CN117030997B - 一种小分子化合物的均相免疫分析方法 - Google Patents

一种小分子化合物的均相免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种小分子化合物的均相免疫分析方法，包括以下步骤：将含有或疑似含有目标小分子化合物的样本与包含第一抗体的第一试剂接触，形成小分子抗原‑抗体复合物；将小分子抗原‑抗体复合物与包含第二抗体和第三抗体的第二试剂接触；检测目标小分子化合物与第一抗体、第二抗体、第三抗体的结合情况，评估目标小分子化合物的数量；其中，第一抗体为抗目标小分子化合物的抗体，第二抗体为特异性识别所述小分子抗原‑抗体复合物的抗体，第三抗体为特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体，且第二抗体与第三抗体包被于不溶性载体粒子。本发明解决了现有的非竞争性免疫测定方法操作复杂，导致检测时间长的技术问题，实现了操作简便的技术效果。

Description

一种小分子化合物的均相免疫分析方法
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种小分子化合物的均相免疫分析方法。
背景技术
相对分子质量小于1500道尔顿的小分子化合物(Small Molecular Compounds，简称SMC)，如抗生素、合成药物、小分子腺激素、小分子肽、维生素、多糖等，由于分子体积和空间位阻的原因，通常只有一个抗原表位(抗体结合位点)，免疫测定一般采用竞争性分析模式。
在竞争性分析方法中，待测物与标记小分子化合物竞争结合少量的固相抗体，反应平衡后，分离结合和游离的小分子化合物，最终分析反应信号强度与样品中待测物的含量成反比。竞争性免疫分析的灵敏度受抗体亲和常数的限制较大。小分子化合物的单克隆抗体的亲和常数在一般情况下很难超过1012mol/L，这就决定了竞争性分析方法难以分析极微量的小分子化合物。另外，在低浓度的反应信号很难与背景信号区别开来，存在待测物低浓度的相对误差较大，分析过程的重现性差等缺陷。上述因素致使竞争性免疫分析在灵敏度、精密度、动力学及线性范围方面都不及非竞争免疫分析。
为了解决上述竞争性免疫分析方法存在的问题，中外科研人员进行了大量研究，提出了一些非竞争法检测小分子化合物的方法。例如公开号为CN114746754A的发明专利公开了一种非竞争性免疫测定方法，其使用了固定化于水不溶性载体的抗半抗原兔单克隆抗体、进行了标记的抗免疫复合物抗体。测定方法包括：(1)使固定化于水不溶性载体的抗半抗原兔单克隆抗体与测定对象溶液中的半抗原反应的工序；(2)使进行了标记的抗免疫复合物抗体与半抗原抗半抗原兔单克隆抗体的免疫复合物反应的工序；(3)检测来自标记的信号的工序。步骤(1)与(2)及(3)之间分别具有洗涤工序，操作复杂，检测时间长。
存在的问题是：现有的非竞争性免疫测定方法操作复杂，导致检测时间长。
发明内容
本发明解决了现有的非竞争性免疫测定方法操作复杂，导致检测时间长的技术问题，实现了操作简便的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种小分子化合物的均相免疫分析方法，包括以下步骤：将含有或疑似含有目标小分子化合物的样本与包含第一抗体的第一试剂接触，形成小分子抗原-抗体复合物；将小分子抗原-抗体复合物与包含第二抗体和第三抗体的第二试剂接触；检测目标小分子化合物与第一抗体、第二抗体、第三抗体的结合情况，评估目标小分子化合物的数量；其中，第一抗体为抗目标小分子化合物的抗体，第二抗体为特异性识别所述小分子抗原-抗体复合物的抗体，第三抗体为特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体，且第二抗体与第三抗体包被于不溶性载体粒子。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的均相免疫分析方法为非竞争型免疫检测，第一步先使含有或疑似含有目标小分子化合物(抗原)的样本与包含第一抗体的第一试剂接触，在溶液中形成抗原-抗体复合物；第二步，第一步反应液与用特异性识别目标小分子抗原-抗体复合物的抗体、特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体致敏的不溶性载体粒子接触，产生抗体夹心抗原的反应，形成以不溶性载体粒子为载体的抗复合物抗体-抗原抗体复合物-抗抗体的复杂免疫复合物，最终产生了该不溶性载体粒子的聚集；第三步，检测该不溶性载体粒子的聚集程度，从而实现了对抗原的检测，并且分析灵敏度和精密度有较大提高，能消除非特异性反应。另外，上述方法没有洗涤步骤，进而操作更为简便快捷。
在本发明的一个实例中，第一试剂还包括聚合物，蛋白稳定剂，防腐剂，缓冲液。
在本发明的一个实例中，聚合物包括聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸钠，葡聚糖中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：聚合物可以选择上述任一种，能够提高抗体的稳定性。
在本发明的一个实例中，第二试剂还包括蛋白稳定剂，防腐剂，缓冲液。
在本发明的一个实例中，蛋白稳定剂包括蔗糖，海藻糖，白蛋白，酪蛋白，卵清蛋白，丙三醇中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：蛋白稳定剂可以选择上述任一种，能够保持抗体分子结构和活性的稳定。
在本发明的一个实例中，防腐剂包括叠氮化钠、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，Proclin 300中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：防腐剂可以选择上述任一种，能够防止试剂受到微生物的污染，避免变质。
在本发明的一个实例中，缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷、哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三乙醇胺、哌嗪-1，4-二(2-羟基丙磺酸)水合物、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、N-三-(羟甲基)甘氨酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸、2-(环已胺)-1-乙磺酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、硼酸盐、醋酸盐、巴比妥盐换缓冲液中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：缓冲液可以选择上述任一种，能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力。
在本发明的一个实例中，不溶性载体粒子包括聚苯乙烯微球，胶体金微球，磁纳米微球中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：上述微球能够特异性结合抗体，通过将抗体包被于微球，更加便于检测，进而提高试剂的检测灵敏度。
在本发明的一个实例中，评估目标小分子化合物的数量包括：检测反应体系中的浊度或透光率或吸光度或荧光信号或发光信号变化。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：上述检测方法便捷，检测结果直观，能够有效评估目标小分子化合物的数量，且能够直接确定目标小分子化合物的存在。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例1：
本发明提供一种小分子化合物的均相免疫分析方法，包括以下步骤：将含有或疑似含有目标小分子化合物的样本与包含第一抗体的第一试剂接触，形成小分子抗原-抗体复合物；将小分子抗原-抗体复合物与包含第二抗体和第三抗体的第二试剂接触；检测目标小分子化合物与第一抗体、第二抗体、第三抗体的结合情况，评估目标小分子化合物的数量；其中，第一抗体为抗目标小分子化合物的抗体，第二抗体为特异性识别所述小分子抗原-抗体复合物的抗体，第三抗体为特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体，且第二抗体与第三抗体包被于不溶性载体粒子。
具体的，第一抗体可以是来源于鼠以外动物的抗体，例如兔抗体、羊抗体，优选的，第一抗体为兔单克隆抗体。第二抗体为与第一抗体来源动物不同的抗体，可以是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段，优选的，第二抗体为鼠单克隆抗体。第三抗体可以是与第一抗体来源动物不同的单克隆抗体及其片段，优选的，第三抗体为鼠抗兔单克隆抗体。样本为血液或尿液或组织液或唾液或粪便。
本发明提供的均相免疫分析方法为非竞争型免疫检测，第一步先使含有或疑似含有目标小分子化合物(抗原)的样本与包含第一抗体的第一试剂接触，在溶液中形成抗原-抗体复合物；第二步，第一步反应液与用特异性识别目标小分子抗原-抗体复合物的抗体、特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体致敏的不溶性载体粒子接触，产生抗体夹心抗原的反应，形成以不溶性载体粒子为载体的抗复合物抗体-抗原抗体复合物-抗抗体的复杂免疫复合物，最终产生了该不溶性载体粒子的聚集；第三步，检测该不溶性载体粒子的聚集程度，从而实现了对抗原的检测，并且分析灵敏度和精密度有较大提高，能消除非特异性反应。另外，上述方法没有洗涤步骤，进而操作更为简便快捷。
进一步地，目标小分子化合物包括：激素，抗生素，合成药物，多肽，多糖中的任一种。
具体的，目标小分子化合物为分子量小于1500道尔顿的化合物。举例来说，激素为甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、皮质醇、雌二醇、雌三醇、睾酮、雄烯二醇、17a羟孕酮、脱氧皮质醇、皮质酮、孕酮、雌酮、醛固酮、黄体酮、褪黑素；抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素、头孢克洛、阿莫西林、红霉素、四环素、林可霉素、万古霉素、环孢霉素；合成药物为地高辛、茶碱、霉酚酸、卡马西平、丙戊酸、苯妥英、他克莫司、甲氨蝶呤、利培酮、利奈唑胺、紫杉醇、伏立康唑、五氟尿嘧啶、替考拉宁、利福平、地西泮、华法林；多肽为谷胱甘肽；多糖为肝素、硫酸软骨素A、透明质酸、壳聚糖、真菌多糖。目标小分子化合物还可以是其他有机物，例如甘胆酸、三聚氰胺。
进一步地，第一试剂还包括聚合物，蛋白稳定剂，防腐剂，缓冲液。
进一步地，聚合物包括聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸钠，葡聚糖中的任一种。
具体的，聚合物可以选择上述任一种，能够提高抗体的稳定性。
进一步地，第二试剂还包括蛋白稳定剂，防腐剂，缓冲液。
进一步地，蛋白稳定剂包括蔗糖，海藻糖，白蛋白，酪蛋白，卵清蛋白，丙三醇中的任一种。
具体的，蛋白稳定剂可以选择上述任一种，能够保持抗体分子结构和活性的稳定。
进一步地，防腐剂包括叠氮化钠、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，Proclin 300中的任一种。
具体的，防腐剂可以选择上述任一种，能够防止试剂受到微生物的污染，避免变质。
进一步地，缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷、哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三乙醇胺、哌嗪-1，4-二(2-羟基丙磺酸)水合物、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、N-三-(羟甲基)甘氨酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸、2-(环已胺)-1-乙磺酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、硼酸盐、醋酸盐、巴比妥盐换缓冲液中的任一种。
具体的，缓冲液可以选择上述任一种，能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力。
进一步地，不溶性载体粒子包括聚苯乙烯微球，胶体金微球，磁纳米微球中的任一种。
具体的，上述微球能够特异性结合抗体，通过将抗体包被于微球，更加便于检测，进而提高试剂的检测灵敏度。
进一步地，评估目标小分子化合物的数量包括：检测反应体系中的浊度或透光率或吸光度或荧光信号或发光信号变化。
具体的，上述检测方法便捷，检测结果直观，能够有效评估目标小分子化合物的数量，且能够直接确定目标小分子化合物的存在。
实施例2：
本实施例提供上述抗体的制备方法以及聚苯乙烯胶乳微球抗体致敏颗粒的制备方法。
一、抗体制备
1.抗目标小分子化合物的抗体(第一抗体)的制备
(1)用小分子化合物(以下以SMC表示)标记鸡卵清蛋白(OVA)制备SMC-OVA，将500μg的SMC-OVA与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下5点注射白兔(1mL/只)。三周后用200μg的SMC-OVA与弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫；以后每两周免疫一次，共免疫5～7次后，血清效价达到64000以上时，用500μg的SMC-OVA耳缘静脉注射，4天后颈动脉采血，取脾脏。将兔子脾淋巴细胞与处于对数生长期的240E细胞进行融合，50％的PEG作为融合剂。
(2)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的细胞培养板中，置5％CO2培养箱内37℃培养。3周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至细胞培养板中。1周后收集各孔的培养上清液，用以下酶标板进行筛选：用SMC-BSA包被、BSA封闭的板。筛选方法：上述酶标板微孔内分别加入100μl各杂交瘤的培养上清，室温孵育2小时，PBST清洗，再加入100μl的HRP标记抗小鼠IgG，室温孵育1小时后，洗板，添加100μl TMB，室温孵育10分钟后，加50μl 2N硫酸终止显色，用酶标仪读450nm的OD值。选择强烈反应的抗体的杂交瘤为产生目标抗体的杂交瘤。
(3)将杂交瘤细胞进行裂解、分离mRNA，分别克隆其重链、轻链基因、重链Fc片段基因。基因经酶切后与质粒连接，涂平板挑取克隆。大肠杆菌过夜培养提取质粒，重链Fc质粒配对转染至T细胞进行表达。无菌收集细胞，离心后取上清。小转后获得目标重链Fc质粒。通过间接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定目标重链Fc质粒进入大转生产，采用Protein A纯化方法纯化并收集目标兔单克隆抗体重链Fc。大肠杆菌过夜培养提取质粒，重链轻链质粒配对转染至T细胞进行表达。无菌收集细胞，离心后取上清。小转后获得目标单抗质粒。通过间接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定目标单抗质粒进入大转生产，采用Protein A纯化方法纯化并收集至少两株抗目标小分子化合物的兔单克隆抗体A1和A2。
2.特异性识别小分子抗原-抗体复合物的抗体(第二抗体)的制备
(1)将纯化兔单克隆抗体A1和SMC按照摩尔比约为1：5的比例混合反应(30μg/100μl in PBS pH6.8)。立即使用预先用PBS(pH6.8)平衡的脱盐柱分离得到高分子量级组分。然后在高分子量级组分中立即加入1/2体积的1M碳酸钠缓冲液(pH8.3)，室温避光1小时，得到抗体A1-SMC复合物。
(2)将抗体A1-SMC复合物(30μg/100μl in PBS pH6.8)与等体积的弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，对7周龄Balb/c小鼠(♀)腹腔内给予注射免疫，三周后进行第二次免疫，再间隔两周进行第三次免疫。两周后用等量的不含佐剂的抗体A1-SMC复合物(80μg/100μlin PBS)腹腔内进行第四次免疫，3天后摘除小鼠脾脏，分离脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，50％的PEG作为融合剂。
(3)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的细胞培养板中，置5％CO2培养箱内37℃培养。2周后，收集各孔的培养上清液，用以下3种酶标板进行筛选：①用SMC-BSA包被、BSA封闭的板；②用SMC–BSA包被、BSA封闭的板上，然后用100μl/孔添加抗体A2(1μg/ml in PBS)孵育2hr清洗后得到的板；③用100μl/抗体A2(1μg/ml in PBS)包被、BSA封闭的板。筛选方法：上述三种酶标板微孔内分别加入100μl各杂交瘤的培养上清，室温孵育2小时，PBST清洗，再加入100μl的HRP标记抗小鼠IgG，室温孵育1小时后，洗板，添加100μl TMB，室温孵育10分钟后，加50μl 2N硫酸终止显色，用酶标仪读450nm的OD值。比较板①、②、③的OD值，选择与①和③不反应且与②强烈反应的抗体的杂交瘤为产生目标抗体的杂交瘤。
(4)将杂交瘤细胞进行裂解、分离mRNA，分别克隆其重链和轻链基因。基因经酶切后与质粒连接，涂平板挑取克隆。大肠杆菌过夜培养提取质粒，重链轻链质粒配对转染至T细胞进行表达。无菌收集细胞，离心后取上清。小转后获得目标单抗质粒。通过间接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定目标单抗质粒进入大转生产。采用Protein A纯化方法纯化并收集特异性识别小分子抗原-抗体复合物的小鼠单克隆抗体B。
3.特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体(第三抗体)的制备
(1)将纯化兔单克隆抗体重链Fc(30μg/100μl in PBS pH6.8)与等体积的弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，对7周龄Balb/c小鼠(♀)腹腔内给予注射免疫，三周后进行第二次免疫，再间隔两周进行第三次免疫。两周后用等量的不含佐剂的兔单克隆抗体重链Fc(80μg/100μl in PBS)腹腔内进行第四次免疫，3天后摘除小鼠脾脏，分离脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，50％的PEG作为融合剂。
(2)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的细胞培养板中，置5％CO2培养箱内37℃培养。2周后，收集各孔的培养上清液，用以下酶标板进行筛选：用兔单克隆抗体重链Fc包被、BSA封闭的板。筛选方法：上述酶标板微孔内分别加入100μl各杂交瘤的培养上清，室温孵育2小时，PBST清洗，再加入100μl的HRP标记抗小鼠IgG，室温孵育1小时后，洗板，添加100μl TMB，室温孵育10分钟后，加50μl 2N硫酸终止显色，用酶标仪读450nm的OD值。选择强烈反应的抗体的杂交瘤为产生目标抗体的杂交瘤。
(3)将杂交瘤细胞进行裂解、分离mRNA，分别克隆其重链和轻链基因。基因经酶切后与质粒连接，涂平板挑取克隆。大肠杆菌过夜培养提取质粒，重链轻链质粒配对转染至T细胞进行表达。无菌收集细胞，离心后取上清。小转后获得目标单抗质粒。通过间接竞争ELISA试验、ELISA夹心法确定目标单抗质粒进入大转生产。采用Protein A纯化方法纯化并收集特异性识别第一抗体的Fc的C端的抗体C。
二、聚苯乙烯胶乳微球抗体致敏颗粒的制备
(1)活化：取100μL聚苯乙烯微球(固含量10％)加入到2mL离心管中，加入1mL包被缓冲液(20mM MES pH6.5)，混匀；加入30μL EDAC(10mg/mL)，25℃孵育30分钟；
(2)包被：加入1mg兔抗SMC抗体A1，混匀，25℃孵育120分钟；离心，去上清，用1mL包被缓冲液(50mM Tris pH7.4)重悬，超声分散。
(3)封闭：加入100μL BSA(2％)，混匀，25℃孵育60分钟；离心，去上清，用1mL保存液(50mM Tris pH7.4、2g/L BSA、50g/L蔗糖、1g/LProclin300)重悬，超声分散。
实施例3：
本实施例抗原选用25-羟基维生素D，则第一抗体为抗25-羟基维生素D的抗体，采用实施例1提供的免疫分析方法对25-羟基维生素D进行检测。
非竞争法25-羟基维生素D均相免疫分析试剂的制备
参照实施例2，分别制备抗25-羟基维生素D抗体A1、特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B、特异性识别抗25-羟基维生素D抗体A1的Fc的C端的抗体C。参照实施例2制备特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球和特异性识别抗25-羟基维生素D抗体A1的Fc的C端的抗体C致敏的聚苯乙烯微球。
一种25-羟基维生素D均相免疫分析试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES(pH7.4)、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300、0.02g/L抗25-羟基维生素D抗体A1。
试剂2：20mmol/L HEPES(pH7.4)、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、1g/L特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球(200nm)、1g/L特异性识别抗25-羟基维生素D抗体A1的Fc的C端的抗体C致敏的聚苯乙烯微球(200nm)
比较例3-1：竞争法25-羟基维生素D均相免疫分析试剂的制备
参照实施例2分别制备抗25-羟基维生素D抗体A1、抗25-羟基维生素D抗体A1致敏的聚苯乙烯微球。
一种25-羟基维生素D均相免疫分析试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES(pH7.4)、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300、0.1mg/L 25-羟基维生素D-BSA。
试剂2：20mmol/L HEPES(pH7.4)、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、2g/L抗25-羟基维生素D抗体A1致敏的聚苯乙烯微球(200nm)。
比较例3-2：非竞争法25-羟基维生素D均相免疫分析试剂的制备
参照实施例2分别制备抗25-羟基维生素D抗体A1、特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B。参照实施例2制备抗25-羟基维生素D抗体致敏的聚苯乙烯微球和特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球。
一种25-羟基维生素D均相免疫分析试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES(pH7.4)、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300。
试剂2：20mmol/L HEPES(pH7.4)、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、1g/L抗25-羟基维生素D抗体A1致敏的聚苯乙烯微球(200nm)、1g/L特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球(200nm)。
分析方法：
比较例3-1、3-2和实施例3试剂检测人血清样本方法：将样本/校准物质加入试剂1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入试剂2，37℃孵育3-5min，读测第2点样本A2，样本/校准物质A＝样本A2-样本A1；分析参数为：主波长600nm、副波长800nm，样本或校准品8μl，试剂1：160μl，试剂2：40μl。按照上述方法制作校准曲线，根据校准曲线计算样本浓度。测试精密度和样本。
结果分析：
对本发明比较例3-1、3-2和实施例3的各浓度测试OD值进行比较，检测结果参见表1。可以清楚知道，实施例3浓度5ng/mL的OD值与0浓度的OD值差异有明显提高。再参见表2，比较例3-1和3-2的不精密度分别为67.6％和28.3％，精密度较差，无法满足临床诊断需求，而实施例3的不精密度(CV)可低至3.9％，说明本发明提供的免疫分析方法可极大提高分析灵敏度和精密度。
实施例4：
本实施例抗原选用地高辛，则第一抗体为抗地高辛的抗体，采用实施例1提供的免疫分析方法对地高辛进行检测。
参照实施例2分别制备抗地高辛抗体A1、特异性识别地高辛-抗体A1复合物的抗体B、特异性识别抗地高辛抗体A1的Fc的C端的抗体C。参照实施例2制备特异性识别地高辛-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球和特异性识别抗地高辛抗体A1的Fc的C端的抗体C致敏的聚苯乙烯微球。
一种地高辛均相免疫分析试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES(pH7.4)、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300、0.02g/L抗25-羟基维生素D抗体A1。
试剂2：20mmol/L HEPES(pH7.4)、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、1g/L特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球(200nm)、1g/L特异性识别抗25-羟基维生素D抗体A1的Fc的C端的抗体C致敏的聚苯乙烯微球(200nm)。
比较例4-1：竞争法地高辛均相免疫分析试剂的制备
参照实施例2分别制备抗地高辛抗体A1和抗地高辛抗体A1致敏的聚苯乙烯微球。
一种地高辛均相免疫分析试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES(pH7.4)、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300、0.1mg/L地高辛-BSA。
试剂2：20mmol/L HEPES(pH7.4)、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、2g/L抗地高辛抗体A1致敏的聚苯乙烯微球(200nm)。
比较例4-2：非竞争法地高辛均相免疫分析试剂的制备
参照实施例2分别制备抗地高辛抗体A1、特异性识别地高辛-抗体A1复合物的抗体B。参照实施例2制备抗地高辛抗体致敏的聚苯乙烯微球和特异性识别地高辛-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球。
一种地高辛均相免疫分析试剂，其各试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES(pH7.4)、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300。
试剂2：20mmol/L HEPES(pH7.4)、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、1g/L抗地高辛抗体A1致敏的聚苯乙烯微球(200nm)、1g/L特异性识别地高辛-抗体A1复合物的抗体B致敏的聚苯乙烯微球(200nm)。
分析方法：
比较例4-1、4-2和实施例4试剂检测人血清样本方法：将样本/校准物质加入试剂1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入试剂2，37℃孵育3-5min，读测第2点样本A2，样本/校准物质A＝样本A2-样本A1；分析参数为：主波长600nm、副波长800nm，样本或校准品8μl，试剂1：160μl，试剂2：40μl。按照上述方法制作校准曲线，根据校准曲线计算样本浓度。测试精密度和样本。
结果分析：
对本发明比较例4-1、4-2和实施例4的各浓度测试OD值进行比较，检测结果参见表3，可以清楚知道，实施例3分析灵敏度更高。再参见表4，比较例4-1、比较例4-2、实施例4的不精密度(CV)分别为59.5％、18.6％、3.9％，实施例3的不精密度(CV)较好，说明本发明提供的免疫分析方法能够明显提高分析灵敏度和精密度。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (1)

1.一种25-羟基维生素D均相免疫分析试剂，由试剂1和试剂2组成，其特征在于，其试剂组分及用量如下：
试剂1：100mmol/L HEPES、0.5g/L 8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐、聚乙二醇6000、2.0g/L牛血清白蛋白、9.0g/氯化钠、1g/L Proclin300、0.02g/L抗25-羟基维生素D抗体A1；
试剂2：20mmol/L HEPES、2.0g/L牛血清白蛋白、1g/L Proclin300、1g/L特异性识别25-羟基维生素D-抗体A1复合物的抗体B致敏的粒径为200nm聚苯乙烯微球、1g/L特异性识别抗25-羟基维生素D抗体A1的Fc的C端的抗体C致敏的粒径为200nm聚苯乙烯微球；
其中，所述抗体A1为兔单克隆抗体；
所述抗体B为小鼠单克隆抗体；
所述抗体C为特异性识别所述抗体A1的Fc的C端的抗体。
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