CN114854696A - 分泌抗人A型血型的IgM型单抗的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分泌抗人A型血型的IgM型单抗的杂交瘤细胞株及应用，能分泌抗人A型血型抗原的单克隆抗体；命名为杂交瘤细胞株A2A10；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021年11月10日，保藏号CCTCC NO：C202198；本发明还提供了由所述分泌抗人A型血型的IgM型单抗的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体及其应用；所述细胞株分泌的抗人A型血型抗体能够与人A1型红细胞、A2型红细胞、A2B型红细胞发生凝集反应，与人B型、O型红细胞不发生凝集反应，是一株抗人A型血型的单抗，与人A1型红细胞试管法凝集效价为1024，与人A2型红细胞试管法凝集效价为512，与人A2B型红细胞试管法凝集效价为512，可以用于人类血型的检测。
Description
技术领域
本发明公开一种IgM型单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用，提供了一株新的能够分泌抗人A型血型的细胞株，属于人类血型检测技术领域。
背景技术
自Landsteinor（1900）发现ABO血型以来，血型鉴定试剂主要用人血清，存在着个体间差异较大、质量不稳定、成本高、需耗用大量人血等问题。多年来各国学者一直致力于寻找一种理想的试剂代替人血清，先后用鱼类、蜗牛、扁豆等动植物组织浆液进行研究，但由于种种问题未能普及推广应用。Voak（1980）和Sacks（1981）用淋巴细胞杂交技术先后建立了分泌抗人A型、抗人B型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其用于ABO系统血型鉴定。如今，在世界各国，ABO血型单克隆抗体试剂已成为常规试剂，在我国抗A、抗B单克隆抗体血型试剂占所有临床应用的ABO血型试剂总量90%以上。我国是一个人口14亿的大国，对血型定型试剂需求量非常大，而目前市场上供应的血型定型试剂在质量上和数量上不能满足市场的需求。
目前，市场上抗A抗B试剂生产用细胞株由于细胞培养上清分泌抗体盐水凝集效价达不到国家标准，为达到国家标准，在试剂中添加少量动物腹水，这样不仅会增加成本，并且腹水中杂抗体会对试剂结果产生干扰。因此，开发安全可靠、性价比高的抗A抗B单克隆抗体血型试剂具有较大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明提供一种分泌抗人A型血型的IgM型单抗的杂交瘤细胞株，以人A型红细胞为抗原通过杂交瘤技术制备了一株分泌抗人A型血型的IgM型单克隆抗体的杂交瘤细胞，将细胞培养上清浓缩后可作为人血型检测试剂，应用于人血型的检测中。
本发明的一个目的是提供一种分泌抗人A型血型的IgM型单抗的杂交瘤细胞株，命名为：杂交瘤细胞株A2A10：保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日为2021年11月10日，保藏号为CCTCC NO：C202198。
本发明的第二个目的是提供一种抗人A型血型单克隆抗体，所述抗人A型血型单克隆抗体分别由如上所述的分泌抗人A型血型的IgM型单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述抗人A型血型单克隆抗体类型为IgM型；所述抗人A型血型抗体能够与人A1型红细胞、A2型红细胞、A2B型红细胞发生凝集反应，与人B型、O型红细胞不发生凝集反应。
本发明的第三个目的是提供一种人ABO血型检测试剂，包括如上所述的抗人A型血型单克隆抗体。
本发明的第四个目的是提供一种人ABO血型检测装置，包括如上所述的抗人A型血型单克隆抗体。
本发明的第五个目的是提供一种人ABO血型检测方法，其特征在于，包括步骤将待测样品与如上所述的抗人A型血型单克隆抗体接触，以确定待测样本ABO血型。
本发明的第六个目的是提供一种如上所述的抗人A型血型单克隆抗体在人ABO系统血型检测上的应用。
本发明积极效果在于：
公开了一种分泌抗人A型血型的IgM型单抗的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。采用人A型红细胞为抗原免疫BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选、克隆，获得能稳定传代并分泌抗人A型血型单抗的杂交瘤细胞株为A2A10；所述杂交瘤细胞株分泌的抗人A型血型单克隆抗体类型为IgM型，能够与人A1型红细胞、A2型红细胞、A2B型红细胞发生凝集反应，与人B型、O型红细胞不发生凝集反应。将该细胞培养上清收集后浓缩，用A1型红细胞做试管凝集试验检测，浓缩液抗体效价可达1024；用A2型红细胞做试管凝集试验检测，浓缩液抗体效价可达512；用A2B型红细胞做试管凝集试验检测，浓缩液抗体效价可达512，可以用于人类血型的检测。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可按照说明书的内容予以实施，以下用一些实例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
图1. 抗人A型血型单克隆抗体试管凝集效价测定结果照片（抗人A型血型单克隆抗体试管凝集效价测定结果照片。A：与A1人红细胞反应结果，B:与A2型人红细胞反应结果；C:与A2B型红细胞反应结果。图中数字表示对应试管中抗体的稀释倍数）；
图2. 抗人A型血型单克隆抗体特异性鉴定结果照片；
图3. 抗人A型血型单克隆抗体（A2A10）Ig亚类鉴定结果图片；
图4. 抗人A型血型单克隆抗体杂交瘤细胞株（A2A10）染色体核型分析结果照片；
图5. 抗人A型血型单克隆抗体杂交瘤细胞株（A2A10）传代稳定性分析结果图片（抗人A型血型单克隆抗体杂交瘤细胞株（A2A10）传代稳定性分析结果图片。横坐标为细胞代次，纵坐标为抗体与红细胞凝集效价）。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
杂交瘤细胞的获得。
1. 免疫原的制备
采集人A型抗凝全血。将全血2500rpm离心10min，弃去上清，压积红细胞用生理盐水洗涤3次，每次2500rpm离心5min，弃去上清。将压积红细胞用生理盐水配制成30%红细胞悬液，备用；
2. 动物免疫与试血
（1）用免疫原免疫4周龄，体重约20g的BALB/c小鼠，免疫原剂量为500µl/只，腹腔注射；
（2）每间隔一周免疫一次；
（3）三次免疫后，尾静脉加强免疫，抗原剂量为100µl/只小鼠，3天后眼眶静脉采血100μL/只，3500rpm离心15min，分离血清，进行血清效价检测。小鼠血清试管凝集效价大于256进行细胞融合试验；
3. 细胞融合
（1）融合前5-7天，对NS-1细胞进行扩大培养，调整细胞状态，使其达到对数生长期，细胞活率在95％以上；将对数生长期的NS-1细胞从培养箱中取出，轻轻晃动细胞，收集细胞悬液于50mL离心管，1000rpm离心10min，弃上清，再用10mL 1640培养液重悬细胞，备用；
（2）提取试血合格的BALB/c小鼠脾脏细胞按1:5~1:8的比例混匀，1000rpm离心15min，弃上清液；
（3）使用50％的PEG4000作为融合剂进行融合，融合2min，加入50mL1640培养液终止反应，800rpm离心5min，弃上清液；
（4）细胞沉淀用HAT培养液重悬，将细胞均匀加入96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养；
4 .杂交瘤细胞的筛选及克隆
（1）制备A、B、O血型红细胞悬液
分别采集人A型、B型、O型抗凝全血。将全血2500rpm离心10min，弃去上清，压积红细胞用生理盐水洗涤3次，每次2500rpm离心5min，弃去上清；将压积红细胞用生理盐水配制成2%红细胞悬液，备用；
（2）筛选及克隆化
① 融合细胞在培养箱培养5~7天后，细胞克隆约上百个细胞进行筛选；
②取杂交瘤细胞上清液至96孔板中，180µl/孔。将待测样本各取50μl分别加到U型板中，每个待测样本加3个孔；将2%A型、B型、O型红细胞悬液分别加到待测样本的3个孔中，50μl/孔；用板式振荡器将加完抗体和细胞的U型板混匀，300g离心30s，再用板式振荡器震荡，观察是否有凝集反应；
③ 筛选出与A型红细胞发生凝集，与B型和O型红细胞不发生凝集的细胞进行克隆化和培养；
获得一株能稳定分泌抗人A型血型单克隆抗体的杂交瘤细胞株A2A10；经多次传代和多次冻融复苏后，细胞株均能良好生长，并能稳定分泌抗体；扩大培养后，细胞冻存，置于液氮中保存。
实施例2
抗人A型血型单克隆抗体的制备
1. 将实施例1获得的细胞株A2A10使用10%完全1640培养液扩大培养；
2. 收集细胞培养上清，使用中空纤维柱将细胞培养上清浓缩，除菌后分别得到抗人A型血型单克隆抗体浓缩液，盐水试管法凝集效价均可达1024；
3. 根据生产需求，将浓缩的抗人A型血型单克隆抗体适当稀释，根据需求加入抗体稳定剂，即可作为抗人A型血型单克隆抗体试剂，用来进行人ABO血型的鉴定或作为抗A抗B血型定型检测卡（单克隆抗体）或抗A抗B血型定型检测卡（微柱凝胶）等试剂盒的原料。
实施例3
抗人A型血型单克隆抗体效价测定
采用盐水试管法，测定实施例2制备抗人A型血型单克隆抗体与A1型红细胞、A2型红细胞，A2B型红细胞反应的效价；
（1）取试管3列，每管中加0.2mL生理盐水，在第2管中加入抗人A型血型单克隆抗体浓缩液0.2mL，用移液器依次进行倍比稀释，从稀释后的最后一管中移去0.2mL；
（2）向每一列试管中分别加入对应2% A1型、A2型、A2B型红细胞悬液0.2mL。置室温孵育15min，立即1000rpm 离心1min，取出试管，观察并记录结果；
（3）对照应没有凝集，以待测抗体的最大稀释度仍能出现肉眼可见红细胞凝集，作为抗体的效价；
实验结果如图1所示，实施例2制备的抗人A型血型单克隆抗体与A1型红细胞试管凝集效价为1024，抗人A型血型单克隆抗体与A2型红细胞试管凝集效价为512，抗人A型血型单克隆抗体与A2B型红细胞试管凝集效价为512。
实施例4
抗人A型血型单克隆抗体特异性鉴定
采用盐水试管法对实施例2制备抗人A型血型单克隆抗体进行特异性鉴定，具体步骤如下：
（1）取3人份A1、B、O与A2B红细胞用生理盐水洗涤3次，2000rpm离心5min，去除上清，用生理盐水配成2%的红细胞悬液；
（2）将试管排成2列，每列4支，做好标记，第一列试管各加待检样品0.1mL，然后在各试管中分别加入2%的A1、A2B、B、O红细胞悬液0.1mL；第二列试管做红细胞悬液对照，即将待检样品改为生理氯化钠溶液，然后在各试管中分别加入上述2%红细胞悬液0.1mL，置室温反应15分钟，1000rpm离心1分钟，轻摇试管，肉眼观察有无凝集；
（3）红细胞悬液对照组无凝集的前提下，观察并记录实施例2制备的抗人A型血型单克隆抗体与相应红细胞的凝集结果。反之如对照组有凝集反应则试验不成立，需重复试验；
（4）结果如图2所示，抗人A型血型单克隆抗体与A1、A2B细胞发生凝集反应，与B、O细胞不发生凝集反应，未发生溶血和其他不易分辨现象。
实施例5
小鼠单克隆抗体Ig亚类鉴定
采用商品化试剂盒（Mouse Ig Isotyping INSTANT ELISA，厂家：eBioscience）对实施例2制备抗人A型血型单克隆抗体Ig亚类分型进行鉴定；
实验结果如图3所示，抗人A型血型单克隆抗体为IgM型。
实施例6
杂交瘤细胞株染色体核型分析
（1）将实施例1获得杂交瘤细胞株A2A10在传代培养48小时后，加秋水仙素，使秋水仙素最终浓度为0.8μg/mL，继续37℃培养4～6小时；将以上细胞1000rpm离心10min，弃去上清液；
（2）向细胞沉淀加入8mL 0.5%的氯化钾低渗液，用吸管吹打均匀，置37℃水浴30min；1000rpm离心10min，弃去上清液；
（3）向细胞沉淀缓慢加入5mL固定液（甲醇：乙酸=3：1）并混匀，37℃水浴固定20min，1000rpm离心10min，弃上清；
（4）向细胞沉淀中加入5mL固定液，1000rpm离心5min，弃上清，留下少许固定液，轻轻混匀细胞；
（5）用移液器吸取细胞滴于预冷的载玻片上，在火焰上经过几次，自然干燥；用Giemsa染液染色20min，用流水冲洗干净后，自然干燥，用显微镜观察染色体数，挑选染色体分散好、中期相多、形态规则的盖玻片封存并拍照记录结果；
（6）杂交瘤细胞的染色体数目接近两种亲本细胞的染色体数目之和，即小鼠脾细胞的染色体数目（40条）与小鼠骨髓瘤细胞NS-1的染色体数目（54～64）之和；
（7）实施例1获得杂交瘤细胞株A2A10染色体数目结果如图4所示，染色体数在94～104条之间。
实施例8
杂交瘤细胞株A2A10传代稳定性检测
（1）将实施例1获得杂交瘤细胞株A2A10扩大培养至细胞培养瓶；
（2）待细胞处于对数生长期，对细胞进行计数，取样稀释到4×105个/ml，接种于一个新的细胞培养瓶中，培养液为10%胎牛血清完全1640培养基；
将方瓶放置二氧化碳培养箱中培养7天后，对细胞培养上清液进行实施例3所述抗人A型血型单克隆抗体效价测定；
（3）实施例1获得杂交瘤细胞株A2A10传代稳定性检测结果如图5所示，杂交瘤细胞株A2A10能够稳定传代。
实施例9
抗人A型血型单克隆抗体检测样本
（1）收集影响人ABO系统血型正定型检测的相关疾病样本112例及40例健康成人样本；
（2）使用实施例2制备的抗人A型血型单克隆抗体对收集到的152例样本进行检测；
（3）抗人A型血型单克隆抗体检测样本记录见表1：
表1.相关疾病样本142例及健康成人样本40例检测结果
Claims (6)
1.一株IgM型单抗的杂交瘤细胞株，命名为：杂交瘤细胞株A2A10；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021年11月10日，保藏号为CCTCC NO：C202198。
2.如权利要求1所述的一种IgM型单抗的杂交瘤细胞株在制备人A型血型抗原检测试剂中的用途。
3.一种抗人A型血型抗原的单克隆抗体，其特征在于：由权利要求1所述的杂交瘤细胞株A2A10分泌产生。
4.根据权利要求3所述的一种抗人A型血型抗原的单克隆抗体，其特征在于，
所述抗人A型血型抗原的单克隆抗体类型为IgM型；
所述抗人A型血型抗体能够与人A1型红细胞、A2型红细胞、A2B型红细胞发生凝集反应，与人B型、O型红细胞不发生凝集反应。
5.一种血型检测试剂，其特征在于，包括如权利要求3所述的抗人A型血型抗原的单克隆抗体。
6.一种血型检测装置，其特征在于，包括如权利要求3所述的抗人A型血型抗原的单克隆抗体。
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2022
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