CN114717197A - 分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株单克隆抗体及应用 - Google Patents

分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用，所述的细胞株命名为杂交瘤细胞株3C11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021.11.10，保藏号为CCTCC NO:C2021100。本发明还提供了由所述分泌抗人IgG1抗原的IgG1型单抗的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体及其应用。所述的细胞株分泌的抗人IgG1单抗能够与人IgG1发生特异性反应，是一株抗人IgG1的单抗，用IgG1型抗D致敏细胞做试管凝集试验检测抗人IgG1单抗效价为1∶256，ELISA法测定抗人IgG1单抗效价为1∶10000。

Description

分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉一种分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。
背景技术
IgG是人血清中免疫球蛋白的主要组成成分，占血清中免疫球蛋白总量的75%。IgG的主要功能是参与机体免疫调节，根据IgG分子中γ链抗原性的差异，IgG可分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，免疫球蛋白亚类与疾病的严重性有关系，而IgG1和IgG3是严重的致病原，这两个亚类通过结合自然杀伤细胞及单核巨噬细胞的Fc受体在补体的激活中起到重要作用，所以临床检测IgG亚类水平对新生儿溶血症、自身免疫性溶血性疾病具有辅助诊断价值。
IgG是唯一能够通过母体胎盘屏障的抗体，而母体中IgG亚类的水平与胎儿新生儿溶血症的发生有非常密切的关系，IgG1和IgG3比IgG2和IgG4更容易导致溶血的发生，所以对母体IgG1和IgG3水平的检测能辅助临床诊断胎儿或新生儿溶血症。
红细胞自身抗体是自身免疫性溶血性贫血的致病因子，IgG、IgM、IgA是3种常见的抗红细胞自身抗体亚型，其中IgG最常见，而IgG亚类影响抗体缩短红细胞寿命的程度，与IgG2和IgG4相比，IgG1和IgG3显著缩短了红细胞的半衰期，IgG类的自身抗体主要针对Rh系统的表位，所以对IgG1和IgG3水平的检测能辅助临床诊断IgG类红细胞自身抗体所致的自身免疫性溶血性贫血。
发明内容
为检测人IgG1抗原，本发明的目的在于提供一种分泌抗人IgG1抗原的IgG1型单抗的杂交瘤细胞株，本发明以人IgG为抗原通过杂交瘤技术制备了一株分泌抗人IgG1抗原的IgG1型单抗的杂交瘤细胞，将细胞培养上清浓缩后可作为人IgG1检测试剂，应用于人IgG1的检测中。
本发明的一个目的是提供一种分泌抗人IgG1抗原的IgG1型单抗的杂交瘤细胞株，所述的细胞株命名为：杂交瘤细胞株3C11：保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉.武汉大学，保藏日为2021年11月10日，保藏号为CCTCC NO:C2021100。
本发明的第二个目的是提供一种抗人IgG1单克隆抗体，所述抗人IgG1单克隆抗体由如上所述的分泌抗人IgG1抗原的IgG1型单抗的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述抗人IgG1单克隆抗体类型为IgG1型；所述抗人IgG1单克隆抗体与人IgG1发生特异性反应。
本发明的第三个目的是提供一种人IgG1检测试剂，包括如上所述的抗人IgG1单克隆抗体。
本发明的第四个目的是提供一种人IgG1检测装置，包括如上所述的抗人IgG1单克隆抗体。
本发明的第五个目的是提供一种人IgG1检测方法，其特征在于，包括步骤将待测样品与如上所述的抗人IgG1单克隆抗体接触，以确定待测样本是否含人IgG1。
本发明的第六个目的是提供一种如上所述的抗人IgG1单克隆抗体在人IgG1检测上的应用。
本发明积极效果在于：公开了一种分泌抗人IgG1抗原的IgG1型单抗的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。采用人IgG为抗原免疫BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选、克隆，获得一株能稳定传代并分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株3C11，其保藏号为CCTCC NO:C2021100。由如上所述杂交瘤细胞株分泌的抗人IgG1单克隆抗体类型为IgG1型。如上所述的抗人IgG1单克隆抗体能够与人IgG1发生特异性反应。将该细胞培养上清收集后浓缩10倍，用IgG1型抗D致敏细胞做试管凝集试验检测效价可达1∶256，浓缩液ELISA法测定抗体效价可达1∶10000。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可按照说明书的内容予以实施，以下用一些实例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
图1. 抗人IgG1单克隆抗体ELISA法效价测定结果图片；
图2. 抗人IgG1单克隆抗体试管凝集效价测定结果图片；
图3. 抗人IgG1单克隆抗体试管凝集特异性鉴定结果图片；
图4. 蛋白免疫印迹试验鉴定抗人IgG1单克隆抗体结果图片；
图5. 抗人IgG1单克隆抗体Ig亚类鉴定结果图片；
图6. 杂交瘤细胞株3C11染色体核型分析结果照片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：
杂交瘤细胞的获得
1. 免疫原的制备
将丙球（国药集团武汉血液制品有限公司）用生理盐水稀释至1mg/mL，按9∶1比例加入磷酸铝佐剂，混匀备用；免疫原需现用现配；
2. 动物免疫与试血。
（1）用免疫原免疫4周龄，体重约20g的BALB/c小鼠，免疫原剂量为100µg/只，皮下多点注射；
（2）每间隔一周免疫一次；
（3）三次免疫后，尾静脉加强免疫，抗原剂量为100µg/只小鼠，3天后眼眶静脉采血100μL/只，3500rpm离心15min，分离血清，进行血清效价检测。试管凝集效价；ELISA法测定小鼠血清抗体效价大于1∶10000进行细胞融合试验；
3. 细胞融合
（1）融合前5-7天，对NS-1细胞进行扩大培养，调整细胞状态，使其达到对数生长期，细胞活率在95％以上；将对数生长期的NS-1细胞从培养箱中取出，轻轻晃动细胞，收集细胞悬液于50mL离心管，1000rpm离心10min，弃上清，再用10mL 1640培养液重悬细胞，备用；
（2）提取试血合格的BALB/c小鼠脾脏细胞，取NS-1细胞与上述小鼠脾细胞按1:5~1:8的比例混匀，1000rpm离心15min，弃上清液；
（3）使用50％的PEG4000作为融合剂进行融合，融合2min，加入50mL1640培养液终止反应，800rpm离心5min，弃上清液；
（4）细胞沉淀用HAT培养液重悬，将细胞均匀加入96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养；
4 .杂交瘤细胞的筛选及克隆
（1）酶标板包被和封闭
①使用包被液将Human IgG1（厂家：Fitzgerald）、Human IgG2（厂家：Fitzgerald）、Human IgG3（厂家：Fitzgerald）、Human IgG4（厂家：Abcam）分别配置成50µg/ml，按照100µL/孔加入酶标板中，37℃孵育2小时；
②包被结束后，轻轻敲去板内液体，每孔加入200µL2% BSA（厂家：SIGMA）溶液，37℃ 孵育2小时。封闭结束后用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（2）细胞筛选及克隆化
① 融合细胞在培养箱培养5~7天后，细胞克隆约上百个细胞进行筛选；
②取杂交瘤细胞上清液至96孔板中，180µl/孔。将待测样本各取40μl分别加到四种IgG抗原包被的酶标板中40µl/孔，37℃孵育1小时。结束后用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
③将HRP标记山羊抗小鼠IgG（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）用洗液（PBST）1∶10000稀释，100µl/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时；结束后使用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
④每孔加入100µl TMB显色液（庄盟生物），显色约5min后，每孔加入100µl终止液（2M H2SO4）；使用酶标仪（波长450nm）检测各孔OD值；
⑤将IgG1特异性阳性孔细胞进行培养和克隆化，获得一株能稳定分泌抗人IgG1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C11。经多次传代和多次冻融复苏后，细胞株均能良好生长，并能稳定分泌抗体；扩大培养后，冻存细胞，置于液氮中保存。
实施例2：
抗人IgG1单克隆抗体的制备
1. 将实施例1获得的细胞株3C11使用10%完全1640培养液扩大培养；
2. 收集细胞培养上清，使用中空纤维柱将细胞培养上清浓缩10倍，除菌后得到抗人IgG1单克隆抗体浓缩液，ELISA法测定抗体效价可达1∶10000；
3. 根据生产需求，将浓缩后抗人IgG1单克隆抗体经适当稀释，根据需求加入抗体稳定剂，即可作为抗人IgG1单克隆抗体试剂，用来进行人IgG1的鉴定或作为人IgG亚类检测相关试剂盒原料。
实施例3：
抗人IgG1单克隆抗体效价测定
1. ELISA法测定抗人IgG1单克隆抗体效价
（1）包被
使用包被液将Human IgG1（厂家：Fitzgerald）配置成50µg/ml，100µL/孔加入酶标板中，37℃孵育2小时；
（2）封闭
包被结束后，轻轻敲去板内液体，每孔加入200µL 2% BSA（厂家：SIGMA）溶液，37℃孵育2小时，封闭结束后用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（3）孵育实施例2制备的抗人IgG1单克隆抗体
取实施例2制备抗人IgG1单克隆抗体100µl/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时，结束后用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（4）孵育二抗
将HRP标记山羊抗小鼠IgG（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）用洗液（PBST）1∶10000稀释，100µl/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时。结束后用PBST洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（5）显色
每孔加入100µl TMB显色液（庄盟生物），显色约5min后，每孔加入100µl终止液（2MH2SO4）。使用酶标仪（波长450nm）检测各孔OD值；
实验结果如图1所示，实施例2制备的抗人IgG1单克隆抗体ELISA法测定效价为1∶10000。
2. 盐水试管法测定抗人IgG1单克隆抗体效价
（1）抗D致敏细胞制备：取抗D抗体（IgG1型，厂家：Millipore）200µl于一支干净的试管中，加入200µl健康献血员D阳性压积红细胞，混匀，37℃孵育30min，生理盐水洗涤3次，再用生理盐水配制成2%浓度抗D致敏细胞悬液备用；
（2）取试管一列，每管中加200µl生理盐水，在第2管中加入抗人IgG1单克隆抗体浓缩液200µl，用移液器依次进行倍比稀释，从稀释后的最后一管中移去200µl；
（3）向每一试管中加入2% 抗D致敏细胞悬液200µl。置室温孵育5min，立即1000rpm离心1分钟。取出试管，观察并记录结果；
（4）对照应没有凝集，以待测抗体的最大稀释度仍能出现肉眼可见红细胞凝集，作为抗体的效价；
实验结果如图2所示，实施例2制备的抗人IgG1单克隆抗体试管凝集效价为1∶256。
实施例4：
抗人IgG1单克隆抗体特异性鉴定
1. ELISA法鉴定抗人IgG1单克隆抗体特异性
（1）包被
使用包被液将Human IgG1（厂家：Fitzgerald）、Human IgG2（厂家：Fitzgerald）、Human IgG3（厂家：Fitzgerald）、Human IgG4（厂家：Abcam）分别配置成50µg/ml，按照100µL/孔加入酶标板中，37℃孵育2小时；
（2）封闭
包被结束后，轻轻敲去板内液体，每孔加入200µL 2% BSA（厂家：SIGMA）溶液，37℃孵育2小时，封闭结束后用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（3）孵育实施例2制备的抗人IgG1单克隆抗体
取实施例2制备抗人IgG1单克隆抗体100µl/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时，结束后用洗液（PBST）洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（6）孵育二抗
将HRP标记山羊抗小鼠IgG（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）用洗液（PBST）1∶10000稀释，100µl/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时。结束后使用多功能洗板机进行洗板，每板洗涤5次，轻轻敲去板内残余液体；
（7）显色
每孔加入100µl TMB显色液（庄盟生物），显色约5min后，每孔加入100µl终止液（2MH2SO4）；使用酶标仪（波长450nm）检测各孔OD值；
实验结果如表1所示：
表1. 抗人IgG1单克隆抗体ELISA法特异性鉴定结果
抗原类型 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
吸光度值 1.125 0.015 0.01 0.084
结论：实施例2制备的抗人IgG1单克隆抗体ELISA法测定特异性结果，抗人IgG1单克隆抗体与人IgG1抗原反应，与人IgG2、IgG3、IgG4抗原不发生反应，特异性鉴定合格；
2. 盐水试管法鉴定抗人IgG1单克隆抗体特异性
（1）致敏细胞制备：分别取抗D抗体（IgG1型，厂家：Millipore）、抗E抗体（IgG1型，厂家：Millipore）、抗Fya抗体（IgG1型，厂家：DIAGAST）、抗S抗体（IgG3型，厂家：DIAGAST）、抗s抗体（IgG3型，厂家：DIAGAST）200µl于干净的试管中，再分别加入200µl健康献血员相应抗原阳性压积红细胞，混匀，37℃孵育30min，生理盐水洗涤3次；
（2）取抗D、抗E、抗Fya、抗S、抗s致敏细胞和3人份A1、B、O型红细胞用生理盐水洗涤3次，2000rpm离心5min，去除上清，用生理盐水配成2%的红细胞悬液；
（3）将试管排成2列，做好标记，第一列试管各加待检样品100µl，然后在各试管中分别加入2%的抗D、抗E、抗Fya、抗S、抗s致敏细胞和3人份A1、B、O型红细胞悬液100µl；第二列试管做红细胞悬液对照，即将待检样品改为生理氯化钠溶液，置室温反应15min，1000rpm离心1min，轻摇试管，肉眼观察有无凝集；
（4）红细胞悬液对照组无凝集的前提下，观察并记录实施例2制备的抗人IgG1单克隆抗体与相应红细胞的凝集结果；反之如对照组有凝集反应则试验不成立，需重复试验；
结果如图3所示，抗人IgG1单克隆抗体与抗D、抗E、抗Fya致敏细胞发生凝集反应，与抗S、抗s致敏细胞和A1、B、O细胞不发生凝集反应，未发生溶血和其他不易分辨现象；
3. 蛋白免疫印迹试验鉴定抗人IgG1单克隆抗体特异性
（1）凝胶配制
配置5%浓缩胶，10%分离胶；
（2）样品处理
分别取Human IgG1（厂家：Fitzgerald）5μg于2个1.5mL EP管内，一管加入5μL还原型loading buffer，另一管加入5μL非还原型loading buffer，100℃加热10min；
（3）SDS-PAGE电泳
电泳上样，处理后的Human IgG1分别上样，蛋白Marker上样量为5µL。恒压电泳，初始电压为80V，进入分离胶时调至120V，当溴酚蓝迁移胶底处停止电泳；
（4）转膜
电泳结束后取出按照蛋白大小切割凝胶，再按凝胶大小剪切PVDF膜。PVDF膜置于甲醇浸泡2 min后放入纯化水清洗两次。按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序放置在转移槽内，200mA恒流转膜1h；
（5）封闭
转膜完毕，将PVDF膜置于预先配置好的5%BSA（PBST配制）封闭液中，37℃封闭1 h；封闭完毕，用PBST洗涤5次，每次5 min；
（6）孵育抗人IgG1单克隆抗体
将PDF膜置于实施例2制备抗人IgG1单克隆抗体中，37℃孵育1 h，孵育结束，用PBST洗涤5次，每次5 min；
（7）孵育二抗
加入HRP标记羊抗鼠IgG（1∶3000稀释）10mL，37℃孵育1 h。用PBST洗涤5次，每次5min；
（8）显色
使用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（厂家：碧云天），按说明书操作进行显色；
结果如图4所示，第1泳道为人IgG1还原型电泳，第2泳道为人IgG1非还原型电泳，抗人IgG1单克隆抗体与人IgG1反应，并且与人IgG1的重链及轻链均有反应，可见抗人IgG1单克隆抗体与人IgG1能特异性结合，由此鉴定此抗体为抗人IgG1单克隆抗体。
实施例5：
小鼠单克隆抗体Ig亚类鉴定
采用商品化试剂盒（小鼠单抗Ig类/亚类/鉴定ELISA试剂盒，厂家：益康生物）对实施例2制备抗人IgG1单克隆抗体Ig亚类分型进行鉴定；
结果如图5所示，抗人IgG1单克隆抗体为IgG1型。
实施例6：
杂交瘤细胞株染色体核型分析
1. 将实施例1获得杂交瘤细胞株3C11在传代培养48小时后，加秋水仙素，使秋水仙素最终浓度为0.8μg/mL，继续37℃培养4～6小时；将以上细胞1000rpm离心10min，弃去上清液；
2. 向细胞沉淀加入8mL 0.5%的氯化钾低渗液，用吸管吹打均匀，置37℃水浴30min。1000rpm离心10min，弃去上清液；
3. 向细胞沉淀缓慢加入5mL固定液（甲醇：乙酸=3：1）并混匀，37℃水浴固定20min，1000rpm离心10min，弃上清；
4. 向细胞沉淀中加入5mL固定液，1000rpm离心5min，弃上清，留下少许固定液，轻轻混匀细胞；
5. 用移液器吸取细胞滴于预冷的载玻片上，在火焰上经过几次，自然干燥；用Giemsa染液染色20min，用流水冲洗干净后，自然干燥，用显微镜观察染色体数，挑选染色体分散好、中期相多、形态规则的盖玻片封存并拍照记录结果；
6. 杂交瘤细胞的染色体数目接近两种亲本细胞的染色体数目之和，即小鼠脾细胞的染色体数目（40条）与小鼠骨髓瘤细胞NS-1的染色体数目（54～64）之和；
实施例1获得杂交瘤细胞株3C11核型分析结果如图6所示，染色体数在94～103条之间。

Claims (7)

1.一种分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株，其特征在于：
所述的细胞株命名为：杂交瘤细胞株3C11；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021年11月10日，保藏号为CCTCC NO:C2021100。
2.一种抗人IgG1单克隆抗体，其特征在于：
所述抗人IgG1单克隆抗体由权利要求1所述的分泌抗人IgG1单抗的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.根据权利要求2所述的一种抗人IgG1单克隆抗体，其特征在于，所述的一种抗人IgG1单克隆抗体类型为IgG1型；所述抗人IgG1单克隆抗体与人IgG1发生特异性反应。
4.一种人IgG1检测试剂，其特征在于，包括如权利要求2所述的抗人IgG1单克隆抗体。
5.一种人IgG1检测装置，其特征在于，包括如权利要求2所述的抗人IgG1单克隆抗体。
6.一种人IgG1检测方法，其特征在于，包括步骤将待测样品与权利要求2所述的抗人IgG1单克隆抗体接触，以确定待测样本是否含有人IgG1。
7.一种如权利要求2所述的抗人IgG1单克隆抗体在制备人IgG1检测试剂中的应用。
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