CN112540177A - 一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法，包括试剂R1和试剂R2；将抗鼠IgG‑Fc抗体与胶乳微球表面氨基反应形成shiff碱，使抗鼠IgG‑Fc抗体定向标记于胶乳微球上，再将抗鼠IgG‑Fc抗体与至少两种鼠抗人CK‑MB单克隆抗体连接，使胶乳微球偶联上鼠抗人CK‑MB单克隆抗体，制得胶乳微球试剂，然后将胶乳微球试剂加入封闭缓冲液重悬超声后进行封闭，再加入胶乳保存液重悬超声制得胶乳试剂，至少两种胶乳试剂混合制成试剂R2；与现有技术相比，本发明的试剂盒灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性高、稳定性好；相较于其他偶联方法，本发明的方法避免了CK‑MB单克隆抗体F(ab)端活性位点偶联于微球上，同时增加了CK‑MB单克隆抗体偶联量，显著提高了试剂检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及医学、免疫和体外诊断领域，具体是一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肌酸激酶(CK)是心肌中重要的能力调节酶，主要催化高能磷酸键从ATP转移到肌酸，生成磷酸肌酸。磷酸激酶是二聚体酶，主要存在于心肌组织中，在骨骼肌中也有微量分布，其结构由肌型亚单位(M)和脑型亚单位(B)两个亚基组成，根据其亚基组成不同，可分为CK-MM、CK-BB、CK-MB和线粒体肌酸激酶等四种同工酶形式，其中CK-MM主要存在于骨骼肌中，CK-BB主要存在于脑组织中，CK-MB主要存在于心肌组织中。CK-MB分子量为80kD，由M和B两个亚单位(每个亚单位分子量为40kD)组成，在心肌组织中的占CK总量得20％左右，在骨骼肌中也有微量分布，血清中CK-MB含量对诊断急性心肌梗死、心肌炎等心肌缺血性疾病有重要意义。
CK-MB在心肌损伤早期即可出现于循环血中，于心肌损伤后2-6h开始升高，在12-24h内达到峰值，36-72h内降至正常水平，CK-MB含量和时间变化对心肌损伤发病时间，梗死体积以及再灌注后损伤有重要意义。此外，骨骼肌损伤，横纹肌溶解症及中风等疾病中也伴随有CK-MB升高。在心肌损伤相关疾病诊断上，常与肌红蛋白和肌钙蛋白I联合检测。
目前常规的CK-MB检测主要采用免疫抑制法，检测的是CK-MB的活性，其原理是应用单克隆抗体与肌酸激酶中的M亚基结合，抑制CK-MM及CK-MB中的M亚基的活性，再测定B亚基的活力，将结果乘以2即为CK-MB的活力，该方法忽略血清中微量的CK-BB，但对某些恶性肿瘤患者、脑神经损伤或平滑肌受损的患者，它们血清中的CK-BB含量会增高，或出现线粒体CK(CK-Mt)，由于其活性不受抗M抗体的抑制，其B亚基活性与CK-MB中B亚基活性同时被测，导致CK-MB检测异常增高，易引起AMI的误诊。
酶联免疫法(ELISA)是基于双抗体夹心法检测CK-MB，该方法特异性强，但操作繁琐，自动化程度低，耗时长。
胶体金免疫层析法，操作简便，快速，适合于急诊，但其灵敏度低，手工加样易受操作者影响，常会出现假阴性。
化学发光测定CK-MB质量是美国心脏病协会和欧洲心脏病协会推荐的检验方法，其原理是基于双抗体夹心法原理的化学发光免疫分析方法，将纯化的特异性鼠单克隆抗体预先包被在载体上，加入待测样本和酶标记的特异性单克隆抗体，形成特异性抗体-抗原-酶标记抗体的免疫复合物，经过激发后发出光子，根据激发光的大小得出样本中CK-MB的质量数。该化学发光测定特异性强，精密度高，但成本高，耗时长不适用于筛查工作和急诊。
胶乳増强免疫比独法是一种动态测定抗原抗体结合的检测方法，在特定的稀释系统中，抗原抗体发生结合，并且在结合比例合适时，微粒会从液相析出；在抗原和抗体结合的前后，会发生浊度的变化；通过全自动生化分析仪检测这种浊度变化，并利用标准品绘制线性曲线，可得出相应样品中待测物质的含量。CN111562372A公开了基于胶乳增强免疫比浊法的肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒，但其存在分析灵敏度达不到临床要求的问题。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术所存在的不足之处，提供了一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1成分及含量为：第一缓冲液10-200mM，无机盐5-30g/L，增浊剂2-40g/L，表面活性剂0.01-3g/L，第一防腐剂0.5-1.53g/L，阻断剂1-3g/L，溶剂为纯化水；试剂R2包括胶乳微球试剂和胶乳保存液；胶乳微球试剂为偶联有至少两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体的胶乳微球；胶乳保存液成分及含量为：第二缓冲液10-200mM，稳定剂30-150g/L，第二防腐剂0.3-1g/L，溶剂为纯化水。
作为优选，第一缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种。
作为优选，无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
作为优选，增浊剂为PVP、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一种或几种。
作为优选，表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为优选，第一防腐剂为Proclin300和叠氮化钠中的一种或几种。
作为优选，第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种。
作为优选，稳定剂为BSA、蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘油、羧甲基纤维素钠、明胶中一种或多种。
作为优选，防腐剂为Proclin300、硫柳汞、叠氮化钠中一种。
与现有技术相比，本发明的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒具有以下优点：在性能评估时线性范围检测，检测上限能高达到250ng/mL，低端检测达到0.1ng/mL，线性相关系数R2>0.99；本发明的试剂盒具有灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性高、稳定性好等优点，能够在生化仪上实现自动化检测，成本低，自动化高，可节省检测时间，便于临床应用。
本发明还提供了一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：
试剂R1制备：称取无机盐5-30g/L，增浊剂2-40g/L，表面活性剂0.01-3g/L，第一防腐剂0.5-1.53g/L，阻断剂1-3g/L，将上述组分溶于10-200mM第一缓冲液中，充分搅拌促进溶解，加纯化水混合均匀，并调整pH为7.0-7.8，制得试剂R1；
试剂R2制备：首先将抗鼠IgG-Fc抗体与胶乳微球表面氨基反应形成shiff碱，使抗鼠IgG-Fc抗体定向标记于胶乳微球上，再将抗鼠IgG-Fc抗体与至少两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体连接，使胶乳微球偶联上鼠抗人CK-MB单克隆抗体，制得胶乳微球试剂，然后将胶乳微球试剂加入封闭缓冲液重悬超声后进行封闭，再加入胶乳保存液重悬超声制得胶乳试剂，至少两种胶乳试剂混合制成试剂R2。
作为优选，抗鼠IgG-Fc抗体与鼠抗人CK-MB单克隆抗体的摩尔比为1:1。
作为优选，抗鼠IgG-Fc抗体定向标记的胶乳微球为氨基聚苯乙烯胶乳微球，直径为100-350nm。
作为优选，定向标记技术采用高碘酸钠氧化法将抗鼠IgG-Fc抗体Fc端糖链邻二醇氧化为醛基，与胶乳微球上的氨基形成shiff碱。
进一步地，试剂R2的制备方法如下：
(1)取一定量的抗鼠IgG-Fc抗体与一定量的0.1M高碘酸钠溶液混合，室温搅拌反应15-30min；将上述溶液用1mM pH4.4的醋酸缓冲液透析，4℃过夜；加入0.2M pH9.5的碳酸钠缓冲液，将pH调至9.0-9.5后，立即加入固含量为10％的胶乳微球，室温搅拌2h；
(2)加入一定量新配制的4mg/mL NaBH4溶液，混匀，4℃反应2h，离心去上清液，加入缓冲液重悬超声，制得胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物；
(3)至少取两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体，分别与胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物按照1:(3-5)的比例混匀，偶联30min，离心去上清，制取偶联后的胶乳微球试剂；
(4)向上述偶联后的胶乳微球试剂中加入封闭缓冲液重悬超声后进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清液，并加入胶乳保存液重悬超声，制取胶乳试剂；然后，将制取的至少两种胶乳试剂混合，即得所需的试剂R2。
作为优选，步骤(1)中，抗鼠IgG-Fc抗体与高碘酸钠溶液的w/v(稀释比例，质量/体积浓度)比为10-50:1；抗鼠IgG-Fc抗体与胶乳微球的w/v比为1-3:1。
作为优选，步骤(2)中，鼠抗人CK-MB单克隆抗体与胶乳微球的w/v比为1:(3-5)。
与现有技术相比，本发明的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒制备方法，在试剂R2制备过程中，采用高碘酸钠氧化抗鼠IgG-Fc抗体Fc端糖链，使抗体定向标记于氨基胶乳微球上，再通过特异性识别将抗鼠IgG-Fc抗体与鼠抗人CK-MB单克隆抗体结合；相较于其他偶联方法，避免了CK-MB单克隆抗体F(ab)端活性位点偶联于微球上，同时增加了CK-MB单克隆抗体偶联量，显著提高了试剂检测灵敏度。
附图说明
图1是实施例中一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒的线性范围线性回归图；
图2是实施例中一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒与罗氏化学发光试剂盒相关性分析图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例一
试剂R1成分及含量：100mM Tris-HCl缓冲液，20g/L氯化钠，20g/L聚乙二醇(PEG4000)，2g/L吐温-20，1g/L叠氮化钠，1g/L阻断剂。
试剂R2制备过程如下：取1mg的抗鼠IgG-Fc抗体与0.1M高碘酸钠按20:1的比例混合，室温搅拌反应20min；反应后的溶液用1mM pH4.4的醋酸缓冲液4℃透析过夜；加入0.2MpH9.5的碳酸钠缓冲液，将pH调至9.0，立即加入0.5mL固含量为10％的280nm粒径胶乳微球，室温搅拌2h；加0.02mL新配制的4mg/mL NaBH4，混匀，4℃反应2h，15000rpm转速下离心40mim去上清液，加入缓冲液将沉淀重悬并超声分散，制得胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物；取2.5mg两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体，分别与制得的胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物混合，室温反应偶联30min，15000rpm转速下离心40mim去上清液，制取偶联后的胶乳微球试剂；向上述偶联后的胶乳微球试剂中加入封闭缓冲液重悬超声进行封闭，离心去上清液，并加入含25mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液、15g/L BSA、15g/L蔗糖、1g/L叠氮化钠重悬超声分散，制取两种胶乳试剂组成液；然后混合即得所需的胶乳试剂R2。
实施例二
试剂R1成分及含量：200mM Tris-HCl缓冲液，1g/L氯化钠，15g/L聚乙二醇(PEG4000)，1g/L吐温-20，1g/L叠氮化钠，1g/L阻断剂。
试剂R2成分及含量：取1mg的抗鼠IgG-Fc抗体与0.1M高碘酸钠按20:1的比例混合，室温搅拌反应20min；反应后的溶液用1mM pH4.4的醋酸缓冲液4℃透析过夜；加入0.2MpH9.5的碳酸钠缓冲液，将pH调至9.0，立即加入0.5mL固含量为10％的330nm粒径胶乳微球，室温搅拌2h；加0.02mL新配制的4mg/mL NaBH4，混匀，4℃反应2h，15000rpm转速下离心40mim去上清液，加入缓冲液将沉淀重悬并超声分散，制得胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物；取2.5mg两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体，分别与制得的胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物混合，室温反应偶联30min，15000rpm转速下离心40mim去上清，制取偶联后的胶乳微球；向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液重悬超声进行封闭，离心去上清，并加入含25mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液、10g/L BSA、2g/L蔗糖、1g/L叠氮化钠重悬超声分散，制取两种胶乳试剂组成液；然后混合即得所需的胶乳试剂R2。
测试例一
肌酸激酶同工酶MB的测定：
测定仪器：日立7180全自动生化分析仪；
分析方法：两点终点法；
分析参数：实施例一试剂R1：0.2mL，实施例一试剂R2：0.05mL，样本：0.015mL；波长：660nm；
测定步骤：先加入试剂R1和样本，于37℃孵育5分钟后，加入试剂R2，立即读取第一点吸光度值，计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值，计算两点吸光度差值。
定标曲线制作：以定标液浓度为横坐标，各浓度定标液对应的吸光度差值为纵坐标，做logit-log(4p)函数曲线。
样本浓度计算方法：根据样本的吸光度值差值，代入定标曲线，计算相对应的浓度值。
测试例二
试剂盒检测样本性能试验：
(1)灵敏度试验
以水为空白样本，选取一份低值CK-MB样本进行倍比稀释，配制出不同浓度的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表1，灵敏度为0.1ng/L。申请号为CN108548926B的发明专利，公开一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其测得的灵敏度为1ng/mL，精密度(CV)为2.54％，可见，本测试例中CK-MB具有更高的灵敏度。
表1灵敏度试验
(2)线性范围试验
用纯品CK-MB配制成浓度为250ng/mL的高值样本，用纯水按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0的稀释系数进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，同时以相同方法测定某公司CK-MB检测试剂盒线性范围，结果见图1。根据理论值与检测均值求出该浓度的线性偏差，结果表明本发明试剂盒对CK-MB的检测上限可达到250ng/mL以上(R2>0.99)，优于某公司CK-MB检测试剂盒线性范围(R2<0.99)。
(3)稳定性试验
在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月和12月对同一血清样本进行测定，每个样本测20次，同时，采用某公司试剂盒对同一血清样本进行同时的稳定性试验，结果见表2。血清样本分装后，储存于-20℃。实施例一制备的试剂盒和某公司试剂盒中，4月，8月，12月与0月相比，测得值差异都小，说明实施例一试剂盒和某公司试剂盒在2-8℃贮存条件下都可稳定贮存一年。
表2稳定性试验
(4)相关性分析
分别采用实施例一制备的本发明试剂盒和罗氏CK-MB化学发光法检测试剂盒做相关性实验，对79份人血清(包含正常和异常样本)进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图2(X、Y轴均为测定值，单位ng/mL)。由图2可知，本发明试剂和对照试剂的相关系数为R2＝0.9987，回归方程为y＝0.9876x-0.1602。该结果表明本发明试剂与对照试剂具有很好的相关性、特异性和准确性。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体方法允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1成分及含量为：第一缓冲液10-200mM，无机盐5-30g/L，增浊剂2-40g/L，表面活性剂0.01-3g/L，第一防腐剂0.5-1.53g/L，阻断剂1-3g/L，溶剂为纯化水；
所述试剂R2包括胶乳微球试剂和胶乳保存液；所述胶乳微球试剂为偶联有至少两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体的胶乳微球；所述胶乳保存液成分及含量为：第二缓冲液10-200mM，稳定剂30-150g/L，第二防腐剂0.3-1g/L，溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种；
所述增浊剂为PVP、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一种或几种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种；
所述第一防腐剂为Proclin300和叠氮化钠中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘油、羧甲基纤维素钠、明胶中一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300、硫柳汞、叠氮化钠中一种。
4.一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：
试剂R1制备：称取无机盐5-30g/L，增浊剂2-40g/L，表面活性剂0.01-3g/L，第一防腐剂0.5-1.53g/L，阻断剂1-3g/L，将上述组分溶于10-200mM第一缓冲液中，充分搅拌促进溶解，加纯化水混合均匀，并调整pH为7.0-7.8，制得试剂R1；
试剂R2制备：首先将抗鼠IgG-Fc抗体与胶乳微球表面氨基反应形成shiff碱，使抗鼠IgG-Fc抗体定向标记于胶乳微球上，再将抗鼠IgG-Fc抗体与至少两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体连接，使胶乳微球偶联上鼠抗人CK-MB单克隆抗体，制得胶乳微球试剂，然后将胶乳微球试剂加入封闭缓冲液重悬超声后进行封闭，再加入胶乳保存液重悬超声制得胶乳试剂，至少两种胶乳试剂混合制成试剂R2。
5.根据权利要求4所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述抗鼠IgG-Fc抗体与鼠抗人CK-MB单克隆抗体的摩尔比为1-2:1。
6.根据权利要求4所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述抗鼠IgG-Fc抗体定向标记的胶乳微球为氨基聚苯乙烯胶乳微球，直径为100-350nm。
7.根据权利要求4所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述定向标记技术采用高碘酸钠氧化法将抗鼠IgG-Fc抗体Fc端糖链邻二醇氧化为醛基，与胶乳微球上的氨基形成shiff碱。
8.根据权利要求4所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒制备方法，其特征在于，所述试剂R2的制备方法如下：
(1)取一定量的抗鼠IgG-Fc抗体与一定量的0.1M高碘酸钠溶液混合，室温搅拌反应15-30min；将上述溶液用1mM pH4.4的醋酸缓冲液透析，4℃过夜；加入0.2M pH9.5的碳酸钠缓冲液，将pH调至9.0-9.5后，立即加入固含量为10％的胶乳微球，室温搅拌2h；
(2)加入一定量新配制的4mg/mL NaBH4溶液，混匀，4℃反应2h，离心去上清液，加入缓冲液重悬超声，制得胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物；
(3)至少取两种鼠抗人CK-MB单克隆抗体，分别与胶乳-抗鼠IgG-Fc抗体偶联物按照1:(3-5)的比例混匀，偶联30min，离心去上清，制取偶联后的胶乳微球试剂；
(4)向上述偶联后的胶乳微球试剂中加入封闭缓冲液重悬超声后进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清液，并加入胶乳保存液重悬超声，制取胶乳试剂；然后，将制取的至少两种胶乳试剂混合，即得所需的试剂R2。
9.根据权利要求8所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，抗鼠IgG-Fc抗体与高碘酸钠溶液的w/v比为10-50:1；抗鼠IgG-Fc抗体与胶乳微球的w/v比为1-3:1。
10.根据权利要求8所述的一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，步骤(2)中，鼠抗人CK-MB单克隆抗体与胶乳微球的w/v比为1:(3-5)。
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