JPS62201596A - ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌｌ上五上月犬里 本発明はヒトＩｇＧ各サブクラスに対するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体産生／＼イプリドーマお
よび該モノクローナル抗体の製造法に関する。本発明の
モノクローナル抗体は、臨床検査薬やアフイニテイクロ
マトグラフイーのリガンドとして有用である。

従乏じｌえ生 ヒト血清免疫グロブリンのＩｇＧは、アミノ酸配列が多
様な可変域（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）とほと
んど一定な定常域（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）
から成っており、可変域は各種抗原に対する結合に関与
し、定常域は各種生体作用に関与している。定常域での
アミノ酸配列はほとんど一定であるが、一部（５％以下
）のアミノ酸残基の置換により、４種のサブクラスＩ　
ｇＧｌ、１ｇＧ２、Ｉ　ＨＧ３およびＩｇＧ４に分類さ
れる。正常成人血清での濃度（ｍｇ／ｍ１）は、ＩｇＧ
１が５〜１２．１ｇＧ２が２〜６、Ｉ　ＨＧ３が０．５
〜１およびＩ　ＨＧ４が０．２〜１である。

ヒトＩｇＧサブクラスの物理化学的性質についての報告
例は次の通りである（表１）。

（以下余白） Ｉ　ｇＧｌは電気易動度が遅く、ペプシンで分解され難
い。１ｇＧ２はＨ鏡開のＳ−８結合が４本であり、蛋白
分解酵素による分解に耐性である。１ＫＧ３はヒンジ領
域にくり返し構造があるのでＨ鏡開のＳ−８結合が１１
本と多く、血清中の半減期が短く、蛋白分解酵素による
作用を受は易１．％。

ＩｇＧ４は電気易動度が最も速い。

ヒトＩｇＧサブクラスの生物学的性質についても、報告
例を表２に示したように、サブクラスによって相異があ
る。

（以下余白） 表２　ヒ）−ＩｇＧサブクラスの生物学的性質Ｆ　シャ
キブ（Ｓｈａｋｉｂ）ら、う・リセルリカ・クリ二カ・
工・イン・ラボラトリオ（Ｒｉｃｅｒｃａ　Ｃ１１ｎ、
　Ｌａｂ、　）　１０゜すなわち、Ｉ　ｇＧ４は補体Ｃ
１ｑを結合しないし、ＩｇＧ３にはリューマチ因子およ
びプロティンＡが結合しない。その他、ヒトまたは異種
動物の細胞への結合性にも相異がみられる。

また、各種抗原に対する抗体としてのＩｇＧにも、サブ
クラス分布の偏りが報告されている（表３）。

（以下余白） 表３　各種抗体のヒトＩｇＣｔサブクラス分布記号：　
　−、ＩＩｊｌ性　；’Ｄ）、時に陽性　；　±２弱陽
性　；＋、陽性　；＋十９強陽性 Ｈ，Ｌ、　スピーゲルバーグ（Ｓｐｉａｇｅｌｂｅｒｇ
）　、アドバンシズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１９．２５９　（１９７４）す
なわち、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サ
イログロブリンなどの複雑な蛋白質抗原に対するＩｇＧ
サブクラスの分布は血清中存在比に近似しているが、デ
キストランやティコ酸のように炭水化物の抗原に対して
は１ｇＧ２のみが得られており、自己抗原に対してもＩ
ｇＧサブクラスの分布に偏りが見られる。

以上のように、Ｉ［Ｇの各種生体作用に関与する定常域
が相異するサブクラスは、それぞれ各種生体機能や疾患
に関与していることが予想される。

明が　決しようとする間　代 これまでは、いずれかのＩｇＧサブクラスに属する骨髄
腫患者血清を用いてヒトＩｇＧサブクラスの研究が行わ
れてきたが、単一の骨髄腫患者血清から得たＩｇＧサブ
クラスには、サブクラスとしての性質の他にそのＩｇＧ
分子に特有の性質（可変域やアロタイプ）も有している
ので、サブクラスに共通の性質だけが得られるわけでは
ない。同じことは、単一の骨髄腫患者血清から得たＩｇ
Ｇサブクラスを免疫して得た抗体の特異性についても言
える。そのサブクラスに特異的な抗体活性の他にもその
可変域に特異的な抗体活性も共存している。

この問題点を解決するためには、同一のＩｇＧサブクラ
スに属する骨髄腫患者血清を数多く用いることであるが
、これは限られた施設にしか可能でない。ロベらにより
モノクローナル抗ヒトＩｇＧサブクラス抗体［Ｊ、ロベ
（Ｌｏｗｅ）ら、イムノロノー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
）　４７．３２９　（１９８２）コが作製されているが
本発明のモノクローナル抗体とは、少なくともその反応
性が異なっている。

間　懺を　　するための手段 本発明では、正常ヒトブール血清からポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラス４種を得て、それを用いて各サブク
ラスに特異的なモノクローナル抗体を得ることを目的と
した。先ず、これまでに報告されてきたヒトＩｇＧサブ
クラスの物理化学的性質の相異を最大限利用して、ヒト
ブール血清からポリクローナルＩｇＧサブクラスを可能
なかぎり分別し、各サブクラスがそれぞれ濃縮きれたＩ
ｇＧサブクラス粗製品を得る。次に、その粗製品を免疫
して、細胞融合法によりモノクローナル抗体を多数作製
して、各サブクラスに特に強く結合したり、成るサブク
ラスにだけ結合しないクローンを選び、それらのモノク
ローナル抗体を固相化してアフィニティーカラムを作製
し、今度は、このアフィニティーカラムを組み合せて、
ＩｇＧサブクラスを更に精製し、得られたポリクローナ
ルヒトＩｇＧサブクラス精製品を用いて、すでに得てい
たモノクローナル抗体のサブクラス特異性を更に厳密に
検定するという手法で、各サブクラス特有の抗原決定基
を認識するモノクローナル抗体を選別したものである６
本発明においては同一のＩｇＧサブクラスに対して数種
のモノクローナル抗体が得られるが、以下の実施例およ
び参考例で示すとおり、少なくともその反応性が異なっ
ている。

今回得られたモノクローナル抗体を用いることにより、
ヒト血清中のＩｇＧサブクラスが検出できるので、臨床
検査薬として有用であり、また各種疾患とＩｇＧサブク
ラスとの関連が研究できる。更には、このモノクローナ
ル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
りポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスを分離精製すれ
ば、それらの物理化学的および生物学的性質が更に詳し
く研究できる。

１〉ポリクロ−ナル１ヒトＩｇＧサブクラス４種の分離 ■第１法（粗製品の調製） ヒトブール血清を塩析して７−グロブリン画分を採る。

７−グロブリン画分を０．０１Ｍリン酸＃１ｆｆｉ液（
ｐ　Ｈ８、０：）ｔ’Ｄ　ＥＡＥイオン交換カ５ムに通
すと、１ｇＧ４は吸着される。ＤＥＡＥカラムの素通り
画分をプロティンＡ−セファロースカラムに添加し、デ
ュアメルらの方法［Ｒ，Ｃ，デュアメル（Ｄｕｈａｍｅ
ｌ）ら、ザ・ジャーナル・サブ・イムノロジカル・メソ
ッズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）旦、
　２１１　（１９７９）］により、ポリクローナルヒト
エｇＧ１、Ｉ　ｇＧ２および１ｇＧ３の粗製品を得る。

すなわち、ポリクロ−ナルヒトＩｇＧ３粗製品は０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）での素通り画分として溶
出され、次に、０．１Ｍクエン酸緩衝液でｐＨ５，０か
ら３．０にグラジェント溶出するとＩｇＧ１がＩ　ｇＧ
２よりも少し遅れて溶出される。Ｉ　ｇＧｌとＩ　ｇＧ
２の画分をそれぞれ同じ条件で再度クロマト溶出するこ
とにより、ポリクローナルヒトＩ　ｇＧｌおよびＩ　ｇ
Ｇ２の粗製品を得る。ＤＥＡＥカラムの吸着成分はｏ、
０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で溶出する。１ｇＧ
４には結合しないが、他のＩｇＧサブクラスには全て結
合するモノクローナル抗体ＨＧ２−１９をすでに得てい
た［Ｓ、ホソイ（ｌｏｓｏｉ）ら、ザ・ジャーナル・サ
ブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー（
Ｊ、　Ａｌｌａｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎ。

１、）ひ、３２０　（１９８５）　］ので、臭化シアン
活性化セファロースに結合させて抗ヒトＩｇＧ１，２，
３アフイニテイーカラムを作製し、ＤＥＡＥカラムの吸
着成分に混在するＩｇＧ４以外のサブクラスを吸収除去
して、ポリクローナルヒトＩ　ｇＧ４粗製品を得る。

■第２法（精製品の調製） ヒトＩｇＧ４にのみ反応するモノクローナル抗体、ヒト
Ｉ　ｇＧ３にのみ反応するモノクローナル抗体およびヒ
トＩｇＧ４以外のサブクラスに反応するモノクローナル
抗体をそれぞれ臭化シアン活性化セファロースに固相化
して、それぞれ抗ヒトＩ　ｇＧ４、抗ヒトＩｇＧ３およ
び抗ヒトＩｇＧ１．２．３のアフィニティーカラムを調
製する。

ヒト７−グロブリン画分を０．ＯＩＭリン酸緩衝生理食
塩液（ｐＨ７，４）で抗ヒトＩｇＧ４アフイニテイーカ
ラムに通すと、ヒトＩｇＧ４が吸着きれるので、低ｐＨ
又は変性剤を含む緩衝液で溶出させたのち、更に、抗ヒ
トＩｇＧ１，２．３アフイニテイーカラムを通して、ヒ
トＩｇＧ４以外のサブクラスを吸着除去し、ポリクロー
ナルヒトＩｇ０４Ｆｌｔ製品を得る。抗ヒトＩｇＧ４カ
ラムの素通り画分を抗ヒトＩｇＧ３アフイニテイーカラ
ムに通すと、ヒトＩｇＧ３が吸着されるので、低ｐＨ又
は変性剤を含む緩衝液で溶出許せたのち、更にプロティ
ンＡ−セファロースカラムに通しで、ヒトＩ　ｇＧ３以
外のサブクラスを吸着除去し、ポリクロ−ナルヒトＩｇ
Ｇ３精製品を得る。

抗ヒトＩｇ０３カラムの素通り画分にはヒトＩｇ　　　
′Ｇ１とＩｇＧ２が含まれているので、第１法と同様に
して、プロティンＡ−セファロースカラムによるグラジ
ェント溶出を２回繰り返して、ポリクローナルヒトＩ　
ｇＧｌおよびＩ　ｇＧ２の精製品を得る。

２）ハイブリドーマの調製 マウス又はラット等の動物を、ポリクローナルヒトＩｇ
Ｇサブクラスで免疫する。免疫された動物から抗体産生
細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られたハイブ
リドーマのうち、免疫したヒト１ＥＧサブクラスに強く
反応し、他のサブクラスにはあまり反応しないハイブリ
ドーマのウェルを選択する０選択されたハイブリドーマ
をクローニングし、出現したハイブリドーマクローンに
つき、ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス４種に対す
る抗体産生能を詳しく検定し、免疫したＩｇＧサブクラ
スに対しては強く反応するが、他のサブクラスには反応
しないクローンを選択し、これを培養し、モノクローナ
ル抗体を回収する。

免疫法、融合法、融合細胞の選択等は公知の通常の方法
によって行うことが出来る。

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。

先ず、マウスをポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスで
免疫する。免疫する動物はマウスに限らず、ラット等の
ネズミ科の動物又はその他の動物を使用してもよいが、
通常はマウスを用いるのが好ましい。ポリクローナルヒ
トＩｇＧサブクラスは熱凝集（６３°、３０分間）させ
たものを用いてもよい。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスに
ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス又はその熱凝集物
を１匹当り１００〜２００μｇずつ、フロイント（Ｆｒ
ｅｕｎｄ　）完全アジュバントと共に腹腔内又は皮下に
投与する。約３週間後、更にポリクローナルヒトＩｇＧ
サブクラス又はその熱凝集物を１匹当り１０〜５０μｇ
をミョウバンアジュバントと共に、１回又は毎日連続し
て２〜４回、腹腔内又は静脈内に投与する。１〜３日後
に肺臓を摘出して細胞浮遊液とし、融合用抗体産生細胞
とする。

この細胞は増殖していく能力を持たないので、自己増殖
能力を有する細胞と融合させる。自己増殖能力を有する
細胞としては骨髄腫細胞が特に好ましい、骨髄腫細胞と
しては、同種の動物のもので、抗体を産生せず、ヒポキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ欠損株であるのが好ましい。融合用抗体産生細胞と骨
髄腫細胞とを、才イ（Ｏｌ）およびヘルツエンベルブ（
Ｈｅｒｚｅｎｂａｒｇ　）の方法［セレクテツド・メソ
ツズ・イン・セルラーφイムノロジー（Ｓｅｌｅｃｔｅ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ）、　３５１〜３７２　（１９８０）、サ
ンフランシスコ（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ）、劉Ｈ
，７り−マンｅアンドφカンパニー（Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅ
ｅｍａｎ　ａｎｄＣＯ，）］に従って、ポリエチレング
リコールの存在下に融合させる。抗体産生細胞と骨髄腫
細胞の使用割合は、細胞数比で２：１〜１０：１とする
のが好ましい、１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地（完全ＲＰＭＩ培地）を基礎培地とし、これ
にヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含
むＨＡＴ培地と、ヒボキサンチンおよびチミジンのみを
含むＨＴ培地を調整する。融合させた細胞をＨＡＴ培地
で約２週間培養することにより、ハイブリドーマのみが
選択される０次の約２週間はＨＴ培地で培養し、以後は
、完全ＲＰＭＩ培地で培養する。

３）ハイブリドーマの選択 ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラスをポリスチレン製
マイクロタイタープレートのウェルに物理吸着させて固
相化し、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。洗浄
後、酸素標識抗マウス免疫グロブリンを反応させ、洗浄
後、基質を加えて酵素活性を測定し、培養上清中の抗体
活性を求める。

免疫したヒトＩｇＧサブクラスに強く反応し、他のＩｇ
Ｇサブクラスにはあまり反応しないハイブリドーマのウ
ェルを選択する０選択されたハイブリドーマを限界希釈
法等によってクローニングし、出現したハイブリドーマ
クローンにつき、ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス
４種に対する抗体産生能を更に詳しく検定する。免疫し
たヒトＩｇＧサブクラスには強く反応するが、他のサブ
クラスには反応しないクローンを選択する。

４）モノクローナル抗体の作製 選択したハイブリドーマをｉｎ　ｖｉｔ、ｒｏ培養法又
はｉｎ　ｖｉｖｏ培養法により増殖させ、モノクローナ
ル抗体を得る。　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法としては、
例えば次のように行うことが出来る。すなわち、ハイブ
リドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界になるまで培養
し、その培養上清を回収する。１ｎｖｉｖＯ培養法とし
ては、例えば次のように行うことが出来る。すなわち、
あらかじめプリステンを腹腔的投与処理したＢＡＬＢ／
ｃマウスに、５×１０６〜１０７個のハイブリドーマを
腹腔内に移植し、約３週間後に、マウスの腹部肥大を確
めて、その腹水を採取する。

爽農迩ユ （１）ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス粗製品４種
の分離 ヒトブール血清８００ｍ１を１２％硫酸ナトリウムで３
回塩析して７−グロブリン画分を採り、その画分をＤＥ
ＡＥ−セファロースカラム（２，６Ｘ４０ｅｍ）に添加
し、０　、　Ｏ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で素通
りする成分■と、０．０２Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）で溶出される成分■に分離した。成分Ｉはタンパ
ク濃度２０　ｍｇ／　ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）の溶液とし、この液５〜１０ｍ１ずつをプロ
ティンＡ−セファロースカラム（１，ｓｘｔｏｃｍ）に
添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）での素通
り画分からポリクロ−ナルヒトＩｇＧ３粗製品を得た０
次に、−０，１Ｍクエン酸緩衝液でｐＨ５、０から３．
０にグラジェント溶出するとＩ　ｇＧｌが１ｇＧ２より
も少し遅れて溶出される。Ｉ　ｇＧｌとＩ　ｇＧ２の画
分をそれぞれ同じ条件で再度クロマト溶出することによ
り、ポリクローナルヒト■ｇＧ１および１ｇＧ２の粗製
品を得た。成分■には、１ｇＧ４のほかにＩｇＧ１、Ｉ
　ｇＧ２およびＩｇＧ３も混在しているので、抗ヒトＩ
　ｇＧｌ、２．３アフイニテイーカラム（１，５×１２
ｃｍ）を通して、混在するＩ　ｇＧ４以外のサブクラス
を吸収除去して、ポリクローナルヒトＩｇＧ４粗製品を
得た。

得られた４種のポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス粗
製品について、ノルディック（Ｎｏｒｄｉｃ　）社のブ
タ抗ヒトＩｇＧサブクラスを用Ｉ／）た免疫二重拡散法
を行い、サブクラスを同定し、サブクラスの純度を確認
した。

（２）免疫 ８週令の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス３匹に、それ
ぞれ１６０ｔＬｇのポリクローナルヒトＩ　ｇＧ１粗製
品をフロイント完全アジュノくントととも昏こ腹腔的投
与し、３週間後に、更に２０Ｍｇのボ１）クローナルヒ
トＩ　ｇＧ１粗製品をミョウ／くン沈降懸ｆＱ液として
腹腔内に３日連続投与した。

（３）細胞融合 最終免疫の翌日に、３匹の肺臓を摘出し、ＲＰｔＩ培地
を用いて細胞浮遊液を調製した。この３×１０８個の肺
細胞とｇｘ１ｏ’個の骨髄腫細胞ＮＳ−１とを混合し、
遠沈後、沈渣に５０％ポリエチレングリコール（平均分
子量４０００）１ｍｌをゆるやかに攪拌しながら加え、
更に１分間攪拌した。ＲＰＭＩ培地１培地１ｍ分間を要
して加え、同じく１ｍ１を追加した後、更に、７ｍｌを
３分間を要して加えた。遠沈後、沈渣を１５％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）６０ｍｌ
に浮遊きせ、９６六マイクロ培養プレ一ト６枚の各ウェ
ルに０．１ｍｌずつ接種し、７％炭酸ガスの存在下、３
７°Ｃで培養した。２４時間後、ヒボキサンチン１００
μと１アミノプテリン０．４μと１チミジン１６μとを
含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）を０．１ｍｌ加え
る。培養開始後、２．３．５および８８目に、培養上清
０．１ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０．１ｍｌを加えた。１
１および１４日目に、培養上清０．１ｍｌを捨て、ヒポ
キサンチン１００μＨ１チミジン１６μＨを含む完全Ｒ
ＰＭＩ培地（ＨＴ培地）０．１ｍｌを加えた。計５７６
ウエルの全てのウェルからハイブリドーマのコロニーが
出現した。

（４）ハイブリドーマの選択 ウェル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培養し
、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のようにし
て検出した。

ポリスチレン製マイクロタイタープレート［Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ　２．グイナテツク（Ｄｙｎａｔａｃｈ　）社コの
各ウェルに、ポリクローナルＩ　ｇＧ１粗製品を０゜０
５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，１）にとかした溶液（１０μ
ｇ／　ｍｌ　）　５０μｍを入れ、３７℃で１時間放置
した後、１０％ウシ胎児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）１００μｍを加え、３７℃で２０分
間ブロックした。０．０５％ツイーン２０を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄し、粗Ｉ　ｇＧ１
同相ウェルを作製した。粗１　ｇＧ１固相ウェルに、培
養上清５０μｍを加え、３７℃で１時間インキュベート
した。

上記と同様に洗浄後、第２抗体として、ヒトＩｇＧとは
反応しない西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体５０μｍを加え、２５℃で１時
間インキュベートした。同様に洗浄後、１．１％過酸化
水素水と１５０１１ｇ７ｍ１のアジノービス（３−エチ
ルベンゾデアゾリン−６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）
を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）５０μｍ
を加え、２５℃で３０分間発色させた。停止液として２
ｍＭナトリウムアジドを５０μｍ加え、４５０ｎｍの吸
光度をマイクロプレート用の分光光度計により測定し、
０．５以上の吸光度のあるハイプリドーマ計１３７ウエ
ルを選択した。

’ｌｊｌ　Ｉ　ｇ　Ｇ　１に対して抗体産生を行ってい
るハイブリドーマについて、他のＩｇＧサブクラスに対
する反応の有無を、上記と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた
。すなわち、ポリクローナルヒトＩｇＧ２、Ｉ　ｇＧ３
およびＩ　ｇＧ４の粗製品を同様にマイクロタイタープ
レートのウェルに同相化して、それぞれのサブクラス固
相ウェルを作製し、ハイブリドーマ培養上清の反応を調
べた。その結果、粗Ｉ　ｇＧｌに強く反応し、他のサブ
クラスにはあまり反応しないハイブリドーマ５ウエルを
選択した。　選択されたハイブリドーマを限界希釈法に
よりクローニングし、出現したハイブリドーマクローン
の培養上清につき、実施例７で得るポリクローナルヒト
ＩｇＧサブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬ
ＩＳＡ法で検定した。

このようにして、ヒトｒ　ｇＧｌとは反応するが、他の
ＩｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマが２クローン得られ、それぞれ
のモノクローナル抗体をＨＧＩ−１ＥおよびＨＧＩ−１
６Ｄと命名した。

（５）モノクローナル抗体の作製 （ａ　）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法 ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界（ＩＸＩ
Ｏ’個／ｍ１）になるまで培養し、その培養上清を回収
した。

（ｂ　）　ｉｎ　ｖｉｖｏ培養法 あらかじめブリステン０．５ｍｌで腹腔的投与処理した
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに、５Ｘ１０’個のハイ
ブリドーマを腹腔内に移植した。約３週間後、マウスの
腹部肥大を確めて、その腹水を採取した。

（６）モノクローナル抗体ＨＧｌ−１ＥおよびＨＧＩ−
１６Ｄの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ培養法により得たモノクローナル抗体ＨＧＩ−１Ｅお
よびＨＧＩ−１６Ｄについて、実施例７で得るポリクロ
ーナルヒト１芯Ｇサブクラス精製品４種に対する反応性
をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により調べた。表４に示すように、
ＨＧＩ−１ＥおよびＨＧ１〜１６Ｄのモノクローナル抗
体はヒトＩ　ｇＧｌには反応するが、他のＩｇＧサブク
ラスには反応しなかった。

（ｂ）アイソタイプの決定 マイルス（Ｍｉｌｅｓ）社の家兎抗マウスＩ　ｇＧｌ、
家兎抗マウスＩ　ｇＧ２　ａ、家兎抗マウスＩ　ｇＧ２
ｂ、家兎抗マウスＩｇＧ３、家兎抗マウスＩｇＭ、家兎
抗マウスＩｇＡ、家兎抗マウスＬ（に）鎖、家兎抗マウ
スＬ（入）鎖を用いた免疫二重拡散法を行った。モノク
ローナル抗体ＨＧ　１−　Ｉ　ＥおよびＨＧＩ−１６Ｄ
はいずれもマウスＩ　ｇＧ１（κ）に属した。

（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法により得たモノクローナル抗体
ＨＧ１−１ＥおよびＨＧｌ−１６Ｄについて、各種動物
ＩｇＧに対する反応性をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により調べた
（表５）。モノクローナル抗体ＨＧＩ−１Ｅは、ブタ、
イヌおよびサルのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ
、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、ウサギおよびラットのＩ
ｇＧには反応しなかった。モノクローナル抗体ＨＧＩ−
１６Ｄは、サルのＩｇＧに対しては反応するが、ニワト
リ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギお
よびラットのＩｇＧには反応しなかった。

夫鳳贋ユ （１）免疫 ８退会の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス２匹に、それ
ぞれ２００μｇの熱凝集（６３°Ｃ１３０分間）移せた
ポリクローナルヒトＩ　ｇＧ２粗製品をフロイント完全
アジュバントとともに腹腔的投与し、３週間後に、更に
２０μｇの熱詠集させたポリクローナルヒトＩ　ｇＧ２
粗製品をミョウバン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続
投与した。

（２）細胞融合 実施例１において、３匹の肺細胞３Ｘ１０’個と９Ｘ１
０’個のＭＳ−１を融合した代りに、２匹の肺細胞２Ｘ
１０”個と６Ｘ１０’個のＭＳ−１を融合許せたことと
、完全ＲＰＭＩ培地６０ｍ１の浮遊液をプレート６枚に
接種した代りに、４０ｍ１の浮遊液をプレート４枚に接
種した以外は実施例１と全く同様にして細胞融合を行っ
た。計３８４ウェル中の２１１ウエルからハイブリドー
マのコロニーが出現した。

（３）ハイブリドーマの選択 実施例１と全く同様に、ポリクロ−ナルヒト１ｇＧ２粗
製品を同相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗１ｇＧ２に対して抗体を産生じてい
るハイプリドーマ計２０ウェルを選択し、更に、粗Ｉ　
ｇＧ２に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応し
ないハイブリドーマ５ウエルを選択した。次に実施例１
と全く同様にして、選択きれたハイブリドーマを限界希
釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇＧ
サブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ
法で検定した。

このようにして、ヒトＩｇＧ２とは反応するが、他のＩ
ｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマが３クローン得られ、それぞれの
モノクローナル抗体をＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０Ｆお
よびＨＧ２−５６Ｆと命名した。

（４）モノクローナル抗体の作製 ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ　＠養法による
モノクローナル抗体の作製を実施例１と同様にして行っ
た。

（５）モノクローナル抗体ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０
ＦおよびＨＧ２−５６Ｆの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性実施例１と同様
にＥＬＩＳＡ法により調べた。

表４に示すように、ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０Ｆおよ
びＨＧ２−５６Ｆのモノクローナル抗体は、ヒトＩ　ｇ
Ｇ２には反応するが、他のＩｇＧすブタラスには反応し
なかった。

（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦおよびＨＧ
２−５６Ｆはいずれもマウス１ｇＧ１（に）に属した。

（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）、
モノクローナル抗体ＨＧ２−６ＡおよびＨＧ２−５６Ｆ
は、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ
、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには反応しなかっ
た。モノクローナル抗体ＨＧ２−３０Ｆは、ヤギおよび
ヒツジのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、
ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇｃ
には反応しなかった。

火蓋±１ （１〉免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス１匹に、１６０μｇのポ
リクローナルヒトＩ　ｇＧ３粗製品をフロイント完全ア
ジュバントとともに腹腔内投与し、３週間後に、更に２
０μｇのポリクロ−ナルヒトＩｇＧ３粗製品をミョウバ
ン沈降懸ｌ蜀液として腹腔内に投与した。

（２）細胞融合 実施例１において、最終免疫の翌日に、３匹の牌細胞３
Ｘ１０”個と９Ｘ１０’個のＮＳ−１を融合した代りに
、最終免疫の３日後に、１匹の牌細胞ＩＸ１０”ｆｌｌ
と３Ｘ１０’個のＮＳ−１を融合させたことと、完全Ｒ
ＰＭＩ培地６０μｍの浮遊液をプレート６枚に接種した
代りに、２０ｍ１の浮遊液をプレート２枚に接種した以
外は実施例１と全く同様にして細胞融合を行った。計１
９８ウェル中の９８ウエルからハイブリドーマのコロニ
ーが出現した。

（３）ハイブリドーマの選択 実施例１と全く同様に、ポリクロ−ナルヒトＩｇＧ３粗
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗Ｉ　ｇＧ３に対して抗体を産生じて
いるハイプリドーマ計１５ウェルを選択し、更に、粗Ｉ
ｇＧ３に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反応し
ないハイブリドーマ３ウエルを選択した６次に実施例１
と全く同様にして、選択されたハイブリドーマを限界希
釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒトＩｇＧ
サブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬＩＳＡ
法で検定した。

このようにして、ヒトＩｇＧ３とは反応するが、他のＩ
ｇＧサブクラスは反応しないモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマが１クローン得られ、そのモノクロ
ーナル抗体をＨＧ２−７Ｃと命名した。

（４）モノクローナル抗体の作製 ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ培養法によるモ
ノクローナル抗体の作製を実施例１と同様にして行った
。

（５）モノクローナル抗体ＨＧ３−７Ｃの特性（ａ）ヒ
トＩｇＧサブクラスとの反応性実施例１と同様にＥＬＩ
ＳＡ法により調べた。

表４に示すように、ＨＧ２−７Ｇのモノクローナル抗体
は、ヒトＩｇＧ３には反応するが、他の工ｇＧサブクラ
スには反応しなかった。

（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ３−７ＣはマウスＩｇＧ１（に）に属
した。

（ｃ）動物１ＫＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。

モノクローナル抗体ＨＧ３−７Ｃは、ネコおよびイヌの
ＩｇＧに対して反応するが、二―７トリ、ウシ、ブタ、
ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには
反応しなかった。

夫履廻１ （１）免疫 ８週令の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス３匹に、それ
ぞれ１６０μｇのポリクローナルヒトＩ　ｇＧ３粗製品
をフロイント完全アジュバントとともに腹腔内投与し、
３週間後に、更に２０μｇのポリクローナルヒトＩ　ｇ
Ｇ３粗製品をミョウバン沈降懸濁液として腹腔内に３日
連続投与した。

（２）細胞融合 実施例１と全く同様に細胞融合を行い、計５７６ウエル
中の５０４ウエルからハイブリドーマのコロニーが出現
した。

（３）ハイブリドーマの選択 実施例３と全く同様にハイブリドーマの選択を行い、ヒ
トＩ　ｇＧ３とは反応するが、他のＩｇＧサブクラスに
は反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマが４クローン得られ、それぞれのモノクローナル抗
体をＨＧ２−３Ｂ、ＨＧ２−３２Ｃ、ＨＧ３−４５Ｂお
よびＨＧ２−４９Ｄと命名した。

（４）モノクローナル抗体の作製 ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｔｖｏ培養法によるモ
ノクローナル抗体の作製を実施例１と同様にして行った
。

（５）モノクローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２
Ｃ、ＨＧ３−４５ＢおよびＨＧ２−４９Ｄの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性実施例１と同様
にＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により調べた。

表４に示すように、ＨＧ２−３８、ＨＧ３−３２０、Ｈ
Ｇ２−４５ＢおよびＨＧ２−４９Ｄのモノクローナル抗
体はヒトＩ　ｇＧ３には反応するが、他のＩｇＧサブク
ラスには反応しなかった。

（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−
４５ＢおよびＨＧ２−４９ＤはいずれもマウスＩｇＧ１
（に）に属した。

（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。

モノクローナル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、Ｈ
Ｇ３−４５ＢおよびＨＧ２−４９Ｄは、ニワトリ、ウシ
、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットお
よびサルのＩｇＧには反応しなかった。

衷轟亘互 （１）免疫 ８退会の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス２匹に、それ
ぞれ１７５μｇのポリクロ−ナルヒトＩｇＧ４粗製品ヲ
フロインド完全アジュバントとともに腹腔内投与し、３
週間後に、更に２０ｔ１ｇのポリクローナルヒトＩ　ｇ
Ｇ４粗製品をミョウバン沈降懸濁液として腹腔内に４日
連続投与した。

（２）細胞融合 実施例２と全く同様に細胞融合を行い、計３８４ウェル
の全てのウェルからハイブリドーマのコロニーが出現し
た。

（３）ハイブリドーマの選択 実施例１と全く同様に、ポリクロ−ナルヒトＩｇＧ４粗
製品を固相化したマイクロタイターウェルを用いるＥＬ
ＩＳＡ法により、粗Ｉ　ｇＧ４に対して抗体を産生じて
いるハイプリドーマ計２３３ウェルを選択し、更に、粗
１　ｇＧ４に強く反応し、他のサブクラスにはあまり反
応しないハイブリドーマ３ウエルを選択した。次に、実
施例１と全く同様にして、選択されたハイブリドーマを
限界希釈法によりクローニングし、ポリクローナルヒト
ＩｇＧサブクラス精製品４種に対する抗体産生能をＥＬ
ＩＳＡ法で検定した。

このようにして、ヒトＩｇＧ４とは反応するが、他のＩ
ｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマが１クローン得られ、そのモノク
ローナル抗体をＨＧ２−３Ｆと命名した。

（４）モノクローナル抗体の作製 ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ培養法によるモ
ノクローナル抗体の作製を実施例１と同様にして行った
。

（５）モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆの特性（ａ）ヒ
トＩｇＧサブクラスとの反応性実施例１と同様にＥＬＩ
ＳＡ法により調べた。

表４に示すように、ＨＧ２−３Ｆのモノクローナル抗体
は、ヒトＩｇＧ４には反応するが、他のＩｇＧサブクラ
スには反応しなかった。

（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ　４−３　ＦはマウスエｇＧ１（に）
に属した。

（ｃ）動物ＩｇＧとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）、
モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆは、ブタおよびサルの
ＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧ
には反応しなかった。

罠厘遭１ （１）免疫 ８適冷の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス３匹に、それ
ぞれ１７５μｇのポリクローナルヒトＩ　ｇＧ４粗製品
をフロイント完全アジュバントとともに腹腔的投与し、
３週間後に、更に２０μｇのポリクロ−ナルヒトＩｇＧ
４粗製品をミョウバン沈降懸濁液として腹腔内に投与し
た。

（２）細胞融合 実施例１において、最終免疫の翌日の代りに３日後に肺
臓を摘出した以外は実施例１と全く同様にして細胞融合
を行った。計５７６ウエル中の３２０ウエルからハイブ
リドーマのコロニーが出現した。

（３）ハイブリドーマの選択 実施例５と全く同様にハイブリドーマの選択を行い、ヒ
トＩｇＧ４とは反応するが、他のＩｇＧサブクラスには
反応しないモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マが２クローン得られ、それぞれのモノクローナル抗体
をＨＧ２−３１ＣおよびＨＧ２−３８Ｂと命名した。

（４）モノクローナル抗体の作製 ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ　＠養法による
モノクローナル抗体の作製を実施例１と同様にして行っ
た。

（５）モノクローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ２
−３８Ｂの特性 （ａ）ヒトＩｇＧサブクラスとの反応性実施例１と同様
にＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により調べた。

表４に示すように、ＨＧ２−３１ＣおよびＨＧ２−３８
Ｂのモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ４には反応する
が、他のＩｇＧサブクラスには反応しなかった。

（ｂ）アイソタイプの決定 実施例１と同様に免疫二重拡散法により調べた。モノク
ローナル抗体ＨＧ４−３１ＣおよびＨＧ２−３８Ｂはマ
ウスＩ　ｇＧｌ　（に）に属した。

（ｃ）動物１匹Ｇとの反応性 実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法により調べた（表５）。

モノクローナル抗体ＨＧ４−３１ＧおよびＨＧ２−３８
Ｂは、ブタのＩｇＧに対して反応するが、ニワトリ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよび
サルのＩｇＧには反応しなかった。

（以下余白） 表４ ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体のヒトＩｇＧサ
ブクラスに対する反応性 単位；吸光度（４５０帥）ＸＩＱＯＯ ポリクローナルヒトＩｇＧ 培養上清　　サブクラス精製品 クローン　　の 嵐　　希釈倍数　コート 濃度　ＩｇＧＩ　ＩｇＧ２　ＩｇＧ３　ＩｇＧ４（８ｇ
７ｍ１） ＨＧＩ−１Ｅ　　　　１　　　　１０　　　８９２　　
２８　　２６　　６９ＨＧＬ−Ｌ６Ｄ　　　　１　　　
　１０　　　９０３　　７５　　２１　　４８）ＨＧ２
−６Ａ　　　　１　　　　１ｎ　　　　ｏｅ　　ｏａｃ
　　　６６　　　ｅｅ表５ ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体の動物ＩｇＧに
対する反応性 ＋十：　　強陽性　　　＋：　陽性　　−：　陰性医Ｊ
１礼ヱ （１）抗ヒトＩｇＧサブクラスアフィニティーカラムの
調製 ヒトＩ　ｇＧ４とは反応するが他のＩｇＧサブクラスに
は反応しないモノクローナル抗体ＨＧ４−５３Ｇ［特願
昭６０−１２７８４４］、ヒトＩｇ０３とは反応するが
他のＩｇＧサブクラスには反応しないモノクローナル抗
体ＨＧ　３−７　ＣおよびヒトＩｇＧ４には反応しない
が他のＩｇＧサブクラスとは反応するモノクローナル抗
体ＨＧ３−１３Ｆ（実施例３で別に得られた）を、それ
ぞれ臭化シアン活性化セファロース（ファルマシア社）
に加えて固相化した。いずれもセファロースカラム当り
に５ｍｇのモノクローナル抗体を反応させた。

得られたモノクローナル抗体同相化セファロースをカラ
ムに充填し、それぞれ抗ヒト１ｇＧ４アフィニティーカ
ラム、抗ヒトＩ　ｇＧ３アフィニティーカラムおよび抗
ヒトＩｇＧ１、’２．３アフイニテイーカラムを調製し
た。

（２）ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種
の調製 ヒト７−グロブリン（Ｃｏｈｎ　Ｆｒ、　ＩＩ　）　２
０　ｇを０、ＯＩＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，４
）２００ｍｌに溶かした液につき、先ず、抗ヒトＩｇＧ
４アフイニテイーカラム（２，５Ｘ９．５ｃｍ）を通し
て、吸着成分を３Ｍチオシアン酸カリウムを含む０．Ｏ
ＩＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，４）で溶出し、０
．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，４）で透析し
たあと、抗ヒトＩｇＧ１．２．３アフイニテイーカラム
（２，５Ｘ６、Ｏｃｍ）を通して、素通り画分にポリク
ローナルヒト■［ｃＧ４精製品を７３ｍｇ得た。次に、
抗ヒｈ　Ｉ　ｇＧ４アフィニティーカラムの素通り画分
につき、抗ヒトＩｇＧ３アフイニテイーカラム（２，５
Ｘ６．５ｃｍ）を通して、吸着成分を３Ｍチオシアン酸
カリウムを含む０．ＯＩＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ
７，４）で溶出し、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（
ｐＨ７，４）で透析したあと、プロティンＡ−セファロ
ースカラム（ファルマシア社、２．５Ｘ１４．５ｃｍ）
を通して、素通り画分に、ポリクローナルヒトＩ　ｇＧ
３精製品を５３ｍｇ得た。抗ヒトＩ　ｇＧ３アフィニテ
ィーカラムの素通り画分は、更に、抗ヒトＩ　ｇＧ４ア
フィニティーカラムと抗ヒトＩｇＧ３アフイニテイーカ
ラムを素通りきせ、ポリクローナルヒトｒｇＧ１と！慝
Ｇ２の混合物１７．５ｇを得た。この混合物５００μｇ
をプロティンＡ−セファロースカラムに添加し、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を通したあと、０．１Ｍ
クエン酸緩衝液でｐＨ５，０から３．０にグラジェント
溶出するとＩ　ｇＧｌがＩ　ｇＧ２よりも少し遅れて溶
出される。ｒｇＧｌとｆｇＧ２の画分をそれぞれ同じ条
件で再度クロマト溶出することにより、ポリクローナル
ヒトＩ　ｇＧｌおよびＩ　ｇＧ２の精製品をそれぞれ３
５５および５３ｍｇ得た。

（３）ポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種
の評価 得られたポリクローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４
種について、ノルディック（Ｎｏｒｄｉｃ　）　社のヒ
ツジ抗ヒトＩｇＧサブクラス４種およびブタ抗ヒトＩｇ
Ｇサブクラス４種並びにマイルス（Ｍｉｌｅｓ　）社と
セロチック（５ｅｒｏｔｅａ　）社のヒツジ抗ヒ、ト１
　ｇＧｌおよびヒツジ抗ヒトＩｇＧ２を用いた免疫二重
拡散法を行い、それぞれ対応するサブクラス抗体との間
に沈降線の生成を認めた。このとき、寒天プレートはデ
ィフッ（Ｄｉｆｃｏ　）社のＡｇａｒＮｏｂｌｅ　１　
、２％であり、２％ポリエチレングリコール（平均分子
量４０００）が含まれている。

口べらが作製したモノクローナル抗ヒトＩｇＧサブクラ
ス［Ｊ、ロベ（Ｌｏｗｅ　）ら、イムノロジー（Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ）　４７．３２９　（１９８２）　１の
うち、ライマーらが多数のミエローマ血清由来ヒトＩｇ
Ｇサブクラスを用いて各サブクラスに対する反応特異性
を確証したモノクローナル抗体４種［Ｃ，Ｂ、ライマー
（Ｒｅｉｍｅｒ　）ら、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ）　３．２６３　（１９８４）コをユニバス（Ｕ
ｎｉｐａｔｈ　）社から購入し、ポリクローナルヒトＩ
ｇＧサブクラス精製品４種の評価に用いた。ポリクロー
ナルヒト１１＜Ｇサブクラス精製品を１０μｇ／ｍｌま
たは２μｇ／ｍｌ濃度でマイクロタイタープレートのウ
ェルに固相化し、各モノクローナル抗体の腹水をそれぞ
れ至適倍数に希釈して反応させた後、実施例１と同様に
ＥＬＩＳＡ法で評価した。表６に示すように、各ポリク
ローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品はそれぞれ対応す
るモノクローナル抗ヒトＩｇＧサブクラスと特に強く反
応し、他のサブクラスに対するモノクローナル抗体との
反応は充分に小さかった。

（以下余白） 表６ 更に、マイルス（Ｍｉｌｅｓ　）社の定量用免疫拡散キ
ット１ヒトＩｇＧサブクラス、を用いて、ポリクローナ
ルヒトＩｇＧサブクラスを定量した結果、ヒトＩｇＧ１
は９０％、ヒトＩｇＧ２は１０８％、ヒトＩｇＧ３は１
００％、ヒトＩｇＧ４は８５％であり、いずれも１００
％に近似していた。

１曳亘ユ ユニバス社製モノクローナル抗体の動物ＩｇＧに対する
反応性 実施例１に準じて、ＪＬ−５１２腹水を１０００倍、０
０Ｍ１腹水を２７００倍、ＺＧ４腹水を８１００倍、Ｒ
Ｊ４腹水を８１００倍に希釈したものについてＥＬＩＳ
Ａ法により、動物ＩｇＧに対する反応性を調べた。その
結果を表７に示す。

（以下余白） 参２目礼至 ａ）固相ヒトＩｇＧサブクラスに対する親和定数ポリス
チレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに、ポリ
クローナルヒトＩｇＧサブクラス精製品４種をそれぞれ
０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，１）に溶かした溶液（
２μｇ／＋ｎｌ）　５０μｍを入れ、３７℃で１時間放
置した後、１０％牛脂児血清を含む０　、　Ｏ１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７゜４）１００μｍを加え、３７℃で２
０分間ブロックした。Ｏ，ＯＳ％ツイーン２０を含む０
．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄し、ヒトＩ
ｇＧサブクラス固相ウェルを作製した。ヒトＩｇＧサブ
クラス固相ウェルに　１１６ｉ標識モノクロ一ナル抗体
ＨＧ４−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ２−３８Ｂを
２４０〜０　、２４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲となるように
１０％牛脂児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４）で希釈して５０μｍ加え、２５℃で１時間イン
キュベートし、同様に洗浄後、７−カウンターで計測し
た。親和定数はスキャンチャード法により求めた。

ｂ）液相ヒトＩｇＧサブクラスに対する親和定数ポリス
チレン製チューブに１０％牛脂児血清を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（＋）Ｈ７，４）１００μｍと、同緩衝液
に溶かしたＩＩＪ標識モノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆ
、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ２−３８Ｂ（４０ｍｇ／ｍ
１）５０μｍと、同緩衝液で２．５〜０．００５μｇ／
ｍｌの濃度範囲となるように希釈したモノクローナル抗
体ＨＧ４−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ２−３８Ｂ
（５０μｍ）および２．５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧサブ
クラス精製品５０μｍを加えて、２５℃で１６時間イン
キュベートした。この反応液にセファデックス結合モノ
クローン抗しトＬ鎖抗体を適当量（６００μｇ／ｍｌ、
１００μｍ）を加えて、２５℃で１時間インキュベート
し、生理食塩液で３回洗浄後、７−カウンターで計測し
た。親和定数はスキャッチャード法により求めた。

以上の結果を表８に示が、同じＩｇＧサブクラスに対す
るモノクローナル抗体でも、その親和性は互いに異なる
。

表８

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＩｇＧ１に結合するが、他のヒトＩｇＧサブ
   クラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体ＨＧ
   １−１ＥまたはＨＧ１−１６Ｄ。
2. （２）ブタ、イヌおよびサルのＩｇＧに結合するが、ニ
   ワトリ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、ウサギおよびラッ
   トのＩｇＧには実質的に結合しない特許請求の範囲第１
   項記載のモノクローナル抗体ＨＧ１−１Ｅ。
3. （３）サルのＩｇＧに結合するが、ニワトリ、ウシ、ブ
   タ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギおよびラットの
   ＩｇＧには実質的に結合しない特許請求の範囲第１項記
   載のモノクローナル抗体ＨＧ１−１６Ｄ。
4. （４）マウスＩｇＧ１（κ）に属する特許請求の範囲第
   １項ないし第３項に記載のモノクローナル抗体ＨＧ１−
   １ＥまたはＨＧ１−１６Ｄ。
5. （５）ヒトＩｇＧ１に結合するが、他のヒトＩｇＧサブ
   クラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体ＨＧ
   １−１ＥまたはＨＧ１−１６Ｄを産生するハイブリドー
   マ細胞系。
6. （６）ポリクローナルヒトＩｇＧ１で免疫した動物の抗
   体産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを形成
   させて、ヒトＩｇＧ１に結合するが、他のヒトＩｇＧサ
   ブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体Ｈ
   Ｇ１−１ＥまたはＨＧ１−１６Ｄを産生するハイブリド
   ーマを選択することを特徴とするモノクローナル抗体の
   製造法。
7. （７）ヒトＩｇＧ２に結合するが、他のヒトＩｇＧサブ
   クラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体ＨＧ
   ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦまたはＨＧ２−５６Ｆ。
8. （８）ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イ
   ヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには実質的に結
   合しない特許請求の範囲第７項記載のモノクローナル抗
   体ＨＧ２−６ＡまたはＨＧ２−５６Ｆ。
9. （９）ヤギおよびヒツジのＩｇＧに結合するが、ニワト
   リ、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサ
   ルのＩｇＧには実質的に結合しない特許請求の範囲第７
   項記載のモノクローナル抗体ＨＧ２−３０Ｆ。
10. （１０）マウスＩｇＧ１（κ）に属する特許請求の範囲
    第７項ないし第９項に記載のモノクローナル抗体ＨＧ２
    −６Ａ、ＨＧ２−３０ＦまたはＨＧ２−５６Ｆ。
11. （１１）ヒトＩｇＧ２に結合するが、他のヒトＩｇＧサ
    ブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦまたはＨＧ２−５６Ｆを産
    生するハイブリドーマ細胞系。
12. （１２）ポリクローナルヒトＩｇＧ２で免疫した動物の
    抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを形
    成させて、ヒトＩｇＧ２に結合するが、他のヒトＩｇＧ
    サブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体
    ＨＧ２−６Ａ、ＨＧ２−３０ＦまたはＨＧ２−５６Ｆを
    産生するハイブリドーマを選択することを特徴とするモ
    ノクローナル抗体の製造法。
13. （１３）ヒトＩｇＧ３に結合するが、他のヒトＩｇＧサ
    ブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ３−３Ｂ、ＨＧ３−７Ｃ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−
    ４５ＢまたはＨＧ３−４９Ｄ。
14. （１４）ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、
    イヌ、ウサギ、ラットおよびサルのＩｇＧには実質的に
    結合しない特許請求の範囲第１３項記載のモノクローナ
    ル抗体ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−４５Ｂ
    またはＨＧ３−４９Ｄ。
15. （１５）ネコおよびイヌのＩｇＧに結合するが、ニワト
    リ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよび
    サルのＩｇＧには実質的に結合しない特許請求の範囲第
    １３項記載のモノクローナル抗体ＨＧ３−７Ｃ。
16. （１６）マウスＩｇＧ１（κ）に属する特許請求の範囲
    第１３項ないし第１５項に記載のモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ３−３Ｂ、ＨＧ３−７Ｃ、、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３
    −４５ＢまたはＨＧ３−４９Ｄ。
17. （１７）ヒトＩｇＧ３に結合するが、他のヒトＩｇＧサ
    ブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ３−３Ｂ、ＨＧ３−７Ｃ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３−
    ４５ＢまたはＨＧ３−４９Ｄを産生するハイブリドーマ
    細胞系。
18. （１８）ポリクローナルヒトＩｇＧ３で免疫した動物の
    抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを形
    成させて、ヒトＩｇＧ３に結合するが、他のヒトＩｇＧ
    サブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体
    ＨＧ３−３Ｂ、ＨＧ３−７Ｃ、ＨＧ３−３２Ｃ、ＨＧ３
    −４５ＢまたはＨＧ３−４９Ｄを産生するハイブリドー
    マを選択することを特徴とするモノクローナル抗体の製
    造法。
19. （１９）ヒトＩｇＧ４に結合するが、他のヒトＩｇＧサ
    ブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ４−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂ。
20. （２０）ブタおよびサルのＩｇＧに結合するが、ニワト
    リ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット
    およびサルのＩｇＧには実質的に結合しない特許請求の
    範囲第１９項記載のモノクローナル抗体ＨＧ４−３Ｆ。
21. （２１）ブタのＩｇＧに結合するが、ニワトリ、ウシ、
    ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラットおよびサル
    のＩｇＧには実質的に結合しない特許請求の範囲第１９
    項記載のモノクローナル抗体ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ
    ４−３８Ｂ。
22. （２２）マウスＩｇＧ１（κ）に属する特許請求の範囲
    第１９項ないし第２１項に記載のモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ４−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂ。
23. （２３）ヒトＩｇＧ４に結合するが、他のヒトＩｇＧサ
    ブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体Ｈ
    Ｇ４−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂを産
    生することを特徴とする抗体産生ハイブリドーマ細胞系
    。
24. （２４）ポリクローナルヒトＩｇＧ４で免疫した動物の
    抗体産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを形
    成させて、ヒトＩｇＧ４に結合するが、他のヒトＩｇＧ
    サブクラスには実質的に結合しないモノクローナル抗体
    ＨＧ４−３Ｆ、ＨＧ４−３１ＣまたはＨＧ４−３８Ｂを
    産生するハイブリドーマを選択することを特徴とするモ
    ノクローナル抗体の製造法。