JPH01231893A

JPH01231893A - 抗ヒトプロテインｓモノクローナル抗体およびその利用

Info

Publication number: JPH01231893A
Application number: JP63058440A
Authority: JP
Inventors: Koji Suzuki; 宏治鈴木; Misako Kyotani; 京谷　美佐子; Kiyoshi Mizuki; 潔水木; Kiyouko Mikawaya; 三河谷　恭子; Hidekuni Shima; 嶋　英邦; Kazushi Iwata; 和士岩田
Original assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Current assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Priority date: 1988-03-14
Filing date: 1988-03-14
Publication date: 1989-09-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は、医学的、診断学的に有用な抗ヒトプロティン
Ｓモノクローナル抗体ならびにそれを利用したヒトプロ
ティンＳの精製法およびヒトプロティンＳ欠損血漿の作
製法に関する。

〔背景技術〕

近年、脳梗塞や心筋梗塞などの血栓症の発症要因の一つ
として血液凝固制御因子の量的あるいは質的な変化があ
ることが明らかにされ、この血液凝固制御因子としての
、プロティンＣおよびその関連因子のプロティンＳにつ
いての研究がなされている。

プロティンＳは、分子量的５ｏｏｏｏの一本鎖糖タンパ
ク質であり、ビタミンに依存性血漿タンパク質の一つで
、活性化プロティンＣのコファクターとして機能する生
理的凝固制御因子である。プロティンＳは、血液中では
、Ｃ１ｂ結合タンパク質（以下Ｃ，ｂｐと記す）と複合
体を形成しているプロティンＳ（以下複合体型プロティ
ンＳと記す）および、Ｃ，ｂｐと複合体を形成していな
いプロティンＳ（以下遊離型プロティンＳと記す）とし
て存在し、この複合体型プロティンＳは、血液凝固制御
作用を有せず、遊離型プロティンＳが、この作用を有す
ることが、明らかにされている（Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｉｎｖｅｓｔ、　７４．　２０８４−２０８８、１９
８４）。

また、多発性の血栓塞栓症を呈する先天性プロティンＳ
欠乏症と、血栓形成傾向を呈する植種の生理的、病的状
態や、薬物投与時における後天的なプロティンＳ欠乏症
が知られている。

この後天的なプロティンＳ欠乏症の原因としては、妊娠
、ネフローゼ症候群、自己免疫疾患、敗血症、抗ビタミ
ンに剤の投与、経口避妊薬の投与などがあげられている
。

プロティンＳ欠乏の形態は、血漿中の全プロティンＳ量
の低下だけではなく　、Ｃ，ｂｐとの結合性の変化によ
り、全プロティンＳに占める複合体型プロティンＳの割
合が増し、血液凝固制御作用をもつ遊離型プロティンＳ
が減少するために、血栓症および血栓形成傾向が現れた
と考えられる症例が、数多く報告されている。

生体内におけるプロティンＳの機能は、全面的に解明さ
れてはいないが、遊離型プロティンＳは、活性化プロテ
ィンＣのコファクターとして機能することから、生理的
な血液凝固制御因子として不可欠なものであり、遊離型
プロティンＳの欠乏が、血栓症の発症要因の一つである
と考えられている。

高純度で、異種抗原性を持たないヒトプロティンＳが得
られれば、ヒトの生体内におけるプロティンＳの機能を
解明することにおいて有用性があるばかりでなく、現在
、他の血液凝固関連因子欠乏患者に対し、その因子の製
剤を投与しているのと同様に、先天性および後天性のプ
ロティンＳ欠乏症患者にそれを投与することにより、遊
離型プロティンＳを補充し、原因療法とすることができ
る。

また、プロティンＳ欠乏症の病態の把握や、原因不明の
血栓症が、プロティンＳの欠乏によるものか否かの判別
、薬物投与などによる後天的プロティンＳ欠乏症の予防
のために、プロティンＳの定量および生物活性測定を精
度良く、かつ簡便に行われることが望まれている。

〔発明の開示〕

本発明者らは、種々研究の結果、ヒトプロティンＳに存
在する抗原決定基のうちいずれか一つの抗原決定基のみ
に免疫交差反応性を有する各モノクローナル抗体を提供
することに成功した。また、これらモノクローナル抗体
を利用してヒトプロティンＳの精製法、およびヒトプロ
ティンＳ欠損血漿の作製法を提供することに成功した。

したがって、本発明は、ヒトプロティンＳに存在する抗
原決定基のうちいずれか一つの抗原決定基のみに免疫交
差反応性を有する各モノクローナル抗体を提供するもの
であり、さらに、これらモノクローナル抗体を利用する
ことにより、■Ｃ４ｂｐと複合体を形成しているヒトプ
ロティンＳ（本明細書中、複合体型ヒトブロテインＳと
記す）に結合性を有せず、かつ、Ｃ，ｂｐと複合体を形
成していないヒトプロティンＳ（本明細書中、遊離型ヒ
トプロティンＳと記す）に結合性を有する抗ヒトプロテ
ィンＳモノクローナル抗体を固相担体に結合せしめ、こ
れに遊離型ヒトプロティンＳを含有する試料を適用し、
固相担体に結合したモノクローナル抗体に遊離型ヒトプ
ロティンＳを結合せしめ、これを解離せしめることを特
徴とする遊離型ヒトプロティンＳの精製法、■　カルシ
ウムイオン存在下にはヒトプロティンＳに結合性を有し
、かつ、カルシウムイオン非存在下にはヒトプロティン
Ｓに結合性を有しない抗ヒトプロティンＳモノクローナ
ル抗体を、固相担体に結合せしめ、カルシウムイオン存
在下、これにヒトプロティンＳを、含有する試料を適用
し、固相担体に結合したモノクローナル抗体にヒトプロ
ティンＳを結合せしめ、これをカルシウムイオン除去作
用を有する溶出剤を用いて、解離せしめることを特徴と
するヒトプロティンＳの精製法、および■複合体型ヒト
プロティンＳおよび遊離型ヒトプロティンＳに結合性を
有する抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体を固相担
体に結合せしめ、これに正常ヒト血漿を適用することに
より、複合体型ヒトプロティンＳおよび遊離型ヒトプロ
ティンＳを除去することを特徴とするヒトプロティンＳ
欠損血漿の作製法を提供するものである。

従来、ヒトプロティンＳの精製法には、ＤｉＳｃｉｐｉ
ｏらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６．６９８
−７０６゜１９７７）、ＤａｈｌｂＭｃｋの方法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０９．８３７−８４６（１９８
３））などがあるが、いずれの方法においても、バリウ
ム−クエン酸沈澱、硫安分画、を行った後に、２回以上
のカラムクロマトグラフィーを必要とし、また、全精製
過程を通して分子量の差や荷電の差など、−船釣な物理
化学的性質にもとづいてヒトプロティンＳと不純物質と
を分離しているため、回収率を増加することならびに精
製規模を拡大することは困難であった。

本発明により提供される前記のモノクローナル抗体のう
ち、複合体型ヒトプロティンＳに結合性を有せず、かつ
、遊離型ヒトプロティンＳに結合性を有するモノクロー
ナル抗体を用いる精製法によれば、従来法に比べ、回収
率を大幅に増加することができ高純度の精製品が得られ
る。この精製法は、ウィルス等の危険因子の除去の点に
おいても、従来法に比し、優れた方法である。

また、本発明に係る上記のモノクローナル抗体は、マウ
スの腹水から、同一品質で大量に得られるので、精製規
模を拡大することができる。

また、本発明に係る上記のカルシウムイオン依存性の大
きいモノクローナル抗体を用いたプロティンＳの精製法
は、前記のモノクローナル抗体を結合せしめた固相担体
に、カルシウムイオン存在下、ヒトプロティンＳを含有
する試Ｍを適用し、−相担体に結合したモノクローナル
抗体にヒトプロティンＳを結合せしめ、これをカルシウ
ムイオン除去作用を有する溶出剤を用いて、解離せしめ
るという簡便な操作で回収率良く精製できる。

この精製法によれば、ヒトプロティンＳ濃度の小さい試
料を用いて、濃縮、精製されたヒトプロティンＳを簡便
に得ることができる。

また、本発明によりヒトプロティンＳ欠損血漿の作製法
が提供されるが、この方法は以下述べるとおり重要な意
義を有する。すなわち、現在、プロティンＳの生物活性
は、活性化プロティンＣの抗凝固作用に対するコファク
ター活性としての測定が行われており（Ｂ　１ｏｏｄ　
＊　６７　＋　２　＋４０６−４１０．１９８６）　、
この測定の際、プロティンＳ以外の血液凝固関連因子に
よる測定値への影響を無くする目的で、正常ヒト血漿よ
り作製したプロティンＳ欠損血漿に、検体を加えて測定
する必要があるが、従来、プロティンＳ欠損血漿の作製
は、抗ヒトプロティンＳポリクローナル抗体を用いて行
われている。しかしながら、ポリクローナル抗体は、抗
原に対する親和力や認識する抗原決定部位の異なる様々
な抗体の混合物であるため、常に一定の品質は、得難く
、従って、ポリクローナル抗体を用いて作製されたプロ
ティンＳ欠損血漿もまた、品質が一定ではなく、測定値
の再現性を低くする要因となり得る。本発明により提供
されるモノクローナル抗体は、抗原に存在する抗原決定
基のうち、いずれか一つにのみ免疫交差反応性を有し、
抗原に対する親和力が一定している。しかも、腹水化す
ることによって同一のモノクローナル抗体を大量に得る
ことができる。

そして、本発明Ｉこ係るモノクローナル抗体のうち、複
合体型ヒトプロティンＳおよび遊離型ヒトプロティンＳ
に結合性を有する抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗
体を選択し、これを用いて、プロティンＳ欠損血漿を作
製することにより、ヒトプロティンＳが特異的に除去さ
れ、一定の品質を保ったヒトプロティンＳ欠損血漿を大
量かつ容易に作製することができる。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体例をもって詳細に説
明する。

実施例　ｌ抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体の作製（ａ）抗原−ヒトプロティンＳの調製ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　　１０土、　２．３７７
−３８１（１９７９）に記載の５ｔｅｎｆｌｏらの方法
を、改変して行った。すなわち、ヒト凍結血漿からクエ
ン酸バリウム沈渣を得、これを緩衝液に溶解させ、３０
〜７０％硫安分画、透析を行った後、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ
、　　Ｃｈａｍ、。

２５８、　１９１４−１９２０　（１９８３）　　に記
載のプロティンＣの精製について用いた方法に従い、Ｄ
ＥＡＥ−５ｅｐｈａｃｅ１１（ファルマシア）カラムク
ロマトグラフィー法を２回行って、単離、精製した。

精製ヒトプロティンＳは、Ｊ−Ｃｅ１ｌ−Ｂｉｏｌ−＋
１７、８３５−８５１（１９７５）に記載のＢｌｏｂｅ
ｌｌ　＆　Ｄｏｂｂｅ−ｒｓｔｅｉｎの方法に従い、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（５ＯＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ、非還元状態で
は、分子量約８０キロダルトン（ＫＤ）の１本のバンド
を示し、還元状態では分子量約８０キロダルトン（ＫＤ
）　８よび７５ＫＤの２本のバンドを示した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製６週令のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス２匹をまず７０インド完
全アジユバント中で、前記（ａ）で記述した精製ヒトプ
ロティンＳで初回免疫する。マウスにそれぞれ８８μ９
のヒトプロティンＳを０．５ｍＱの混合液として腹腔内
投与する。さらに１６日目に０．１１Ｍの食塩を含む４
０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＦ＋７．５）に溶解し
た８８μ９のヒトプロティンＳを追加免疫する。最終免
疫として５７日目に帆１１Ｍ食塩含有４０ｍＭ　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解したヒトプロティン
５（８８μｇ／　３００ｕ２）を腹腔内投与することに
より補助免疫し、３日後にマウス牌臓を取り出し、牌細
胞を調製する。

（ｃ）細胞融合（１）以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ｎｏ　１６４０
　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）に重
炭酸ナトリウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（
１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカ
リウムＣ３０Ｕ／ｍ（１）、硫酸ストレプトマイシン（
５０Ｍｇ／　＋１１１２）、８　Ｊ：　Ｕ硫酸アミカシ
ン（１００μ９／１１Ｑ）を加え、ドライアイスでｐＨ
を７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで
除菌ろ過する。

Ｎ５−１培地二上記ＲＰＭＩ　　１６４０培地に除菌ろ
過した仔牛脂児血清（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。

ＰＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４，０００　（ＰＥＧ　４．０
００、Ｍｅｒｃｋ　＆Ｇｏ、、　Ｉｎｃ、）　５０％（
ｗ／ｗ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＭＳ−１（Ｐ３−
ＮＳＩ−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（
ｅｄ、Ｂ、Ｂ、Ｍｉｓｈｅｌｌａｎｄ　Ｓ、Ｍ、Ｓｈｉ
ｉｇｉ）、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ（１９８０）３５［−３７２に記載のＯｉらの方
法を若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核牌臓細胞（生細胞率１
００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５
：１の割合で融合する。肺臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のＲＰＭＩ　　１６４０培地で洗浄する。次に
同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合
する。容量５０ｍＱの円錐形スチロール樹脂製試験管（
ＩｖａｋｉＧｌａｓｓ）を用い、４０ｍＱのＲＰＭＩ　
１６４０培地中４００Ｘｙ、１０分間遠心し、上溝を完
全に吸出する。沈澱細胞ｉ１７℃加温ＰＥＧ　４．００
０溶液１．１ｍ（ｌを穏やかに撹拌しながら１分間で滴
下し、さらに１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる
。次に３７℃加温ＲＰＭＩ　１６４０培地１．１ｍＱを
１分間で滴下する。この操作をさらに１回繰り返した後
、同培地７．８ｒｎＱを２〜３分間で常に撹拌しながら
滴下し細胞を分散させる。これを４００Ｘｙ、７分間遠
心分離し、上溝を完全に吸引除去する。

次にこの沈澱細胞に３７℃加温Ｎ５−１培地１１１＋Ｉ
Ｑをすみやかに加え、細胞の大きい塊りを１０ｍｆｆの
ピペットを用いて注意深くピペッティングして分散する
。さらに同培地２２ｍ（ｌを加えて希釈し、ポリスチレ
ン製９６六マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）
にウェル当り６．ＯＸ　１０’個１０．１＋ｌＩＱの細
胞を加える。なお、この時使用する９６六マイクロウエ
ルは前処理として０．２ｍＱのＮ５−１培地を加え、炭
酸ガス培養器中（３７℃）で−晩保温し、使用時に培地
を吸引除去しておく。

細胞を加えた上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス／９
３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下に培養に付す
る。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖（１）使用する培地は以下のとおりである。

ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＮ５−１培地にさらに
ヒボキサンチン（ｌＯＯｔＬＭ）、アミノプテリン（０
，４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

（２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１日日）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｔＱ）
を加える。２．３．５．８．１１日日目培地の半分（０
，ｌ肩ｆｆ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日日
目培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。以降３〜
４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。通
常２〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が観察され
る（融合率６２％）。ハイブリドーマ生育全ウェルにつ
いて次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩ
ＳＡ）により陽性ウェルをチエツクする。次にフィーダ
ーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１　
ｍＱをポリスチレン製２４穴セルウエル（Ｉｗａｋｉ　
Ｇｌａｓｓ）に加えたものを用い、上記で検出された各
陽性ウェルの全内容物を移す。これを前記（ｃ）におけ
ると同様に７％炭酸ガス存在下、３７°０で約１週間培
養に付する。その間１〜２回各ウェルの上溝０．５＋Ｑ
を新しいＨＴ培地０．５ｍＩ２と交換する。ハイブリド
ーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再
確認し、それぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法
によるクローニングを行う。

なお、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製２
５Ｃ＋１’組織培養フラスコ（ＩｖａｋｉＧｌａｓｓ）
に移し、凍結保存用試料を調製する。

（ｅ）固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）による抗
ヒトプロティンＳ抗体産生ハイプリドーマの検索Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５−２１４
　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干
改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレージヨン
プレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ
ｃ、）を０．５〜１．０ｕｙのヒトプロティンＳでコー
トし、次に、未コート部分を１％牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）でブロックする。これに前記（ｄ）で得られたハ
イブリドーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約
１時間インキュベートする。２次抗体として西洋わさび
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識−ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加え、さらに
室温で約１時間インキュベートする。次に、過酸化水素
と基質である。−フ二二レンジアミンを加え、生成した
褐色の程度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４
、東洋曹達工業）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。

（ｆ）クローニング前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地ｍ（ｌ当りフィ
ーダーとして１０’個のマウス胸腺細胞を含むクローニ
ング培地を調製し、９６六マイクロウエルの３６ウエル
、３６ウエルおよび２４ウエルにウェル当り５個、１個
および０．５個のハイブリドーマを力口える。５日日と
１２日日目全ウェルに各約Ｑ、１ｍＱのＮＳ−１培地を
追加する。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハ
イブリドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェ
ルが５０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行う。

テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル
中のコロニー数を確認し、ウェル中に１コロニーが確認
されたウェルを４〜６個選び再クローニングする。最終
的にヒトプロティンＳに対するモノクローナル抗体産生
ハイブリドーフ１２株（第１表参照）が得られた。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをＮＳ
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白濃度はｌＯ〜１００μｇ／ｍＱである）。一方
、大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細胞の
由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ１マウス）に腫瘍
形成促進剤ブリスタン（２，６，ＩＯ，１４−テトラメ
チルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、）をマウス−匹当り０．５ｍＱ腹腔
内投与し、１〜３週間後に、各ハイブリドーマＩＸ　１
０’個を同じく腹腔内投与する。それにより１〜２週間
後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７ｍｇ／ｍｎ
の腹水を得ることができる（生体内増殖）。

（ｈ）モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖及びアイソタイ
プ前記（ｇ）で得られた各々の腹水を、ヒトプロティンＳ
をコートしたミクロタイトレージョンプレートを用いて
前述したＥＬＩＳＡ法に従って各腹水中のモノクローナ
ル抗体をそのヒトプロティンＳに結合させる。ＰＢＳに
よる洗浄後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウスｒｇ抗
体（ＺｙｍｅｄＬａｂ’ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加える
。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質とし
て２．２′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリン
硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した。その結
果は第１表に示されている。得られた抗ヒトプロティン
Ｓモノクローナル抗体の内１０個が免疫グロブリン鎖γ
ｌ／にを、１個がγ２ｂ／にを、そして、１個がμ／に
を有していた。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製前記（ｇ）で得られた各腹水のうち、ＩｇＧクラスはア
フィゲルプロティンＡ　ＭＡＰＳ−ｎキット（バイオラ
ッド）を用いて精製した。１ｇＭクラスは、硫安分画（
４０％飽和）後、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有、４０ｍ
１Ｊリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＥ
−Ｓｅｐｈａｃｅ　Ｉ　ｌカラムクロマトグラフィーに
おいて、塩化ナトリウム０．１Ｍから１．０Ｍまでの直
線的濃度勾配で溶出し、含有画分を集め、単離精製した
。

（ｊ）プロティンＳに対する抗ヒトプロティンＳモノク
ローナル抗体の親和定数前記（ｉ）で得られた各モノクローナル抗体のプロティ
ンＳに対する親和定数を、５　ｍＭ　ＣａＣＪ存在下お
よび０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下においてＥＬＩＳＡ法
を用いて求めた。先述のＥＬＩＳＡ法に従って、ミクロ
タイトレージョンプレートにヒトプロティンＳｔ−コー
トシ、ｌＯ％ＢＳＡでブロックした。

前記（ｉ）で得られた各モノクローナル抗体を、５　ｍ
Ｍ　ＣａＣＱ、または０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有の緩衝
液に溶解し、５００ｎｇ／ｍＱに調製したものを段階希
釈し、各々１００μＱを前述で調製したミクロタイトレ
ージョンプレートの各ウェルに添加し、室温で約１時間
インキュベートした。以下、二次抗体反応と発色反応を
、前記（ｅ）のＥＬＩＳＡ法に従って行ない、得られた
測定値から常法に従って親和定数（Ｋｄ）を求めた。そ
の結果は、第１表に示されている。

実施例　２複合体形成に対する効果の検討９６ウエルミクロタイトレーシヨンプレート（ＦＩＯＷ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を、Ｏ，１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解したＣａｂｐ　（
１０Ｍｇ／ｍｇ）　５０ｕＱでコートし、次に未コート
部分を１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし
た。一方、別の試験管にヒトプロティンＳ　（３００ｎ
ｇ／　ｍＱ）　６０μＱと実施例１（ｉ）で得られた各
モノクローナル抗体を含有するリン酸緩衝液（１０Ｍｇ
／ｍ（１）　６０μＱを加え、３７℃で６０分間反応さ
せた。この反応混合液から５０μＱを予めＣ，ｂｐをコ
ートしておいたプレートの各ウェルに加え、３７°Ｃで
６０分間反応させた。プレートを０．１％ＢＳＡ含有ト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄した後、Ｐ
ｏＤ標識ポリクローナル抗ヒトプロティンＳ　　ＩｇＧ
（０，４μｇ／ｍ（２）５０μＱを加え、３７°０６０
分間反応させ、上記の緩衝液で２回洗浄した。次に過酸
化水素と、基質である〇−７二二レンジアミンを加え、
生成した褐色の程度を、マイクロプレートリーダー（Ｍ
ＰＲ−Ａ４、東洋曹達工業）を用いて４９２ｎｍの吸光
度を測定し、結合したヒトプロティンＳを測定した。そ
の結果、第１表に示されているモノクローナル抗体Ｎｏ
、ＭＦＳ−５およびＭＦＳ−７がプロティンＳとｃａｂ
ｐの複合体の形成を阻害した。

実施例　３モノクローナル抗体を用いた遊離型ヒトプロティンＳの
精製法（ａ）抗体カラムの調製実施例１（ｉ）で得られた抗ヒトプロティンＳモノクロ
ーナル抗体（第１表：　Ｎｏ、　ＭＦＳ−５）を、ＣＮ
Ｂ　ｒ　活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）１ｍ
ｕ当り５ｍｇの割合で固定化した。このようにして得た
セファロース４Ｂ結合抗ヒトプロティンＳモノクローナ
ル抗体をカラム（ｌＸ５ｃｍ）に充てんした後、０．１
Ｍ塩化ナトリウム、５ｍ）Ｊ塩化カルシウム含有０．０
２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて平衡化した
。

（ｂ）試料の調製実施例１　（ａ）抗原−ヒトプロティンＳの調製に記載
の方法に従い、ヒト凍結血漿からクエン酸バリウム沈澱
、硫安分画、透析により、濃厚ヒトプロティンＳ試料を
得た。ただし、硫安分画は２０〜７０％硫安分画とした
。

（Ｃ）遊離型ヒトプロティンＳの抗体カラムへの吸着お
よび溶出（ｂ）で調製した試料を（ａ）のカラムにかけ、平衡化
緩衝液で非結合蛋白を充分に洗浄除去後、カラムに結合
した遊離型ヒトプロティンＳを８Ｍ尿素溶液で溶出した
。溶出フラクションのＡｈｍ。における吸光度測定を行
い、ヒトプロティンＳ含有７ラクシヨンを集めた。この
ヒトプロティンＳ含有フラクションをリン酸緩衝液を用
いて透析した後、実施例１（ａ）に記載したドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で調べたところ、非還元状態では、分子
量約８０キロダルトン（ＫＤ）の１本のバンドを示し、
還元状態では、分子量的８０ＫＤおよび７５ＫＤのヒト
プロティンＳを示すバンドが見られた。還元状態におい
ても、非還元状態においてもＣ，ｂｐの存在を示すバン
ドは認められなかった。

実施例　４モノクローナル抗体を用いたヒトプロティンＳの精製法（ａ）抗体カラムの調製実施例１（ｉ）で得られた抗ヒトプロティンＳモノクロ
ーナル抗体（第１表：　Ｎｏ、　ＮＦＳ−９）を、ＣＮ
Ｂｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）１ｍＱ当
り５ｍｇの割合で固定化した。このようにして得たセフ
ァロース４Ｂ結合抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗
体を、カラム（Ｉ　Ｘ　５　ａｍ）ｊ：充てんした後、
０．１Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム含有０
．０２Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて平衡
化した。

（ｂ）試料の調製実施例１　（ａ）抗原−ヒトプロティンＳの調製に記載
の方法に従い、ヒト凍結血漿からクエン酸バリウム沈澱
、硫安分画、透析により、プロティンＳＣ，ｂｐ複合体
を除去した濃厚ヒトプロティンＳ試料を得た。

（Ｃ）ヒトプロティンＳの抗体カラムへの吸着および溶
出（ｂ）で調製した試料を（ａ）のカラムにかけ、平衡化
緩衝液で非結合蛋白を充分に洗浄除去後、カラムに結合
したプロティンＳを、０．１Ｍ塩化ナトリウム、５　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ含有０．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）で溶出した。溶出７ラクシヨンのＡ、。におけ
る吸光度測定を行い、ヒトプロティンＳ含有７ラクシヨ
ンを集めた。ヒトプロティンＳ含有７ラクシヨンを実施
例１（ａ）に記載しｆ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたとこ
ろ、非還元状態では、分子魚釣８０ＫＤの１本のバンド
を示し、還元状態では、分子魚釣８０ＫＤおよび７５Ｋ
ＤのヒトプロティンＳを示すバンドが見られた。

実施例　５プロティンＳ欠損血漿の作成法（ａ）抗体カラムの調製マウス腹水より精製した抗ヒトプロティンＳモノクロー
ナル抗体（第１表：　Ｎｏ−ＭＦＳ−３）を、ＣＮＢｒ
活性化セファロース４８　１ｍ１２当り１０１１１９の
割合で固定化しｔ；。このようにして得たセファロース
４Ｂ結合抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体を、カ
ラム（１−５Ｘ３ｃｍ）に充てんした後、Ｑ、１Ｍ　Ｎ
ａＣ（２含有０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）にて平衡化した。

（ｂ）抗体カラムによる血漿中のヒトプロティンＳの除
去ヒト乏血小板血漿５０ｍＱを、４°Ｃ流速６ｍ１２／ｈ
ｒにて、（ａ）で調製したカラムを通過させ、得られた
溶出血漿を、ヒトプロティンＳ欠損血漿とした。この血
漿中の全ヒトプロティンＳ量を後述の定量法にて測定し
たところ、２５　ｎ　ｇ／　ｍ　Ｑ以下であった。また
、Ｂｌｏｏｄ、　　６７、　２．　４０６−４１０（１
９８６）に記載の方法に従ってヒトプロティンＳ活性を
測定したところ、０．１％未満であった。

また、ヒトプロティンＳ以外の血液凝固関連因子の濃度
は、抗体カラムでの処理前後において変化は見られなか
った。

全ヒトプロティンＳの定量法（ＥＩＡ法）（ａ）酵素標
識モノクローナル抗体（ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体）の調製実施例１（ｉ）で得られたＩｇＧ分画を、１０ｍＭ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に対して一夜透析した
。これとは別に、１ｍｇのＰＯＤを２５０μＱの蒸留水
に溶解し、０．１Ｍ通過ウ素酸ナトリウム５０μＱを加
え、室温で２０分間酸化処理後、ｌ　ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４，０）に対し一夜透析した。

得られたアルデヒドＰＯＤに０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，５）を５μＱ加え、ｐＨを９〜９．５に
すると同時に、前述のようにあらかじめ透析した１ｇＧ
２＋ＩＩｇを添加した。室温で２時間反応後、４ｍｇ／
ｍＱの水素化ホウ素ナトリウム２５μαを加え、４°Ｃ
で２時間静置した。

以上のようにして得られたＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を０．
１５Ｍの塩化ナトリウムを含むＯ，０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ　４４
カラム（ＬＫＢ製）を用いたゲルが過により、ＩｇＧ−
ＰＯＤ画分を分取した。

（ｂ）コーティングおよびブロッキング実施例１（ｉ）
で得られた抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体（Ｎ
ＦＳ−２）を炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，２）
に溶解し、その濃度を５μ９／＋ｌｌαに調製した。こ
の抗体溶液を９６ウエルミクロタイトレーシヨンプレー
ト（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、
）に１ウェル当り、ｌＯＯμα添加し、コートした。次
に１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ−ＰＢＳ）　３００
μαでプレートをブロックした後、緩衝液Ａ　（０，２
Ｍ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．５
ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％Ｂ５Ａ１０．０２％マーチ
オレイト含有０．０５Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液、ｐｌ（
７，５）で洗浄した。

（ｃ）試料の調製（１）標準試料の調製正常プール血漿の全プロティンＳ濃度を、旧ｏｏｄ、　
６７、２．４０６　４１０　（１９８６）記載のＬａｕ
−ｒａｌｌ　ｒｏｃｋｅｔ法により確認した後、緩衝液
Ａで希釈して、全プロティンＳ濃度を２７０ｎｇ／ｍρ
に調製し、これを段階希釈した。

（２）血漿試料の調製血漿試料を緩衝液Ａで２００倍に希釈した。

（ｄ）測　定（ｃ）で調製した試料を、各々、１ウェル当りｌＯＯμ
ｇ添加し、室温で１時間インキュベート（免疫反応）後
、反応溶液を除去し、緩衝液Ａで２回洗浄した。さらに
緩衝液Ｂ　（０，２Ｍ塩化ナトリウム、０．Ｉ％Ｔｗｅ
ｓｎ　２０ｑ　５　ｒｎＭ塩化カルシウム、０．５％Ｂ
ＳＡ、　０．０２％マーチオレイト含有０．０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液１．）Ｈ７，５）で１回洗浄した。

次にＩｇＧ　（ＮＦＳ−１１）　−ＰＯＤ複合体を緩衝
液Ｂで１００　ｎ　ｇ　／　ｒｎαに調製した標識抗体
溶液をｌウェル当り１００μαずつ添加し、室温にて１
時間インキュベーション（免疫反応）後、反応溶液を除
去し、緩衝液Ｂでプレートを２回洗浄した。

次に、０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）に０−フ二二レンジアミン・２塩酸塩
を溶解し、その濃度を２　ｍｇ／　ｒｎ（ｌに調製した
溶液を２００μａ加え室温で１０分間インキュベート（
発色反応）後、２Ｎ硫酸１００ｕＱを添加し、反応を停
止させる。反応停止後、マイクロプレートリーダー（Ｍ
Ｒ−６００、ダイナチック）を用いて、波長４９０ｎｍ
の吸光度を測定し、盲検と試料の吸光度差を求める。標
準試料より作成した検量線よ・す、試料中の全プロティ
ンＳ濃度を求めた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトプロテインＳに存在する抗原決定基のうちい
ずれか一つの抗原決定基のみに免疫交差反応性を有する
各モノクローナル抗体。
（２）モノクローナル抗体の結合性を利用した遊離型ヒ
トプロテインＳの精製法であって、複合体型ヒトプロテ
インＳに結合性を有せず、かつ遊離型ヒトプロテインＳ
に結合性を有する抗ヒトプロテインＳモノクローナル抗
体を固相担体に結合せしめ、これに遊離型ヒトプロテイ
ンＳを含有する試料を適用し、固相担体に結合したモノ
クローナル抗体に遊離型ヒトプロテインＳを結合せしめ
、これを解離せしめることを特徴とする遊離型ヒトプロ
テインＳの精製法。
（３）モノクローナル抗体の結合性を利用したヒトプロ
テインＳの精製法であって、カルシウムイオン存在下に
はヒトプロテインＳに結合性を有し、かつ、カルシウム
イオン非存在下にはヒトプロテインＳに結合性を有しな
い抗ヒトプロテインＳモノクローナル抗体を、固相担体
に結合せしめ、カルシウムイオン存在下、これにヒトプ
ロテインＳを、含有する試料を適用し、固相担体に結合
したモノクローナル抗体にヒトプロテインＳを結合せし
め、これをカルシウムイオン除去作用を有する溶出剤を
用いて、解離せしめることを特徴とするヒトプロテイン
Ｓの精製法。
（４）モノクローナル抗体の結合性を利用したプロテイ
ンＳ欠損血漿の作製法であって、複合体型ヒトプロテイ
ンＳおよび遊離型ヒトプロテインＳに結合性を有する抗
ヒトプロテインＳモノクローナル抗体を固相担体に結合
せしめ、これに正常ヒト血漿を適用することにより、ヒ
トプロテインＳを除去することを特徴とするヒトプロテ
インＳ欠損血漿の作製法。