CN115651915A - 分泌抗猫b型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，其中杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2022268，所分泌产生的B35G单克隆抗体仅与猫的B型红细胞发生凝集，应用于特异性抗猫B型血型检测，反应速度快且测定结果准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
血型系统是根据红细胞膜上抗原种类不同而对血液进行分型的体系，猫公认的血型系统是AB血型系统，包括A、B、AB三种血型。现有技术中常使用植物小麦凝集素lectin识别NeuAc从而凝集猫B型血，用于猫B型血的鉴定。但由于不同厂家供应的lectin品质差别较大，且不能提供稳定的供货保障，不易实现对猫血型鉴定的工业化和标准化，因此，开发特异型识别NeuAc抗原的单克隆抗体，用于猫B型血型的检测尤其必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，方便对猫进行血型检测。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2022268。
进一步的，所述抗猫B型血型特异性单克隆抗体由如上所述的分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备。
进一步的，所述抗猫B型血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，所述抗猫B型血型特异性单克隆抗体与猫的B型血红细胞发生凝集。
本发明提供一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，其特征在于，包含如上所述的抗猫B型血型特异性单克隆抗体。
本发明提供一种血型检测装置，所述装置包含如上所述的血型检测试剂、试纸或试剂盒。
本发明提供一种如上所述的抗猫B型血型特异性单克隆抗体，或血型检测试剂、试纸或试剂盒在猫血型检测上的应用。
本发明提供一种血型检测方法，其特征在于，所述方法包括将待测样品与如上所述的抗猫B型血型特异性单克隆抗体接触，确定待测样品的血型。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本发明提供的分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的抗猫B型血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，该抗猫B型血型特异性单克隆抗体与猫的B型血红细胞发生凝集，而与猫的其他血型血红细胞不发生凝集反应，应用在猫血型检测操作简单，且具有反应迅速、测定结果准确度高的优点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗猫B型血型特异性单克隆抗体的凝胶电泳图；
图2是本发明实施例提供的抗猫B型血型特异性单克隆抗体凝集结果示意图，其中图A1-A3为抗猫B型血型特异性单克隆抗体与A型红细胞不发生凝集示意图，图B1-B3为抗猫B型血型特异性单克隆抗体与B型红细胞发生凝集示意图；
图3是本发明实施例提供的抗猫B型血型特异性单克隆抗体的亚型鉴定结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
分泌抗猫B型血型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为B35G，于2022年8月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉•武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022268。
分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，该抗猫B型血型特异性单克隆抗体与猫的B型血红细胞发生凝集，而与猫的其他血型血红细胞不发生凝集反应，测定结果精度高，应用在猫血型检测。
实施例一：
杂交瘤细胞的获得
1.免疫原及检测抗原的制备
(1)本实施例的免疫原选用新鲜的EDTA抗凝的B型血猫红细胞，先使用生理盐水至少洗涤三次，再用生理盐水配置成3％红细胞悬液。
(2)检测抗原选用新鲜的猫A、B型红细胞，生理盐水洗涤三次，用生理盐水配置成3%浓度的红细胞悬液。
2.免疫动物
(1)用免疫原免疫6周龄，体重约20g的BALB/c雌性小鼠，使用0.5ml免疫原直接腹腔注射。
(2)两周后加强免疫，0.5ml免疫原直接腹腔注射。
(3)加强免疫三天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合试验。
3.细胞融合
(1) 取上述免疫动物小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5:1-10:1的比例混匀，1000rpm离心5分钟，去除培养基。
(2) 使用无血清的RPMI-1640培养基洗涤一次，1000rpm离心5分钟，去除培养基。
(3) 使用50％PEG（聚乙二醇，购自Sigma，分子量1500）作为融合剂进行融合，室温融合2min，使用无血清的RPMI-1640培养基终止融合，1000rpm离心5分钟。
(4) 细胞沉淀用含HAT的RPMI-1640完全培养基悬浮，分装到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞的筛选及克隆
(1)融合的细胞在培养箱中静置培养10-14天，中途半量换液2次，融合细胞生长至约覆盖孔底1/3时进行取培养上清进行筛选。
(2)在U型96孔酶标板中加入细胞培养上清50ul，分别与50ul生理盐水配置的3％猫A、B型红细胞混匀，室温反应半小时，1000rpm离心1min，温和震荡，观察并记录凝集试验结果。
(3)筛选跟猫B型红细胞凝集而与A型红细胞无凝集的细胞孔作为阳性孔细胞，进行细胞扩大培养和单克隆化，即获得一株能稳定分泌抗猫B型血型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株B35G。扩大培养后，冻存细胞，置于液氮保存。
实施例二：
抗猫B型血型的单克隆抗体试剂的制备
(1) 将获得的杂交瘤细胞株B35G用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基扩大培养。PBS洗涤2次后用PBS重悬，调整杂交瘤细胞悬液密度为5x106/ml。
(2)6周龄BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂（Sigma），一周后腹腔注射0.5 ml 杂交瘤细胞悬液，7-10天后取腹水。
(3) 将含单克隆抗体的腹水经过12000rpm， 10分钟离心后，取上清，加入10倍体积的去离子水，使抗体析出；再12000rpm，离心15分钟后，抗体沉淀用PBS溶解，测定A280吸光度，计算抗体浓度A280/1.18。用PBS稀释调整抗体浓度为1 mg/ml，分别取5 ug、10ug、20ug 抗体加入1x还原型上样缓冲液，10% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，可见到分子量为70 kDa的IgM 重链及25 kDa的轻链。
实施例三：
分泌抗猫B型血型的单克隆抗体的特异性鉴定
采用试管法对制备的抗猫B型血型的单克隆抗体进行特异性鉴定，具体操作步骤如下：
(1)取A，B血型红细胞各3例，用生理盐水洗涤3次，2000rpm离心5分钟，最后用生理盐水配置成3％红细胞悬液。
(2)按每组3支试管，共2组，图2中的A1、A2及A3为A型血红细胞，B1、B2及B3为B型血红细胞，各加入20 ug/ml B35G单克隆抗体0.1ml，然后在各试管分别加入3％A，B血型红细胞悬液0.1ml，置室温反应15分钟，经过1000r/min离心1min，温和震荡，观察有无凝集。
图2为本实施例提供的抗猫B型血型特异性单克隆抗体凝集结果示意图，其中图A1-A3为抗猫B型血型特异性单克隆抗体与A型红细胞不发生凝集示意图，图B1-B3为抗猫B型血型特异性单克隆抗体与B型红细胞发生凝集示意图。从图中可知3支B型血红细胞全部发生凝集，而3支A型血红细胞没有发生凝集，具有显著的特异性。
实施例四：
抗体亚型鉴定
按照Proteintech的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作规程要求操作，将50ulB35G杂交瘤细胞培养上清加入ELISA板条中，加入50ul HRP标记的各亚型抗体二抗，室温孵育1小时，PBST洗3遍后TMB显色。
图3为本实施例提供的抗猫B型血型特异性单克隆抗体的亚型鉴定结果示意图，结果显示B35G单克隆抗体为IgM, 轻链为Kappa型。
本发明提供一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，包含抗猫B型血型特异性单克隆抗体；一种血型检测装置，包含血型检测试剂、试纸或试剂盒，均能够应用在猫的血型检测。
本发明还提供一种血型检测方法，该方法步骤中包括将待测样品与抗猫B型血型特异性单克隆抗体接触，用于确定待测样品的血型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1. 一种分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2022268。
2.一种抗猫B型血型特异性单克隆抗体，其特征在于，所述抗猫B型血型特异性单克隆抗体由权利要求1所述的分泌抗猫B型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备。
3.根据权利要求2所述的一种抗猫B型血型特异性单克隆抗体，其特征在于，所述抗猫B型血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，所述抗猫B型血型特异性单克隆抗体与猫的B型血红细胞发生凝集。
4.一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，其特征在于，包含权利要求2或3所述的抗猫B型血型特异性单克隆抗体。
5.一种血型检测装置，其特征在于，所述试剂包含权利要求4所述的血型检测试剂、试纸或试剂盒。
6.权利要求2或3所述的抗猫B型血型特异性单克隆抗体，或权利要求4所述的血型检测试剂、试纸或试剂盒在猫血型检测上的应用。
7.一种血型检测方法，其特征在于，所述方法包括将待测样品与权利要求2或3所述的抗猫B型血型特异性单克隆抗体接触，确定待测样品的血型。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20230131 |