JPH0690784A - モノクローナル抗体及びその利用 - Google Patents
モノクローナル抗体及びその利用Info
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- JPH0690784A JPH0690784A JP4240690A JP24069092A JPH0690784A JP H0690784 A JPH0690784 A JP H0690784A JP 4240690 A JP4240690 A JP 4240690A JP 24069092 A JP24069092 A JP 24069092A JP H0690784 A JPH0690784 A JP H0690784A
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- neocarzinostatin
- antibody
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを認識し得るモノ
クローナル抗体、ＮＣＳ−Ａｐｏを免疫原として用いて
得た当該モノクローナル抗体産生能を有する免疫細胞と
形質細胞腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ、
当該モノクローナル抗体を利用するＮＣＳ及びＮＣＳ−
Ａｐｏの測定法及び単離・精製法。 【効果】 本発明のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的
に認識するモノクローナル抗体を使用すれば、検体中の
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを定量的に測定できると共
に、培養液等の中からＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを有利
に単離・精製することができる。
クローナル抗体、ＮＣＳ−Ａｐｏを免疫原として用いて
得た当該モノクローナル抗体産生能を有する免疫細胞と
形質細胞腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ、
当該モノクローナル抗体を利用するＮＣＳ及びＮＣＳ−
Ａｐｏの測定法及び単離・精製法。 【効果】 本発明のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的
に認識するモノクローナル抗体を使用すれば、検体中の
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを定量的に測定できると共
に、培養液等の中からＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを有利
に単離・精製することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なモノクローナル抗
体、更に詳細には、ネオカルチノスタチン（ＮＣＳと称
する）及びネオカルチノスタチン−アポプロテイン（Ｎ
ＣＳ−Ａｐｏと称する）を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体、このモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ、並びにこのモノクローナル抗体を利用するＮＣ
Ｓ及びＮＣＳ−Ａｐｏの免疫学的測定法並びにこれらの
単離・精製法に関する。
体、更に詳細には、ネオカルチノスタチン（ＮＣＳと称
する）及びネオカルチノスタチン−アポプロテイン（Ｎ
ＣＳ−Ａｐｏと称する）を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体、このモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ、並びにこのモノクローナル抗体を利用するＮＣ
Ｓ及びＮＣＳ−Ａｐｏの免疫学的測定法並びにこれらの
単離・精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ネオカ
ルチノスタチン（ＮＣＳ）は放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ ｖａｒ．Ｆ
−４１株の培養ろ液から発見された抗腫瘍性抗生物質で
あり、現在、急性白血病、膵臓がん、胃がん、膀胱がん
等に広く臨床応用されている。しかしながら、培養ろ液
あるいは生体内中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの定量的
解析に必要な、十分な感度や定量性を併せ持つ検討手段
は報告されていない。
ルチノスタチン（ＮＣＳ）は放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ ｖａｒ．Ｆ
−４１株の培養ろ液から発見された抗腫瘍性抗生物質で
あり、現在、急性白血病、膵臓がん、胃がん、膀胱がん
等に広く臨床応用されている。しかしながら、培養ろ液
あるいは生体内中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの定量的
解析に必要な、十分な感度や定量性を併せ持つ検討手段
は報告されていない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に鑑み、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの定量的解析法を確
立すべく、鋭意検討を行った結果、ＮＣＳ−Ａｐｏに対
するモノクローナル抗体を調製し、これを用いることに
より、菌体の産生するＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを定量
的に解析し得ることを見い出した。
に鑑み、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの定量的解析法を確
立すべく、鋭意検討を行った結果、ＮＣＳ−Ａｐｏに対
するモノクローナル抗体を調製し、これを用いることに
より、菌体の産生するＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを定量
的に解析し得ることを見い出した。
【０００４】すなわち、本願は以下の発明を提供するも
のである。 （１）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体。 （２）ＮＣＳ−Ａｐｏを免疫原として用いて得られた、
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得るモノク
ローナル抗体の産生能を有する免疫細胞と形質細胞腫細
胞とを融合して得られるハイブリドーマ。 （３）免疫学的測定法により検体中のＮＣＳ及びＮＣＳ
−Ａｐｏを検出する方法において、ＮＣＳ及びＮＣＳ−
Ａｐｏを特異的に認識し得るモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの検出方
法。 （４）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体及び／又は当該モノクローナル抗体
の標識体を含むことを特徴とするＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａ
ｐｏの測定キット。 （５）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体を抗原抗体反応により検体組織の一
部に結合せしめることを特徴とする検体組織中における
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの検索方法。 （６）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを含む菌体培養液中か
らＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを単離・精製する方法にお
いて、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体を使用することを特徴とするＮＣＳ
及びＮＣＳ−Ａｐｏの単離・精製法。
のである。 （１）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体。 （２）ＮＣＳ−Ａｐｏを免疫原として用いて得られた、
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得るモノク
ローナル抗体の産生能を有する免疫細胞と形質細胞腫細
胞とを融合して得られるハイブリドーマ。 （３）免疫学的測定法により検体中のＮＣＳ及びＮＣＳ
−Ａｐｏを検出する方法において、ＮＣＳ及びＮＣＳ−
Ａｐｏを特異的に認識し得るモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの検出方
法。 （４）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体及び／又は当該モノクローナル抗体
の標識体を含むことを特徴とするＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａ
ｐｏの測定キット。 （５）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体を抗原抗体反応により検体組織の一
部に結合せしめることを特徴とする検体組織中における
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの検索方法。 （６）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを含む菌体培養液中か
らＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを単離・精製する方法にお
いて、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得る
モノクローナル抗体を使用することを特徴とするＮＣＳ
及びＮＣＳ−Ａｐｏの単離・精製法。
【０００５】本発明のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異
的に認識できるモノクローナル抗体はＮＣＳ−Ａｐｏを
抗原決定基として利用して製造することができる。ここ
で用いられるＮＣＳ−Ａｐｏとしては、菌体培養液から
単離・精製したもの、合成したもの、あるいは市販され
ている標準品等を用いることができる。
的に認識できるモノクローナル抗体はＮＣＳ−Ａｐｏを
抗原決定基として利用して製造することができる。ここ
で用いられるＮＣＳ−Ａｐｏとしては、菌体培養液から
単離・精製したもの、合成したもの、あるいは市販され
ている標準品等を用いることができる。
【０００６】このＮＣＳ−Ａｐｏを免疫抗原として免疫
した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の形質細胞腫細胞と
のハイブリドーマを作成し、これによりＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏを認識する所望抗体を産生するクローンを選
択し、当該クローンを培養することにより所望のモノク
ローナル抗体を製造することができる。
した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の形質細胞腫細胞と
のハイブリドーマを作成し、これによりＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏを認識する所望抗体を産生するクローンを選
択し、当該クローンを培養することにより所望のモノク
ローナル抗体を製造することができる。
【０００７】免疫される哺乳動物の種類は、特に限定さ
れず、マウス、ラット等が挙げられるが、細胞融合に使
用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するの
が好ましく、かかる点よりマウスが実用上有利に用いら
れる。
れず、マウス、ラット等が挙げられるが、細胞融合に使
用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するの
が好ましく、かかる点よりマウスが実用上有利に用いら
れる。
【０００８】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原として用いるＮＣＳ−Ａｐｏを哺乳動物に静脈内、
皮内、皮下、腹腔内注射等により投与することにより行
われる。より具体的には、上記免疫抗原を、必要に応じ
て通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜１４
日毎に数回投与し、例えばマウスの場合には、上記免疫
抗原の投与量が２０μｇ／マウス程度となるように投与
するのが好ましい。免疫細胞としては上記最終投与の３
日程度後に摘出した脾細胞を使用するのが望ましい。
抗原として用いるＮＣＳ−Ａｐｏを哺乳動物に静脈内、
皮内、皮下、腹腔内注射等により投与することにより行
われる。より具体的には、上記免疫抗原を、必要に応じ
て通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜１４
日毎に数回投与し、例えばマウスの場合には、上記免疫
抗原の投与量が２０μｇ／マウス程度となるように投与
するのが好ましい。免疫細胞としては上記最終投与の３
日程度後に摘出した脾細胞を使用するのが望ましい。
【０００９】次に得られた免疫細胞を形質細胞腫細胞と
融合し、ハイブリドーマを得る。細胞融合においては、
公知のポリエチレングリコールを用いる方法〔Ｍａｒｃ
Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｃ．Ｄ．Ｗｉｄｅ＆Ｇ．Ｋｏｈｌｅ
ｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７
８）〕、Ｓｅｎｄａｉ Ｖｉｒｕｓにより融合する方法
〔Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕ
ｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）又はＢｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９
７６）〕、あるいは電気パルスによる方法〔Ｊ．Ｖｉｅ
ｎｋｅｎ＆Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ，１３７，１１−１３（１９８２）〕のいず
れを用いてもよい。
融合し、ハイブリドーマを得る。細胞融合においては、
公知のポリエチレングリコールを用いる方法〔Ｍａｒｃ
Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｃ．Ｄ．Ｗｉｄｅ＆Ｇ．Ｋｏｈｌｅ
ｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７
８）〕、Ｓｅｎｄａｉ Ｖｉｒｕｓにより融合する方法
〔Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕ
ｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）又はＢｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９
７６）〕、あるいは電気パルスによる方法〔Ｊ．Ｖｉｅ
ｎｋｅｎ＆Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ，１３７，１１−１３（１９８２）〕のいず
れを用いてもよい。
【００１０】この様にハイブリドーマを経由して本発明
のモノクローナル抗体を製造する際の、形質細胞腫細胞
は、免疫細胞と同一種の動物からのものが好ましく、免
疫細胞としてマウス脾細胞を用いる場合にはマウス由来
ミエローマ細胞を用いるのが好ましい。
のモノクローナル抗体を製造する際の、形質細胞腫細胞
は、免疫細胞と同一種の動物からのものが好ましく、免
疫細胞としてマウス脾細胞を用いる場合にはマウス由来
ミエローマ細胞を用いるのが好ましい。
【００１１】免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、
通常形質細胞腫細胞１に対して、免疫細胞１〜１０程度
である。融合反応時の培地としては、形質細胞腫細胞の
増殖に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１
６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養に一
般的に利用されるものを例示でき、通常これらの培地に
は、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血液補液は添加しないの
が好ましい。
通常形質細胞腫細胞１に対して、免疫細胞１〜１０程度
である。融合反応時の培地としては、形質細胞腫細胞の
増殖に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１
６４０培地、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養に一
般的に利用されるものを例示でき、通常これらの培地に
は、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血液補液は添加しないの
が好ましい。
【００１２】融合法として前出のポリエチレングリコー
ルを用いる方法を採用する場合には、上記免疫細胞と形
質細胞腫細胞の所定量を上記培地内でよく混合し、予め
３７℃程度に加温したポリエチレングリコール溶液、例
えば平均分子量が１０００〜６０００程度のものを、通
常培地に３０〜６０v/v ％程度の濃度で加えて混ぜ合わ
せることにより行われる。以後、培地を逐次添加して遠
心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより所望の
ハイブリドーマが形成される。
ルを用いる方法を採用する場合には、上記免疫細胞と形
質細胞腫細胞の所定量を上記培地内でよく混合し、予め
３７℃程度に加温したポリエチレングリコール溶液、例
えば平均分子量が１０００〜６０００程度のものを、通
常培地に３０〜６０v/v ％程度の濃度で加えて混ぜ合わ
せることにより行われる。以後、培地を逐次添加して遠
心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより所望の
ハイブリドーマが形成される。
【００１３】得られた所望のハイブリドーマの分離は、
通常の選別培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、
アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養するこ
とにより行われる。当該ＨＡＴ培地での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時
間、具体的には数日〜数週間程度行われる。かくして得
られるハイブリドーマは、通常、限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。
通常の選別培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、
アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養するこ
とにより行われる。当該ＨＡＴ培地での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時
間、具体的には数日〜数週間程度行われる。かくして得
られるハイブリドーマは、通常、限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。
【００１４】目的の抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩ
ＳＡ法〔Ｅｎｇｖａｌｌ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）〕、プラー
ク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー（Ｏｕｃ
ｈｔｏｅｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０−５３頁、昭和５
７年３月５日）に従って行うことができる。
ＳＡ法〔Ｅｎｇｖａｌｌ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）〕、プラー
ク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー（Ｏｕｃ
ｈｔｏｅｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０−５３頁、昭和５
７年３月５日）に従って行うことができる。
【００１５】上記により得られるＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａ
ｐｏを認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、通常公知の培地で継代培養することが
可能であり、また液体窒素中で長期間保存することがで
きる。
ｐｏを認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、通常公知の培地で継代培養することが
可能であり、また液体窒素中で長期間保存することがで
きる。
【００１６】上記ハイブリドーマから本発明のモノクロ
ーナル抗体を採取するには、上記ハイブリドーマを常法
に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるい
はハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与
して増殖させ、その腹水として得る方法等を採用するこ
とができる。また、免疫された動物の細胞より調製され
る抗体産生に関る遺伝子を試験管内に発現させ〔Ｖ．
Ｔ．Ｏｉ，Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｈｅｒ
ｚｅｎｂｅｒｇ＆Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，８２５−８２９（１
９８３）〕、かかるモノクローナル抗体を製造すること
もできる。
ーナル抗体を採取するには、上記ハイブリドーマを常法
に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるい
はハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与
して増殖させ、その腹水として得る方法等を採用するこ
とができる。また、免疫された動物の細胞より調製され
る抗体産生に関る遺伝子を試験管内に発現させ〔Ｖ．
Ｔ．Ｏｉ，Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｈｅｒ
ｚｅｎｂｅｒｇ＆Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，８２５−８２９（１
９８３）〕、かかるモノクローナル抗体を製造すること
もできる。
【００１７】上記のごとくして得られたモノクローナル
抗体は、更に塩析、ゲルろ過法、アフィニティークロマ
トグラフィー等の通常の手段により精製することができ
る。
抗体は、更に塩析、ゲルろ過法、アフィニティークロマ
トグラフィー等の通常の手段により精製することができ
る。
【００１８】かくして得られる本発明のモノクローナル
抗体は、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏに対して特異的な反
応性を有するものである。なお、本発明のモノクローナ
ル抗体のクラスとしては、ＩｇＧが好ましく、そのなか
でもＩｇＧ1 やＩｇＧ2aが好適であり、殊にＩｇＧ1 の
クラスのモノクローナル抗体がＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏの認識における反応特異性が高く、かつ抗体価が高い
ことから有利である。
抗体は、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏに対して特異的な反
応性を有するものである。なお、本発明のモノクローナ
ル抗体のクラスとしては、ＩｇＧが好ましく、そのなか
でもＩｇＧ1 やＩｇＧ2aが好適であり、殊にＩｇＧ1 の
クラスのモノクローナル抗体がＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏの認識における反応特異性が高く、かつ抗体価が高い
ことから有利である。
【００１９】次に、本発明のモノクローナル抗体を用い
るＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの免疫学的測定法について
説明する。本発明の免疫学的測定法においては、直接
法、拮抗阻害法、サンドウィッチ法、サンドウィッチに
よる拮抗阻害法などが用いられる。検体もしくはモノク
ローナル抗体は単体に固定化しておくのが好ましい。固
定化の方法は公知の方法を採用でき、担体としては各種
の固相担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リアクリレート、テフロン、ポリアセタール等を用い
た、ボール又はビーズ、ギヤ、マイクロプレート等が好
ましく使用される。
るＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの免疫学的測定法について
説明する。本発明の免疫学的測定法においては、直接
法、拮抗阻害法、サンドウィッチ法、サンドウィッチに
よる拮抗阻害法などが用いられる。検体もしくはモノク
ローナル抗体は単体に固定化しておくのが好ましい。固
定化の方法は公知の方法を採用でき、担体としては各種
の固相担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リアクリレート、テフロン、ポリアセタール等を用い
た、ボール又はビーズ、ギヤ、マイクロプレート等が好
ましく使用される。
【００２０】また、モノクローナル抗体の標識化の方法
や手段、それの検出方法や手段は何ら限定されるもので
はなく、公知の方法や手段、例えば、放射性物質又は酵
素もしくは蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体
又はプロテインＡとの２次反応により測定することがで
きる。標識剤としては、酵素を用いる方法（ＥＩＡ）で
は西洋わさびパーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素が、放射性物
質を用いる方法（ＲＩＡ）では 125Ｉ、 3Ｈ等が、蛍光
物質を用いる方法（ＦＩＡ）ではフルオレセインイソチ
オサイアネート等が通常使用されるが、その標識剤の活
性が可能であれば、その他のものであってもよい。
や手段、それの検出方法や手段は何ら限定されるもので
はなく、公知の方法や手段、例えば、放射性物質又は酵
素もしくは蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体
又はプロテインＡとの２次反応により測定することがで
きる。標識剤としては、酵素を用いる方法（ＥＩＡ）で
は西洋わさびパーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素が、放射性物
質を用いる方法（ＲＩＡ）では 125Ｉ、 3Ｈ等が、蛍光
物質を用いる方法（ＦＩＡ）ではフルオレセインイソチ
オサイアネート等が通常使用されるが、その標識剤の活
性が可能であれば、その他のものであってもよい。
【００２１】標識剤が酵素である場合には、その活性を
測定するために基質が用いられる。その基質としては、
例えば西洋わさびパーオキシダーゼの基質としての２，
２′−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホ
ン酸］アンモニウム酸（ＡＢＴＳ）−Ｈ2Ｏ2、５−アミ
ノサリチル酸−Ｈ2Ｏ2、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ 2
Ｏ2、４−アミノアンチピリン−Ｈ2Ｏ2などを、またβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてのフルオレセイン
−ジ−（β−ガラクトピラノシド）、ｏ−ニトロフェノ
ール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを挙げることが
できる。測定のためには、これらの試薬以外にも溶解
剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が使用される。
また抗原−抗体複合体の偏光を利用する方法を用いるこ
ともできる。
測定するために基質が用いられる。その基質としては、
例えば西洋わさびパーオキシダーゼの基質としての２，
２′−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホ
ン酸］アンモニウム酸（ＡＢＴＳ）−Ｈ2Ｏ2、５−アミ
ノサリチル酸−Ｈ2Ｏ2、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ 2
Ｏ2、４−アミノアンチピリン−Ｈ2Ｏ2などを、またβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてのフルオレセイン
−ジ−（β−ガラクトピラノシド）、ｏ−ニトロフェノ
ール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを挙げることが
できる。測定のためには、これらの試薬以外にも溶解
剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が使用される。
また抗原−抗体複合体の偏光を利用する方法を用いるこ
ともできる。
【００２２】本発明の免疫学的測定法に用いられる検体
としては、例えば菌体培養液、ヒト若しくはヒト以外の
動物の体液自体又はこれに処理を施したものを例示する
ことができるが、体液自体を用いる方法が簡便かつ有利
である。
としては、例えば菌体培養液、ヒト若しくはヒト以外の
動物の体液自体又はこれに処理を施したものを例示する
ことができるが、体液自体を用いる方法が簡便かつ有利
である。
【００２３】また、本発明は、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏを特異的に認識し得るモノクローナル抗体及び／又は
当該モノクローナル抗体の標識体を含むＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの測定用キットをも提供するものである。こ
の測定用キットにおけるＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特
異的に認識し得るモノクローナル抗体及び当該モノクロ
ーナル抗体の標識体は前述と同様であるが、これらの他
に必要に応じ標識体や標識化抗体の検出試薬を含んでい
てもよい。
ｏを特異的に認識し得るモノクローナル抗体及び／又は
当該モノクローナル抗体の標識体を含むＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの測定用キットをも提供するものである。こ
の測定用キットにおけるＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特
異的に認識し得るモノクローナル抗体及び当該モノクロ
ーナル抗体の標識体は前述と同様であるが、これらの他
に必要に応じ標識体や標識化抗体の検出試薬を含んでい
てもよい。
【００２４】更に、本発明においては、当該モノクロー
ナル抗体を抗原抗体反応により検体組織の一部に結合せ
しめることによって検体組織中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａ
ｐｏを検索することができる。かかる検索方法における
検体組織とは、ヒト以外の動物又はヒトの細胞又は組織
切片を意味するが、ヒトの組織等を用いるのが実用上好
適である。なお、かかる細胞又は組織切片は通常アセト
ン、ホルマリン、パラホルムアルデヒド等で固定して用
いられる。
ナル抗体を抗原抗体反応により検体組織の一部に結合せ
しめることによって検体組織中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａ
ｐｏを検索することができる。かかる検索方法における
検体組織とは、ヒト以外の動物又はヒトの細胞又は組織
切片を意味するが、ヒトの組織等を用いるのが実用上好
適である。なお、かかる細胞又は組織切片は通常アセト
ン、ホルマリン、パラホルムアルデヒド等で固定して用
いられる。
【００２５】本発明の検索法は、更に具体的には、組織
に当該モノクローナル抗体を作用させることにより免疫
反応を生じさせて、組織におけるＮＣＳ、ＮＣＳ−Ａｐ
ｏ及びその代謝体の存在部位にそのモノクローナル抗体
を結合せしめることを特徴としている。更にその後、例
えば当該モノクローナル抗体を認識するビオチン化抗体
で処理し、更に酵素標識アビジンを作用させる等の方法
によって組織における当該ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏ類
の存在部位を金コロイド等による染色や発色色素による
発色等で標識化せしめてＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの体
内動態の解析を可能にする。
に当該モノクローナル抗体を作用させることにより免疫
反応を生じさせて、組織におけるＮＣＳ、ＮＣＳ−Ａｐ
ｏ及びその代謝体の存在部位にそのモノクローナル抗体
を結合せしめることを特徴としている。更にその後、例
えば当該モノクローナル抗体を認識するビオチン化抗体
で処理し、更に酵素標識アビジンを作用させる等の方法
によって組織における当該ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏ類
の存在部位を金コロイド等による染色や発色色素による
発色等で標識化せしめてＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの体
内動態の解析を可能にする。
【００２６】更にまた、当該モノクローナル抗体を用い
れば、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを含む菌体培養液か
ら、有利にＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを単離・精製する
ことができる。
れば、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを含む菌体培養液か
ら、有利にＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを単離・精製する
ことができる。
【００２７】この単離・精製法には、当該モノクローナ
ル抗体を固定化したアフィニティカラムが好適に使用さ
れる。このアフィニィカラムの被結合担体としてはアガ
ロース、セファロース、ポリ塩化ビニル、ナイロン又は
ポリスチレン等の本発明モノクローナル抗体と結合し得
る素材であれば特に限定されないが、その中でも結合体
の安定性、分離の再現性及び各種スペーサーとの反応性
等の点で、アガロース及びセファロースが好ましい。モ
ノクローナル抗体の担体への結合方法も、酸無水物法、
Ｎ−ヒドロキシサクシイミド法及びグルタルアルデヒド
法等の通常公知の方法を用いることができ、ＮＢＳ［Ｎ
−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）サクシイミド］
等のスペーサーを介して結合させることもできる。すな
わち、本発明の単離・精製法は、例えば菌体培養液中の
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを上記アフィニティカラムに
結合・溶出させ、これをＨＰＬＣ等により単離・精製す
ることにより実施できる。
ル抗体を固定化したアフィニティカラムが好適に使用さ
れる。このアフィニィカラムの被結合担体としてはアガ
ロース、セファロース、ポリ塩化ビニル、ナイロン又は
ポリスチレン等の本発明モノクローナル抗体と結合し得
る素材であれば特に限定されないが、その中でも結合体
の安定性、分離の再現性及び各種スペーサーとの反応性
等の点で、アガロース及びセファロースが好ましい。モ
ノクローナル抗体の担体への結合方法も、酸無水物法、
Ｎ−ヒドロキシサクシイミド法及びグルタルアルデヒド
法等の通常公知の方法を用いることができ、ＮＢＳ［Ｎ
−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）サクシイミド］
等のスペーサーを介して結合させることもできる。すな
わち、本発明の単離・精製法は、例えば菌体培養液中の
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを上記アフィニティカラムに
結合・溶出させ、これをＨＰＬＣ等により単離・精製す
ることにより実施できる。
【００２８】
【発明の効果】本発明のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特
異的に認識するモノクローナル抗体を使用すれば、検体
中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを定量的に測定できると
共に、培養液等の中からＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを有
利に単離・精製することができる。
異的に認識するモノクローナル抗体を使用すれば、検体
中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを定量的に測定できると
共に、培養液等の中からＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを有
利に単離・精製することができる。
【００２９】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】（１）免疫原の調製 ＮＣＳ粉末１０ｇを０．１Ｎ塩酸：メタノール（１：１
０）５００ml中で４℃にて攪拌し、不溶性画分を得た。
これを脱イオン水に懸濁し１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で
pHを６．０〜７．０に修正後、透析した後、凍結乾燥
し、８．４ｇのＮＣＳ−Ａｐｏを得た。
０）５００ml中で４℃にて攪拌し、不溶性画分を得た。
これを脱イオン水に懸濁し１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で
pHを６．０〜７．０に修正後、透析した後、凍結乾燥
し、８．４ｇのＮＣＳ−Ａｐｏを得た。
【００３１】（２）モノクローナル抗体の調製 （１）で得た免疫原２０μｇを滅菌生理食塩水０．２ml
に溶解し、同量のフロイントの完全アジュバント（Ｆｒ
ｅｕｎｄ′ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）
と混合しエマルジョンとした後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの
皮下内に投与した。２回目以降は滅菌生理食塩水０．２
mlに溶解したＮＣＳ−Ａｐｏ２０μｇを、同量のフロイ
ントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）に懸濁後１０日間隔で
３回腹腔内投与した。最終免疫はＮＣＳ−Ａｐｏ２０μ
ｇを含む０．２mlの滅菌生理食塩水を静脈内投与するこ
とにより行った。
に溶解し、同量のフロイントの完全アジュバント（Ｆｒ
ｅｕｎｄ′ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）
と混合しエマルジョンとした後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの
皮下内に投与した。２回目以降は滅菌生理食塩水０．２
mlに溶解したＮＣＳ−Ａｐｏ２０μｇを、同量のフロイ
ントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）に懸濁後１０日間隔で
３回腹腔内投与した。最終免疫はＮＣＳ−Ａｐｏ２０μ
ｇを含む０．２mlの滅菌生理食塩水を静脈内投与するこ
とにより行った。
【００３２】最終免疫の３日後に過免疫マウスから摘出
した脾細胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞株
ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４をポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）４０００を用いて融合した。細胞は９６穴マイクロ
プレートに１００μｌ／ウエルずつ加え、２４時間後に
培地の半量をＨＡＴ培地に交換し２日おきに培地交換し
た。７〜１０日後にＨＡＴ耐性のハイブリドーマの成長
がみられてくる。この時期に培地をＨＴに変え、約１０
日間培養した後にハイブリドーマ生育培地に変えた。
した脾細胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞株
ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４をポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）４０００を用いて融合した。細胞は９６穴マイクロ
プレートに１００μｌ／ウエルずつ加え、２４時間後に
培地の半量をＨＡＴ培地に交換し２日おきに培地交換し
た。７〜１０日後にＨＡＴ耐性のハイブリドーマの成長
がみられてくる。この時期に培地をＨＴに変え、約１０
日間培養した後にハイブリドーマ生育培地に変えた。
【００３３】抗体産生細胞のスクリーニングは、ＮＣＳ
−Ａｐｏを抗原として用いたＥＬＩＳＡ法を行うことに
より、抗原と強く反応するハイブリドーマを選択でき、
またＮＣＳ−Ａｐｏを抗原とし、ハイブリドーマ培養上
清添加時に種々濃度のＮＣＳ−Ａｐｏを加え、その用量
依存的な阻害効果を受ける抗体を産生するハイブリドー
マを選択することにより、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏに
対する特異性を有する抗体が選択された。ここで選択さ
れた細胞株を限界希釈法によりクローン化し、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。なお、ＮＣ
Ｓ及びＮＣＳ−Ａｐｏの測定には、ハイブリドーマをプ
リスタン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウスに移植して１０〜
１５日目に腹水を採取し、５０％飽和硫安塩析法により
精製したモノクローナル抗体を用いた。
−Ａｐｏを抗原として用いたＥＬＩＳＡ法を行うことに
より、抗原と強く反応するハイブリドーマを選択でき、
またＮＣＳ−Ａｐｏを抗原とし、ハイブリドーマ培養上
清添加時に種々濃度のＮＣＳ−Ａｐｏを加え、その用量
依存的な阻害効果を受ける抗体を産生するハイブリドー
マを選択することにより、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏに
対する特異性を有する抗体が選択された。ここで選択さ
れた細胞株を限界希釈法によりクローン化し、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。なお、ＮＣ
Ｓ及びＮＣＳ−Ａｐｏの測定には、ハイブリドーマをプ
リスタン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウスに移植して１０〜
１５日目に腹水を採取し、５０％飽和硫安塩析法により
精製したモノクローナル抗体を用いた。
【００３４】なお、ここで得られたハイブリドーマ（Ａ
ＰＯＩＣ７Ｄ４）は微工研菌寄第１３０７６号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３０７６）として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。
ＰＯＩＣ７Ｄ４）は微工研菌寄第１３０７６号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３０７６）として工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。
【００３５】（３）モノクローナル抗体の性質 ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏに対するモノクローナル抗体
のクラス（サブクラス）はＩｇＧ1 であった。抗体価は
５０００倍（マウス腹水から精製した抗体を２段階希釈
し、それぞれと精製ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを反応さ
せるＥＬＩＳＡ法を行ったとき、最も高い吸光度の持続
する希釈倍数を抗体価とした。）であった。得られたモ
ノクローナル抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけの分子
量は約１５０ｋ、他の菌体成分との交差反応性はいずれ
も認められず、高いＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏ特異性が
示された。
のクラス（サブクラス）はＩｇＧ1 であった。抗体価は
５０００倍（マウス腹水から精製した抗体を２段階希釈
し、それぞれと精製ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを反応さ
せるＥＬＩＳＡ法を行ったとき、最も高い吸光度の持続
する希釈倍数を抗体価とした。）であった。得られたモ
ノクローナル抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけの分子
量は約１５０ｋ、他の菌体成分との交差反応性はいずれ
も認められず、高いＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏ特異性が
示された。
【００３６】実施例２ 免疫測定法 実施例１で得られたモノクローナル抗体（２０μｇ／m
l）溶液を９６穴マイクロプレートへ５０μｌずつ添加
し、４℃で１２〜２４時間放置し、抗体の固相化を行っ
た。次に各ウエルに１％ＰＳＡを含むＰＢＳを２００μ
ｌずつ添加し、３７℃で１時間放置した。次に、ＰＢＳ
を用いて調整した各濃度の精製ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏを５０μｌずつ加え、３７℃で１時間放置した。プレ
ートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳとＰＢＳ
とで洗浄した後に、抗ＮＣＳ−Ａｐｏウサギポリクロー
ナル抗体（５００倍）を５０μｌ加え、３７℃で１時間
放置した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳとＰＢＳとで洗浄した後に、アルカリフォスファ
ターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇ（２０００倍）を５０μｌ
ずつ添加し、３７℃で１時間放置した。プレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳとＰＢＳとで洗浄し
た後に、パラにとりフェニルリン酸を基質として４０５
nmの吸光度をイムノリーダーを用いて測定した。この結
果、添加した精製ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの容量に依
存して吸光度の減少が見られた。本モノクローナル抗体
を用いた時の定量可能範囲はＮＣＳでは０．５pg〜５ng
／ml、ＮＣＳ−Ａｐｏでは０．２pg〜２０ng／mlであ
り、血清中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの測定が可能に
なった。
l）溶液を９６穴マイクロプレートへ５０μｌずつ添加
し、４℃で１２〜２４時間放置し、抗体の固相化を行っ
た。次に各ウエルに１％ＰＳＡを含むＰＢＳを２００μ
ｌずつ添加し、３７℃で１時間放置した。次に、ＰＢＳ
を用いて調整した各濃度の精製ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏを５０μｌずつ加え、３７℃で１時間放置した。プレ
ートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳとＰＢＳ
とで洗浄した後に、抗ＮＣＳ−Ａｐｏウサギポリクロー
ナル抗体（５００倍）を５０μｌ加え、３７℃で１時間
放置した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳとＰＢＳとで洗浄した後に、アルカリフォスファ
ターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇ（２０００倍）を５０μｌ
ずつ添加し、３７℃で１時間放置した。プレートを０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳとＰＢＳとで洗浄し
た後に、パラにとりフェニルリン酸を基質として４０５
nmの吸光度をイムノリーダーを用いて測定した。この結
果、添加した精製ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの容量に依
存して吸光度の減少が見られた。本モノクローナル抗体
を用いた時の定量可能範囲はＮＣＳでは０．５pg〜５ng
／ml、ＮＣＳ−Ａｐｏでは０．２pg〜２０ng／mlであ
り、血清中のＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの測定が可能に
なった。
【００３７】実施例３ 検体組織中のＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの検索方法 ヒト肝等の細胞又は組織切片をアセトン、ホルマリン、
パラホルムアルデヒドなどで固定した後、１％ＢＳＡを
含むＰＢＳでタンパク質の非特異的吸着を防ぐ。次に、
１００μｇ／mlに調整した本発明モノクローナル抗体を
反応させ、室温３０分放置する。ＰＢＳでよく洗った
後、過酸化水素水０．０１％を含むＰＢＳに約５分浸
し、内在性のパーオキシダーゼ活性を失活させる。ＰＢ
Ｓでよく洗った後ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（ＶＥ
ＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を反応させ室温３０分放置す
る。ＰＢＳでよく洗った後、アビジン−ビオチン化ペル
オキシダーゼ複合体（ＡＢＣ；ＢＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社
製）溶液を反応させ室温で３０分間放置後ＰＢＳでよく
洗浄する。次に、基質溶液（ジアミノベンチジンを０．
５mg／ml、過酸化水素水を０．０１％の濃度で含むＰＢ
Ｓ）を添加し、発色させる。各組織中のＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの細胞内局在が光学顕微鏡にて検討可能とな
った。
Ｓ−Ａｐｏの検索方法 ヒト肝等の細胞又は組織切片をアセトン、ホルマリン、
パラホルムアルデヒドなどで固定した後、１％ＢＳＡを
含むＰＢＳでタンパク質の非特異的吸着を防ぐ。次に、
１００μｇ／mlに調整した本発明モノクローナル抗体を
反応させ、室温３０分放置する。ＰＢＳでよく洗った
後、過酸化水素水０．０１％を含むＰＢＳに約５分浸
し、内在性のパーオキシダーゼ活性を失活させる。ＰＢ
Ｓでよく洗った後ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（ＶＥ
ＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を反応させ室温３０分放置す
る。ＰＢＳでよく洗った後、アビジン−ビオチン化ペル
オキシダーゼ複合体（ＡＢＣ；ＢＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社
製）溶液を反応させ室温で３０分間放置後ＰＢＳでよく
洗浄する。次に、基質溶液（ジアミノベンチジンを０．
５mg／ml、過酸化水素水を０．０１％の濃度で含むＰＢ
Ｓ）を添加し、発色させる。各組織中のＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの細胞内局在が光学顕微鏡にて検討可能とな
った。
【００３８】実施例４ ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏに
対する特異性を有するモノクローナル抗体のイムノアフ
ィニティカラムを用いたＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの単
離・濃縮と定量 （１）イムノアフィニティカラムの作製 アフィゲル−１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のカラム担体
約１ｇを、腹水より精製した本発明モノクローナル抗体
約１０mgと室温にて約５時間反応させ、未反応の活性基
をグリシンにてブロックし、イムノアフィニティカラム
を作製した。用いた担体、活性化法は公知のいかなる方
法を用いても可能である。この抗体結合担体をカラム容
器に充填して、本発明イムノアフィニティカラムを作製
した。
対する特異性を有するモノクローナル抗体のイムノアフ
ィニティカラムを用いたＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの単
離・濃縮と定量 （１）イムノアフィニティカラムの作製 アフィゲル−１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のカラム担体
約１ｇを、腹水より精製した本発明モノクローナル抗体
約１０mgと室温にて約５時間反応させ、未反応の活性基
をグリシンにてブロックし、イムノアフィニティカラム
を作製した。用いた担体、活性化法は公知のいかなる方
法を用いても可能である。この抗体結合担体をカラム容
器に充填して、本発明イムノアフィニティカラムを作製
した。
【００３９】（２）ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの単離・
濃縮 ＮＣＳのヒトへの投与時において、その治療効果のモニ
タリング等を目的とした血液、尿等の生体試料中のＮＣ
Ｓ濃度の測定は、それらのＮＣＳ含量が少ないことから
困難であった。そこで（１）で作製したイムノアフィニ
ティカラムに試料を添加するとＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏはカラム内の抗体と結合し、更に公知の溶液をカラム
に添加し、抗体とＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの結合を分
離した。（１）で作製したイムノアフィニティカラムを
１０mlのＰＢＳにて平衡化し、十ｕｎｉｔのＮＣＳを添
加したヒト血清約２０mlをカラムに添加する。検体中の
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏはカラム内の抗体と結合する
ため、２０mlのＰＢＳにて洗浄後、５mlのりん酸緩衝液
（pH３．０）を添加すると、検体とＮＣＳ及びＮＣＳ−
Ａｐｏとの結合は分離して、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏ
は溶出された。溶出画分は濃縮後、公知の方法によりタ
ンパク定量、Ｍ．Ｉｕｔｅｕｓを用いた寒天平板法によ
る抗菌活性の検討を行った結果、９５％以上の回収率が
得られた。この方法によりＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを
回収し、公知の方法により特異的な定量が可能であり、
生体試料中はもとより、菌体培養液中のＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの濃縮、分離・精製が可能となった。
濃縮 ＮＣＳのヒトへの投与時において、その治療効果のモニ
タリング等を目的とした血液、尿等の生体試料中のＮＣ
Ｓ濃度の測定は、それらのＮＣＳ含量が少ないことから
困難であった。そこで（１）で作製したイムノアフィニ
ティカラムに試料を添加するとＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐ
ｏはカラム内の抗体と結合し、更に公知の溶液をカラム
に添加し、抗体とＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの結合を分
離した。（１）で作製したイムノアフィニティカラムを
１０mlのＰＢＳにて平衡化し、十ｕｎｉｔのＮＣＳを添
加したヒト血清約２０mlをカラムに添加する。検体中の
ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏはカラム内の抗体と結合する
ため、２０mlのＰＢＳにて洗浄後、５mlのりん酸緩衝液
（pH３．０）を添加すると、検体とＮＣＳ及びＮＣＳ−
Ａｐｏとの結合は分離して、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏ
は溶出された。溶出画分は濃縮後、公知の方法によりタ
ンパク定量、Ｍ．Ｉｕｔｅｕｓを用いた寒天平板法によ
る抗菌活性の検討を行った結果、９５％以上の回収率が
得られた。この方法によりＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを
回収し、公知の方法により特異的な定量が可能であり、
生体試料中はもとより、菌体培養液中のＮＣＳ及びＮＣ
Ｓ−Ａｐｏの濃縮、分離・精製が可能となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｂ 8214−4Ｂ Ａ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 9284−4Ｃ Ｍ 9284−4Ｃ ＡＤＵ Ｎ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (7)
- 【請求項１】 ネオカルチノスタチン（ＮＣＳ）及びネ
オカルチノスタチン−アポプロテイン（ＮＣＳ−Ａｐ
ｏ）を認識し得るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ＮＣＳ−Ａｐｏを免疫原として用いて得
られた、ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを特異的に認識し得
るモノクローナル抗体の産生能を有する免疫細胞と形質
細胞腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ。 - 【請求項３】 免疫学的測定法により検体中のＮＣＳ及
びＮＣＳ−Ａｐｏを検出する方法において、請求項１記
載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＮＣ
Ｓ及びＮＣＳ−Ａｐｏの検出方法。 - 【請求項４】 請求項１記載のモノクローナル抗体及び
／又は当該モノクローナル抗体の標識体を含むことを特
徴とするＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの測定キット。 - 【請求項５】 請求項１記載のモノクローナル抗体を、
抗原抗体反応により検体組織の一部に結合せしめること
を特徴とする検体組織中におけるＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａ
ｐｏの検索方法。 - 【請求項６】 ＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを含む菌体培
養液中からＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏを単離・精製する
方法において、請求項１記載のモノクローナル抗体を使
用することを特徴とするＮＣＳ及びＮＣＳ−Ａｐｏの単
離・精製法。 - 【請求項７】 請求項１記載のモノクローナル抗体を固
定化したアフィニティカラムを使用する請求項６記載の
単離・精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4240690A JPH0690784A (ja) | 1992-09-09 | 1992-09-09 | モノクローナル抗体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4240690A JPH0690784A (ja) | 1992-09-09 | 1992-09-09 | モノクローナル抗体及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690784A true JPH0690784A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=17063261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4240690A Pending JPH0690784A (ja) | 1992-09-09 | 1992-09-09 | モノクローナル抗体及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690784A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111521813A (zh) * | 2020-03-20 | 2020-08-11 | 天德瑞(北京)生物科技有限公司 | 绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用 |
-
1992
- 1992-09-09 JP JP4240690A patent/JPH0690784A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111521813A (zh) * | 2020-03-20 | 2020-08-11 | 天德瑞(北京)生物科技有限公司 | 绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用 |
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