JPH0459880B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼモノクローナル抗体および該
モノクローナル抗体の利用方法ならびにその製造
法に関するものである。 一般に、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（以下、TdTということがあ
る）は、哺乳動物の胸腺細胞あるいは骨髄細胞の
一部に存在し、細胞の分化に関係する酵素であろ
うと推測されている。それ故にターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフエラーゼはリンパ球
の分化過程を知るための重要なマーカーとされて
いる。さらに、一部の白血病、特に急性リンパ性
白血病患者の腫瘍細胞中にターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼが存在している
ため、白血病を分類するための１つの指標となつ
ている。ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ陽性の白血病患者にビンクリスチ
ン−プレドニゾン療法を行なうことで寛解率が高
まることが知られている。これらの事情から多く
の生化学者、病理学者、臨床家等によつてターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
に対し特異性の高い抗体の開発および簡便で精度
の高い測定法が要望されているのである。 現在、抗TdT抗体としはてウサギ抗血清ある
いはこれがらアフイニテイー精製した抗体が市販
されている。しかし、ウサギ抗血清を用いてヒト
TdTを検出する場合、抗血清中に存在する非特
異的抗体が多量夾雑することにより、検出感度、
精度を非常に悪くしている。また非特異的抗体を
除くためアフイニテイー精製を行つた抗TdT抗
体が市販されているが、非常に高価であり、日常
の検査に使えない状態である。さらにこれらの抗
体製品はロツトにより差があり、測定結果を定量
的に判断できない状態にある。またTdTの力価
測定には放射性同位元素を標識した基質を用いて
行なつているため、特殊な管理区域で測定をしな
ければならないなど多くの欠点がみられた。 またヒトTdTに対するモノクローナル抗体は、
当然ヒトTdTに鋭敏に反応するが、反面人間か
らTdTを入手するのは人道的な問題もあり入手
に制約を伴なうという欠点がある。そこでヒト以
外の動物由来の抗TdTモノクローナル抗体で、
かつヒトTdTに鋭敏に交差反応し、容易に入手
できるモノクローナル抗体を開発することは経済
面及び量産面においても意義のあることである。 本発明者らは、よりすぐれた抗TdTモノクロ
ーナル抗体を求めて、抗体を産生するハイブリド
ーマ作成の手順に登場する各要素を選択組合せて
鋭意研究した。例えばウシ、ブタ、ウサギ、にわ
とり等から入手した各TdTを用い、さらにラツ
ト、マウス等由来の各種細胞を種々組合わせて融
合させ、各種抗TdTモノクローナル抗体を調製
することを試みた。そしてその結果、ウシTdT
−マウス脾臓細胞−マウスミエローマの組合せに
到達することによつて、はじめて実用化の域に達
する抗TdTモノクローナル抗体を得ることに成
功したのである。 即ち、本発明者らは、正常なウシの胸腺等由来
のTdTで免疫したマウス脾細胞とマウスミエロ
ーマとを融合させて得たハイブリドーマによつて
産生されるモノクローナル抗体を使うことによ
り、種々の実験動物のTdT、更にはヒトTdTを
測定できることを見い出し、本発明を完成した。 一般論として、免疫マウス抗体産生細胞とマウ
スミエローマとを融合させて得られるハイブリド
ーマよりモノクローナル抗体を製造する方法は公
知である。（Nature、256巻495−497頁（1975）） しかしながら、ウシTdTのマウスに対する免
疫から出発し、マウス脾細胞とマウスミエローマ
のハイブリドーマによるモノクローナル抗体の製
造方法に関する報告はなく、さらに該モノクロー
ナル抗体がヒトTdTならびに各種実験動物の
TdTにも交差反応を示した例は全く知られてい
ない。 本発明は、ウシターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼで免疫したマウス脾臓細
胞とマウスミエローマとのハイブリドーマによつ
て生産され、かつ、ヒトターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼに反応することを
特徴とするモノクローナル抗体に関するものであ
る。 そして、本発明のモノクローナル抗体は間接螢
光抗体法あるいは／および酵素抗体法によりター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ陽性細胞を検出する方法に使用されるものであ
り、また、サンドウイツチ法による酵素免疫測定
法によりターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼを測定する方法に使用されるもの
である。 また、本発明は、ウシターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼで免疫したマウス
脾臓細胞とマウスミエローマとを融合させて得ら
れ、かつヒトターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼに反応するモノクローナル抗
体を産生する能力を有するハイブリドーマをイ
ン・ビトロで培養するかまたは動物の腹腔内に移
植することにより、培養液中あるいは腹水中に該
モノクローナル抗体を産生させ、これらからモノ
クローナル抗体を採取することを特徴とするモノ
クローナル抗体の製造法を包含する。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明のTdTモノクローナル抗体の製造は次
のとうりである。 (1) ウシTdTの調製例 仔牛胸腺２Kgを細断し、４の0.2M KCl含
有KEM緩衝液（50ｍＭリン酸カリウム緩衝液
PH7.5、１ｍＭ EDTA、１ｍM2−メルカプト
エタノール）を加え、ホモジネートする。次い
で15000rpm、15分間遠心分離し、４の上清
液を得る。KEM緩衝液で平衝化したリン酸セ
ルロース（ワツトマン製Ｐ−11）500mlを上記
上清液に加え、４℃で１晩（18時間）穏かに撹
拌する。そしてリン酸セルロースを回収し、カ
ラムに詰め（５×27cm）、KEM緩衝液３で洗
浄する。 次に０から1.2M KClの濃度勾配からなる
KEM、緩衝液で溶出させ、活性画分約１を
得、直ちに35〜70％飽和の硫酸アンモニウムに
て塩析を行い、8000rpm、15分間遠心分離し、
沈殿物を約40mlの50ｍＭ KCl含有KEMG緩
衝液（20ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭ
EDTA、１ｍM2−メルカプトエタノール、20
％グリセリン）に溶解する。これを直ちに
Sephacryl Ｓ−200カラム（2.0×90cm）にかけ
ゲル過を行ない、活性画分約70mlをKEMG
緩衝液に一晩透析する。 透析した試料を0ligo（dT）_12-18Celluloseカラ
ム（0.9×10cm）にかけ吸着させる。KEMG緩
衝液で充分に洗浄した後、０から1M KClの濃
度勾配から成るKEMG緩衝液で溶出させる。
0.5M KCl付近で溶出した活性画分約20mlを
KEMG緩衝液に一晩透析した後、ハイドロキ
シルアパタイト（Bioge1−HTP）カラム（0.9
×10cm）に吸着させる。そしてKEMG緩衝液
で充分にカラムを洗浄し、20ｍＭから300ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（PH7.2）による濃度
勾配で溶出させ、精製TdT約１mgを得る。 (2) ウシTdTで免疫されたマウス脾細胞の調製
例 免疫方法は５〜10週令のマウスの皮下あるい
は腹腔内あるいは静脈内に、適当なアジユバン
ドとともにウシTdTを10μｇ〜200μｇ／匹を投
与する。以後１〜３週間おきにウシTdTを３
〜６回投与する。各免疫後５日間で、眼底静脈
叢より採血し、血清中の抗ウシTdT抗体価を
以下に示すDot法による酵素免疫法で調べる。 ３mm×３mmのニトロセルロース膜にウシ
TdT溶液（100μｇ／ml）2μを落し、37℃で
２時間乾燥する。次に１％ウシ血清アルブミン
（BSA）／0.9％食塩含有リン酸緩衝液
（PBS；リン酸２ナトリウム1.83ｇ、リン酸１
カリウム0.21ｇ、食塩9.0ｇ、蒸留水１、PH
7.2）にウシTdT吸着ニトロセルロース膜を入
れ約15分室温で放置する。 96穴のマイクロタイタープレートに被検抗体
（ここではマウス血清）の培々希釈系列を作る。
１穴中の試料量は50〜100μが適当である。
各ウエルに上記処理したウシTdT吸着ニトロ
セルロース膜を１枚ずつ添加し、室温で２時間
放置する。次にそれぞれのウエル中のニトロセ
ルロース膜をPBSで数回洗浄する。次に100培
希釈したペルオキシダーゼ標識やぎ抗マウス
IgG溶液（ガツペル社製）を100μずつ添加す
る。室温で２時間インキユベートし、その後
PBSで５回洗浄を繰返す。次に発色剤（30％
H₂O₂ 6μ、0.3％４−クロロ−１−ナフトー
ル メタノール溶液２ml、PBS10ml）100μ
／穴に分注し、15分間室温に放置する。各穴
より発色剤を除き、蒸留水で３回洗浄し、ニト
ロセルロース膜を乾燥する。ニトロセルロース
膜のウシTdT吸着部分の発色の有無により抗
体価を判定する。すなわち発色のみられる最大
希釈を抗体価とした。 ウシTdTに対する抗体価が2560以上になり、
さらに血清がNalm−18（ヒト白血病細胞確立
株）に対する間接螢光抗体法による細胞染色で
陽性を示したマウスを免疫化マウスとした。そ
して細胞融合を行う４日前に静脈内にウシ
TdT（100μｇ／匹）を追加投与した免疫化マウ
スの脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。 (3) マウスミエローマ マウスミエローマ（マウス骨髄腫細胞）として
は、８−アザグアニン耐性マウス ミエローマを
使用する。例えば P3−NSI−１−Ag4−１（NS−１）、European
J.Immun.６ 511−519（1976） P3−X63−Ag8−U1（P3U1）、Current topics
in Microbiology＆Immunology81 １〜７
（1978） X63−Ag8−6.5.3（X6.5.3）、J.Immun.123
1548−1550（1979） SP2／０−Ag14（SP−２）、Nature276 269〜
270（1980） などの細胞が挙げられる。 (4) 細胞融合例 細胞融合例は常法に従つて行うことが出来
る。 上記免疫化マウスの脾細胞１×10⁸個と８−
アザグアニン耐性マウスミエローマ１×10⁷に
なるように混合し、遠心分離にかける。上清液
を捨て、沈殿した細胞をよくほぐした後、撹拌
しながら45％ポリエチレングリコール
（PEG6000 0.45ｇ、RPMI₁₆₄₀培地0.55ml）１ml
をゆつくり加える。７分間静置した後に
BPMI₁₆₄₀培地20mlを撹拌しながら加える。遠
心分離後、上清液を捨て、細胞を穏かに100ml
培養液（20ml牛胎児血清、80mlRPMI₁₆₄₀培地、
6.6mgカナマイシン、Ｌ−グルタミン58mg、重
炭酸水素ナトリウム0.12ｇ）に懸濁させる。こ
の懸濁液を96穴培養プレートの各穴に100μ
ずつ分注し、５％CO₂インキユベーター中37℃
で16〜24時間培養する。 培養プレートの各穴に100μのHAT培地
（前記培養液に100μMヒポキサンチン、0.4μM
アミノプテリン、16μMチミジンを加えた培
地）を加え、さらに24時間培養する。培養上清
の半容量を捨て、新たにHAT培地を同量加え
培養する。以後３日間隔ごとにHAT培地を半
量交換しながら10〜14日間培養を続ける。細胞
の生育してきた穴について、HAT培地をHT
培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた
培地）に切り換え培養を続ける。細胞が十分生
育したところで培地中の上清液の一部をとり上
記の方法によりウシTdTに対する抗体価を測
定する。 抗体価の認められた穴の細胞について、限界
希釈法によりクローニングを行い、ウシTdT
に対する抗体価を有するクローンを、抗ウシ
TdTモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
株として選択する。 (5) モノクローナル抗体の調製例 抗ウシTdTモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ株の培養上清液をモノクローナル抗体
として利用できる。あるいは、プリスタン0.5
mlを腹腔内に投与したマウス（BALB／Ｃ）
の腹腔内に上記ハイブリドーマを１〜２×10⁶
個を移植し、１〜14日後にこのマウスの腹水を
採取し、遠心分離で固形物を除去した上清液を
抗ウシTdTモノクローナル抗体として使うこ
ともできる。さらに必要な場合には、培養上清
液あるいは腹水を硫安塩析し、50％飽和硫安画
分をPBSで透析して得てもよい。さらにDEAE
セルロースカラム、ゲルロ過、プロテインＡ−
カラム、オリゴdT・セルロースカラム等によ
り、より精製した抗ウシTdTモノクローナル
抗体を得ることができる。 一般に、モノクローナル抗体が各種動物由来の
TdTに対する抗体である証明は、モノクローナ
ル抗体と各TdTとを反応させ、次いで各TdT活
性の失活の測定により確定することができる。す
なわち、１単位の各種動物のTdTと抗ウシTdT
モノクローナル抗体とを37℃、30分間反応させ、
反応液中のTdT残存活性を常法により測定する
のがよい。あるいは各種動物の骨髄細胞やTdT
陽性白血病細胞とモノクローナル抗体とによる間
接螢光抗体法による細胞染色により確認すること
もできる。 本発明のマウスモノクローナル抗体のアイソタ
イプ、サブクラスの決定は、やぎ抗マウスIgG₁、
やぎ抗マウスIgG_2a、やぎ抗マウスIgG_2b、やぎ抗
マウスIgG₃を吸着させたマイクロプレートを使
つたELISA法で同定できる。 本発明においては、実施例１に示す如く、前記
(4)項に記載した方法によつて、クローンＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈと命名したハイブリドー
マ株を得た。これら各ハイブリドーマ株から得ら
れるモノクローナル抗体は、すべてIgGに属する
イソタイプであり、Ａ、ＢはIgG₁、Ｃ、Ｄは
IgG_2b、Ｅ、Ｆ、ＧはIgG_2aに属していた。次に、
各クローンが生産したモノクローナル抗体をウシ
TdT、ヒトTdTと反応させ、その残存活性を測
定して、各抗体の結合力をみた。その結果を次の
表１に示す。なお、対照にはウサギ抗ウシTdT
血清及び正常マウス血清を用いた。

【表】 上記表１から明らかなように、クローンＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧのIgGはウシTdTによく
結合し、しかもヒトTdTにもよく結合する。特
にクローンＡの生産したIgG₁は、ウシTdTおよ
びヒトTdTに非常によく結合することから、ク
ローンＡは実用化に最も近いクローンとして選択
された。 次に表１と同じ抗体源を用いて、ラツト骨髄細
胞とヒトNalm−18細胞との結合性をみた。その
結果を次の表２に示した。

【表】

【表】 従来の知見より、ラツト骨髄細胞中でTdT陽
性細胞の占める割合は２〜４％とされており、こ
の範囲を越える陽性率はTdT以外を認識したこ
とになり、非特異的反応を示した結果と考えられ
る。また間接螢光抗体法によるTdT陽性細胞の
染色像は、該内が網目状に染まるのが通常であ
る。上記知見及び表２から明らかなように、クロ
ーンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇの生産した抗体
は、TdT陽性細胞に特異的に結合することが確
認できた。 実施例 １ 0.6mlウシTdT溶液（400μｇ蛋白質／ml）を同
量の完全フロイントアジユバントで乳化し、マウ
ス１匹当りその0.1mlを５週令のBALB／Ｃ、♀
マウスの皮下数ケ所に投与した。２週間おきに不
完全フロイントアジユバントで乳化したウシ
TdTを同様に追加投与した。４回目投与後５日
目のマウス血清中の抗体価は6500〜100000であつ
た。４回目投与後21日目に20μｇウシTdT／匹を
尾静脈にブースターとして投与した。 一方、８−アザグアニン耐性マウスミエローマ
P3U1を10％ウシ胎児血清を含むRPMI₁₆₄₀培地に
２×10⁵／mlの濃度に懸濁し、５％CO₂−インキ
ユベーター中37℃で３日間培養し、１×10⁶／ml
の細胞濃度にした。 前記ブースター投与後４日目にマウスより脾臓
を摘出し、常法に従い脾細胞浮遊液を調製した。
脾細胞１×10⁸個とマウスミエローマ１×10⁷個を
混合し、800r.p.mで８分間遠心分離し、上清液を
除去した。 沈殿した細胞をよくほぐした後、撹拌しながら
37℃で１mlの45％ポリエチレングリコール液
（0.45ｇポリエチレングリコール6000と0.55ml
RPMI₁₆₄₀培地）をゆつくり滴下した。７分間37
℃で静置後37℃のRPMI₁₆₄₀培地20mlを３ml／
minの速度で加えた。1000r.p.mで７分間遠心分
離し、上清液を除去し、37℃の20％ウシ胎児血清
を含むRPMI₁₆₄₀培地100mlに懸濁し、24穴培養プ
レートに１ml／穴ずつ分注し、５％CO₂−インキ
ユベータ−37℃で１晩培養した。培養プレートに
１ml／穴ずつHAT培地を添加し24時間培養し
た。次に培養プレートの各穴より培養液１mlを捨
て、新たなHAT培地を１mlずつ添加し培養を行
つた。３日毎にHAT培地の半量交換を行ない、
培養14日後に80％の培養穴に細胞の生育を認め
た。細胞生育培養穴の上清液の抗体価をDot法
で、さらにTdT酵素の失活程度、Nalm−18細胞
ラインの間接螢光抗体法による染色性により、陽
性と認めた培養穴について、マウス胸腺細胞をフ
イーダー細胞として限界希釈法にて0.3細胞／穴
の濃度でクローニングを行ない抗ウシTdTモノ
クローナル抗体産性株としてＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈのクローンを選択した。 0.5mlプリスタン（２、６、10、14−tetra
methyl−pentadecane）を腹腔内に投与し２週間
を経たBALB／Ｃマウス（♀、８週令）の腹腔
に上記で得られた各ハイブリドーマ株２×10⁶個
を移植し、14日間にマウス腹水を採集した（６〜
11ml腹水／匹）。遠心分離し、固形物を除き上清
液に同量の飽和硫安液を加え、沈殿物を少量の
PBSに溶解した。500倍量のPBSで１晩透析し、
粗精製抗ウシTdTモノクローナル抗体を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウシターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
   ンスフエラーゼで免疫したマウス脾臓細胞とマウ
   スミエローマとのハイブリドーマによつて生産さ
   れ、かつ、ヒトターミナルデオキシヌクレオチジ
   ルトランスフエラーゼに反応することを特徴とす
   るモノクローナル抗体。 ２ モノクローナル抗体がIgGイソタイプに属す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   モノクローナル抗体。 ３ モノクローナル抗体が間接螢光抗体法あるい
   は／および酵素抗体法によりターミナルデオキシ
   ヌクレオチジルトランスフエラーゼ陽性細胞を検
   出する方法に使用されるものである特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ４ モノクローナル抗体がサンドウイツチ法によ
   る酵素免疫測定法によりターミナルデオキシヌク
   レオチジルトランスフエラーゼを測定する方法に
   使用されるものである特許請求の範囲第１項記載
   のモノクローナル抗体。 ５ ウシターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
   ンスフエラーゼで免疫したマウス脾臓細胞とマウ
   スミエローマとを融合させて得られ、かつヒトタ
   ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラ
   ーゼに反応するモノクローナル抗体を産生する能
   力を有するハイブリドーマをイン・ビトロで培養
   するかまたは動物の腹腔内に移植することによ
   り、培養液中あるいは腹水中に該モノクローナル
   抗体を産生させ、これらからモノクローナル抗体
   を採取することを特徴とするモノクローナル抗体
   の製造法。