CN114717198A - 分泌抗a1血型单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 - Google Patents

分泌抗a1血型单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分泌抗A1血型单抗的杂交瘤细胞株，能分泌抗人A1型血型抗原的单克隆抗体；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021年10月18日，保藏号为CCTCC NO:C2021237，命名为：杂交瘤细胞株A6F12；本发明还提供了由所述分泌抗人A1型血型抗原的IgM型单抗的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体及其应用。所述细胞株分泌的抗人A1型血型抗原的单抗能够与人A1型红细胞、A1B型红细胞发生细胞凝集反应，与人A2型红细胞、A2B型红细胞弱凝集或不凝集，与人B型红细胞、O型红细胞不发生细胞凝集反应，是一株抗人A1型血型抗原的单抗。

Description

分泌抗A1血型单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉一种分泌抗人A1型血型抗原的IgM型单抗的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用。
背景技术
A1和A2是血型血清学方法确定的最重要的A型红细胞亚型，一般认为有两种A型抗原：A和A1，A1型人红细胞有这两种抗原，A2型人红细胞只有A抗原。A1型人红细胞与抗A和抗A1抗体反应，A2型人红细胞只与抗A抗体反应。约1%~2%的A2型人和22%~26%的A2B型人的血清中能产生抗A1抗体，所以A1、A2亚型之间输血可能会引起输血反应，为输血安全带来隐患。临床上需要使用抗A1试剂对A1和A2进行表型鉴定，最常用的抗A1试剂是双花扁豆植物血凝素，但其不易于工业化和标准化，而抗A1单克隆抗体细胞株研制成功后，可以实现工业化、标准化生产。
发明内容
本发明提供了一种分泌抗人A1型血型的杂交瘤细胞株，以人A1型红细胞为抗原通过杂交瘤技术制备了一株分泌抗人A1型血型抗原的IgM型单抗的杂交瘤细胞株，细胞培养上清适当稀释后可作为血型检测试剂，应用于人ABO血型的检测中，使人ABO血型检测方法更科学与完善。
本发明的一个目的是提供一种分泌抗人A1型血型的杂交瘤细胞株，所述的细胞株命名为：杂交瘤细胞株A6F12：保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉.武汉大学，保藏日为2021年10月18日，保藏号为CCTCC NO：C2021237。
本发明的第二个目的是提供一种抗人A1型血型抗原的单克隆抗体，所述抗人A1型血型抗原的单克隆抗体由如上所述的分泌抗人A1型血型抗原的IgM型单抗的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述抗人A1型血型抗原的单克隆抗体类型为IgM型；所述抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与人的A1型红细胞、A1B型红细胞发生细胞凝集反应，与人A2型红细胞、A2B型红细胞弱凝集或不凝集，与人B型红细胞、O型红细胞不发生细胞凝集反应。
本发明的第三个目的是提供一种血型检测试剂，包括如上所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体。
本发明的第四个目的是提供一种血型检测装置，包括如上所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体。
本发明的第五个目的是提供一种血型检测方法，其特征在于，包括步骤将待测样品与如上所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体接触，以确定待测样本血型。
本发明的第六个目的是提供一种如上所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体抗体在人ABO血型检测上的应用。
本发明积极效果在于：公开了一种分泌抗人A1型血型抗原的IgM型单抗的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。采用人A1型红细胞悬液为抗原免疫BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选、克隆，获得一株能稳定传代并分泌抗人A1型血型抗原单抗的杂交瘤细胞株A6F12，其保藏号为CCTCC NO:C2021237。由如上所述杂交瘤细胞株分泌的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体类型为IgM型。如上所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体能够与人A1型红细胞、A1B型红细胞发生细胞凝集反应，与人A2型红细胞、A2B型红细胞弱凝集或不凝集，与人B型红细胞、O型红细胞不发生细胞凝集反应，是一株抗人A1型血型抗原的单抗。将该株细胞培养上清用人A1型红细胞做试管凝集试验检测，细胞上清效价可达128。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可按照说明书的内容予以实施，以下用一些实例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
图1. 抗人A1型血型抗原的单克隆抗体试管凝集效价测定结果照片；
图2. 抗人A1型血型抗原的单克隆抗体特异性鉴定结果照片；
图3. 抗人A1型血型抗原的单克隆抗体Ig亚类鉴定结果图片；
图4. 杂交瘤细胞株A6F12染色体核型分析结果照片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
杂交瘤细胞的获得
1. 免疫原的制备
免疫原为新鲜的人A1型抗凝红细胞，生理盐水洗涤3次，用生理盐水配制成10%红细胞悬液；免疫抗原现用现配，保证红细胞新鲜；
2. 动物免疫与试血
（1）用免疫原免疫4周龄，体重约20g的BALB/c小鼠，免疫原剂量为500µL/只，皮下多点注射；
（2）每间隔一周免疫一次；
（3）三次免疫后，尾静脉加强免疫，抗原剂量为100µL/只小鼠，3天后眼眶静脉采血100µL/只，3500rpm离心15min，分离血清，进行血清效价检测；小鼠血清试管凝集效价大于200进行细胞融合试验；
3. 细胞融合
（1）融合前5-7天，对NS-1细胞进行扩大培养，调整细胞状态，使其达到对数生长期，细胞活率在95％以上；将对数生长期的NS-1细胞从培养箱中取出，轻轻晃动细胞，收集细胞悬液于50mL离心管，1000rpm离心10min，弃上清，再用10mL 1640培养液重悬细胞，备用；
（2）提取试血合格的BALB/c小鼠脾脏细胞，将NS-1与脾脏细胞按1:5~1:8的比例混匀，1000rpm离心15min，弃上清液；
（3）使用50％的PEG4000作为融合剂进行融合，融合2min，加入50mL1640培养液终止反应，800rpm离心5min，弃上清液；
（4）细胞沉淀用HAT培养液重悬，将细胞均匀加入96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养；
4 .杂交瘤细胞的筛选及克隆
（1）检测抗原的制备
检测抗原为新鲜的人A1、A2、B、O型抗凝红细胞，生理盐水洗涤3次，用生理盐水配制成所需浓度的红细胞悬液；检测抗原现用现配，保证红细胞新鲜；
（2）筛选及克隆化
① 融合细胞在培养箱培养5~7天后，细胞克隆约上百个细胞进行筛选；
②取杂交瘤细胞上清液至96孔板中，180µL/孔。将待测样本各取40µL分别加到U型板中，每个待测样本加4个孔；将四种A1、A2、B、O型红细胞用生理盐水配制成0.3%悬液，再分别加到待测样本的4个孔中，40µL/孔；用板式振荡器将加完抗体和细胞的U型板混匀，300g离心30s，再用板式振荡器震荡，观察是否有凝集反应；
③ 筛选出与A1型红细胞发生凝集，与A2、B、O型红细胞不发生凝集的细胞进行克隆化和培养；
获得一株能稳定分泌抗人A1型血型抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株A6F12；经多次传代和多次冻融复苏后，细胞株均能良好生长，并能稳定分泌抗体。扩大培养后，细胞冻存，置于液氮中保存。
实施例2
抗人A1型血型抗原的单克隆抗体的制备
1. 将实施例1获得的细胞株A6F12使用10%完全1640培养液扩大培养，收集细胞培养上清，除菌后得到抗人A1型血型抗原的单克隆抗体，盐水试管法凝集效价可达128；
2. 根据生产需求，将除菌后得到抗人A1型血型抗原的单克隆抗体适当稀释后加入抗体保护剂，即可作为抗人A1型血型抗原的单克隆抗体试剂，用来进行人ABO血型的鉴定或作为人ABO血型鉴定试剂盒的原料。
实施例3
抗人A1型血型抗原的单克隆抗体效价测定
采用盐水试管法，测定实施例2制备抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与A1型红细胞反应的效价；
1. 取试管一列，每管中加0.2mL生理盐水，在第2管中加入抗人A1型血型抗原的单克隆抗体0.2mL，用移液器依次进行倍比稀释，从稀释后的最后一管中移去0.2mL；
2. 向每一试管中加入2%A1型红细胞悬液0.2mL；置室温孵育15min，立即1000rpm离心1分钟；取出试管，观察并记录结果；
3. 对照应没有凝集，以待测抗体的最大稀释度仍能出现肉眼可见红细胞凝集，作为抗体的效价；
实验结果如图1所示，实施例2制备的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体试管凝集效价为128。
实施例4
抗人A1型血型抗原的单克隆抗体特异性鉴定
采用盐水试管法对实施例2制备抗人A1型血型抗原的单克隆抗体进行特异性鉴定，具体步骤如下：
1. 取A1、A1B、A2、A2B、B、O型红细胞用生理盐水洗涤3次，2000rpm离心5min，去除上清，用生理盐水配成2%的红细胞悬液；
2. 将试管排成2列，每列6支，做好标记，第一列试管各加待检样品0.1mL，然后在各试管中分别加入2%的A1、A1B、A2、A2B、B、O型红细胞悬液0.1mL；第二列试管做红细胞悬液对照，即将待检样品改为生理氯化钠溶液，然后在各试管中分别加入上述2%红细胞悬液0.1mL，置室温反应15分钟，1000rpm离心1分钟，轻摇试管，肉眼观察有无凝集；
3. 红细胞悬液对照组无凝集的前提下，观察并记录实施例2制备的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与相应红细胞的凝集结果；反之如对照组有凝集反应则试验不成立，需重复试验；
结果如图2所示，抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与与人A1型红细胞、A1B型红细胞发生细胞凝集反应，与人A2型红细胞、A2B型红细胞弱凝集或不凝集，与人B型红细胞、O型红细胞不发生细胞凝集反应，未发生溶血和其他不易分辨现象。
实施例5
小鼠单克隆抗体Ig亚类鉴定
采用商品化试剂盒（小鼠单抗Ig类/亚类/鉴定ELISA试剂盒，厂家：益康生物）对实施例2制备抗人A1型血型抗原的单克隆抗体Ig亚类分型进行鉴定；
实验结果如图3所示，抗人A1型血型抗原的单克隆抗体为IgM型。
实施例6：
杂交瘤细胞株染色体核型分析
1. 将实施例1获得杂交瘤细胞株A6F12在传代培养48小时后，加秋水仙素，使秋水仙素最终浓度为0.8μg/mL，继续37℃培养4～6小时。将以上细胞1000rpm离心10min，弃去上清液；
2. 向细胞沉淀加入8mL 0.5%的氯化钾低渗液，用吸管吹打均匀，置37℃水浴30min。1000rpm离心10min，弃去上清液；
3. 向细胞沉淀缓慢加入5mL固定液（甲醇：乙酸=3：1）并混匀，37℃水浴固定20min，1000rpm离心10min，弃上清；
4. 向细胞沉淀中加入5mL固定液，1000rpm离心5min，弃上清，留下少许固定液，轻轻混匀细胞；
5. 用移液器吸取细胞滴于预冷的载玻片上，在火焰上经过几次，自然干燥；用Giemsa染液染色20min，用流水冲洗干净后，自然干燥，用显微镜观察染色体数，挑选染色体分散好、中期相多、形态规则的盖玻片封存并拍照记录结果；
6. 杂交瘤细胞的染色体数目接近两种亲本细胞的染色体数目之和，即小鼠脾细胞的染色体数目（40条）与小鼠骨髓瘤细胞NS-1的染色体数目（54～64）之和；
实施例1获得杂交瘤细胞株A6F12染色体数目结果如图4所示，染色体数在94～103条之间。
实施例7
抗人A1型血型抗原的单克隆抗体亲和力测定
采用玻片凝集试验，测定实施例2制备抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与人A1型、A1B型红细胞反应的亲和力，具体步骤如下：
1. 取人A1型、A1B型红细胞用生理盐水配制成10%红细胞悬液，取50µL滴加到玻片上；
2. 再取待测抗体50µL滴加到玻片上，立即将10%红细胞悬液与待测抗体接触并混匀，记录肉眼可见凝集块的时间；实验结果如表1所示：
表1. 抗人A1型血型抗原的单克隆抗体亲和力测定结果
红细胞亚型 实验份数 A6F12单抗亲和力
A<sub>1</sub> 6 3秒11
A<sub>1</sub>B 4 5秒68
结论：实施例2制备抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与人A1型红细胞反应的亲和力为3秒11；与人A1B型红细胞反应的亲和力为5秒68。
实施例8：
抗人A1型血型抗原的单克隆抗体试剂的应用
收集68人份已知血型样本，采用试管凝集试验进行鉴定，同时用抗A血型定型试剂（单克隆抗体）和抗A1（Lectin）对收集的临床样本进行鉴定，对血型抗原判定结果进行记录和对比。具体步骤如下：
1. 将已知血型红细胞样本用生理盐水制成2%红细胞悬液；
2．每个待测样本分别取3支试管做好标记，分别加入0.2mL抗人A1型血型抗原的单克隆抗体试剂、抗A血型定型试剂（单克隆抗体）和抗A1（Lectin），再分别加入待测样本2%红细胞悬液，混匀；
3．立即1000rpm离心1min，判读并记录反应结果；实验结果如表2所示：
表2. 已知血型样本检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结论：A6F12单抗试剂对人A1、A1B型红细胞均凝集，对人A2、A2B型红细胞弱凝集或不凝集，对人B、O型红细胞不凝集，可由此可鉴定人A1、A1B型红细胞，血型鉴定结果与商品化抗A1（Lectin）检测结果相符。

Claims (6)

1.一种分泌抗人A1型血型的杂交瘤细胞株，其特征在于：
所述的细胞株命名为：杂交瘤细胞株A6F12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2021年10月18日，保藏号为CCTCC NO：C2021237。
2.如权利要求1所述的一种分泌抗人A1型血型的杂交瘤细胞株在制备人ABO血型检测试剂中的用途。
3.一种抗人A1型血型抗原的单克隆抗体，其特征在于：
所述抗人A1型血型抗原的单克隆抗体由权利要求1所述的分泌抗人A1型血型的杂交瘤细胞株A6F12分泌产生。
4.根据权利要求3所述的一种抗人A1型血型抗原的单克隆抗体，其特征在于，
所述的一种抗人A1型血型抗原的单克隆抗体类型为IgM型；所述抗人A1型血型抗原的单克隆抗体与人A1型红细胞、A1B型红细胞发生细胞凝集反应，与人A2型红细胞、A2B型红细胞弱凝集或不凝集，与人B型红细胞、O型红细胞不发生细胞凝集反应。
5.一种血型检测试剂，其特征在于，包括如权利要求3所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体。
6.一种血型检测装置，其特征在于，包括如权利要求3所述的抗人A1型血型抗原的单克隆抗体。
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