CN115449512A - 分泌抗犬dea1.1血型单抗的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

分泌抗犬dea1.1血型单抗的杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗犬DEA1.1血型单抗的杂交瘤细胞株及应用，本发明采用犬DEA1.1型红细胞悬液为抗原免疫BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选、克隆，获得一株分泌抗犬DEA1.1型血型单抗的杂交瘤细胞株C10H，保藏编号为CCTCC NO：C2022290，杂交瘤细胞株C10H所分泌产生的单克隆抗体能够与犬DEA1.1+型红细胞发生凝集，而与DEA1.2+、DEA1‑血型红细胞不发生凝集反应，用于特异性抗犬DEA1.1型血型定型，检测准确高效。

Description

分泌抗犬DEA1.1血型单抗的杂交瘤细胞株及应用
技术领域
本发明涉及一种分泌抗犬DEA1.1血型单抗的杂交瘤细胞株及应用，属于生物技术领域。
背景技术
血型系统是根据红细胞膜上抗原种类不同而对血液进行分型的体系，犬的血型抗原较复杂，迄今已发现超过12种，被公认的国际标准的犬红细胞抗原系统（DEA系统）有8种：DEA1.1、1.2、3、4、5、6、7、8。其中DEA1.1和DEA1.2型对输血最重要，DEA1-犬输入DEA1+血时体内产生抗DEA1抗体，当再次输入DEA1+血时会迅速破坏输入的红细胞，使输血无效。研制生产针对特定血型抗原的单克隆抗体血型定型试剂以确保输血安全是行业发展趋势。法国Alvedia公司、美国DMS Laboratories公司开发了DEA1单克隆抗体，韩国KABB Bio公司进一步开发了分别针对DEA1.1和DEA1.2亚型的单克隆抗体用以区分DEA1.1和DEA1.2，但现有技术对于犬血型鉴定准确性仍然偏低，需要进一步研制不同的血型单克隆抗体作为补充或者替代以提高血型鉴定准确性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种分泌抗犬DEA1.1血型单抗的杂交瘤细胞株及应用，方便对犬进行血型检测。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种分泌抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022290。
进一步的，使用犬DEA1.1血型红细胞血影或DEA1.1型血犬红细胞为抗原免疫BALB/c小鼠。
进一步的，所述抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2022290的杂交瘤细胞株分泌产生。
进一步的，所述抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，所述抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与犬的DEA1.1型血红细胞发生凝集。
本发明提供一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，包含如上所述的抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体。
本发明提供一种血型检测装置，所述装置包含上述任一所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体。
本发明提供一种血型检测方法，所述方法包括将待测样品与上述任一所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体接触，确定待测样品的血型。
本发明还提供一种如上所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体，或血型检测试剂、试纸或试剂盒，或血型检测装置在犬血型检测上的应用。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本发明使用犬DEA1.1型红细胞血影或DEA1.1型血犬红细胞为抗原免疫BALB/c小鼠，获得分泌抗犬DEA1.1型血型单抗的杂交瘤细胞株C10H，所分泌产生的C10H单克隆抗体能够与犬的DEA1.1型红细胞发生凝集，而与犬的其他血型红细胞不发生凝集反应，应用特异性抗犬DEA1.1型血型的测定，显著提高对犬血型检测的便捷性及准确性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体的凝胶电泳图；
图2是本发明实施例提供的抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体凝集结果示意图，其中图中1-3为抗DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与DEA1.1型红细胞发生凝集示意图，图中4-6为抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与DEA1.2型红细胞不发生凝集示意图，图中7-9为抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与DEA1-型红细胞不发生凝集示意图；
图3是本发明实施例提供的抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体的亚型鉴定结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
分泌抗犬DEA1.1型血型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株C10H，于2022年9月9日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉•武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: C2022290。
分泌抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，该抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与犬的DEA1.1型血红细胞发生凝集，而与犬的其他血型血红细胞不发生凝集反应，测定结果精度高，应用在犬血型检测。
实施例一：
杂交瘤细胞的获得
1.免疫原及检测抗原的制备
(1) 采集EDTA抗凝的犬外周静脉血，以韩国KABB Bio犬血型卡定型血型，取DEA1.1+血用生理盐水洗涤三次，用5mM Na2HPO4 （pH为7.4）裂解红细胞，PBS洗涤三次，再使用PBS重悬获得红细胞血影（ghost）悬液作为免疫原。
可实施的，本实施例的免疫原还可以选用新鲜的EDTA抗凝的DEA1.1型血犬红细胞，先使用生理盐水至少洗涤三次，再用生理盐水配置成3％红细胞悬液作为免疫原。
(2)检测抗原为新鲜的犬DEA1.1、DEA1.2及DEA1-红细胞，生理盐水洗涤三次，用生理盐水配置成3%浓度的红细胞悬液。
2.免疫动物
(1)用免疫原免疫6周龄体重约20g的BALB/c雌性小鼠，0.5ml免疫原直接腹腔注射。
(2)两周后加强免疫，0.5ml免疫原直接腹腔注射。
(3)加强免疫三天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合试验。
3.细胞融合
(1) 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5:1-10:1的比例混匀，1000rpm离心5分钟，去除培养基。
(2) 使用无血清的RPMI-1640培养基洗涤一次，1000rpm离心5分钟，去除培养基。
(3) 使用50％PEG（聚乙二醇，购自Sigma，分子量1500）作为融合剂进行融合，室温融合2min，再使用无血清的RPMI-1640培养基终止融合，1000rpm离心5分钟。
(4) 离心后的细胞沉淀用含HAT的RPMI-1640完全培养基悬浮，分装到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞的筛选及克隆
(1)融合的细胞在培养箱中静置培养10-14天，中途半量换液2次，融合细胞生长至约覆盖孔底1/3时进行取培养上清进行筛选。
(2)在U型96孔酶标板中加入细胞培养上清50ul，分别与50ul生理盐水配置的3％犬DEA1.1+、DEA1.2+、DEA1-型红细胞混匀，室温反应半小时，经1000rpm离心1min，温和震荡，观察并记录凝集试验结果。
(3)筛选跟犬DEA1.1+型红细胞凝集而与DEA1.2+、DEA1-型红细胞无凝集的细胞孔作为阳性孔细胞，进行细胞扩大培养和单克隆化，即获得一株能稳定分泌抗犬DEA1.1型血型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株C10H，扩大培养后，冻存细胞，置于液氮保存。
实施例二：
抗犬DEA1.1型血型的单克隆抗体试剂的制备
(1)将获得的杂交瘤细胞株C10H用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基扩大培养。PBS洗涤2次后用PBS重悬，调整细胞密度为2x106/ml。
(2)6周龄BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂（Sigma），一周后腹腔注射0.5 ml 杂交瘤细胞悬液，7-10天后取腹水。
(3)将含单克隆抗体的腹水经过12000rpm，10分钟离心后，取上清，加入10倍体积的去离子水，使抗体析出；在经过12000rpm，离心15分钟后，抗体沉淀用PBS溶解，测定A280吸光度，计算抗体浓度A280/1.18。用PBS稀释调整抗体浓度为1 mg/ml，分别取2ug、10ug 抗体加入1x还原型上样缓冲液，10% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示，可见到分子量为70 kDa的IgM 重链及25 kDa的轻链。
实施例三：
分泌抗犬DEA1.1型血型的单克隆抗体的特异性鉴定
采用试管法对制备的抗犬DEA1.1型血型的单克隆抗体进行特异性鉴定。具体步骤如下：
(1)取DEA1.1+、DEA1.2+、DEA1-血型红细胞各3例，用生理盐水洗涤3次，2000rpm离心5分钟，最后用生理盐水配置成3％红细胞悬液。
(2)按每组3支试管，共3组，图2中的1-3为DEA1.1型血红细胞，3-6为DEA1.2型血红细胞，7-9为DEA1-型血红细胞，各加入20 ug/ml C10H单克隆抗体0.1ml，然后在各试管分别加入3％DEA1.1，DEA1.2，DEA1-血型红细胞悬液0.1ml，置室温反应15分钟，再经过1000r/min离心1min，温和震荡，观察有无凝集。
图2为本实施例提供的抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体凝集结果示意图，其中图中1-3为抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与DEA1.1型红细胞发生凝集示意图，图中4-6为抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与DEA1.2型红细胞不发生凝集示意图，7-9为抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与DEA1-型红细胞不发生凝集示意图。从图中可知3支DEA1.1型血红细胞全部发生凝集，而3支DEA1.2型血红细胞没有发生凝集，3支DEA1-型血红细胞没有发生凝集，具有显著的特异性。
实施例四：
抗体亚型鉴定
按照Proteintech的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作规程要求操作，将50ul杂交瘤培养上清加入ELISA板条中，加入50ul HRP标记的各亚型抗体二抗，室温孵育1小时，PBST洗3遍后TMB显色，硫酸终止反应后测A450吸光度。
图3为本实施例提供的抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体的亚型鉴定结果示意图，结果显示C10H单克隆抗体为IgM, 轻链为Kappa型。
本发明提供一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，包含抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体；一种血型检测装置，包含抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体，均能够应用在犬的血型检测，检测效率高且准确。
本发明还提供一种血型检测方法，该方法步骤中包括将待测样品与抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体接触，以确定待测样品的血型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种分泌抗犬DEA1.1血型单抗的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022290。
2.根据权利要求1所述的一种分泌抗犬DEA1.1血型单抗的杂交瘤细胞株，其特征在于，使用犬DEA1.1型红细胞血影或DEA1.1型血犬红细胞为抗原免疫BALB/c小鼠。
3.一种抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体，其特征在于，所述抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2022290的杂交瘤细胞株分泌产生。
4.根据权利要求3所述的一种抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体，其特征在于，所述抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体为IgM单克隆抗体，所述抗犬DEA1.1型血型特异性单克隆抗体与犬的DEA1.1型血红细胞发生凝集。
5.一种血型检测试剂、试纸或试剂盒，其特征在于，包含权利要求3或4所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体。
6.一种血型检测装置，其特征在于，包含权利要求3或4所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体。
7.一种血型检测方法，其特征在于，所述方法包括将待测样品与权利要求3或4所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体接触，以确定待测样品的血型。
8.权利要求3或4所述的抗犬DEA1.1血型特异性单克隆抗体，或权利要求5所述的血型检测试剂、试纸或试剂盒，或权利要求6所述的血型检测装置在犬血型检测上的应用。
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