CN117402833B - 分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株、红细胞a抗体及应用 - Google Patents

分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株、红细胞a抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于血型抗体技术领域，具体涉及一种分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株、红细胞A抗体及应用。本发明所述杂交瘤细胞株C1为通过血型抗原三糖类似物蛋白偶联物免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合得到，其菌种保藏编号为CGMCC No.45726。

Description

分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株、红细胞A抗体及应用
技术领域
本发明属于血型抗体技术领域，具体涉及一种分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株、红细胞A抗体及应用。
背景技术
红细胞血型是根据血液中红细胞膜表面抗原来划分的，根据抗原种类的不同，可以划分出20多个常见的分类系统，其中包括ABO血型系统和RhD血型系统。正确的血型鉴定对输血至关重要，输入不相容的血型会导致溶血的发生，进而导致严重的医疗事故。因此，快速、准确、操作简便的血型鉴定方法可为抢救危急病人、应对突发事件提供保障。
血型鉴定主要分为凝集法和基因法两大类。凝集法的原理为检测血液中红细胞（RBC）表面抗原，只要RBC表面存在相应抗原，即可与相应抗体发生凝集反应，包括纸片法、试管法、微柱法等。其优点是检测速度快，将预先准备好的商业化单克隆抗体放置/包被到检测装置中，检测时加入含红细胞的全血或红细胞悬浮液与对应的单克隆抗体结合。目前使用的大部分商业化单克隆抗体都依赖于进口，不仅价格较高，还极大了限制了血型研究在我国的发展。已有学者提出可以利用杂交瘤技术、基因工程、EB病毒转化等技术手段来制备所需的单克隆抗体。文献资料《特异性抗AB-血型抗原的单克隆抗体制备及初步鉴定》（2021年）公开了以人AB型红细胞为免疫原，通过杂交瘤技术获得了1株分泌抗-AB血型的单克隆抗体杂交细胞瘤。但该技术方法是以人AB型红细胞作为免疫源，但人细胞上存在的细胞膜抗原种类繁多、性质复杂，不同的细胞作为免疫原会激发不同的抗体，因此该技术方案得到的抗体不能保证稳定量产，推广到工业化制备应用上具有困难。因此，有必要开发新的用于血型检测的单克隆抗体，以补充现有应用的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株、红细胞A抗体及应用，具体技术方案如下。
分泌特异性红细胞抗体A的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为C1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.45726。具体菌种保藏信息如下所示。
杂交瘤细胞株C1于2023年9月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），杂交瘤细胞株C1的保藏编号为CGMCC No.45726，实验菌株号为(A-8)-2A6-D1-B6-C3，其可稳定分泌红细胞抗体A。
进一步，所述杂交瘤细胞株C1为通过血型抗原三糖类似物蛋白偶联物免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合得到。
红细胞抗体A，所述红细胞抗体A为抗血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物的单克隆抗体，其由保藏编号CGMCC No.45726的杂交瘤细胞株分泌产生。
进一步，所述血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物为血型抗原三糖A类似物与血蓝蛋白的偶联物，所述血型抗原三糖A类似物为A2型。
进一步，所述血型抗原三糖A类似物与血蓝蛋白的偶联比值为A2：KLH=40:1。
红细胞抗体A的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物和等体积的弗式完全佐剂/弗式不完全佐剂混合，然后注入小鼠体内。
步骤2：在首次免疫后第7天采集小鼠尾静脉血，利用基于柱凝集法的抗体亲和力检测实验和中和实验来评价小鼠血清的效价，基于血清效价的评价结果调整免疫抗原的剂量。
步骤3：在小鼠血清效价末次评价后第21天，对选定需要进行融合的小鼠进行腹腔冲击免疫，冲击免疫剂量为末次免疫剂量的一半。
步骤4：收集经过步骤3冲击免疫后的小鼠脾细胞，将所述小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合制备出杂交瘤细胞，筛选出融合成功并稳定分泌目标单克隆抗体的杂交瘤细胞。
步骤5：将步骤4筛选出的杂交瘤细胞进一步注射到小鼠腹腔以腹水瘤的形式增殖，得到含有所述红细胞抗体A的腹水。
进一步，所述步骤4中小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为1:2~1:10。
进一步，收集步骤5中的小鼠腹水，采用Protein A – Sephaorse 4B亲和层析法进行抗体纯化。
上述红细胞抗体A在制备红细胞抗原检测试剂盒中的应用。
进一步，所述红细胞抗原检测试剂盒包括柱凝集试剂盒，所述柱凝集试剂盒中包含ABO血型正定型检测卡或ABO血型反定型检测卡。
有益技术效果
1）本发明通过制备杂交瘤的方式，得到一株新型红细胞抗体A。该新型红细胞抗体A与其同类抗体相比，在小鼠血清中产生的浓度较高，但亲和力和特异性最强。
2）本发明方法制备得到的红细胞抗体A可直接用于检测人红细胞，准确度高。相较于其他商业单克隆抗体，在稀释数倍以后，依然可以检测到人红细胞，灵敏度高。
3）本发明抗体可以进行冻存保存，相较于其他商业化单克隆抗体需要在2-8℃的条件下进行保存和冷链运输，大大降低了成本。
4）本发明制备的杂交瘤细胞是通过用血型抗原三糖A蛋白偶联物（人工合成抗原）作为免疫源免疫小鼠得到，该人工合成抗原制备工艺先进可控，因此可以保证制备得到的杂交瘤细胞稳定且实现量产，能够推广到工业化生产和应用当中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明制备的人工抗原蛋白浓度标准曲线；
图2为免疫原为A2:BSA=40:1的免疫小鼠第5次免疫后血清效价检测（NC代表未免疫小鼠组）；
图3为免疫原为A2:KLH =40:1的免疫小鼠第5次免疫后血清效价检测（NC代表未免疫小鼠组）；
图4为A2:KLH =40:1的免疫原与稀释后血清反应15分钟后进行中和效价检测结果：
图5为各细胞株产生的抗体稀释数倍后效价检测结果；
图6为10 μg A2:KLH=40:1免疫原与杂交瘤细胞株抗体柱凝集试验结果；
图7为1 μg A2:KLH=40:1免疫原与杂交瘤细胞株抗体柱凝集试验结果
图8为100ng A2:KLH=40:1免疫原与杂交瘤细胞株抗体柱凝集试验结果；
图9为10ng A2:KLH=40:1免疫原与杂交瘤细胞株抗体柱凝集试验结果；
图10为1ng A2:KLH=40:1免疫原与杂交瘤细胞株抗体柱凝集试验结果。
本发明所述的杂交瘤细胞株C1于2023年9月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），杂交瘤细胞株C1的保藏编号为CGMCC No.45726，实验菌株号为(A-8)-2A6-D1-B6-C3，其可稳定分泌红细胞抗体A；分类命名为抗A单克隆杂交瘤细胞。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5%，更典型的是所述值的+/-4%，更典型的是所述值的+/-3 %，更典型的是所述值的+/-2 %，甚至更典型的是所述值的+/-1 %，甚至更典型的是所述值的+/-0.5%。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述的“血型抗原三糖A类似物”指的是基础化学式如化学式A1–A4所示的四种化合物及其衍生物，分别为I型A抗原化合物（化学式A1，以下简称“A1”或“A1型”）、II型A抗原化合物（化学式A2，以下简称“A2”或“A2型”）、III型A抗原化合物（化学式A3, 以下简称“A3”或“A3型”）和IV型A4抗原化合物（化学式A4, 以下简称“A4”或“A4型”）。
（化学式A1）。
（化学式A2）。
（化学式A3）。
（化学式A4）。
本发明所述的“血型抗原三糖类似物蛋白偶联物”是指上述血型抗原三糖A类似物与BSA或KLH蛋白偶联形成的蛋白偶联物（以下简称“A-BSA”、“A-KLH”）。
实施例1
人工抗原的制备
1.取3mL A型抗凝混合全血，制备成红细胞膜碎片。
2.BCA法测定红细胞膜碎片蛋白浓度：A抗原浓度为4.5 mg/mL。
3.红细胞膜碎片超声处理：红细胞膜碎片用PBS定容至蛋白浓度为1.5mg/mL，取20mL于小烧杯中，处理时间为30min，在功率为200 w，冰浴条件下分别进行间歇式（超声3 s，间歇3 s）超声处理，冻干。
4.粗抗原制备：将冻干细胞膜碎片加入弱酸洗涤液（含枸橼酸；磷酸氢二钠；加入双蒸水；pH值3.3；0.22 μm滤膜过滤）；充分混匀；洗涤1 min后；9000 r/min 离心8 min收集上清。0.22 μm滤膜过滤后，-20℃冻存。然后将将上清置入低温冷冻干燥机中冻干，以1.5ml去离子水充分溶解样品。置于超滤离心管(截留相对分子质量3000 Da)中12000 r/min离心10 min，收集超滤液。
5.抗原寡糖链的酶解：红细胞A/B抗原均是由乙酰半乳糖胺通过O-糖苷键与肽链进行连接的，因此，选用α-内切乙酰氨基半乳糖苷酶酶解寡糖链与肽链之间的连接。
6.硅胶层析柱分离纯化寡糖：1）柱层析条件：玻璃层析柱:25×1000 mm(硅胶填充高度为900 mm )；填料:柱层析硅胶(200-300目)；装柱方法：干柱法；流动相：正丁醇/冰醋酸/水(2/1/1,v/v/v )；洗脱方式:等度洗脱；洗脱速度:0.5 mL/min；样品及上样方法:3 g寡糖粗品溶于1 mL蒸馏水中，再加入3 g硅胶，混匀，置于通风橱中风干，上样。
2）将处理好的样品加入到装好的层析柱中，用流动相以0.5 mL/min的流速进行洗脱，每管8 mL左右，直至洗脱液中无糖检出为止。共收集240管，并依序编号。
3）采用薄层层析法检测收集得到的240管溶液中所含糖的成份(每隔一管上样)。合并同一成份的收集液，48℃下旋转真空浓缩至干，再加入少量蒸馏水重新溶解，并旋转真空浓缩至3-4 mL，用薄层层析法进行定性测定。最后将浓缩得到的样品于真空冷冻干燥机中冻干成粉。
7.抗原寡糖与大分子蛋白的偶联—碳二亚胺（EDC）法：称取纯化抗原寡糖和EDC(0.022 mmol)溶解于NaHCO3缓冲液中，室温搅拌30 min；称取适量KLH或BSA溶解于NaHCO3缓冲液(pH=8.1)中。在搅拌的条件下，吸取EDC反应液逐滴滴入含蛋白的缓冲液中，4℃冰箱搅拌过夜。次日将反应所得偶联物溶液装入透析袋中，于4℃冰箱中用PBS透析(每四个小时更换透析液)，3天后取出分装，加入0.01%(w/v)叠氮钠，4℃储存。最后将得到的样品于真空冷冻干燥机中冻干成粉进行长期保存，得到抗血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物。
8.抗血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物（简称人工抗原）蛋白浓度测定：配置不同浓度蛋白的标准液，以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，画出其标准曲线，如图1所示，结果显示蛋白浓度与吸光度呈线性关系，拟合系数R2为0.9998。以同样的方法测定待测样品在595 nm处的吸光度，然后根据标准曲线，得到合成的人工抗原A标记浓度为0.90 mg/mL。
实施例2
小鼠免疫：
杂交瘤技术所用小鼠骨髓瘤细胞来源于Balb/c小鼠，挑选（6-8周龄）雌性SPF级小鼠，每种免疫组分免疫5-10只。首次免疫取等体积抗原（血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物）和弗氏完全佐剂（Freiuid complete adjuvant，FCA）乳化物，后续免疫用弗氏不完全佐剂（Freund incomplete adjuvant，FIA)（表1，表2）。
表1 小鼠免疫程序
表2免疫分组
免疫原准备方式如下：
1）用生理盐水将血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物（后称免疫原）稀释至2mg/mL，用等体积弗氏完全佐剂/不完全佐剂和免疫原混合，使佐剂与免疫原充分混匀。
2）用针头滴1滴液滴在水面上，如果呈液滴状且不会马上扩散，表明乳化完全。将乳化后的免疫原慢慢注入1mL注射器中，排净空气，准备对小鼠进行免疫。
3）以100μg的免疫剂量对小鼠进行免疫，注射体积为100μL/只。在首次免疫后第7天采集小鼠尾静脉血，釆血后用2mL离心管收集，放4℃备用。根据抗体亲和力检测实验（柱凝集法）和中和实验（柱凝集法）评价小鼠三免和四免后血清的效价和抑制（对于目标物红细胞），基于此结果调整免疫原的剂量。
4）在小鼠最后一次免疫后抗血清评价后第21天，对选定将要融合的小鼠在融合前3天进行腹腔冲免，冲击免疫剂量为末次免疫剂量的一半，用吸取免疫原的注射器，慢慢打入小鼠左侧腹腔内。
实施例3
抗体亲和力检测实验（柱凝集法）和中和实验（柱凝集法）检测小鼠血清：
柱凝集检验原理是利用玻璃微球分离技术、离心技术和血清红细胞抗原抗体凝集反应原理相结合而设计。当被测样本中相应红细胞血型抗体与已知红细胞血型抗原发生凝集反应后凝集的红细胞在离心力的作用下，不能通过玻璃微珠之间的间隙而留在微柱中分离介质的上层或分散的分离介质中，呈现为阳性反应；反之，未凝集的红细胞在离心力的作用下，能通过玻璃微珠之间的间隙而留在微柱的底层，呈现为阴性反应。具体操作步骤如下。
1）实验操作环境的温度为18-25℃，相对湿度20%-80%。取出柱凝集试剂卡，平衡室温，在有空白的一面作标记。
2）将小鼠血浆按照实验设计稀释至对应倍数。
3）小心撕去试剂卡上的封口铝箔，避免试剂喷溅造成微柱之间的交叉污染。
4）将已知红细胞指示剂（3%浓度）分别取10μL，依次加入试剂卡两个柱中，再将40μL待测血清分别加入到上述两个柱中。
5）轻弹微柱，使微柱上方的反应物混匀。
6）立即用专用卡式离心机离心5分钟（自动两相离心，第一相约为55g×2分钟，第二相为200g×3分钟）。
7）判读结果并记录。
柱凝集中和实验原理是采用人ABO血型反定型检测卡（柱凝集法）进行中和实验，即先用人工抗原对一定量的抗体进行中和，然后再加入指示剂细胞查验是否还存在尚未被人工抗原中和的抗体。如果人工抗原的特异性强、与抗体结合的效率高，抗体就能被人工抗原充分中和，则加入（与抗体对应的）指示剂细胞时就没有能和指示剂细胞表面抗原反应的抗体，从而实验结果显示为阴性（无凝集现象）；相反地，如果人工抗原的特异性弱、与抗体结合的效率低，抗体未能被人工抗原充分中和，那么当加入（与抗体对应的）指示剂细胞时，依然存在能和指示剂细胞表面抗原反应的抗体，从而实验结果显示为阳性（有凝集现象）。具体操作步骤如下。
1）实验操作环境的温度为18-25℃，相对湿度20%-80%。取出试剂卡，平衡室温，在有空白的一面作标记。
2）将小鼠血浆按照实验设计稀释至对应倍数。
3）将稀释后的小鼠血清与10μg相应的免疫抗原进行混合，室温孵育15min。
4）小心撕去试剂卡上的封口铝箔，避免试剂喷溅造成微柱之间的交叉污染。
5）将已知红细胞指示剂（3%浓度）分别取10μL,依次加入到试剂卡两个柱中，再将40μL步骤3的孵育后的试剂，分别加入到上述两个柱中。
6）轻弹微柱，使微柱上方的反应物混匀。
7）立即用专用卡式离心机离心5分钟（自动两相离心，第一相约为55g×2分钟，第二相为200g×3分钟）。
8）判读结果并记录。
通过上述实验设计可以有效验证人工合成的抗原（即血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物）与抗体的反应性能，即人工合成的抗原在识别其对应的抗体时是否具有良好的特异性。
实施例4
细胞融合：
取出骨髓瘤细胞冻存管，浸入37℃水浴锅中使其融化。取出冻存管，在超净工作台内开盖，取出细胞悬液加入离心管中，加入10 mL培养基（RoswellParkMemotialInstitute，RPMI 1640）混匀。在室温下离心，1100 r/min离心5min。离心后弃上淸，加入均悬液（10%RPMI 1640培养液）调整细胞密度，于37°C 5% CO2培养箱培养。依据细胞生长情况，更换一次培养液，等到细胞长至一定的密度后进行扩大培养，一次融合需要备好8瓶储备细胞。确保骨髓瘤细胞在融合前一天已长至对数生长期，形态表现为圆润且透亮，并进行一次10% RPMI1640培养液的更换。收集培养的骨髓瘤细胞，将培养液中上清液弃掉，用移液枪吸取10 mL不完全培养基RPMI 1640吹打细胞，重复操作将培养瓶中洗下的细胞悬液性于无菌离心管中，将离心机设置为1100r/min，然后于室温下离心5min。使用RPMI1640不完全培养基重悬骨髓瘤细胞。
1）冲击免疫：小鼠抗血清最后一次（五免或者六免）评价后第21天时，对选定需要融合的小鼠在细胞融合前三天对其进行腹腔冲免。用生理盐水稀释免疫原，剂量为末次加强免疫剂量的1/2。用注射器吸取准备好的免疫原，于腹腔位置缓慢注入小鼠体内。
2）脾细胞收集：细胞融合当天，收集骨髓瘤细胞，然后在超净工作台取出小鼠脾脏，将脾脏放在筛网（200目）上，缓缓研磨并用培养基冲洗，收集细胞悬浮液，离心机设置参数为1200 r/min离心10 min，离心弃上清，轻吹离心管底部分散细胞，加入培养基使脾细胞重悬，转移到离心管中，舍弃结缔组织，离心三次后加入10 mL RPMI 1640 培养基，取出100mL RPMI1640培养基稀释并计数，剰下的细胞悬液备用。
3）细胞融合：通过聚乙二醇（PEG）诱导细胞，通过膜融合可以使两个细胞融合到一起。具体操作步骤如下：以最低1：2、最高1：10的比例于离心管中混合骨髓瘤细胞和小鼠的脾细胞，将离心机参数设置为1200 r/min离心8min该混合液，待离心结束后弃去上清液，使骨髓瘤细胞均匀分布在离心管底部。准备融合，于混合细胞中滴加准备好的PEG，轻摇离心管以便PEG更好的发挥作用，静置离心管1min，在两分钟内缓慢滴加2mL的RPMI1640，速度控制在1mL/min，需注意边加边摇动离心管，接着再缓缓滴加4mL的RPMI 1640，速度控制在2mL/mm，注意边加边摇晃离心管，将滴加速度提至6 mL/min，使最后加入的RPMI 1640终体积为20 mL。使用封口膜将离心管封好，然后放于培养箱等候5 min，8000 r/min离心8 min后弃上淸，加入HAT选择培养基，使细胞分散开来可以用手指轻轻弾击离心管底部，混合后转移至细胞板中每孔200 μL，二氧化碳培养箱中进行培养。
4）HAT半换液：选择性培养基HAT中，融合成功的杂交瘤细胞利用了骨髓瘤细胞无限増殖的优势，并在B淋巴细胞中获取次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核苷酸转移酶，利用旁路途径合成DNA，在HAT培养基中可以存活和増殖。具体操作步骤为，细胞融合四天后，将细胞板置于灭菌的超净台中，使用排枪缓缓取出原细胞上清液100uL/孔弃掉，于细胞培养板中加入HAT选择培养基100μL/孔，培养箱中培养。
5）HT全换液：HAT可以筛选出成功融合的杂交瘤细胞，未融合成功的骨髓瘤细胞去除后，不再需要氨基嘌呤，因此使用HT培养基进行培养。具体操作步骤为，融合后一周左右，于培养箱中取出细胞板，然后置于准备好的超净台中，使用排枪缓缓取出原细胞上清液200μL/孔并弃掉，在细胞培养板中加入HT培养基200μL/孔，培养箱中培养。
6）细胞筛选：HAT培养基中的杂交瘤细胞，无关细胞融合体占有一定数量，采用有限稀释法进行克隆化培养杂交瘤细胞，用柱凝集亲和实验和柱凝集中和实验进行评价，筛选能产生目标单克隆抗体的杂交瘤细胞，进行扩増。具体操作步骤为，在融合后第七天，当克隆后的杂交瘤细胞面积约占孔底面积的1/10~1/5时，进行细胞上清液的检测，依据小鼠抗血清的阳性效价和抑制数据，选择细胞筛选时的中和实验的抗原添加浓度。可以将阳性和抑制一起进行测定，一般情况下先进行细胞阳性的检测，将细胞板拿出放置于准备好的超净工作台中，取出原细胞上清毎孔100μl，采用柱凝集法进行抗体亲和实验和抗体中和实验。
抗体亲和实验方法如下：
1）实验操作环境的温度为18-25℃，相对湿度20%-80%。取出试剂卡，平衡室温，在有空白的一面作标记。
2）将阳性克隆上清100μl,进行倍比稀释，稀释倍数为 10倍，100倍，1000倍，10000倍，100000倍。
3）小心撕去试剂卡上的封口铝箔，避免试剂喷溅造成微柱之间的交叉污染。
4）将已知红细胞指示剂（3%浓度）分别取10μl,依次加入到两个柱中，再将40μl待测血清分别加入到上述两个柱中。
5）轻弹微柱，使微柱上方的反应物混匀。
6）立即用专用卡式离心机离心5分钟（自动两相离心，第一相约为55g×2分钟，第二相为200g×3分钟）。
7）判读结果并记录。
抗体中和试验操作步骤如下：
1）实验操作环境的温度为18-25℃，相对湿度20%-80%。取出试剂卡，平衡室温，在有空白的一面作标记。
2）将阳性克隆上清100μl,进行倍比稀释，稀释倍数为 10倍，100倍，1000倍，10000倍，100000倍。
3）将步骤2稀释后的各个上清与10μg相应的免疫抗原进行混合，室温孵育15min。
4）小心撕去试剂卡上的封口铝箔，避免试剂喷溅造成微柱之间的交叉污染。
5）将已知红细胞指示剂（3%浓度）分别取10uL,依次加入到两个柱中，再将40μl步骤3的孵育后的试剂，分别加入到上述两个柱中。
6）轻弹微柱，使微柱上方的反应物混匀。
7）立即用专用卡式离心机离心5分钟（自动两相离心，第一相约为55g×2分钟，第二相为200g×3分钟）。
8）判读结果并记录。
细胞亚克隆与扩大培养：一般釆用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，首次亚克隆后杂细胞较多，以每孔三个细胞的数量铺板防止阳性孔丢失，后面亚克隆则按照毎孔一个细胞铺板。细胞亚克后进行评价，选择阳性好抑制高的单团细胞亚克。末次亚克隆结束后，用10% RPMI 1640培养基扩大培养单团细胞。
细胞冻存：细胞冻存前一天更换培养液确保冻存细胞当天处于对数生长期。用RPMI 1640培养液吹洗平皿中的细胞将其吹下，将细胞收集到50mL的离心管中，1200 r/min离心8 min，离心后弃上清后加入细胞冻存液混勾，转移至冻存管1.5mL/管，细胞密度5×106~5×1010个/mL。将细胞名称、冻存时间标记后放入冻存盒，-20°C放两小时后，随后-80℃超低温环境过夜，转移到液氮罐中保存。
实施例5
1.单抗腹水制备：
1）筛选出通过扩大培养能稳定分泌单抗的细胞株，注射到BALB/c小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内以腹水瘤的形式增殖，得到大量含单克隆抗体的腹水。选择雌性8周龄的活跃BALB/c小鼠，注射无菌石蜡油，剂量0.5mL/只，降低小鼠对杂交瘤细胞的免疫排斥反应，刺激小鼠产生抗体，有利于制备腹水。在12孔细胞培养板中加2mL细胞培养液，将冻存细胞管在水浴锅中融化，融化后的细胞吸入细胞培养液5mL，装入EP管进行离心。离心后奔细胞上清，使沉淀细胞于3 mL培养液中混匀，以1 mL/孔的标准吸出细胞液勾入培养孔中，显微镜下观察复苏后的细胞长势和形态，放入培养箱培养。
2）待细胞长至对数期，收集杂交瘤细胞，培养基洗3次后按0.5mL/管注入小鼠腹腔。注射7天后注意观察小鼠腹腔隆起情况和生命体征，避免出现小鼠死亡。
3）当发现小鼠的腹腔出现肿胀情况后，用75%酒精轻擦小鼠腹部，用注射器从小鼠腹腔抽取腹水打入离心管中，8000r/min离心10min后将上清装入无菌管中，即为所需要的腹水，最后将收集到的腹水于-20℃冰箱中保存备用。
2.抗体纯化：
采用Protein A - Sephaorse 4B亲和层析法。纯化腹水使用Protein A -Sepharose 4B做为其亲合层析介质，该方法可以一次性获得接近分析纯的纯化抗体。具体操作如下。
1）平衡柱子使用磷酸缓冲液，流速设定为1 mL/min。
2）腹水使用用磷酸缓冲液进行1：1稀释后进行上柱，流速设置为0.5 mL/min。所需抗体吸附于Protein A - Sephaorse 4B柱子中，其余蛋白均随缓冲液流出。
3）冲洗柱子使用磷酸缓冲液，在λ=280 nm进行检测，待基线平衡后使用pH 2.7的甘氨酸缓冲液对抗体进行洗脱，流速设置为0.5 mL/min。
4）收集A280>0.2时的洗脱液，迅速用缓冲液(pH 9.0，1 mol/L的 Tris溶液)中和抗体，PBS浓缩超滤。
5）处理纯化柱：收集抗体后，迅速使用醋酸酸化柱子，平衡柱子使用磷酸盐缓冲液，浓度为20%的乙醇进行饱和柱子。
6）所得抗体在4℃冰箱中中透析3天，透析液使用PBS缓冲溶液，最后加入0.1% (w/v)的叠氮钠，于4℃备用储存，或以1：1比例加入甘油，在-20℃下冻存。
3.单克隆抗体浓度及纯度鉴定：
测定抗体浓度的方法(A280光吸收法)：抗体使用PBS缓冲溶液进行20倍稀释，以PBS为空白对照，在λ= 280 nm处测量其吸光度，抗体浓度可由以下公式算得。
。
A0 —280 nm下空白对照的吸光值。
A1 —280 nm下抗体蛋白的吸光值。
1.35—蛋白系数。
实施例6
结果验证
1.抗体亲和力检测：用柱凝集法检测小鼠血清抗体，见图2、图3，其中横坐标代表细胞株编号，纵坐标代表血清稀释倍数。结果显示，人工抗原A2:BSA=40:1和A2:KLH=40:1均能激发小鼠血清产生抗体。但免疫原为A2:KLH=40:1的人工抗原显然能够激发更多的小鼠血清抗体产生，当血清稀释倍数达到4096倍后依然能够检测到抗体。
2.中和实验检测小鼠血清，见图4，其中横坐标代表细胞株编号，纵坐标代表血清稀释倍数。本实验用A2:KLH=40:1的人工抗原与稀释后的小鼠血清反应15分钟后再进行柱凝集试验。小鼠血清中的抗体理论上能够和人工抗原A2:KLH=40:1特异性结合，因此当抗体-抗原反应15分钟以后，再加入与抗体对应的指示剂细胞，产生的柱凝集反应越少，说明抗体与抗原的特异性结合越好。结果显示，编号为A-8的细胞株产生的抗体与抗原的特异性结合能力越好。
3.杂交瘤细胞株的筛选：将表2中编号为A-8小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，铺满8块培养板，融合后的杂交瘤细胞放培养箱进行培养，七天后在显微镜下观察，可清晰看到细胞培养板中致密的细胞团,对培养板中的细胞上清液进行抗体亲和力评价，其中细胞上清液稀释10000倍以上的阳性孔共有84个，细胞上清液稀释1000000倍以上的阳性孔有30个，中和实验抗体特异性较好的孔有6个，分别为(2A6、3E8、1D3、8G2、6H3、4F7)显示岀强阳性以及较高的抑制。因此选择这6个孔中的细胞进行首次亚克隆，将其铺满细胞培养板4块板384个孔。1D3经克隆后阳性丢失，6H3经中和实验检测抗体的特异性较差，因此结合亲和力和抑制性实验结果进一步选择4个孔(2A6-D1、3E8-C6、8G2-B5、4F7-F3)进行二次亚克隆。培养7天后进行细胞上清检测，其中细胞上清液稀释10000倍以上的阳性孔共有38个，细胞上清液稀释1000000倍以上的阳性孔有16个，因此结合中和抑制实验结果进一步选择4个孔(2A6-D1-B6、3E8-C6-A5、8G2-B5-C7、4F7-F3-H2)进行第三次亚克隆，待其培养至第七天后，以同样的操作进行细胞上清评价，其中细胞上清液稀释10000倍以上的阳性孔共有158个，细胞上清液稀释1000000倍以上的阳性孔有96个。对其中阳性值较高的40个孔进行二次中和抑制率评价，选择抗原浓度为 100ng/mL，抑制率在99%以上的有26个孔，选择其中抑制率最突出的且细胞形态为单团的4株，具体信息如下，对其进行扩大培养，并开展制备腹水和细胞冻存工作。
将筛选出的4株细胞株产生的抗体上清稀释数倍以后进行检测，见图5，其中横坐标代表细胞株，纵坐标代表稀释倍数。结果显示2A6-D1-B6-C3（C1）产生的抗体量最高。
4.用不同浓度的A2:KLH=40:1作为免疫原（变量）与杂交瘤细胞株产生的抗体（定量）反应15分钟后进行柱凝集检测，然后再加入与抗体对应的指示剂细胞检测抗体与抗原结合能力的强弱。如果没有柱凝集结果，说明抗体的特异性结合能力强。见图6-图10，其中横坐标代表杂交瘤细胞株，纵坐标代表杂交瘤细胞培养上清稀释倍数。结果显示当免疫原浓度降到1ng时， 2A6-D1-B6-C3（C1）与免疫原特异性结合效力最好。
5.柱凝集法验证抗体A的性能：
株系C1：2A6-D1-B6-C3抗体验证60例人血样本（17例A、20例B、10例AB、13例O），20例B、13例O结果均为阴性，2例A、2例AB在抗体稀释1:1024000000-1:4096000000时有阴性结果出现。
株系C2：3E8-C6-A5-F7抗体验证60例人血样本（17例A、20例B、10例AB、13例O），20例B、13例O结果均为阴性，1例A、2例AB在抗体稀释1:1024000000-1:4096000000时有阴性结果出现，个别样本随抗体稀释倍数的增大，显色有变弱趋势。
株系C3：8G2-B5-C7-H2抗体验证60例人血样本（17例A、20例B、10例AB、13例O），20例B、13例O结果均为阴性，17例A、10例AB结果均为阳性，但个别样本随抗体稀释倍数的增大，显色有变弱趋势。
株系C4：4F7-F3-H2-B5抗体验证60例人血样本（17例A、20例B、10例AB、13例O），20例B、13例O结果均为阴性，1例A、1例AB在抗体稀释1:4096000000时有阴性结果出现。
表3 2A6-D1-B6-C3验证60例样本结果
样本编号 血型 1:512000000 1:1024000000 1:2048000000 1:4096000000
1 A 4+ 4+ 4+ 4+
2 B - - - -
3 AB 2+ 1+ 0.5+ -
4 B - - - -
5 B - - - -
6 B - - - -
7 B - - - -
8 A 4+ 4+ 4+ 4+
9 A 4+ 4+ 4+ 4+
10 O - - - -
11 A 4+ 4+ 4+ 4+
12 B - - - -
13 AB 4+ 4+ 4+ 4+
14 B - - - -
15 B - - - -
16 O - - - -
17 O - - - -
18 A 4+ 4+ 4+ 4+
19 A 4+ 4+ 4+ 4+
20 O - - - -
21 A 4+ 4+ 4+ 4+
22 B - - - -
23 AB 4+ 4+ 4+ 4+
24 A 1+ 0.5+ - -
25 B - - - -
26 B - - - -
27 B - - - -
28 A 4+ 4+ 4+ 4+
29 AB 4+ 4+ 4+ 4+
30 O - - - -
31 A 4+ 4+ 4+ 4+
32 O - - - -
33 AB 4+ 4+ 4+ 4+
34 B - - - -
35 B - - - -
36 A 4+ 4+ 4+ 4+
37 O - - - -
38 AB 4+ 4+ 4+ 4+
39 A 4+ 4+ 4+ 4+
40 O - - - -
41 O - - - -
42 B - - - -
43 AB 4+ 4+ 4+ 4+
44 A 4+ 4+ 4+ 4+
45 B - - - -
46 B - - - -
47 B - - - -
48 A 4+ 4+ 4+ 4+
49 AB 4+ 4+ 4+ 4+
50 O - - - -
51 B - - - -
52 O - - - -
53 AB 0.5+ - - -
54 A 4+ 4+ 4+ 4+
55 B - - - -
56 A 4+ 4+ 4+ 4+
57 O - - - -
58 AB 4+ 4+ 4+ 4+
59 A 2+ 1+ 0.5+ -
60 O - - - -
表4 2A6-D1-B6-C3与商业抗体验证60例样本结果
对比抗体信息：Millipore公司购买的A抗体（批号JHH2005），鼠源 IgM，蛋白含量6mg/ml。该抗体在稀释1000000倍以后就检测不到人血样本中的红细胞了，因此结果为阴性。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (4)

1.分泌特异性红细胞抗体A的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为C1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.45726；所述杂交瘤细胞株C1为通过血型抗原三糖类似物蛋白偶联物免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合得到，所述血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物为血型抗原三糖A类似物与血蓝蛋白的偶联物，偶联比值为A2：KLH=40：1，所述血型抗原三糖A类似物为A2型，化学式如下：
。
2.红细胞抗体A，其特征在于，所述红细胞抗体A为抗血型抗原三糖A类似物蛋白偶联物的单克隆抗体，所述红细胞抗体A由保藏编号CGMCC No.45726的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.权利要求2所述的红细胞抗体A在制备红细胞抗原检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述红细胞抗原检测试剂盒包括柱凝集试剂盒，所述柱凝集试剂盒中包含ABO血型正定型检测卡或ABO血型反定型检测卡。
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