JPS63222699A - 単クローン性抗体及びこれを用いるシユードウリジンψの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は単クローン性抗体に関し、更に詳細には進行癌
のマーカーであるシユードウリジンψ（ｐｍ＠ｄｏｕｒ
ｉｄｌｎｅψ）に対する単クロ−ン性抗体に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

近年癌関連抗原に対する単クローン性抗体を用いた臨床
検査診断が盛んに実施されてきている。また、癌になる
と増加することが知られている物質である癌胎児性抗原
（ＣＩＡ　）、α−７エトｆロテンなどに対する抗体を
用いて同様なことが行われている。

ところで、癌になると増加する物質、すなわち腫瘍マー
カーと呼ばれている物質の中で、進行癌患者尿中に増加
するものとしてシユードウリジンψが知られている。こ
の物質はトランスファー・リボヌクレイツクアシド（ｔ
　−ＲＮＡ）の構成成分の１つであシ、その増加の原因
は、癌組織におけるｔ　−ＲＮＡのブレークダウン（ｂ
ｒｅａｋｄｏｗｎ　）が正常組織に比較し、充進してい
るためであるといわれているが、その増加のメカニズム
の詳細については未解明である０ 現在、このシユードウリジンψ（以下「ψ」と略称する
ことがある）の量を測定し、これから進行癌の存在を判
定する試みがなされているが、ψの定量は高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）　　でおこなわれるため、
？ンゾルの前処理等が煩雑であり、多検体を測定するに
は非常に長時間を要するという欠点があった。

本発明者らは先に、簡便なψの測定法を開発すべく、種
々検討をおこなった結果、ψに対する単クローン性抗体
を断念に作成し、これを用いることによシ、尿サンゾル
の前処理操作を行うことな（ＥＬＩＳ人法を応用した多
検体同時測定方法を実施することができ、測定の迅速化
、簡素化がはかれることを見出し特許出願したく４１！
？願昭６１−１４３４８４号）。

しかしながら、特願昭６１−１４３４８４号に記載され
たψに対する単クローン性抗体は、ウリゾンと９６〜９
９％、ウラシルと３０〜４０％の交叉反応性を有してい
るため、この単クローン性抗体を用いたＩＬｆＳＡによ
るψの定量においては、ψのほかにウリゾンやウラシル
も含めて、測定していた可能性があった。（そのため、
進行癌患者においてさえもψの高　（値例が少ないとｂ
う、これまでのＨＰ　ＬＣによ　（る定量のデータと矛
盾する結果が得られるという欠点があった。

そこで、本発明者らは更に、ψに対する反応特異性の高
Ａ単りローン性抗体を得べく研究をおこなった結果、遊
離のψに対する阻害が強く、ウリゾン及びウラシルに対
する阻害がないかあるいは阻害の極めて弱い単クローン
性抗体はψに対する反応特異性が高く、しかもこれをψ
の測定法に用いた場合、ＨＰＬＣ等による定量のデータ
とよく一致することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は１次の性質 １）　抗体のクラス：　ＩｇＧ１ ２）　抗体価　　　２６４倍 ３）　交叉反応性　　：シユードウリジン　　　１００
％ウリゾン　　　　　　　０％ ウラシル　　　　　　　７％ ５−フルオロウラシル　２８％ を有するψに対する単クローン性抗体及びこれを用いる
φの測定法を提供するものである。

本発明のψに対する単クローン性抗体は、例えば次の如
くして調製される。

すなわち、まず、ψを用いて動物を免疫し、その動物の
牌細胞を採取するＯこの工程において、ψはそれ単独で
は免疫原となり得ないので、適当なキャリア・プロティ
ン（Ｃａｒｒｉ・ｒＰｒｏｔ・１ｍ　）と結合させたの
ち、免疫原として用いる。ψとしては、例えば進行癌患
者の尿中から公知の方法１例えばシグマ（５１ｇｍｍ　
）社から販売されている標品を用いることができ、キャ
リア・プロティンとしては、−・ゾテン部分を免疫担当
細胞が認識−すること全可能にする目的で用いられるノ
ロティン、例えばキーホール・す／ペット・ヘモシアニ
ン、牛血清アルブミン等を用いることができる。また、
このψと千ヤリア・プロティンを結合する方法としては
、例えば、核酸塩基の糖部分を過ヨウ素醗で酸化したの
ちにキャリア・ゾロティンと結合させる等の方法が挙げ
られる。

更に、免疫動物としては、マウス、ラット等が挙げられ
る。

次【得られた免疫動物の牌細胞を骨髄腫細胞と融合し、
ハイプリドーマを得る。細胞融合においては、公知の？
リエデレングリコールを用いる方法及びウィルスを用い
る方法のいずれを用いても良いが、ハイプリドーマのス
クリーニングに当っては、キャリア・ゾロナインに対す
る抗体産生ハイプリドーマを除去するための留意が必要
である。このためには、免疫に用いたキャリア・プロテ
ィンと異なった種由来のノロティンとψを結合させたも
のを抗原としてスクリーニングする等の方法を用いるこ
とが望ましい。

斯くして得られたハイプリドーマは、更に遊離のψ、ウ
リゾン及びクラシルで阻害されるか否か検討し、ψによ
シ強く阻害され、ウリゾン及びウラシルで阻害されない
か、あるいは極めて弱く阻害されるものが選ばれ、以下
常法によシクローニングして目的の抗体を産生ずるハイ
プリドーマを得る。

このハイプリドーマによシ産生される本発明の単クロー
ン性抗体は、前記した如き性質を有するものである。

叙上の如くして得られた単クローン性抗体を用いてψを
測定する場合の例を挙げれば次の通りである〇 すなわち、９６ウエルゾレートに、ψと牛血清アルブミ
ン（Ｂ８ム）の結合物を０２μｔ／穴で添加したのち、
４℃で、１２〜２４ｈｒ放置する。次に各ウェルに１％
ＢＳＡ　ｔ−含むリン駿緩衝生理食塩水（ＰＨ１）ｔ−
１００μｔずつ添加することにより、抗体その他のタン
ノックの非特異的吸着を防止する０次に試料（尿など）
を各ウェルに５０μを添加し、ざらに１本発明の単クロ
ーン性抗体（２０倍希釈液）を各ウェルに５０　ａＬ添
加する。よくかくはんしたのちに％４℃で１時間放置す
る。反応混合物をＰＢＳでよく洗浄したのちに、アルカ
リホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の１００
０倍希釈液を各ウェルに１００μｔずつ添加する。室温
で３０分間反応させたのちに、　ｐｎｓでよく洗い、水
分を切ったのちに基ｉ溶ｆｆ（）”ラニトロフェニルフ
オスフエートＬ　ｗｉ／　ｄ　、　ｐＨ９，８ゾエタノ
ールアミ／バッフ７−）ｔ”１ｏｏＡｔずつ加え、３７
℃で３０分間反応させる。各ウェルの４０５　ｎｍにお
ける吸光度ｔ−ＥＩムリーダーで測定することにより試
料中に存在するφ量の定量を行なう０〔本発明の効果〕 以上のように本発明の単クローン性抗体を用いれば、試
料の前処理ｔ−シとなうことなくψの測定をおこなうこ
とができ、しかもＨＰＬＣの如き犬がかりな装置も必要
としないので。

簡便かつ迅速に進行癌の有無を判定することができる。

また、特願昭６１−１４３４８４号記載の単クローン性
抗体を用いるよりも、よシ特異的なψの定量が可能であ
る。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を説明する。

実施例１ （１）　　免疫原の調製： 癌患者の尿中から常法により分離したψと、キャリアノ
ロティンであるキーホール・リンペット・ヘモシアニン
（Ｋ＠ｙｈｏｌ＠ｌｙｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｓ
　；　ＫＬＨ）をエルランガー（Ｅｒｌａｕｇ＠ｒ　）
とピーザー（Ｂｔ＊ｓ＊ｒ　）の方法（過ヨウ素酸酸化
法）により結合した。すなわちψを過ヨウ素酸で酸化し
、過剰の過ヨウ素酸をエチレングリコールで分解したの
ち、アルカリ性（ＰＨ９〜９．５）条件下でＫＬＨと結
合させ、シック塩基を形成させる。ついでＮａＢＨ４で
還元し、安定化合物を生成させる。

この反応混合物を緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ
７４）中で一晩透析し、未反応のψを除き、このあと凍
結乾燥に付し一２０℃の冷凍庫中に保存した。

（２）　　単クローン性抗体の作成： （１）　　（１１で得たψとＫＬＨ結合物を、フロイン
トの完全アゾユパント（Ｆｒｅｔ＋ｎｄｌｓ　Ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ人ｄｊａｖａｎｔ　）と等量混合し、エマルシ
ョンとしたのち、　　ＢＡＬＩＩ　／　ｅマウスの腹腔
内に一四当Ｆ）５０μを投与した。２回目以降は不完全
アゾエパント（ｉｎｃｏｍｐｌ＠ｔ＠ａｄｊｕｖａｎｔ
　）　′ｔ−用いたエマルションを、１０日間隔で２回
腹腔内に投与した。最終免疫はψ−ＫＬＨ１００μｔ／
ｄ溶液をα２ｄ靜脈内投与した。

（ｉ）　　最終免疫の３日後に、過免疫マウスから摘出
した牌細胞とＢＡＬＥ　／　ｅマウス由来ミエローマ細
胞株ａｐ　２　／　Ｏ−Ａｇ　１４　ｆ　ｄｅリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ　）４０００を用いて融合した。

細胞は９６穴プレートに１００μｔ／穴ずつ加え、２４
時間後に培地の半量をハラ）　（ＨＡＴ　）培地に交換
し２日おきに培地交換した０７〜１０日後にＨＡＴ耐性
のハイプリドーマの成長がみられてくる。この時期に培
地ｔ−ＨＴｉｃ変え、約１０日間培養したのちにハイプ
リドーマ生育培地に変えた０ （ｉ）　　抗体産生細胞のスクリーニングはψと牛血清
アルプミｙ　（ＢＳＡ　）　ｆ：結合させたものを抗原
として用い２抗体エライザ（ＥＬＩ８人）法により行っ
た。この方法により、キャリアプロティンに対する抗体
を産生ずるノーイブリドーマの除外に成功した０次にψ
による阻害カニかかるか否かを検討することによりψと
特異的に反応する単クローン性抗体を産生ずるノ・イブ
リドーマを選択したＯこのノ・イブ１）ドーマについて
、更にウリゾン及びウラシルによる阻害がかかるか否か
をムＮＴＩＣＡＮＣＩＲＲＥ８ＥＡＲＣＨ６：　　１３
５　−　１．３８　　（１９８６）　　、ＣＡＭＣＥＲ
Ｒ］Ｃ８ＥムＲＣＨ４６，３１６４−３１６７（１９８
６）、　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｌｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、８Ｌ　（１９８５）１６
９−１８５等に開示の方法に準じて検討し、これらに対
する阻害が無いか、あるいはあっても極めて弱いものを
選択した。ここで選択された細胞株を限界希釈法により
クローン化し単クローン性抗体産生ハイプリドーマクロ
ーンを樹立した０ （３）単クローン性抗体の性質： ψに対する単クローン性抗体のクラス（サブクラス）は
ＩｇＧ、であった。抗体価は６４倍（培養上清ｔ−２段
階希釈し、それぞれとψ−Ｂ８Ａ　ｔ−反応させるＥＬ
Ｉ８Ａｔ−行ナツタ時、最も高い吸光度を持続する希釈
倍率を抗体価とした）であった。また％種々のプリン、
ビリミシン、修飾、非修飾ヌクレオシドおよび塩基類と
の交叉反応性を検討したところ、ウリゾンとは交叉せず
、ウラシルと７％、５−フルオロクラシルと２８％の交
叉反応性を示したが他の化合物とは、交叉反応性を示さ
なかったＯ 実施例２ ψの２００ｈ　１００ｖ　５０ｓ　２０ｓ　Ｌ　Ｏ１５
，２％１　ｓ　ａ　ｂ　（μｔ　／　ｄ　）溶液をあら
かじめψ−ＢＳＡα３μｔ／穴でコートされた９６穴ゾ
レートヘ５０μｔずつ加え、実施例１で得られた単クロ
ーン性抗体の２０倍希釈液を５０μｔずつ加え、競合阻
害実験を行なった０この結果、図１に示すように遊離の
ψの用量に依存して抗体とψ−ＢＢムの結合が阻害され
ることが明らかとなった。本革クローン性抗体を用いる
ψの定量範囲は１〜５０μｆ／ＮＩであった０ 実施例３ 実施例２のψ溶液にかえて試料として、正常人および癌
患者の尿を用い、同様に競合阻害試験を行なった。実施
例２の結果から得た検量線を用い、試料中のφ量を測定
した。特願昭６１−１４３４８４号に記載されたψに対
する単クローン性抗体についても同様の測定を行なうこ
とにより、両単クローン性抗体の比較を行なったところ
、φ値が（平均＋２×標準偏差）値を越えた癌患者は新
抗体では６／６、旧抗体では１／６であつ九。

この結果を表１に示した。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の単クローン性抗体の、ψに対する検量
線である。 以上 出願人　財団法人　仙台微生物研究所 ；ｌ゛−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質、 （１）抗体のクラス：ＩｇＧ＿１ （２）抗体価：６４倍 （３）交叉反応性：シユードウリジン１００％ ウリゾン　０％ ウラシル　７％ ５−フルオロウラシル　２８％ を有するシユードウリジンφに対する単クローン性抗体
   。 ２、被検体に、下に示す性質を有するシユードウリジン
   φに対する単クローン性抗体を加え、生じたシユードウ
   リジンφ−単クローン性抗体複合物量を測定することを
   特徴とするシユードウリジンφの測定法。 （１）抗体のクラス：ＩｇＧ＿１ （２）抗体価：６４倍 （３）交叉反応性：シユードウリジン１００％ ウリジン　０％ ウラシル　７％ ５−フルオロウラシル　２８％