻止
剤」と称する)に関するものである。更に特に、本発明
は、標識として試料の蛍光イムノ染色または免疫組織化
学(i+n+nunoh isむochemical
)染色後の流動細胞計測(flow cytometr
ic)および/または顕微鏡分析を夫々可能にしたTd
T特異的モノクロナール抗体を用いて分析する前に、ア
ッセイ操作の適当な段階で選択的に導入されるカゼイン
を使用するものである。
オシドル トランスフェラーゼ(TdT) に対し特
異的な抗体の、蛍光イムノアッセイ (imnuno−
fluorent assay)またはイムノペルオキ
シダーゼアッセイ (immunoperoxidas
e assay) の操作中における非特異的な染色ま
たは結合を有意に阻止する新規な薬剤(以下「化学阻止
剤」と称する)に関するものである。更に特に、本発明
は、標識として試料の蛍光イムノ染色または免疫組織化
学(i+n+nunoh isむochemical
)染色後の流動細胞計測(flow cytometr
ic)および/または顕微鏡分析を夫々可能にしたTd
T特異的モノクロナール抗体を用いて分析する前に、ア
ッセイ操作の適当な段階で選択的に導入されるカゼイン
を使用するものである。
TdTは、早期TおよびB IJンパ球の分化並びに他
の種に関係する特殊なりNAポリマラーゼである。Td
Tは極めて低い割合のリンパ芽球、特にを推動物の免疫
系の早期発生において見い出されるが、ヒトの白血病の
診断には高レベルのTdTが使用されてきた。TdTは
リンパ芽球の新生物、例えば急性リンパ芽球性白血病(
ALL) 、慢性顆粒球性白血病(CGL)およびリン
パ芽球性リンパ種(LL)に関する貴重な酵素マーカー
となる。従って、正常および白血病性の両捕乳動物にお
いてTdTに対し陽性であるリンパ球の度数測定方法を
開発する研究が行われてきた。米国特許第430718
9号明細書には、標識したデオキシヌクレオシド トリ
フオスフェートを用いてTdTの定置的測定を行う方法
が開示されているが、この方法ではかかるデオキシヌク
レオシド トリフオスフェートをTdTにより蛍光性ま
たは放射性のポリデオキシヌクレオチドに変換し、この
ポリデオキシヌクレオチドを生物試料に最初から存在す
るTdT量の反映として計量し得るものである。しかし
、この方法はTdTに対しモノクロナール抗体を使用す
るものではなかった。オーグル(Augl)等により発
表された研究論文においては(フェト・ブロク(Fed
、Proc、42:21471983) (要約)、ウ
シTdTに対するモノクロナール抗体の産生について報
告されているが、この抗体の詳細な結合の認識について
は述べられていない。色々な哺乳動物におけるTdTの
免疫化学の研究では、エフ、ジュー。ボルム(F、 J
、 Bollum)により報告されている如く (ジャ
ーナル オブバイオロジカル ケミストリー256 :
8768.1981)、この酵素のペプチドは、調製し
た抗血清で調べた場合、ウシ胸腺からの分解した酵素と
免疫学的に関係することが示された。
の種に関係する特殊なりNAポリマラーゼである。Td
Tは極めて低い割合のリンパ芽球、特にを推動物の免疫
系の早期発生において見い出されるが、ヒトの白血病の
診断には高レベルのTdTが使用されてきた。TdTは
リンパ芽球の新生物、例えば急性リンパ芽球性白血病(
ALL) 、慢性顆粒球性白血病(CGL)およびリン
パ芽球性リンパ種(LL)に関する貴重な酵素マーカー
となる。従って、正常および白血病性の両捕乳動物にお
いてTdTに対し陽性であるリンパ球の度数測定方法を
開発する研究が行われてきた。米国特許第430718
9号明細書には、標識したデオキシヌクレオシド トリ
フオスフェートを用いてTdTの定置的測定を行う方法
が開示されているが、この方法ではかかるデオキシヌク
レオシド トリフオスフェートをTdTにより蛍光性ま
たは放射性のポリデオキシヌクレオチドに変換し、この
ポリデオキシヌクレオチドを生物試料に最初から存在す
るTdT量の反映として計量し得るものである。しかし
、この方法はTdTに対しモノクロナール抗体を使用す
るものではなかった。オーグル(Augl)等により発
表された研究論文においては(フェト・ブロク(Fed
、Proc、42:21471983) (要約)、ウ
シTdTに対するモノクロナール抗体の産生について報
告されているが、この抗体の詳細な結合の認識について
は述べられていない。色々な哺乳動物におけるTdTの
免疫化学の研究では、エフ、ジュー。ボルム(F、 J
、 Bollum)により報告されている如く (ジャ
ーナル オブバイオロジカル ケミストリー256 :
8768.1981)、この酵素のペプチドは、調製し
た抗血清で調べた場合、ウシ胸腺からの分解した酵素と
免疫学的に関係することが示された。
エフ、ジュー。ボルム等により発表された研究論文では
(ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー25
9 +5848.1984) 、ヒトTdTに対する
モノクロナール抗体の産生について述べられている。こ
れらの抗ヒトモノクロナール抗体は、ヒトおよび仔ウシ
細胞のTdTに対するエピトープまたは決定基を認識す
る性能において広く様々である。
(ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー25
9 +5848.1984) 、ヒトTdTに対する
モノクロナール抗体の産生について述べられている。こ
れらの抗ヒトモノクロナール抗体は、ヒトおよび仔ウシ
細胞のTdTに対するエピトープまたは決定基を認識す
る性能において広く様々である。
クールター イムノロジー ディビジョン(CID)に
より、研究用のTdTモノクロナール抗体イムノペルオ
キシダーゼ アッセイ用キットが販売されている。この
アッセイは、急性化の研究における慢性骨髄性白血病(
CML)や急性リンパ芽球性白血病(ALL)を含むリ
ンパ芽球障害の研究を可能にする。供給されるTdTモ
ノクロナール抗体は、直接蛍光イムノ染色し、流動細胞
計測または蛍光顕微鏡により分析するために、標識、例
えばフルオレセイン イソチオシネ−) (FITC)
に結合させる。
より、研究用のTdTモノクロナール抗体イムノペルオ
キシダーゼ アッセイ用キットが販売されている。この
アッセイは、急性化の研究における慢性骨髄性白血病(
CML)や急性リンパ芽球性白血病(ALL)を含むリ
ンパ芽球障害の研究を可能にする。供給されるTdTモ
ノクロナール抗体は、直接蛍光イムノ染色し、流動細胞
計測または蛍光顕微鏡により分析するために、標識、例
えばフルオレセイン イソチオシネ−) (FITC)
に結合させる。
この結合されたTdTモノクロナール抗体は、正常およ
び悪性の造血組織および血液中のTdT陽性細胞の分析
および計量を可能にする。
び悪性の造血組織および血液中のTdT陽性細胞の分析
および計量を可能にする。
前記CIOのアッセイ用キットに使用するTdTモノク
ロナール抗体は、本発明者の一人であるアール・グラハ
ム・スミスにより開発された。
ロナール抗体は、本発明者の一人であるアール・グラハ
ム・スミスにより開発された。
このモノクロナール抗体はアール・グラハム・スミスに
より開発された数種のうちの一つであり、TdTの特殊
な抗原決定基またはエピトープに対して特異的である。
より開発された数種のうちの一つであり、TdTの特殊
な抗原決定基またはエピトープに対して特異的である。
これらモノクロナール抗体は、ヒト、マウス、ラット、
ウサギおよびウシの起源を含む哺乳類細胞の広範な種類
においてTdTを特異的に認識する。コンペティティブ
ディスプレイスメント アッセイ法によって決定され
る如く、3種の特別なる抗体はTdT上の同じエピトー
プと公差反応し、4番目の特別なるモノクロナール抗体
は別個のエピトープと反応する。これらのモノクロナー
ル抗体は、TdT陽性細胞を含むウサギ、マウスおよび
ラットの胸腺の抽出物と同様に、ヒトおよび仔牛のTd
Tは結合する。しかし、これら同種抗体はTdT陽性細
胞を含んでいないネズミの肺臓とは結合しない。TdT
に対するCIOのモノクロナール抗体に関するこれら研
究やその他の同様の研究でも、種の起源に無関係に、ま
た池の抗原に対して非特異的な結合をすることなく、か
かるTdTに対する特異性が示された。
ウサギおよびウシの起源を含む哺乳類細胞の広範な種類
においてTdTを特異的に認識する。コンペティティブ
ディスプレイスメント アッセイ法によって決定され
る如く、3種の特別なる抗体はTdT上の同じエピトー
プと公差反応し、4番目の特別なるモノクロナール抗体
は別個のエピトープと反応する。これらのモノクロナー
ル抗体は、TdT陽性細胞を含むウサギ、マウスおよび
ラットの胸腺の抽出物と同様に、ヒトおよび仔牛のTd
Tは結合する。しかし、これら同種抗体はTdT陽性細
胞を含んでいないネズミの肺臓とは結合しない。TdT
に対するCIOのモノクロナール抗体に関するこれら研
究やその他の同様の研究でも、種の起源に無関係に、ま
た池の抗原に対して非特異的な結合をすることなく、か
かるTdTに対する特異性が示された。
これらTdTモノクロナール抗体は、アール・グラハム
・スミスにより1985年11月26日に米国に出願さ
れた名称「モノクロナール アンチボディーズ ツー
アブロード レンジ オブ マムマリアン ターミナル
デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ」の米
国特許出願第802039号明細書に開示されている。
・スミスにより1985年11月26日に米国に出願さ
れた名称「モノクロナール アンチボディーズ ツー
アブロード レンジ オブ マムマリアン ターミナル
デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ」の米
国特許出願第802039号明細書に開示されている。
本発明者らは、ヒトの末梢血液内のTdT陰性細胞の細
胞質および核質がCIOのTdT特異的モノクロナール
抗体並びに市場で人手し得る他のTdTモノクロナール
抗体と非特異的に結合し、あるいはこれらにより染色さ
れることを見い出した。そこで、末梢血液試料内のTd
T陽性細胞の臨床的に適切な分析および計量法を開発す
るために、この非特異的結合現象の性質について調べた
。TdTが存在する場合の染色に関するアッセイプロト
コルを本発明のプロセスの一部として検討した。アッセ
イの操作には、結合形態にあるTdTモノクロナール抗
体が細胞の細胞質に浸透してTdTに対し細胞核を染色
し得るようにするために、被検査細胞を固定する工程が
含まれる。
胞質および核質がCIOのTdT特異的モノクロナール
抗体並びに市場で人手し得る他のTdTモノクロナール
抗体と非特異的に結合し、あるいはこれらにより染色さ
れることを見い出した。そこで、末梢血液試料内のTd
T陽性細胞の臨床的に適切な分析および計量法を開発す
るために、この非特異的結合現象の性質について調べた
。TdTが存在する場合の染色に関するアッセイプロト
コルを本発明のプロセスの一部として検討した。アッセ
イの操作には、結合形態にあるTdTモノクロナール抗
体が細胞の細胞質に浸透してTdTに対し細胞核を染色
し得るようにするために、被検査細胞を固定する工程が
含まれる。
従って本発明者らは、検出しようとする細胞核における
TdT分子を破壊することなく細胞膜にTdTに対する
抗体を導入するための大きな孔を開けるために使用する
ことのできるすべての既知固定液を分析した。また、あ
る文献の論評には、当業界の他の研究者が2工程または
間接的操作法を採用して前記と同様の非特異的結合現象
の実験を行ったことが示されている。これらによると、
かかる結合現象の性質は固定液、並びに染色法で使用し
た抗体の特異性には全く左右されなかった。例えば、第
1工程において、TdTの存在する固定細胞を染色する
ために、TdTに対して開発された第1番目の標識して
ない抗体を使用した。引き続く第2工程は、TdTに対
する抗体を開発するために使用した種の分子の免疫グロ
ブリンクラスに特異的な抗体を添加する工程を伴うもの
とした。従って、この間接的操作法においては、第1番
目の標識してない抗体がTdTに対するウサギ抗体であ
る場合には、蛍光染料を担持する発生剤(+jevel
opingreagent)はウサギ免疫グロブリンに
対するヤギ抗体となる。このため、TdTに対するウサ
ギの抗体は固定細胞の核内のTdTと結合し、次いでウ
サギ抗体に対するヤギ抗体がこれに結合する。ヤギ抗体
は蛍光染料を担持しているので、当該ウサギ抗体により
固定細胞内のTdTの染色を目で見ることができること
になる。しかし、この間接的な技術においては、ウサギ
免疫グロブリンに対するヤギ抗体をTdT陰性または陽
性細胞に供給した場合には、すべての細胞が明確に染色
されるという問題点があった。このことは、特異性はヤ
ギの抗ウサギ免疫グロブリンを用いた場合には細胞染色
に対し僅かしか関係しないかもしくは関係しないことを
意味するものである。この理由は、染色される細胞がヒ
トの細胞であり、かつ循環するウサギ抗体 (circ
ulating rabbit antibodies
) がヒト細胞内で見い出されることは期待すること
ができないからである。更には、循環するウサギ抗体が
患者の被分析試料内に見い出されることは期待すること
ができないからである。
TdT分子を破壊することなく細胞膜にTdTに対する
抗体を導入するための大きな孔を開けるために使用する
ことのできるすべての既知固定液を分析した。また、あ
る文献の論評には、当業界の他の研究者が2工程または
間接的操作法を採用して前記と同様の非特異的結合現象
の実験を行ったことが示されている。これらによると、
かかる結合現象の性質は固定液、並びに染色法で使用し
た抗体の特異性には全く左右されなかった。例えば、第
1工程において、TdTの存在する固定細胞を染色する
ために、TdTに対して開発された第1番目の標識して
ない抗体を使用した。引き続く第2工程は、TdTに対
する抗体を開発するために使用した種の分子の免疫グロ
ブリンクラスに特異的な抗体を添加する工程を伴うもの
とした。従って、この間接的操作法においては、第1番
目の標識してない抗体がTdTに対するウサギ抗体であ
る場合には、蛍光染料を担持する発生剤(+jevel
opingreagent)はウサギ免疫グロブリンに
対するヤギ抗体となる。このため、TdTに対するウサ
ギの抗体は固定細胞の核内のTdTと結合し、次いでウ
サギ抗体に対するヤギ抗体がこれに結合する。ヤギ抗体
は蛍光染料を担持しているので、当該ウサギ抗体により
固定細胞内のTdTの染色を目で見ることができること
になる。しかし、この間接的な技術においては、ウサギ
免疫グロブリンに対するヤギ抗体をTdT陰性または陽
性細胞に供給した場合には、すべての細胞が明確に染色
されるという問題点があった。このことは、特異性はヤ
ギの抗ウサギ免疫グロブリンを用いた場合には細胞染色
に対し僅かしか関係しないかもしくは関係しないことを
意味するものである。この理由は、染色される細胞がヒ
トの細胞であり、かつ循環するウサギ抗体 (circ
ulating rabbit antibodies
) がヒト細胞内で見い出されることは期待すること
ができないからである。更には、循環するウサギ抗体が
患者の被分析試料内に見い出されることは期待すること
ができないからである。
染料を担持するヤギ抗体の非特異的結合を減少させるの
に不完全ではあるが主な助けとなるのは、既知の特異性
を有さずに染料担持ヤギ−抗−ウサギ抗血清の非特異的
結合を阻止するIgGで、固定されたTWIT抗体染色
試料を満たす(flood) ことてあった。
に不完全ではあるが主な助けとなるのは、既知の特異性
を有さずに染料担持ヤギ−抗−ウサギ抗血清の非特異的
結合を阻止するIgGで、固定されたTWIT抗体染色
試料を満たす(flood) ことてあった。
これらの観察から導き出される結論は、以下に述べるよ
うな直接染色法を用いる固定細胞内のTdTに対する特
殊アッセイ法を開発するためには、TdTに対し特異的
なモノクロナール抗体の非特異的結合に対しては化学阻
止剤が必要であるということであった。このため本発明
者らは、この非特異的結合の機構を明確にし、TdT分
析の背景となる染色について説明する。先ず、流動細胞
計測器は、適当なる臨床上の結論を導き出すことのでき
る分析結果を得るに十分な正確さで、細胞質と核との間
のTdT染色を区別することはできないという点に注目
した。
うな直接染色法を用いる固定細胞内のTdTに対する特
殊アッセイ法を開発するためには、TdTに対し特異的
なモノクロナール抗体の非特異的結合に対しては化学阻
止剤が必要であるということであった。このため本発明
者らは、この非特異的結合の機構を明確にし、TdT分
析の背景となる染色について説明する。先ず、流動細胞
計測器は、適当なる臨床上の結論を導き出すことのでき
る分析結果を得るに十分な正確さで、細胞質と核との間
のTdT染色を区別することはできないという点に注目
した。
そこで本発明者らは、結合すなわち標識したモノクロナ
ール抗体を用いて、被検査細胞の細胞質内のTdTモノ
クロナール抗体のかかる非特異的結合を実質的に阻止す
る特殊な化学阻止剤を開発した。この化学阻止剤はカゼ
インと称するリンタンパク質であり、特にミルクにおい
て見い出される。
ール抗体を用いて、被検査細胞の細胞質内のTdTモノ
クロナール抗体のかかる非特異的結合を実質的に阻止す
る特殊な化学阻止剤を開発した。この化学阻止剤はカゼ
インと称するリンタンパク質であり、特にミルクにおい
て見い出される。
抗TdTモノクロナール抗体の非特異的結合を有効に阻
止するカゼインは種々の給源から誘導することができる
。更に、粗脱脂ミルク製品もカゼインを含む化学阻止剤
として効果的であることが見い出された。更にまた、非
結合形態のモノクロナール抗体を使用した場合でも、こ
の化学阻止剤はイムノアッセイに有効である。
止するカゼインは種々の給源から誘導することができる
。更に、粗脱脂ミルク製品もカゼインを含む化学阻止剤
として効果的であることが見い出された。更にまた、非
結合形態のモノクロナール抗体を使用した場合でも、こ
の化学阻止剤はイムノアッセイに有効である。
従って、TdTに対して特異的な抗体の、蛍光イムノま
たはイムノペルオキシダーゼ試験操作中における非特異
的染色または結合を有意に阻止する化学阻止剤は、カゼ
インタンパク質を有効成分とするものである。カゼイン
クンバク質は、脱脂ミルクの使用により若しくは以下に
規定するような数種の他のカゼイン源からの誘導として
供給することができる。精製カゼイン、工業銘柄カゼイ
ン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−カゼイン、カゼ
インのナトリウム塩、N、N−ジメチル化カゼイン、ジ
フォスフォリル化カゼイン、ヒトミルク、ウマカゼイン
、ヤギミルクカゼイン、イヌミルクカゼイン、およびウ
シ並びにウマミルクカゼインは、TdT 、F[TC染
色の若干のまたはすべての非特異的結合を阻止すること
ができることが確かめられた。また、カゼインの酵素加
水分解生成物は、阻止効果が低下することが確かめられ
た。
たはイムノペルオキシダーゼ試験操作中における非特異
的染色または結合を有意に阻止する化学阻止剤は、カゼ
インタンパク質を有効成分とするものである。カゼイン
クンバク質は、脱脂ミルクの使用により若しくは以下に
規定するような数種の他のカゼイン源からの誘導として
供給することができる。精製カゼイン、工業銘柄カゼイ
ン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−カゼイン、カゼ
インのナトリウム塩、N、N−ジメチル化カゼイン、ジ
フォスフォリル化カゼイン、ヒトミルク、ウマカゼイン
、ヤギミルクカゼイン、イヌミルクカゼイン、およびウ
シ並びにウマミルクカゼインは、TdT 、F[TC染
色の若干のまたはすべての非特異的結合を阻止すること
ができることが確かめられた。また、カゼインの酵素加
水分解生成物は、阻止効果が低下することが確かめられ
た。
カゼインの酸加水分解生成物は、TdTの非特異的結合
または染色を阻止するのには不十分であることが確かめ
られた。
または染色を阻止するのには不十分であることが確かめ
られた。
カゼインのナトリウム塩を選んでTdTイムノアッセイ
用キットに化学阻止剤として使用した。本発明に使用す
るこの化学阻止剤は、本発明の実施に際しTdTモノク
ロナール抗体の少なくとも90%の非特異的結合を阻止
することが確かめられた。
用キットに化学阻止剤として使用した。本発明に使用す
るこの化学阻止剤は、本発明の実施に際しTdTモノク
ロナール抗体の少なくとも90%の非特異的結合を阻止
することが確かめられた。
この塩の形態は殆ど好都合にかつ所望のpH範囲内に溶
解する。従って、TdTに対するモノクロナール抗体の
最も効果的な結合または染色がアッセイ操作において実
現されることになる。
解する。従って、TdTに対するモノクロナール抗体の
最も効果的な結合または染色がアッセイ操作において実
現されることになる。
脱脂蒸発乾燥粉末、すなわち脱脂ミルクを使用して、物
理的フィルタ上のタンパク質の非特異的取り込みあるい
は結合を阻止することは既知の・ことである。
理的フィルタ上のタンパク質の非特異的取り込みあるい
は結合を阻止することは既知の・ことである。
しかし、本発明らが知っている限り、カゼインはアッセ
イ操作、すなわち蛍光イノムアッセイにおいて結合また
は非結合形態のモノクロナール抗体の非特異的結合を阻
止するために使用されたことはなかった。
イ操作、すなわち蛍光イノムアッセイにおいて結合また
は非結合形態のモノクロナール抗体の非特異的結合を阻
止するために使用されたことはなかった。
本発明の最初の工程は、前記米国特許出願第80203
9号明細書に開示されている、TdT 1およびTdT
4を確認するTdTモノクロナール抗体に、フルオレ
セインイソチオシアネート(FITc)全結合すせるこ
とに関するものである。蒸発処理したウシミルク製品を
、従来の細胞調製操作が終了した後に使用した。懸濁さ
せた被検査単核細胞を調製操作工程に従い、蒸発処理し
たウシミルクで処理し、洗浄し、次いでクールターコー
ポレーションの流動細胞計測器IEPIC3(登録商標
)で分析した。細胞質におけるTdT −FITCの非
特異的結合の顕著な低減は、かかる阻止剤を使用するこ
となしに予め行ったアッセイと比較して明らかに際立っ
ていた。
9号明細書に開示されている、TdT 1およびTdT
4を確認するTdTモノクロナール抗体に、フルオレ
セインイソチオシアネート(FITc)全結合すせるこ
とに関するものである。蒸発処理したウシミルク製品を
、従来の細胞調製操作が終了した後に使用した。懸濁さ
せた被検査単核細胞を調製操作工程に従い、蒸発処理し
たウシミルクで処理し、洗浄し、次いでクールターコー
ポレーションの流動細胞計測器IEPIC3(登録商標
)で分析した。細胞質におけるTdT −FITCの非
特異的結合の顕著な低減は、かかる阻止剤を使用するこ
となしに予め行ったアッセイと比較して明らかに際立っ
ていた。
抗−TdTモノクロナール抗体の非特異的結合のかかる
認識可能なまでの阻止を実現するにあたり、この現象の
活性成分はカゼイン、すなわちリンクバク質であること
が確かめられた。カゼインを複数の給源から単離して得
て化学阻止剤としての適否試験を行った。
認識可能なまでの阻止を実現するにあたり、この現象の
活性成分はカゼイン、すなわちリンクバク質であること
が確かめられた。カゼインを複数の給源から単離して得
て化学阻止剤としての適否試験を行った。
以下に示す手順に従い繰り返し試験を行った。
1、100μ!(マイクロリットル)の全血を適当な容
積の試験管に入れ、1ml (ミリリットル)のリン酸
塩緩衝生理的食塩水(PBS)で希釈し、混合した。
積の試験管に入れ、1ml (ミリリットル)のリン酸
塩緩衝生理的食塩水(PBS)で希釈し、混合した。
2、 PBSて10倍に希釈したLYSE II”と称
する分離剤50μβを添加し、混合した。尚、LYSE
n”はこの分離剤製品に関する、フロリダ州バイアレ
ア所在のCIDの登録商標である。
する分離剤50μβを添加し、混合した。尚、LYSE
n”はこの分離剤製品に関する、フロリダ州バイアレ
ア所在のCIDの登録商標である。
3.10秒経過後、100μβの固定液、例えば47十
%のホルムアルデヒドを添加した。
%のホルムアルデヒドを添加した。
4、 次いで試験管内の混合物を4,5mlのPBsで
3回洗浄し、約3分回400倍の重力で遠心分離した。
3回洗浄し、約3分回400倍の重力で遠心分離した。
5、 抗TdT −FITC結合モノクロナール抗体溶
液50μβおよび200μβの分量の試験下、本発明の
化学阻止剤を添加し、約5分間培養させた。
液50μβおよび200μβの分量の試験下、本発明の
化学阻止剤を添加し、約5分間培養させた。
66 次いて4.5mnのPBSて洗浄し、1分間4
00倍の重力で遠心分離した。
00倍の重力で遠心分離した。
7、 PBSで10倍に希釈した固定液の1.0mβを
添加して再懸濁を生ぜしめ、EPIC3(登録商標)流
動細胞計測器で分析を行った。
添加して再懸濁を生ぜしめ、EPIC3(登録商標)流
動細胞計測器で分析を行った。
この操作において試験したカゼインは、精製カゼイン、
工業銘柄カゼイン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−
カゼイン、カゼインのナトリウム塩、N、N−ジメチル
化カゼイン、ジフォスフォリル化カゼイン、ヒト、ヤギ
、イヌおよびウシまたはウマのミルクカゼインであり、
これらはTdT−FITCの非特異的染色または結合の
殆どまたはすべてを阻止することが確かめられた。カゼ
インの酵素加水分解生成物は化学阻止剤として唯一部分
的に有効であることが確かめられた。カゼインの酸加水
分解生成物も試験したところ、かかる非特異的染色の阻
止に対し不十分であることが確か必られた。
工業銘柄カゼイン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−
カゼイン、カゼインのナトリウム塩、N、N−ジメチル
化カゼイン、ジフォスフォリル化カゼイン、ヒト、ヤギ
、イヌおよびウシまたはウマのミルクカゼインであり、
これらはTdT−FITCの非特異的染色または結合の
殆どまたはすべてを阻止することが確かめられた。カゼ
インの酵素加水分解生成物は化学阻止剤として唯一部分
的に有効であることが確かめられた。カゼインの酸加水
分解生成物も試験したところ、かかる非特異的染色の阻
止に対し不十分であることが確か必られた。
PBS中に夫々混合したヒトミルク、ヤギミルク:イヌ
ミルクおよび脱脂乾燥ウシミルクも試験したところ、こ
れらもTdTモノクロナール抗体の非特異的背景の結合
を阻止し得ることが確かめられた。
ミルクおよび脱脂乾燥ウシミルクも試験したところ、こ
れらもTdTモノクロナール抗体の非特異的背景の結合
を阻止し得ることが確かめられた。
本発明者らは、カゼインのナトリウム塩が最も効果的な
化学阻止剤であり、TdTモノクロナール抗体の非特異
的結合の少なくとも90%を阻止することを確かめた。
化学阻止剤であり、TdTモノクロナール抗体の非特異
的結合の少なくとも90%を阻止することを確かめた。
使用配合剤は、はぼ中和pH近傍でカゼインのナトリウ
ム塩が混合されるPBSlmlあたり3mg含めた。P
BS配合剤には0.01モルのリン酸カリウムと0.1
5モルの塩化ナトリウムを含めた。静菌剤、例えばアジ
化ナトリウムを使用したが、かかる静菌剤は必ずしも必
要ではない。
ム塩が混合されるPBSlmlあたり3mg含めた。P
BS配合剤には0.01モルのリン酸カリウムと0.1
5モルの塩化ナトリウムを含めた。静菌剤、例えばアジ
化ナトリウムを使用したが、かかる静菌剤は必ずしも必
要ではない。
またPBSを使用したが、その機能は必要ではなかった
。
。
上述の如く、本発明の一例の、蛍光発光またはペルオキ
シダーゼによる組織の免疫組織化学的染色に関し化学阻
止剤を使用することな(、フルオレセインインチオシア
ネート (FITC) に結合させたTdTモノクロ
ナール抗体を使用するキット製品は、クールターコーポ
レーションより販売されている。このFITCに結合さ
せたTdTモノクロナール抗体の311 製に関する技
術は本発明とは関係ない事項である。同随に、流動細胞
計測分析用の試゛科調製に関する固定、染色および洗浄
の操作は当業界において既に実施されているが、前記化
学阻止剤は未だ流動細胞計測分析のための染色操作には
導入されたことはない。
シダーゼによる組織の免疫組織化学的染色に関し化学阻
止剤を使用することな(、フルオレセインインチオシア
ネート (FITC) に結合させたTdTモノクロ
ナール抗体を使用するキット製品は、クールターコーポ
レーションより販売されている。このFITCに結合さ
せたTdTモノクロナール抗体の311 製に関する技
術は本発明とは関係ない事項である。同随に、流動細胞
計測分析用の試゛科調製に関する固定、染色および洗浄
の操作は当業界において既に実施されているが、前記化
学阻止剤は未だ流動細胞計測分析のための染色操作には
導入されたことはない。
固定単核細胞試料の調製に関し推奨される染色操作は次
の通りである。
の通りである。
1、 固定した細胞試料を化学阻止剤の配合物中に、細
胞106個当たり阻止剤50μβの割合で9ffiさせ
る。
胞106個当たり阻止剤50μβの割合で9ffiさせ
る。
2、 化学阻止剤を、TdTモノクロナール抗体の非特
異的結合を低減させるに効果的な室温で30分間加水分
解する。
異的結合を低減させるに効果的な室温で30分間加水分
解する。
3、 12X75 mm (ミリメートル)のシリコ
ーン処理試験管当たり106個の固定細胞を添加する。
ーン処理試験管当たり106個の固定細胞を添加する。
4、 各試験管につきTdT−FITCを等量のPBA
で希釈した溶液200μβを調製し、よく混合する。
で希釈した溶液200μβを調製し、よく混合する。
5、200μβの混合物を各試験管に添加し、混合する
。
。
6、 蓋をして振Ω板上で1時間室温にて培饗する。
次いで、上述のTdTモノクロナール抗体キット製品に
おいて知られている洗浄操作を行うことが好ましい。し
かる後、流動細胞計測器により試料の分析を行う。この
分析操作は従来通りである。
おいて知られている洗浄操作を行うことが好ましい。し
かる後、流動細胞計測器により試料の分析を行う。この
分析操作は従来通りである。
顕微鏡蛍光イムノアッセイを行う場合には、単核細胞を
PBS O,5ml当たり細胞2.5X105個の希釈
度で、約140倍の重力にて遠心分離(サイトスピン)
(Cytospin)する。試料を塗布したスライ
ドグラスを30分間空気乾燥し、次いで15分間メタノ
ール中で固定する。しかる後、かかるスライドガラスを
15分間空気乾燥し、3分間PBSで洗浄する。次いで
、このスライドガラスを本発明の化学阻止剤を用いて1
5分間培養処理に供する。過剰の阻止剤は軽くたたいて
除去し、172倍希釈度にて45分間TdT主要物(T
dT primary )に浸漬(f looding
)する。次いで水性固定媒体(aqueous mou
ntingmedium)に固定しながら10分間PB
Sで洗浄する。
PBS O,5ml当たり細胞2.5X105個の希釈
度で、約140倍の重力にて遠心分離(サイトスピン)
(Cytospin)する。試料を塗布したスライ
ドグラスを30分間空気乾燥し、次いで15分間メタノ
ール中で固定する。しかる後、かかるスライドガラスを
15分間空気乾燥し、3分間PBSで洗浄する。次いで
、このスライドガラスを本発明の化学阻止剤を用いて1
5分間培養処理に供する。過剰の阻止剤は軽くたたいて
除去し、172倍希釈度にて45分間TdT主要物(T
dT primary )に浸漬(f looding
)する。次いで水性固定媒体(aqueous mou
ntingmedium)に固定しながら10分間PB
Sで洗浄する。
しかる後、従来法で分析を行う。
流動細胞計測および顕微鏡蛍光イムノアッセイ法の操作
は、使用装置により変動し得ることは理解され得るとこ
ろである。ここでは前記クールターコーポレーションの
製品で実施する操作法と関係する。ただ、これら操作法
は、クールターコーポレーションの製品によるよりもむ
しろ給源に起因する装置により変動し得るものである。
は、使用装置により変動し得ることは理解され得るとこ
ろである。ここでは前記クールターコーポレーションの
製品で実施する操作法と関係する。ただ、これら操作法
は、クールターコーポレーションの製品によるよりもむ
しろ給源に起因する装置により変動し得るものである。
しかし、カゼインタンパク質を含む本発明の化学阻止剤
の使用により誘導される利点は、かかる直接染色型の蛍
光イムノアッセイにおいて尚一層達成されることになる
。
の使用により誘導される利点は、かかる直接染色型の蛍
光イムノアッセイにおいて尚一層達成されることになる
。
尚、当業者には、本発明の化学阻止剤の配合組成を本発
明の範囲から逸脱することなく変更することができるの
は勿論のことである。更に、結合形態のモノクロナール
抗体を使用する場合には、適当なるディテクタ、例えば
染料、酵素または他のディテクタ基の分子を使用するこ
とができる。
明の範囲から逸脱することなく変更することができるの
は勿論のことである。更に、結合形態のモノクロナール
抗体を使用する場合には、適当なるディテクタ、例えば
染料、酵素または他のディテクタ基の分子を使用するこ
とができる。
また本発明は、非結合形態のモノクロナール抗体をアッ
セイに使用する場合にも有効である。
セイに使用する場合にも有効である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、少なくとも単核細胞試料中でモノクロナール抗体を
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
(TdT)酵素と結合させるかまたはモノクロナール抗
体によりTdT酵素を染色するイムノアッセイ操作法に
使用するための化学薬剤において、 該化学薬剤がアッセイ中における細胞の細 胞質内のモノクロナール抗体の非特異的な結合を有意に
阻止する機能を有するカゼインタンパク質であることを
特徴とする化学阻止剤。 2、モノクロナール抗体が結合形態である特許請求の範
囲第1項記載の化学阻止剤。 3、モノクロナール抗体が染料、酵素、およびイムノア
ッセイの確定的分析に適する他のディテクタから成る群
から選ばれたディテクタ基の一つと結合している特許請
求の範囲第2項記載の化学阻止剤。 4、前記カゼインタンパク質がミルクから誘導された特
許請求の範囲第1項記載の化学阻止剤。 5、前記カゼインタンパク質がカゼインのナトリウム塩
を含む特許請求の範囲第1項記載の化学阻止剤。 6、前記カゼインタンパク質が脱脂ミルク、ヒトミルク
カゼイン、ヤギミルクカゼイン、イヌミルクカゼインお
よびウシ並びにウマミルクカゼインから成る群から選定
された特許請求の範囲第1項記載の化学阻止剤。 7、前記カゼインタンパク質が精製カゼイン、工業銘柄
カゼイン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−カゼイン
、カゼインのナトリウム塩、N,N−ジメチル化カゼイ
ンおよびジフォスフォリル化カゼインから成る群から選
ばれた特許請求の範囲第1項記載の化学阻止剤。 8、前記カゼインタンパク質がカゼインタンの酵素加水
分解生成物を含む特許請求の範囲第1項記載の化学阻止
剤。 9、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ(TdT)に対し特異的なモノクロナール抗体が被
試験細胞試料の核において結合するTdTに関するイム
ノアッセイにおいて、細胞試料の確定的分析を行う前の
アッセイ操作中にカゼインタンパク質形態の化学薬剤を
導入して、細胞の細胞質内のTdTモノクロナール抗体
の非特異的結合を有意に阻止することを特徴とするTd
Tに関するイムノアッセイ法。 10、前記モノクロナール抗体が結合された形態である
特許請求の範囲第9項記載のイムノアッセイ法。 11、モノクロナール抗体を染料、酵素および他の適当
なる標識またはマーカーから成る群から選ばれたディテ
クタと結合させる特許請求の範囲第10項記載のイムノ
アッセイ法。 12、前記カゼインタンパク質がカゼインのナトリウム
塩である特許請求の範囲第9項記載のイムノアッセイ法
。 13、前記カゼインタンパク質をリン酸塩緩衝生理的食
塩水(PBS)中にてほぼ中和pHで混合するカゼイン
のナトリウム塩である特許請求の範囲第9項記載のイム
ノアッセイ法。 14、前記カゼインタンパク質をアッセイの確定的分析
を行う前のアッセイ操作中に導入する特許請求の範囲第
9項記載のイムノアッセイ法。 15、前記カゼインタンパク質をミルクから誘導する特
許請求の範囲第9項記載のイムノアッセイ法。 16、前記カゼインタンパク質を脱脂、ヒト、ヤギ、イ
ヌ、ウマおよびウシのミルクから成る群のミルク源から
選ぶ特許請求の範囲第9項記載のイムノアッセイ法。 17、前記カゼインタンパク質を精製カゼイン、工業銘
柄カゼイン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−カゼイ
ン、N,N−ジメチル化カゼイン、ジフォスフォリル化
カゼインおよびカゼインの酵素加水分解生成物から成る
群から選ぶ特許請求の範囲第9項記載のイムノアッセイ
法。 18、TdT酵素に対して特異的なモノクロナール抗体
と細胞用固定液とを含む、生物細胞の核においてTdT
酵素を検出するイムノアッセイ用キットにおいて、細胞
の細胞質におけるモノクロナール抗体の非特異的結合ま
たは染色を阻止するためのカゼインタンパク質形態の化
学薬剤を特徴とするイムノアッセイ用キット。 19、前記モノクロナール抗体がディテクタマーカーに
結合されている特許請求の範囲第18項記載のイムノア
ッセイ用キット。 20、前記ディテクタマーカーが染料から成る特許請求
の範囲第19項記載のイムノアッセイ用キット。 21、前記ディテクタマーカーが酵素から成る特許請求
の範囲第19項記載のイムノアッセイ用キット。 22、前記カゼインタンパク質がミルクから誘導された
特許請求の範囲第18項記載のイムノアッセイ用キット
。 23、前記カゼインタンパク質がカゼインのナトリウム
塩である特許請求の範囲第18項記載のイムノアッセイ
用キット。 24、前記カゼインタンパク質が低脂肪、ヒト、ヤギ、
イヌ、ウマおよびウシのミルクから成る群から選ばれた
ミルクから誘導された特許請求の範囲第18項記載のイ
ムノアッセイ用キット。 25、前記カゼインタンパク質が精製カゼイン、工業銘
柄カゼイン、α−カゼイン、β−カゼイン、K−カゼイ
ン、N,N−ジメチル化カゼイン、ジフォスフォリル化
カゼインおよび酵素加水分解カゼインから成る群から選
ばれた特許請求の範囲第18項記載のイムノアッセイ用
キット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US907003 | 1986-09-15 | ||
US06/907,003 US4818686A (en) | 1986-09-15 | 1986-09-15 | Chemical blocking agent against non-specific binding or staining of an antibody specific for terminal deoxynucleotidyl transferase in biological specimens during immunoassay |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63127161A true JPS63127161A (ja) | 1988-05-31 |
Family
ID=25423386
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62230883A Pending JPS63127161A (ja) | 1986-09-15 | 1987-09-14 | 化学阻止剤およびこれを使用するイムノアッセイ法並びにイムノアッセイ用キット |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4818686A (ja) |
EP (1) | EP0260903A3 (ja) |
JP (1) | JPS63127161A (ja) |
CA (1) | CA1305920C (ja) |
IL (1) | IL83885A0 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0219766A (ja) * | 1988-07-08 | 1990-01-23 | Teijin Ltd | 免疫測定方法及びそれに用いる試薬キット |
JPH0236353A (ja) * | 1988-07-26 | 1990-02-06 | Teijin Ltd | 免疫測定方法 |
WO1991006857A1 (fr) * | 1989-11-02 | 1991-05-16 | Teijin Limited | Procede d'analyse immunologique de la thrombomoduline humaine, et reactif et kit utilises a cet effet |
JP2523171B2 (ja) * | 1987-08-12 | 1996-08-07 | 帝人株式会社 | 免疫測定方法及びそれに用いる試薬キット |
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-
1986
- 1986-09-15 US US06/907,003 patent/US4818686A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-09-11 CA CA000546443A patent/CA1305920C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-14 EP EP87308085A patent/EP0260903A3/en not_active Ceased
- 1987-09-14 IL IL83885A patent/IL83885A0/xx unknown
- 1987-09-14 JP JP62230883A patent/JPS63127161A/ja active Pending
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---|---|
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EP0260903A3 (en) | 1989-02-15 |
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