JPS61126100A - 抗ＴｄＴモノクロ−ナル抗体及びその製造法 - Google Patents
抗ＴｄＴモノクロ−ナル抗体及びその製造法Info
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- JPS61126100A JPS61126100A JP59246194A JP24619484A JPS61126100A JP S61126100 A JPS61126100 A JP S61126100A JP 59246194 A JP59246194 A JP 59246194A JP 24619484 A JP24619484 A JP 24619484A JP S61126100 A JPS61126100 A JP S61126100A
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- monoclonal antibody
- tdt
- antibody
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗ターミナルデオキシヌクレオチジル゛トラン
スフェラーゼモノクローナル抗体および該゛モノクロー
ナル抗体の利用方法ならびにその製造法に関するもので
ある。
スフェラーゼモノクローナル抗体および該゛モノクロー
ナル抗体の利用方法ならびにその製造法に関するもので
ある。
一般に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
エラーゼ（以下、ＴｄＴということがある）は、唾乳動
物の胸腺細胞あるいは骨髄細胞の一部に存在し、細胞の
分化に関係する酵素であろうと推測されている。それ故
にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼはリンパ球の分化過程を知るための重要なマーカーと
されている。さらＫ、一部の白血病、特に急性リンパ性
白血病患者の腫瘍細胞中にターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼが存在しているため、白血病
を分類するための１つの指標となっている。ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ陽性の白血
病患者にビンクリスチン−プレドニゾン療法を行なうこ
とで寛解率が高まることが知られている。これらの事情
から多くの生化学者、病理学者、臨床家等によってター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼに対
し特異性の高い抗体の開発および簡便で精度の高い測定
法が要望されているのである。
エラーゼ（以下、ＴｄＴということがある）は、唾乳動
物の胸腺細胞あるいは骨髄細胞の一部に存在し、細胞の
分化に関係する酵素であろうと推測されている。それ故
にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼはリンパ球の分化過程を知るための重要なマーカーと
されている。さらＫ、一部の白血病、特に急性リンパ性
白血病患者の腫瘍細胞中にターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼが存在しているため、白血病
を分類するための１つの指標となっている。ターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ陽性の白血
病患者にビンクリスチン−プレドニゾン療法を行なうこ
とで寛解率が高まることが知られている。これらの事情
から多くの生化学者、病理学者、臨床家等によってター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼに対
し特異性の高い抗体の開発および簡便で精度の高い測定
法が要望されているのである。
現在、抗ＴｄＴ抗体としてはウサギ抗血清あるいはこれ
からアフィニティー精製した抗体が市販されている。し
かし、ウサギ抗血清を用いてヒトＴｄＴを検出する場合
、抗血清中に存在する非特異的抗体が多量夾雑すること
により、検出感度、精度を非常に悪くしている。また非
特異的抗体を除くためアフィニティー精製を行った抗Ｔ
ｄＴ抗体が市販されているが、非常に高価であり、日常
の検査（使えない状態である。さらにこれらの抗体製品
はロットによ抄差があり、測定結果を定量的に判断でき
ない状態にある。またＴｄＴの力価測定には放射性同位
元素を標識した基質を用いて行なっているため、特殊な
管理区域で測定をしなければならないなど多くの欠点が
みられた。
からアフィニティー精製した抗体が市販されている。し
かし、ウサギ抗血清を用いてヒトＴｄＴを検出する場合
、抗血清中に存在する非特異的抗体が多量夾雑すること
により、検出感度、精度を非常に悪くしている。また非
特異的抗体を除くためアフィニティー精製を行った抗Ｔ
ｄＴ抗体が市販されているが、非常に高価であり、日常
の検査（使えない状態である。さらにこれらの抗体製品
はロットによ抄差があり、測定結果を定量的に判断でき
ない状態にある。またＴｄＴの力価測定には放射性同位
元素を標識した基質を用いて行なっているため、特殊な
管理区域で測定をしなければならないなど多くの欠点が
みられた。
またヒ）ＴｄＴに対するモノクローナル抗体は、当然ヒ
トＴ ｄ Ｔｉｃ鋭敏に反応するが、反面人間からＴｄ
Ｔを入手するのは人道的な問題もあり人手に制約を伴な
うという欠点がある。そこでヒト以外の動物由来の抗Ｔ
ｄＴモノクローナル抗体で、かつヒトＴ ｄ ＴＫ鋭敏
に交差反応し、容易に入手できるモノクローナル抗体を
開発することは経済面及びｔｍ面においても意義のある
ことである。
トＴ ｄ Ｔｉｃ鋭敏に反応するが、反面人間からＴｄ
Ｔを入手するのは人道的な問題もあり人手に制約を伴な
うという欠点がある。そこでヒト以外の動物由来の抗Ｔ
ｄＴモノクローナル抗体で、かつヒトＴ ｄ ＴＫ鋭敏
に交差反応し、容易に入手できるモノクローナル抗体を
開発することは経済面及びｔｍ面においても意義のある
ことである。
本発明者らは、よりすぐれた抗ＴｄＴモノクローナル抗
体を求めて、抗体を産生ずるハイブリドーマ作成の手順
に発鳴する各要素を選択組合せて鋭意研究した。例えば
ウシ、ブタ、ウサギ、にわとり等から入手した各ＴｄＴ
を用い、さらにラット、マウス等由来の各種細胞を種々
組合わせて融合させ、各塊抗ＴｄＴモノクローナル抗体
を調製することを試みた。そしてその結果、ウシＴｄＴ
−マウス脾臓細胞−マウスミエローマの組合せに到達す
ることによって、はじめて実用化の域に達する抗ＴｄＴ
モノクローナル抗体を得ることに成功したのである。
体を求めて、抗体を産生ずるハイブリドーマ作成の手順
に発鳴する各要素を選択組合せて鋭意研究した。例えば
ウシ、ブタ、ウサギ、にわとり等から入手した各ＴｄＴ
を用い、さらにラット、マウス等由来の各種細胞を種々
組合わせて融合させ、各塊抗ＴｄＴモノクローナル抗体
を調製することを試みた。そしてその結果、ウシＴｄＴ
−マウス脾臓細胞−マウスミエローマの組合せに到達す
ることによって、はじめて実用化の域に達する抗ＴｄＴ
モノクローナル抗体を得ることに成功したのである。
即ち、本発明者らは、正常なウシの胸腺等由来のＴｄＴ
で免疫したマウス牌細胞とマウスミエローマとを融合さ
せて得たハイブリドーマによって産生されるモノクロー
ナル抗体を使うことにより、種々の実験動物のＴｄＴ、
更にはヒトＴ、ｄＴを測定で□きることを見い出し、本
発明を完成した。
で免疫したマウス牌細胞とマウスミエローマとを融合さ
せて得たハイブリドーマによって産生されるモノクロー
ナル抗体を使うことにより、種々の実験動物のＴｄＴ、
更にはヒトＴ、ｄＴを測定で□きることを見い出し、本
発明を完成した。
一般論として、免疫マウス抗体産生＃Ｉ抱とマウスミエ
ローマとを融合させて得られるハイブリド−マよりモノ
クローナル抗体を製造する方法は公知である。（Ｎａｔ
ｕｒｅ、 ２５６巻 ４９５−４９７頁（１９７５３） しかしながら、ウシＴｄＴのマウスに対する免疫から出
発し、マウス牌細胞とマウスミエローマのハイブリドー
マによるモノクローナル抗体の製造方法て関する報告は
なく、さらに該モノクローナル抗体がヒトＴｄＴならび
に各種実験動物のＴｄＴにも交差反応を示した例は全く
知られていない。
ローマとを融合させて得られるハイブリド−マよりモノ
クローナル抗体を製造する方法は公知である。（Ｎａｔ
ｕｒｅ、 ２５６巻 ４９５−４９７頁（１９７５３） しかしながら、ウシＴｄＴのマウスに対する免疫から出
発し、マウス牌細胞とマウスミエローマのハイブリドー
マによるモノクローナル抗体の製造方法て関する報告は
なく、さらに該モノクローナル抗体がヒトＴｄＴならび
に各種実験動物のＴｄＴにも交差反応を示した例は全く
知られていない。
本発明は、ウシターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼで免疫したマウス膵臓細胞とマウスミエ
ローマとのハイブリドーマによって生産され、かつ、ヒ
トターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼに反応することを特徴とするモノクローナル抗体に関
するものである。
ンスフエラーゼで免疫したマウス膵臓細胞とマウスミエ
ローマとのハイブリドーマによって生産され、かつ、ヒ
トターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼに反応することを特徴とするモノクローナル抗体に関
するものである。
そして、本発明のモノクローナル抗体は間接螢光抗体法
あるいは／および酵素抗体法によりターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーセ１＠性細胞を検出す
る方法に使用されるものであリ、また、サンドウィンチ
法による酵素免疫測定法によりターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼを測定する方法に使用さ
れるものである。
あるいは／および酵素抗体法によりターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーセ１＠性細胞を検出す
る方法に使用されるものであリ、また、サンドウィンチ
法による酵素免疫測定法によりターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼを測定する方法に使用さ
れるものである。
また１本発明は、ウシターミナルデオ千シヌクレオチジ
ルトランスフエラーゼで免疫したマウス膵臓細胞とマウ
スミエローマとを融合させて得られ、かつヒトターミナ
ルデオキシヌクンオチジルトランスフエラーゼに反応す
るモノクローナル抗体を産生ずる能力を有するハイブリ
ドーマをインφビトロで＠養するかまだは動物の腹腔内
に移植するととンＣより、培＃液中あるいは腹水中に該
モノクローナル抗体を産生させ、これらからモノクロー
ナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル抗
体の製造法を包含する。
ルトランスフエラーゼで免疫したマウス膵臓細胞とマウ
スミエローマとを融合させて得られ、かつヒトターミナ
ルデオキシヌクンオチジルトランスフエラーゼに反応す
るモノクローナル抗体を産生ずる能力を有するハイブリ
ドーマをインφビトロで＠養するかまだは動物の腹腔内
に移植するととンＣより、培＃液中あるいは腹水中に該
モノクローナル抗体を産生させ、これらからモノクロー
ナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル抗
体の製造法を包含する。
以下、不発明の詳細な説明する。
本発明のＴｄＴモノクローナル抗体の製造は次のとうり
である。
である。
（１） ウシＴｄＴの、ｍ製例
仔牛哨腺２ｋｇを細断し、４ｔの０．２ＭＫＣ４含有Ｋ
ＥＮ緩衝液（５０ｍＭ Ｉ）ン酸カリウム緩衝液虜Ｚ５
．１ ｍＭ ＥＤ ＴＡ、１ ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール）を加え、ホモジネートする。次いで１５Ｃ１
００ｒｐｍ、 １５分間遠心分離し、４ｔの上清液を
得る。ＫＥＭ緩衝液で平衡化したリン酸セルロース（ワ
ットマン製Ｐ−１１）５００−を上記上清液に加え、４
℃で１晩（１８時間）穏かく攪拌する。そしてリン酸セ
ルロースを回収し、カラムに詰め（５Ｘ ２７ ｃａｔ
）、ＫＥＮ緩衝液６ｔで −洗浄する。
ＥＮ緩衝液（５０ｍＭ Ｉ）ン酸カリウム緩衝液虜Ｚ５
．１ ｍＭ ＥＤ ＴＡ、１ ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール）を加え、ホモジネートする。次いで１５Ｃ１
００ｒｐｍ、 １５分間遠心分離し、４ｔの上清液を
得る。ＫＥＭ緩衝液で平衡化したリン酸セルロース（ワ
ットマン製Ｐ−１１）５００−を上記上清液に加え、４
℃で１晩（１８時間）穏かく攪拌する。そしてリン酸セ
ルロースを回収し、カラムに詰め（５Ｘ ２７ ｃａｔ
）、ＫＥＮ緩衝液６ｔで −洗浄する。
次に０から１．２ＭＫＣＬの幾度勾配からなるＫＥＭ緩
衝液で溶出させ、活性画分約１ｔを得、直ちに３５〜７
０チ飽和の硫酸アンモニウムにて塩析を行い、８０００
ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈殿物を約４０−の５０
ｍＭ ＫＣＬ 含有ＫＥＭＧ緩衝Ｍ１． （２０ｍＭ
リン酸カリウム、ＩｍＭＥＤＴＡ。
衝液で溶出させ、活性画分約１ｔを得、直ちに３５〜７
０チ飽和の硫酸アンモニウムにて塩析を行い、８０００
ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈殿物を約４０−の５０
ｍＭ ＫＣＬ 含有ＫＥＭＧ緩衝Ｍ１． （２０ｍＭ
リン酸カリウム、ＩｍＭＥＤＴＡ。
１ｍＭ２−メルカプトエタノール、２０％グリセリン）
に溶解する。これを直ちに５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −
２００カラム（２，０×９０ｃｒｒＬ）にかけゲル濾過
を行ない、活性画分約７０ＷＬｔｔ−ＫＥＭＧ緩衝液に
一晩透析する。
に溶解する。これを直ちに５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −
２００カラム（２，０×９０ｃｒｒＬ）にかけゲル濾過
を行ない、活性画分約７０ＷＬｔｔ−ＫＥＭＧ緩衝液に
一晩透析する。
透析した試料をＯｌｉｇｏ （ｄＴ）Ｈｇｓ Ｃｅ１ｌ
ｕｌｏｓｅカラム（０，９Ｘ １０ｃｍ） Ｋかけ吸着
させる。ＫＥＭＧ緩衝夜で充分に洗浄した後、０からＩ
ＭＫＣｔの濃度勾配から成るＫＥＭＧ緩衝液で溶出させ
る。
ｕｌｏｓｅカラム（０，９Ｘ １０ｃｍ） Ｋかけ吸着
させる。ＫＥＭＧ緩衝夜で充分に洗浄した後、０からＩ
ＭＫＣｔの濃度勾配から成るＫＥＭＧ緩衝液で溶出させ
る。
０．５ＭＫＣｔ付近で溶出した活性画分約２０ｒＲｔを
ＫＥＭＧ緩衝液に一晩透析した後、ハイトロキシルアパ
タイト（Ｂｉｏｇｅｌ−ＨＴＰ）カラム（り、９Ｘ１０
ｃＷＬ）Ｋ吸着させる。そしてＫＥＭＧ緩衝液で充分に
カラムを洗浄し、２０ ｍＭから５００ ｍＭのリン酸
カリウム緩衝ＦＬ（ｐ［１Ｚ２）による濃度勾配で溶出
させ、精ｄＴｄｒ約１１１９を得る。
ＫＥＭＧ緩衝液に一晩透析した後、ハイトロキシルアパ
タイト（Ｂｉｏｇｅｌ−ＨＴＰ）カラム（り、９Ｘ１０
ｃＷＬ）Ｋ吸着させる。そしてＫＥＭＧ緩衝液で充分に
カラムを洗浄し、２０ ｍＭから５００ ｍＭのリン酸
カリウム緩衝ＦＬ（ｐ［１Ｚ２）による濃度勾配で溶出
させ、精ｄＴｄｒ約１１１９を得る。
（２） ウシＴｄＴで免疫されたマウス牌細胞の調製
例 免疫方法は５〜１０週令のマウスの皮下あるいは腹腔内
あるいは静脈内に、適当なアジュバントとともにウシＴ
ｄＴを１０μｆ〜２００μｔ／匹を□投与する。以後１
〜３週問おきにウシＴｄＴを３〜６回投与する。各免疫
後５日間で、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗つシＴ
ｄＴ抗体価を以下に示すＤｏｔ法による酵素免疫法で調
べる。
例 免疫方法は５〜１０週令のマウスの皮下あるいは腹腔内
あるいは静脈内に、適当なアジュバントとともにウシＴ
ｄＴを１０μｆ〜２００μｔ／匹を□投与する。以後１
〜３週問おきにウシＴｄＴを３〜６回投与する。各免疫
後５日間で、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗つシＴ
ｄＴ抗体価を以下に示すＤｏｔ法による酵素免疫法で調
べる。
３ ｒｔａｇ Ｘ ３ｔａｘのニトロセルロース膜にウ
シＴｄＴ溶液（１００μｒ／ｄ）２μｔｔ−落し、３７
℃で２時間乾朦する。次に１チウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡＩｌｏ、９チ食塩含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ；’Ｊ
ン酸２ナトリウム １．８５ｆ、 リン酸１カリウム
０．２７Ｆ、食塩 ９０？、蒸留水 １４．ｐＨ７，２
）にウシＴｄＴ吸着ニトロセルロース嗅を入れ約１５分
室温で放置する。
シＴｄＴ溶液（１００μｒ／ｄ）２μｔｔ−落し、３７
℃で２時間乾朦する。次に１チウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡＩｌｏ、９チ食塩含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ；’Ｊ
ン酸２ナトリウム １．８５ｆ、 リン酸１カリウム
０．２７Ｆ、食塩 ９０？、蒸留水 １４．ｐＨ７，２
）にウシＴｄＴ吸着ニトロセルロース嗅を入れ約１５分
室温で放置する。
９６穴のマイクロタイタープレートに被検抗体（ここで
はマウス血清）の倍々希釈系列を作る。
はマウス血清）の倍々希釈系列を作る。
１穴中の試料量は５０〜１００μｔが適当である。
各ウェルに上記処理したウシＴｄＴ吸着ニトロセルロー
ス模を１枚ずつ添加し、室温で２時間放置する。次に゛
それぞれのウェル中のニトロセルロース膜をＰＢＳで数
回洗浄する。次に１００倍希釈したはルオキシダーゼ標
識やぎ抗マウスＩｇＧ溶液（ガラベル社製）を１００μ
ｔずつ添加する。室温で２時間インキュベートし、その
後ＰＢＳで５回洗浄を繰返す。次に発色剤（５０チ）Ｉ
、０． ６μｔ。
ス模を１枚ずつ添加し、室温で２時間放置する。次に゛
それぞれのウェル中のニトロセルロース膜をＰＢＳで数
回洗浄する。次に１００倍希釈したはルオキシダーゼ標
識やぎ抗マウスＩｇＧ溶液（ガラベル社製）を１００μ
ｔずつ添加する。室温で２時間インキュベートし、その
後ＰＢＳで５回洗浄を繰返す。次に発色剤（５０チ）Ｉ
、０． ６μｔ。
０、５１４−クロロ−１−ナフトール メタノール溶液
２ｄ、ＰＢＳ １０ｄ１１００μＡ／穴に分径し、
１５分間室温に放置する。各穴より発色剤を除き、蒸留
水で６回洗浄し、ニトロセルロース膜を乾燥する。ニト
ロセルロース膜の＝７７’ｒｄＴ吸着部分の発色の有無
により抗体価を判定する。
２ｄ、ＰＢＳ １０ｄ１１００μＡ／穴に分径し、
１５分間室温に放置する。各穴より発色剤を除き、蒸留
水で６回洗浄し、ニトロセルロース膜を乾燥する。ニト
ロセルロース膜の＝７７’ｒｄＴ吸着部分の発色の有無
により抗体価を判定する。
すなわち発色のみられる最大希釈を抗体価とした。
ウシＴｄＴに対する抗体価が２５６０以上になを示した
マウスを免疫化マウスとした。そして細胞融合を行う４
日前に静脈内にウシＴｄＴ（１００μｆ／匹）を追加投
与した免疫化マウスの膵臓を摘出し、牌細胞を調製する
。
マウスを免疫化マウスとした。そして細胞融合を行う４
日前に静脈内にウシＴｄＴ（１００μｆ／匹）を追加投
与した免疫化マウスの膵臓を摘出し、牌細胞を調製する
。
（３） マウスミエローマ
マウスミエローマ（マウス骨髄腫細胞）トシては、８−
アザグアニン耐性マウス ミエローマを使用する。例え
ば Ｐ３−ＮＳ Ｉ−１−ＡｇＡ−１（ＮＳ−１）。
アザグアニン耐性マウス ミエローマを使用する。例え
ば Ｐ３−ＮＳ Ｉ−１−ＡｇＡ−１（ＮＳ−１）。
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ、 ６ ５１１−
５１９Ｐ３−Ｘ６５−Ａｇ８−Ｕｌ （Ｐ２Ｏ３）。
５１９Ｐ３−Ｘ６５−Ａｇ８−Ｕｌ （Ｐ２Ｏ３）。
Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ’￥ｉｏ
ｌｏｇｙ ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８土 １〜７（１
９７８）Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．５ （Ｘ６．５゜
５）。
ｌｏｇｙ ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８土 １〜７（１
９７８）Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．５ （Ｘ６．５゜
５）。
Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、１２！ｉ １５４８−１５５０Ｓ
Ｐ２１０−Ａｇ１４ （ＳＰ−２）。
Ｐ２１０−Ａｇ１４ （ＳＰ−２）。
Ｎａｔｕｒｅ２７６ ２６９〜２７０ （１９８０
）などの細胞が挙げられる。
）などの細胞が挙げられる。
（４） 細胞融合例
細胞融合例は常法に従って行うことが出来る。
上記免疫化マウスの牌細胞ｌＸ１０’個と８−アザグア
ニン耐性マウスミエローマＩ Ｘ １０？に７！に、６
よう（混合し、遠心分離にかける。上清液を捨て、沈殿
した細胞をよくほぐした後、攪拌しながら４５チポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ６０００ ０．４５ｔ、ＲＰ
Ｍ■１６ａｏ培地 Ｃ１，５５ｍ）１ｍをゆっくり加え
る。７分間静置した後にＲＰ Ｍ Ｉ １６４０培地２
０ＩＲｔｔ−攪拌しながら加える。遠心分離後、上清液
を捨て、細胞を穏かに１００ｄ培養液（２〇−牛胎児血
清、 ８０ ｄＲＰ Ｍ １１６４０培地、 ６．６
ｊｌＰカナマイシン、Ｌ−グルタミン ５８岬１重炭酸
水素ナトリウム ０．１２ｆ）に懸濁させる。この懸濁
液を９６穴培養プレートの各人に１００μｔずつ分注し
、５１ Ｃｏ１インキユベーター中３７℃で１６〜２４
時間培養する。
ニン耐性マウスミエローマＩ Ｘ １０？に７！に、６
よう（混合し、遠心分離にかける。上清液を捨て、沈殿
した細胞をよくほぐした後、攪拌しながら４５チポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ６０００ ０．４５ｔ、ＲＰ
Ｍ■１６ａｏ培地 Ｃ１，５５ｍ）１ｍをゆっくり加え
る。７分間静置した後にＲＰ Ｍ Ｉ １６４０培地２
０ＩＲｔｔ−攪拌しながら加える。遠心分離後、上清液
を捨て、細胞を穏かに１００ｄ培養液（２〇−牛胎児血
清、 ８０ ｄＲＰ Ｍ １１６４０培地、 ６．６
ｊｌＰカナマイシン、Ｌ−グルタミン ５８岬１重炭酸
水素ナトリウム ０．１２ｆ）に懸濁させる。この懸濁
液を９６穴培養プレートの各人に１００μｔずつ分注し
、５１ Ｃｏ１インキユベーター中３７℃で１６〜２４
時間培養する。
培養プレートの各穴に１００μｔのＩ（ＡＴ培地（前記
培養液に１００μＭヒポキナンチン、０．４μＭアミノ
プテリン、１６μＭチミジンを加えた培地）を加え、さ
らに２４時間培養する。培養上清の半容量を捨て、新た
にＨＡＴ培地を同量加え培養する。以後６日間隔ごとに
ＨＡＴ培地を半量交換しながら１０〜１４日間培養を続
ける。細胞の生育してきた穴について、ＨＡＴ培地をＥ
（Ｔ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地
）に切夛換え培養を続ける。細胞が十分生育したところ
で培地中の上清液の一部をとり上記の方法によりウシＴ
ｄＴに対する抗体価を測定する。
培養液に１００μＭヒポキナンチン、０．４μＭアミノ
プテリン、１６μＭチミジンを加えた培地）を加え、さ
らに２４時間培養する。培養上清の半容量を捨て、新た
にＨＡＴ培地を同量加え培養する。以後６日間隔ごとに
ＨＡＴ培地を半量交換しながら１０〜１４日間培養を続
ける。細胞の生育してきた穴について、ＨＡＴ培地をＥ
（Ｔ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地
）に切夛換え培養を続ける。細胞が十分生育したところ
で培地中の上清液の一部をとり上記の方法によりウシＴ
ｄＴに対する抗体価を測定する。
抗体価の認められた穴の細胞について、限界希釈法によ
りクローニングを行い、ウシ’１’ｄＴに対する抗体価
を有するクローンを、抗つシＴｄＴモノクローナル抗体
産生ハイプリド−マ株として選択する。
りクローニングを行い、ウシ’１’ｄＴに対する抗体価
を有するクローンを、抗つシＴｄＴモノクローナル抗体
産生ハイプリド−マ株として選択する。
（５）モノクローナル抗体の調製側
枕つシＴｄＴモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
の培養上清液をモノクローナル抗体として利用できる。
の培養上清液をモノクローナル抗体として利用できる。
あるいは、プリスタン ０．５４を腹腔内に投与したマ
ウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の腹腔内に上記ハイブリドーマを
１〜２Ｘ１０’個を移植し、１０〜１４日後にこのマウ
スの腹水を採取し、遠心分離で固形物を除去した上清液
を抗つシＴｄＴモノクローナル抗体として使うこともで
きる。さらに必要な場合には、培養上清液あるいは腹水
を硫安塩析し、５０チ飽和硫安画分をＰＢＳで透析して
得てもよい。さらにＤＥＡＥセルロースカラム、ゲルロ
過、プロティンへ−カラム、オリゴｄＴ・セルロースカ
ラム等により、よりｎＩｆｉした抗つシＴｄＴモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
ウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の腹腔内に上記ハイブリドーマを
１〜２Ｘ１０’個を移植し、１０〜１４日後にこのマウ
スの腹水を採取し、遠心分離で固形物を除去した上清液
を抗つシＴｄＴモノクローナル抗体として使うこともで
きる。さらに必要な場合には、培養上清液あるいは腹水
を硫安塩析し、５０チ飽和硫安画分をＰＢＳで透析して
得てもよい。さらにＤＥＡＥセルロースカラム、ゲルロ
過、プロティンへ−カラム、オリゴｄＴ・セルロースカ
ラム等により、よりｎＩｆｉした抗つシＴｄＴモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
一般に、モノクローナル抗体が各種動物由来のＴｄＴに
対する抗体である証明は、モノクローナル抗体と各Ｔｄ
Ｔとを反応させ、次いで各ＴｄＴ活性の失活の測定によ
り確定することができる。
対する抗体である証明は、モノクローナル抗体と各Ｔｄ
Ｔとを反応させ、次いで各ＴｄＴ活性の失活の測定によ
り確定することができる。
すなわち、１単位の各種動物のＴｄＴと抗つシＴｄＴモ
ノクローナル抗体とを３７℃、３０分間反応させ、反応
液中のＴｄＴ残存活性を常法により測定するのがよい。
ノクローナル抗体とを３７℃、３０分間反応させ、反応
液中のＴｄＴ残存活性を常法により測定するのがよい。
あるいは各種動物の骨髄細胞やＴｄＴ陽性白血病細胞と
モノクローナル抗体とによる間接螢光抗体法による細胞
染色により確認することもできる。
モノクローナル抗体とによる間接螢光抗体法による細胞
染色により確認することもできる。
本発明のマウスモノクローナル抗体のアイソタイプ、サ
ブクラスの決定は、やぎ抗マウスＩｇＧ、。
ブクラスの決定は、やぎ抗マウスＩｇＧ、。
やぎ抗マウスＩｇＧ□、やぎ抗マウスＩｇＧｘｂ−やぎ
抗マウスＩ ｇＧ、を吸潰させたマイクロプレートを使
ったＩＬＩＳＡ法で同定できる。
抗マウスＩ ｇＧ、を吸潰させたマイクロプレートを使
ったＩＬＩＳＡ法で同定できる。
本発明においては、実施例１に示す如く、前記（４）項
に記載した方法によって、クローンＡ、Ｂ。
に記載した方法によって、クローンＡ、Ｂ。
Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈと命名したハイブリドーマ株を
得た。これら各ハイブリドーマ株から得られるモノクロ
ーナル抗体は、すべてｒｇＧＫＩＡするイソタイプでお
り、Ａ、ＢはＩｇＧ、、Ｃ、ＤはＩｇＧ！ｂ、Ｅ、Ｆ、
ＧはＩｇＧｔａに属していた。次に、各クローンが生産
したモノクローナル抗体をウシＴｄＴ、ヒトＴｄＴと反
応させ、その残存活性を測定して、各抗体の結合力をみ
た。その結果を次の表１に示す。なお、対照にはウサギ
抗つシＴｄＴ血清及び正常マウス血清を用いた。
得た。これら各ハイブリドーマ株から得られるモノクロ
ーナル抗体は、すべてｒｇＧＫＩＡするイソタイプでお
り、Ａ、ＢはＩｇＧ、、Ｃ、ＤはＩｇＧ！ｂ、Ｅ、Ｆ、
ＧはＩｇＧｔａに属していた。次に、各クローンが生産
したモノクローナル抗体をウシＴｄＴ、ヒトＴｄＴと反
応させ、その残存活性を測定して、各抗体の結合力をみ
た。その結果を次の表１に示す。なお、対照にはウサギ
抗つシＴｄＴ血清及び正常マウス血清を用いた。
表 １
上記表１から明らかなように、クローンＡ、Ｂ。
Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧのＩｇＧはウシＴｄ’Ｉ’によく結
合し、しかもヒトＴｄＴにもよく結合する。特にクロー
ンＡの生産したＩ ｇＧ、は、クシＴｄＴおよびヒ１−
ＴｄＴに非常によく結合することから、クローンＡは実
用化に鰻も近いクローンとして選択された。
合し、しかもヒトＴｄＴにもよく結合する。特にクロー
ンＡの生産したＩ ｇＧ、は、クシＴｄＴおよびヒ１−
ＴｄＴに非常によく結合することから、クローンＡは実
用化に鰻も近いクローンとして選択された。
次に表１と同じ抗体源を用いて、ラット骨髄細胞とヒ）
Ｎａ１ｍ−１８細胞との結合性をみた。その結果を次の
表２に示した。
Ｎａ１ｍ−１８細胞との結合性をみた。その結果を次の
表２に示した。
従来の知見より、ラット骨髄細胞中でＴ ｄ Ｔｍ性細
胞の占める割合は２〜４チとされており、この範囲を越
える陽性率はＴｄＴ以外を認識したことになり、非特異
的反応を示した結果と考えられる。
胞の占める割合は２〜４チとされており、この範囲を越
える陽性率はＴｄＴ以外を認識したことになり、非特異
的反応を示した結果と考えられる。
また間接螢光抗体法によるＴｄＴ陽性細胞の染色像は、
核内が網目状に染まるのが通常である。上記知見及び表
２から明らかなように、クローンＡ。
核内が網目状に染まるのが通常である。上記知見及び表
２から明らかなように、クローンＡ。
Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ’、Ｇの生産した抗体は、ＴｄＴ陽
性細胞に特異的に結合することが確認できた。
性細胞に特異的に結合することが確認できた。
実施例１゜
０．６−ウ７ＴｄＴ溶液（４００μｆ蛋白質／ｍｌを同
量の完全７０インドアジユバ／トで乳化し、マウス１匹
当りその０．１Ｗ４ｔを５週令のＢＡＬＢ／Ｃ。
量の完全７０インドアジユバ／トで乳化し、マウス１匹
当りその０．１Ｗ４ｔを５週令のＢＡＬＢ／Ｃ。
♀マウスの皮下数ケ所に投与した。２週問おきに不完全
７０インドアジユバントで乳化したウシＴｄＴを同様に
追加投与した“。４回目投与後５日目のマウス血清中の
抗体価は６，５００〜ｉｏｏ、ｏｏ。
７０インドアジユバントで乳化したウシＴｄＴを同様に
追加投与した“。４回目投与後５日目のマウス血清中の
抗体価は６，５００〜ｉｏｏ、ｏｏ。
であった。４回目投与後２１日目に２０μｆ ウシＴｄ
Ｔ／匹を尾静脈にブースターとして投与した。
Ｔ／匹を尾静脈にブースターとして投与した。
一方、８−７４１’クアニン耐性マウスミエローマＰ２
Ｏ３を１０チウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４゜培地
に２×１０う／−の濃度に懸濁し、５チＣＯ，−インキ
ュベーター中６７℃で３日間培養し、１、Ｘｌ［］６／
−の細胞屓度にした。
Ｏ３を１０チウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４゜培地
に２×１０う／−の濃度に懸濁し、５チＣＯ，−インキ
ュベーター中６７℃で３日間培養し、１、Ｘｌ［］６／
−の細胞屓度にした。
前記ブースター投与後４日目にマウスより膵臓を摘出し
、常法に従い牌細胞浮遊液を調製した。
、常法に従い牌細胞浮遊液を調製した。
牌細胞ｌＸ１０”個とマウスミエローマｌＸ１０丁個を
混合し、８００ｒ、ｐ、ｍで８分間遠心分離し、上清液
を除去した。
混合し、８００ｒ、ｐ、ｍで８分間遠心分離し、上清液
を除去した。
沈殿した細胞をよくほぐした後、攪拌しながら６７℃で
１−の４５チポリエチレングリコール液（０，４！Ｍポ
リエチレングリコール６０００と０、５５ ｄＲＰ Ｍ
１１６４（ｌ培地）をゆっくり滴下した。
１−の４５チポリエチレングリコール液（０，４！Ｍポ
リエチレングリコール６０００と０、５５ ｄＲＰ Ｍ
１１６４（ｌ培地）をゆっくり滴下した。
７分間３７℃で静置後３７℃のＲＰ Ｍ １１１５４０
培地２０−を３！ｎｔ／ｍｉｎの速度で加えた。１００
０ｒ、 ｐ、 ｍで７分間遠心分離し、上清液を除去し
、３７℃の２０チック胎児血清を含むＲＰ Ｍ １１６
４０培地１００−に懸濁し、２４穴培養プレートに１ゴ
／穴ずつ分注し、５ ％ Ｃｏｔ−インキュベーター３
７℃で１晩培養した。培養プレートに１ｄ／穴ずつ１（
ＡＴ堵地を添加し２４時間培養した。次に培養プレート
の各穴より培養液１ ｍｌを捨て、ν「たなＨＡＴ培地
を１−ずつ添加し培養を行った。３日毎にＨＡＴ培地の
半量交換を行ない、培養１４日後に８０チの培養穴に細
ｉｌ己の生育を認めた。ａ抱生育培養穴の上清液の抗体
価をＤｏｔ法で、さらにＴｄＴ酵素の失活程度、Ｎａ１
ｍ −１ｓｍｅラインの間接螢光抗体法による染色性よ
り、陽性と認め是培養穴について、マウス胸腺細胞をフ
ィーダー細胞として限界希釈法にて０．３細胞／穴の濃
度でクローニングを行ない抗つシＴｄＴモノクローナル
抗体産生株としてＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ。
培地２０−を３！ｎｔ／ｍｉｎの速度で加えた。１００
０ｒ、 ｐ、 ｍで７分間遠心分離し、上清液を除去し
、３７℃の２０チック胎児血清を含むＲＰ Ｍ １１６
４０培地１００−に懸濁し、２４穴培養プレートに１ゴ
／穴ずつ分注し、５ ％ Ｃｏｔ−インキュベーター３
７℃で１晩培養した。培養プレートに１ｄ／穴ずつ１（
ＡＴ堵地を添加し２４時間培養した。次に培養プレート
の各穴より培養液１ ｍｌを捨て、ν「たなＨＡＴ培地
を１−ずつ添加し培養を行った。３日毎にＨＡＴ培地の
半量交換を行ない、培養１４日後に８０チの培養穴に細
ｉｌ己の生育を認めた。ａ抱生育培養穴の上清液の抗体
価をＤｏｔ法で、さらにＴｄＴ酵素の失活程度、Ｎａ１
ｍ −１ｓｍｅラインの間接螢光抗体法による染色性よ
り、陽性と認め是培養穴について、マウス胸腺細胞をフ
ィーダー細胞として限界希釈法にて０．３細胞／穴の濃
度でクローニングを行ない抗つシＴｄＴモノクローナル
抗体産生株としてＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ。
Ｈのクローンを選択した。
０．５ｄプリスタン（２，６，１０，１４−ｔｓｔｒａ
ｍｅｔｈｙｌ −ｐｅｎｔａｄａｅａｎｓ ）を腹腔
内に投与し２週間を経たＢＡＬＢ／Ｃマクス（♀、８週
令）の腹腔に上記で得られた各ハイブリドーマ株２Ｘ１
０６個を移植し、１４日間にマウス腹水を採集した（６
〜１１ｒＲｔ腹水／匹）。遠心分離し、固形物を除き上
清液に同業の飽和硫安液を加え、沈殿物を少量のＰＢＳ
に溶解した。５００倍竜のＰＢＳで１晩透析し、粗精襄
抗りシＴｄＴモノクローナル抗体金得た。
ｍｅｔｈｙｌ −ｐｅｎｔａｄａｅａｎｓ ）を腹腔
内に投与し２週間を経たＢＡＬＢ／Ｃマクス（♀、８週
令）の腹腔に上記で得られた各ハイブリドーマ株２Ｘ１
０６個を移植し、１４日間にマウス腹水を採集した（６
〜１１ｒＲｔ腹水／匹）。遠心分離し、固形物を除き上
清液に同業の飽和硫安液を加え、沈殿物を少量のＰＢＳ
に溶解した。５００倍竜のＰＢＳで１晩透析し、粗精襄
抗りシＴｄＴモノクローナル抗体金得た。
Claims (5)
- （１）ウシターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼで免疫したマウス脾臓細胞とマウスミエロー
マとのハイブリドーマによつて生産され、かつ、ヒトタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼに
反応することを特徴とするモノクローナル抗体。 - （２）モノクローナル抗体がＩｇＧイソタイプに属する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノクロ
ーナル抗体。 - （３）モノクローナル抗体が間接螢光抗体法あるいは／
および酵素抗体法によりターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼ陽性細胞を検出する方法に使用
されるものである特許請求の範囲第１項記載のモノクロ
ーナル抗体。 - （４）モノクローナル抗体がサンドウイツチ法による酵
素免疫測定法によりターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼを測定する方法に使用されるもので
ある特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - （５）ウシターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼで免疫したマウス脾臓細胞とマウスミエロー
マとを融合させて得られ、かつヒトターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼに反応するモノクロ
ーナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマをイ
ン・ビトロで培養するかまたは動物の腹腔内に移植する
ことにより、培養液中あるいは腹水中に該モノクローナ
ル抗体を産生させ、これらからモノクローナル抗体を採
取することを特徴とするモノクローナル抗体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59246194A JPS61126100A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | 抗ＴｄＴモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59246194A JPS61126100A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | 抗ＴｄＴモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61126100A true JPS61126100A (ja) | 1986-06-13 |
| JPH0459880B2 JPH0459880B2 (ja) | 1992-09-24 |
Family
ID=17144907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59246194A Granted JPS61126100A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | 抗ＴｄＴモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61126100A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0260903A2 (en) * | 1986-09-15 | 1988-03-23 | Coulter Corporation | Use of a chemical blocking agent against non-specific binding of an antibody specific for terminal deoxynucleotidyl transferase in biological specimens during immunoassays |
| JPH01131461A (ja) * | 1987-08-20 | 1989-05-24 | Takeyori Saeki | ヒトａｓｓの測定方法および測定試薬 |
| EP0459190A2 (en) * | 1990-05-29 | 1991-12-04 | E.R. SQUIBB & SONS, INC. | Monoclonal anitbodies which bind mevalonate kinase |
-
1984
- 1984-11-22 JP JP59246194A patent/JPS61126100A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0260903A2 (en) * | 1986-09-15 | 1988-03-23 | Coulter Corporation | Use of a chemical blocking agent against non-specific binding of an antibody specific for terminal deoxynucleotidyl transferase in biological specimens during immunoassays |
| JPH01131461A (ja) * | 1987-08-20 | 1989-05-24 | Takeyori Saeki | ヒトａｓｓの測定方法および測定試薬 |
| EP0459190A2 (en) * | 1990-05-29 | 1991-12-04 | E.R. SQUIBB & SONS, INC. | Monoclonal anitbodies which bind mevalonate kinase |
| US5898068A (en) * | 1990-05-29 | 1999-04-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies which bind mevalonate kinase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0459880B2 (ja) | 1992-09-24 |
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